Summary
다광자 이미징은 조직 표면의 제한된 깊이에서만 효과적이지만 pCLE를 통해 모든 깊이에서 3μm 해상도의 이미징을 달성할 수 있습니다. 여기에서는 ictal 및 야생형 마우스의 해마에서 미세혈관 역학을 측정하기 위해 pCLE 이미징을 수행하는 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
이 프로토콜의 목표는 벽화 세포에 의해 구동되는 발작 중 모세관 혈류 효과를 설명하기 위한 특정 응용 분야에서 광섬유 번들 결합 전임상 컨포칼 레이저 스캐닝 내현미경(pCLE)을 설명하는 것입니다. 시험관 내 및 생체 내 피질 영상은 pericyte에 의해 유발되는 모세혈관 수축이 건강한 동물의 기능적 국소 신경 활동뿐만 아니라 약물 적용으로 인해 발생할 수 있음을 보여주었습니다. 여기에서는 pCLE를 사용하여 모든 조직 깊이(특히 해마)에서 간질의 신경 퇴행에서 미세혈관 역학의 역할을 결정하는 방법에 대한 프로토콜을 제시합니다. 신경 활동에 대한 마취제의 잠재적인 부작용을 해결하기 위해 깨어 있는 동물의 pCLE를 기록하도록 조정된 머리 구속 기술에 대해 설명합니다. 이러한 방법을 사용하여 뇌의 심부 신경 구조에서 몇 시간에 걸쳐 전기 생리학 및 영상 기록을 수행할 수 있습니다.
Introduction
다른 현미경 이미징 방법(1,2,3,4,5,6,7,8)과 달리, 생체 내 광섬유 기반 컨포칼 현미경은 모든 뇌 영역, 모든 깊이에서 고속(시야 크기에 따라 최대 240Hz)으로 혈류 역학을 측정할 수 있습니다9). 광섬유 프로브는 프로브의 팁(5000-6000개의 3μm 직경의 개별 섬유 번들로 구성된 렌즈 없는 대물렌즈)이 관심 형광 대상의 15μm 이내에서 미세 전극의 정확도로 배치될 수 있기 때문에 3μm 해상도에서 생체 내 컨포칼 레이저 스캐닝 이미징을 가능하게 합니다. in vivo two-photon imaging과 마찬가지로, 형광단은 이미징 타겟에 미리 도입되어야 합니다. 예를 들어, 플루오레세인 덱스트란(또는 퀀텀닷)을 혈관 조직에 주입하거나, 유전적으로 인코딩된 형광 단백질을 세포에 transfection하거나, Oregon Green BAPTA-1과 같은 형광 염료를 이미징 전에 세포에 벌크 로딩할 수 있습니다.
이러한 기법을 이용한 최근 연구에서는 발작 중 벽화 세포의 위치에서 발생하는 갑작스러운 수축인 외측 모세혈관 경련(ictal capillary vasospasm)9을 유발하는 벽체 세포 운동 활동이 전골 해마(ictal hippocampus)9의 신경 퇴화에 기여할 수 있다는 사실이 밝혀졌다. 이전의 이미징 연구는 약물 적용과 관련된 in vitro 및 in vivo pericyte constrictings를 보여주었지만 6,7,10,11,12, Leal-Campanario et al.은 쥐 뇌에서 생체 내 자발적 모세혈관 수축의 첫 번째 증거를 발견했습니다. 인간 측두엽 간질과의 관련성을 확립하기 위해, 그들은 인간 일시적 운동 실조증 유형 1 15의 유전 모델인 수컷(P30-40세) 녹아웃(KO) Kv1.1(kcna1-null) 마우스14,15(JAX stock #003532)를 연구했다. pericyte는 자발적 간질을 하는 동물과 야생형(WT) 새끼에서 병리학적 및 생리학적 해마 벽화 혈관 수축(vasopcontractions)9을 유도했다. 이러한 관찰은 카이닌산으로 간질에 걸린 WT 동물에서 복제되었으며, 따라서 다른 형태의 간질에 대한 일반화를 나타냅니다. Leal-Campanario 등은 또한 새로운 입체학적 현미경 접근 방식을 사용하여 간질 동물의 세포사멸(건강하지는 않음) 뉴런이 해마 미세혈관에 공간적으로 결합되어 있음을 확인했습니다. 흥분독성은 혈관구조와 공간적 연관성이 알려져 있지 않기 때문에, 이 결과는 비정상적인 모세혈관 혈관 경련성 허혈 유발 저산소증이 간질의 신경 퇴행에 기여한다는 것을 나타냈다. 그림 1은 일반 설정의 개략도를 보여줍니다.
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Protocol
이 프로토콜은 NIH Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals를 따릅니다. 모든 절차는 Barrow Neurological Institute의 Institutional Animal Care and Use Committee의 승인을 받았습니다.
1. 개두술을 위한 입체 위치 지정
- 무게를 잰 다음 케타민-자일라진(100mg/kg–10mg/kg i.p.) 칵테일로 마우스를 마취합니다. 꼬리 및/또는 발가락 꼬집음에 대한 반응 부족을 관찰하여 동물이 완전히 마취되었는지 확인하십시오.
- 마우스 아래에 온열 패드를 놓고 직장 체온계를 사용하여 초기 마취 이식 수술 중에 체온을 지속적으로 모니터링합니다(그림 2A).
- 안구 건조증을 예방하기 위해 안과 연고를 바르십시오.
- 쥐 어댑터가 장착된 설치류 입체 프레임에 동물의 머리를 고정합니다. 입체 프레임에서 마우스의 방향을 올바르게 지정하려면 동물의 이빨을 바이트 바의 구멍 안에 놓습니다(그림 2A 및 그림 3A, 항목 g). 노즈 cl을 조입니다.amp 꼭 맞을 때까지 (그림 2A, B 및 그림 3A, 항목 h). 마우스의 몸체 위치는 가능한 한 직선이어야 합니다(그림 2A 참조).
- 턱 홀더 커프가 있는 마우스 이어바(그림 2A 및 그림 3A, 항목 i)를 사용하여 동물의 머리를 추가로 고정하여 두개골의 접합 돌기를 단단히 고정합니다.
알림: 일단 고정되면 마우스 헤드는 수평 동작 범위가 없어야 합니다.
- 턱 홀더 커프가 있는 마우스 이어바(그림 2A 및 그림 3A, 항목 i)를 사용하여 동물의 머리를 추가로 고정하여 두개골의 접합 돌기를 단단히 고정합니다.
- 마우스가 입체 프레임(그림 3B, 항목 j)에 맞게 조정되면 클로르헥세딘 스크럽으로 두피를 2-3회 닦고 매번 알코올 헹굼으로 두피를 세척하고 살균합니다. 그런 다음 국소 리도카인을 머리 위에 바른다.
- 가는 가위나 칼날을 사용하여 두개골의 시상 정중선을 따라 후방에서 전방까지 정중선을 따라 절개합니다(두개골 기저부에서 절개를 시작하여 눈 사이 12-15mm). 4개의 28mm 불독 세레파인 클램프로 두피의 테두리를 집어넣어 두개골을 노출시키고 작업 영역을 최대화합니다(그림 2B 및 그림 3C).
- 메스 또는 미세 주걱(그림 3C)을 사용하여 골막을 절개 가장자리까지 긁어냅니다. 조직 분리 가위 또는 집게(그림 3C)를 사용하여 목 뒤쪽의 근육을 조심스럽게 집어넣습니다(그림 2B).
- 두개골 봉합사의 시각화를 최적화하기 위해 알코올 또는 30% 과산화수소를 적신 면 끝이 있는 어플리케이터로 두개골 상단을 건조시킵니다. 결합 조직이 제거되면 두개골에 식염수를 바릅니다.
- 마우스의 머리가 입체 장치에 안정화되면 주사기 바늘 팁(21G)을 전극 홀더(그림 3B, 항목 l)에 놓고 전극 홀더를 입체 미세 조작기에 부착하여 바늘 끝을 두개골 높이까지 낮춥니다(그림 2D).
- 브레그마 후방의 모든 거리(즉, -2.0mm)와 두개골 양쪽의 정중선에서 측면의 두 개의 동일한 거리(즉, ± 1.5mm)에서 두개골의 높이를 측정하여 두개골의 내측-측면 방향을 조정합니다(그림 2D). 등쪽-복부 방향으로 0.05mm 미만의 위치 간 높이 차이를 목표로 합니다.
- 0.05mm보다 큰 경우 바이트 바를 사용하여 마우스의 두개골을 회전하거나 이어바를 조심스럽게 풀고 필요에 따라 헤드와 이어바를 옆으로 이동한 다음 이어바를 다시 조여 마우스의 머리 위치를 변경합니다.
- 두개골이 입위 장치에 배치되면 전후(AP), 내측(ML) 및 배쪽 복부(DV) 축을 따라 브레그마 및 람다 두개골 봉합사의 정위 좌표를 결정하고 기록합니다.
- 입체 아틀라스(stereotaxic atlas)를 사용하여 목표 지점(오른쪽 해마)을 식별합니다. 그런 다음 두개골에서 브레그마(AP: -2.7mm, ML: -2.7mm)를 기준으로 표적 좌표를 찾습니다(그림 2E).
- 수술용 마커를 사용하여 후속 개두술을 위해 해마 바로 위의 표적 지점(그림 2F)을 중심으로 두개골에 있는 1.4mm x 2mm 이미징 창의 네 모서리를 점으로 표시합니다.
- 수술 마커를 사용하여 왼쪽 상단 두정골 위(그림 2G)와 오른쪽 전두골 위(그림 2H)에 두 개의 점을 추가로 그려 헤드 캡(그림 3B, 항목 m)을 두개골에 고정할 두 개의 뼈 나사(그림 3A, 항목 b)의 향후 배치를 나타냅니다.
- 수술 마커를 사용하여 경막외 EEG 기록 전극이 삽입될 위치를 나타내는 점 3개를 더 그립니다: 정중선의 양쪽에 1mm 위치에 있는 점 1개와 Lambda 뒤 1mm 위치에 있는 정중선에 추가 점 1개(그림 2E, 그림 4A 및 그림 5B).
2. 헤드 캡 설치
- 직경 0.7mm의 버(그림 3C)를 사용하여 뼈 나사 위치를 나타내는 점 위치에서 두개골에 두 개의 작은 구멍을 조심스럽게 뚫습니다(위의 1.15단계 참조). 그런 다음 이전에 에탄올 70-80%로 소독한 두 개의 뼈 나사(스테인리스 스틸 슬롯, 길이: 4mm, 직경: 0.85mm)를 두개골에 나사로 고정하여 헤드 캡 안정성을 높입니다(그림 2I-J 및 그림 3A, 항목 b).
- 나사 끝이 뼈 바닥을 넘어 두개강으로 돌출되어 뇌가 손상될 위험이 없는지 확인하십시오. 두 개의 뼈 나사 중 하나는 두 개의 헤드 캡 나사의 앞쪽에 있고 다른 하나는 뒤쪽에 있습니다(그림 2GJ).
- 두개골 위에 식염수를 뿌려 식히고 청소하십시오. 그런 다음 두개골을 완전히 말리고 나사 주위에 시아노아크릴레이트를 얇게 바릅니다.
- 입체 장치(그림 2F-J 및 그림 3A, 항목 d)에 장착된 마이크로 드라이브에 고정된 맞춤형 정렬 조각(그림 3A, 항목 c)을 사용하여 헤드 캡의 위치가 앞쪽 융기가 브레그마 위에 놓이도록 정중선을 따라 정렬되도록 합니다. 이 맞춤형 스테인리스 스틸 조각은 L자형(90° 각도)이며 두 개의 구멍이 4mm 떨어져 있습니다(그림 2F-J 및 그림 3A, 항목 c).
- 입체 조작기를 사용하여 두 개의 필리스터 헤드 슬롯 드라이브 나사가 부착된 L자형 정렬 조각을 배치합니다(M1.6 x 0.35 미터법 거친, 12mm 길이; 그림 3A, 항목 a) 나사 바닥이 두개골에 평평하게 놓일 때까지 브레그마 위에 두개골에 압력이 가해지지 않도록 주의합니다(그림 2I-J).
- 시아노아크릴레이트를 바른 다음 치과용 시멘트를 도포하여 나사 바닥을 두개골에 부착합니다. 해마 위의 이미징 창 참조 표시를 가리지 않도록 주의하십시오(그림 2K).
3. 영상창 개두술 수술
- 이미징 창의 모서리를 나타내는 개두술 참조 표시의 각 위치에서(위의 1.14단계 참조) 0.7mm 직경의 버 구멍을 뚫은 다음 드릴로 1.4mm x 2mm 개두술 창의 주변을 반복적으로 더 깊게 절단하여 부드럽게 묘사합니다(그림 2L).
- 두께가 약 300μm인 얇고 깨지기 쉬운 두개골에 너무 깊거나 너무 많은 힘을 가하지 않도록 주의하십시오. 뼈 피판이 완성되면 메스 끝으로 느슨한 피판을 들어 올리고 밑에 있는 경막이 손상되지 않도록 주의합니다.
- 열린 창을 뼈 왁스로 덮습니다(그림 2M).
- 0.9mm 직경의 버를 사용하여 경막외 EEG 전극의 향후 배치를 위해 3개의 구멍을 뚫습니다(위의 1.15단계 참조) 경막을 절단하지 않도록 주의합니다(그림 2E,L).
- 세 개의 구멍을 뼈 왁스로 덮습니다.
- 골왁지로 덮인 이미징 창과 EEG 구멍의 가장자리 주위에 시아노아크릴레이트를 부드럽게 바르고 개두술을 밀봉하지 않도록 주의합니다(그림 2L).
- 이미징 창과 EEG 구멍을 둘러싸고 이전에 시멘트로 된 헤드 캡에 결합하는 치과용 시멘트 벽을 만듭니다(그림 2M 및 그림 3B, 항목 m).
- 시멘트를 최소 10분 동안 건조시킵니다.
- 4-0 또는 5-0 검은색 꼰 실크를 사용하여 간단한 단속 봉합사로 느슨한 상처 가장자리를 닫습니다(그림 2N 및 그림 3C).
4. 수술 후
- 면 팁 어플리케이터를 사용하여 노출된 피부 주위에 리도카인 연고를 바르면 상처 가장자리 주변의 감각을 약화시킵니다.
- 멸균 면 팁 어플리케이터를 사용하여 노출된 피부에 네오스포린을 바릅니다.
- 입체 프레임에서 동물을 제거합니다(그림 2N).
- 수술 후 진통을 위해 케토프로펜(5mg/kg) IP 또는 IM을 주사합니다.
- 동물이 경계하고 움직일 때까지 관찰하십시오(보통 몇 분 이내에 발생함).
- 동물을 따뜻한 케이지에 넣고 물을 마시거나 먹고 동물 사육장으로 옮길 준비가 될 때까지 회복 상태를 계속 모니터링합니다.
- 수술 후 약 1주일 동안 적어도 하루에 한 번 동물을 검사하여 무기력한 행동 및/또는 부적절한 식사/음주의 징후가 있는지 관찰합니다(그림 2O).
5. 염료 주입 및 EEG 기록
- 헤드 캡 이식 수술 후 최소 하루를 기다렸다가 녹음을 시작합니다.
- 마우스를 입체 프레임 내에서 몸체에 맞게 성형된 폼 억제 장치에 넣습니다(그림 3B, 항목 n 및 j).
- 헤드 캡(그림 3 B-I, 항목 m)을 입체 프레임(그림 3A, B, 항목 e 및 j, 그림 4A)에 부착된 맞춤형 장착 막대에 고정합니다. 항목 e(그림 3A,B)의 긴 섹션은 길이가 9.4 – 13mm 사이여야 합니다. 항목 f(크기가 1.5cm x 0.5cm인 장착 플레이트, 중앙에서 중앙으로 4mm 떨어진 두 개의 구멍이 있음)를 항목 e(그림 3A, B, 항목 e, f 및 k)에 고정합니다. 이 정렬 시스템은 이미징 세션 전반에 걸쳐 깨어 있는 마우스를 입체 프레임에 안전하게 배치합니다(그림 4).
- 경막외 EEG 기록 전극(그림 5A)을 삽입하고 접지 전극(흰색 와이어)을 후방 중앙 구멍에 배치하고 기록 전극(빨간색 와이어)을 전방 왼쪽 및 오른쪽 구멍에 배치합니다(그림 2E, 그림 4E 및 그림 5E). 각 와이어를 두개골과 경막 사이의 L자형에 배치하여(그림 5C) 전기 접촉을 최적화합니다.
- 꼬리 정맥에 녹색 플루오레세인 라이신 고정 가능한 덱스트란(플루오레세인 5% w/w 25g)을 주입하여 해마 내 혈류를 시각화합니다.
- 주사 전에 쥐 꼬리의 중심 정맥의 확장을 향상시키려면 다음 전략 중 하나 이상을 사용하십시오 : a) 면봉 어플리케이터를 사용하여 중앙 정맥에 70 % 에탄올을 적용합니다. b) 꼬리를 따뜻한 물(35-40°C)에 1-3분 동안 담그십시오. c) 꼬리를 가열 램프에 몇 분 동안 노출시킵니다.
- 두 손가락으로 쥐의 꼬리를 고정하고 피부 바로 아래에 있는 중심 정맥을 찾습니다. 바늘(바늘 30G가 통합된 초미세 인슐린 주사기)을 비스듬히 위로 향하게 하여 꼬리 바닥에서 약 절반에서 2/3 지점의 정맥에 삽입합니다. 주입하는 동안 바늘을 꼬리와 평행하게 유지하십시오.
- 바늘이나 꼬리의 위치가 변하지 않도록 주의하면서 염료를 천천히 꾸준히 주입합니다.
알림: 주사기 플런저를 누를 때 저항이 없어야 합니다. - 주입 완료 후 바늘을 빼고 천자 부위에 부드러운 압력을 가하여 혈관을 밀봉합니다.
- 응고가 일어나도록 하십시오.
6. 생체 내 광섬유 번들 결합 전임상 컨포칼 레이저 스캐닝 내현미경(pCLE)
- 꼬리 정맥 주입(위의 5.5.3단계) 직후, 300μm 비스듬한 광섬유 다발(각 다발에 5000–7000 3μm 섬유 포함)을 로봇 입체 드라이브의 모바일 암에 아래쪽 방향으로 고정합니다.
- 개두술에서 뼈 왁스를 제거합니다.
- 주사기 바늘의 구부러진 끝을 사용하여 경막을 제거합니다.
- 로봇 포지셔닝 시스템을 사용하여 먼저 섬유 대물렌즈를 적절한 전방 후방 및 좌우 입체 위치로 이동하고 팁이 피질 표면의 z축에서 영점 조정됩니다.
- EEG 기록을 시작합니다(그림 5D).
- 광섬유 대물렌즈의 뒷면에 대한 컨포칼 레이저 스캐닝을 시작한 다음 로봇 마이크로 드라이브의 z-컨트롤을 사용하여 대물렌즈가 뇌 내의 목표 깊이에 도달할 때까지 z축에서 대물렌즈를 천천히 하강시킵니다(그림 4C). 하강하는 동안 현미경 소프트웨어에서 이미징 결과를 볼 수 있습니다.
- 광섬유 팁이 대상 X-Y-Z 기록 영역 내에 있고 두 개 이상의 선박이 이미징 창의 FOV에 들어가는 경우 하강을 중지하고 비디오 녹화를 시작합니다. Cellvizio Lab의 이미징 소프트웨어를 사용하여 11.7Hz에서 혈류의 라이브 전체 필드 타임랩스 동영상을 얻을 수 있습니다. (더 작은 FOV로 더 높은 속도를 얻을 수 있습니다). 녹음은 한 번에 4-5시간 동안 진행될 수 있으며 필요한 경우 연속적으로 며칠 동안 진행될 수 있습니다.
- 바늘 끝에 비스듬한 실리콘 튜브가 고정된 10mL 주사기를 사용하여 생쥐 알갱이로 만든 페이스트를 주기적으로 물로 빻아 동물에게 먹이를 줍니다.
- 이미징 세션이 끝나면 녹화를 종료합니다.
- EEG 리드를 부드럽게 제거하고 Tergazyme으로 청소하십시오.
- 입구의 z축을 따라 섬유를 뒤집어 동물의 뇌에서 광섬유 다발을 천천히 제거합니다.
- 머리 기둥과 신체 구속 장치에서 동물을 풀어줍니다.
- 적절한 경우 필요한 안락사 및 조직 처리 프로토콜을 따라 혈관을 시각화하고 면역조직화학을 수행합니다.
- 향후 세션에서 동일한 동물의 사진을 촬영할 계획이라면 이미징 창을 뼈 왁스 또는 실라스틱으로 덮으십시오.
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Representative Results
우리는 발작의 결과로 발생하는 해마의 비정상적인 세포 주위 모세혈관 혈관 경련이 ictal 초점 9,13에서 세포 사멸에 기여하는 솔직한 저산소증을 유발할 수 있는지 여부를 평가하기 위해 이러한 방법을 개발했습니다.
헤드 캡의 개발과 적절한 설치는 기록에 높은 안정성을 제공하여 ictal 및 interictal 기간 동안 야생형 및 간질성 각성 마우스의 해마 깊숙한 곳에서 EEG와 혈류를 동시에 기록할 수 있도록 했습니다. 발작과 관련된 혈류 사건을 포착하려면 장기간 기록해야 하므로 비주기적 혈류 사건(예: 혈관 경련)이 유도된 간질 발작과 자연적으로 발생하는 간질 발작 모두에 반응하여 포착될 수 있습니다. 구속 시스템은 장시간 동안 뇌심부 미세혈관과 근위 벽화 세포의 안정적인 혈류 기록을 가능하게 했습니다(그림 6A-R). 우리는 전체 미세혈관에서 혈류 정지가 라벨링된 벽화 세포의 위치에서 발생한다는 것을 발견했습니다.
우리는 표준 입체 아틀라스의 내부 좌표를 목표로 하는 로봇 입체 장치를 사용하여 해마에서 혈관을 안정적으로 찾았습니다. 우리는 이광자 이미징이 도달할 수 있는 깊이에서 피질 조직의 혈류 및 동등한 혈관 경련에 대한 고해상도 이광자 이미징 기록과 비교하여 광섬유 기록의 품질을 검증했습니다(그림 6S-AA). 또한 기록 부위에서 면역조직화학을 사용하여 pCLE 결과를 검증하여 기존 컨포칼 현미경으로 해마 벽화 세포가 정확하게 표적화되었으며 수축할 뿐만 아니라 세동맥에서 멀리 떨어진 미세혈관의 협착과 공간적으로 연관되어 있음을 보여주었습니다15 (그림 7).
이러한 방법으로 발표 된 결과는 실제로 발작에 의해 유발되는 비정상적인 해마 모세 혈관 경련뿐만 아니라 Kv1.1 간질 돌연변이 마우스와 카이네이트 모델 간질 마우스 9,13에서 상관 세포 사멸을 보여줍니다. 이러한 결과는 비정상적인 혈관 경련으로 인한 발작 중 세포 사멸에서 국소 허혈/저산소증의 역할을 나타내며 ictal 세포 사멸의 잠재적 메커니즘을 확장하는 연구의 성장에 기여합니다.
그림 1: 실험 설계의 개략도.우리는 깨어 있는 간질 마우스와 WT littermates의 해마 모세혈관에서 컨포칼 현미경을 수행하면서 EEG를 기록했습니다. 꼬리 정맥에 플루오레세인을 주입한 후, 뇌 깊숙한 곳의 모세혈관 혈류 역학을 기록하기 위해 팁 직경이 0.3mm인 섬유 대물렌즈와 함께 새로운 전임상 컨포칼 레이저 스캐닝 내현미경(pCLE)을 사용했습니다. 노란색은 혈류량 증가를 나타내고 빨간색은 혈류가 일정하거나 감소했음을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 헤드 캡 이식 수술을 위한 프로토콜. A) 마취된 동물을 가열 패드 위에 놓고 입체 프레임 (그림 3B, 항목 j 참조) 내에 위치시키고 마우스 이어 바 (그림 3A, 항목 i) 및 턱 홀더 커프 (그림 3A, 항목 g, h)로 가열 패드 위에 고정시켰다. B) 두개골 봉합사의 노출. C-D)를 사용합니다. 브레그마(Bregma)와 람다(Lambda)의 측정. E) 동물의 두개골 위에 드릴링 위치를 시각화합니다. 검은색 점과 사각형은 pCLE 삽입을 허용하는 해마 위의 창을 나타냅니다. 두 개의 빨간색 원은 EEG 기록 와이어의 삽입 위치를 표시합니다. 흰색 점은 EEG 접지선의 삽입 지점을 표시합니다. F) 두개골에 있는 4개의 검은 점은 해마 위의 영상 창 개두술의 미래 모서리를 표시합니다. 정위 마이크로드라이브 포지셔너(그림 3A, 항목 d)에 부착된 헤드포스트 임플란트(그림 3A, 항목 a)가 있는 맞춤형 정렬 부품(그림 3A, 항목 c). G-H) 두 개의 추가 점, 즉 후방(G)과 전방(H)은 헤드캡 앵커 나사의 미래 위치를 표시합니다(그림 3A, 항목 b). I-J)를 선택합니다. 두 개의 작은 나사가 헤드 캡을 두개골에 고정합니다(그림 3A, 항목 b). K) 시아노아크릴레이트 및 치과용 시멘트가 패널 I & J.L)의 앵커 스크류에 도포되어 해마에 대한 이미징 창 개두술과 EEG 전극을 위한 3개의 구멍이 뚫려 있습니다. M) 이미징 챔버는 3개의 EEG 구멍과 이미징 창을 둘러싸기 위해 추가 치과용 시멘트로 둔덕을 조각하여 구축됩니다(그림 3B, 항목 i, m). N) 완성된 헤드 캡의 오버헤드 뷰. O) 이식 수술 후 회수된 마우스를 케이지에 다시 넣습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 프로토콜에 사용된 자료(소문자로 열거된 특정 항목). A) 헤드 캡을 만드는 데 사용되는 재료. (a) M1.6 x 12mm 기계 나사 2개(헤드포스트 임플란트). (비) 헤드 캡을 두개골에 고정하기 위한 두 개의 작은 볼트. (c) 수술 중 두 개의 M1.6 나사를 고정하는 4mm 간격의 두 개의 구멍이 있는 맞춤형 L자형 스테인리스 스틸 정렬 조각. (d) 입체 장치에 장착된 표준 마이크로드라이브는 항목 c를 고정합니다. (e) 항목 c의 두 구멍과 일치하는 (f) 정렬 조각이 있는 맞춤형 장착 바. (g) 바이트 바 및 (h) 동물의 머리 위치를 안정화하기 위한 코 클램프. B) 녹음 중 설정. (i) 헤드 캡은 마취 이식 수술 중에 항목 f에 고정됩니다. (j) 입체 프레임은 마이크로 드라이브(항목 d)를 배치합니다. (l) 21G 바늘이 마이크로드라이브(항목 d)에 부착되어 Bregma 및 Lambda 두개골 봉합사의 위치를 결정하는 데 사용됩니다. (m) 시뮬레이션된 헤드 캡이 항목 f에 부착되어 폼 라이닝 구속 튜브(마우스가 존재하지 않음)에서 마우스의 위치를 보여주기 위해 여기에 그려져 있습니다. 항목 n은 마우스 몸의 모양에 맞게 성형됩니다. C) 수술을 수행하는 데 필요한 기구 및 용품. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 녹화 세션 설정. A) 동물의 머리가 고정되어 있습니다. B) EEG 기록 와이어의 위치. 흰색 EEG 와이어는 두개골의 양쪽에 별도로 배치됩니다. 빨간색 EEG 와이어는 중간 바닥(접지) 구멍에 함께 배치됩니다. C) 광섬유 번들이 대상 창에 삽입됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: EEG 기록. A) 경막외 EEG 기록은 Physiotel F20-EET 송신기를 사용하여 깨어 있는 동물의 광섬유 pCLE 기록과 동시에 수행됩니다. B) EEG 기록용 리드를 삽입하기 위한 드릴 구멍의 위치. 두 개의 빨간색 리드는 빨간색 점으로 표시된 두 개의 구멍으로 이동합니다. 두 개의 흰색 리드가 흰색 점으로 표시된 구멍에 함께 삽입됩니다. 빨간색 사각형은 동물의 해마 위에 있는 대상 창을 나타냅니다. 쥐의 두개골에 있는 문자 'B'는 브레그마를 나타냅니다. C) EEG 기록 와이어는 두개골과 경막 사이의 전기적 접촉을 향상시키기 위해 L자 모양으로 구부러져 있습니다. D) 깨어 있는 쥐의 EEG 기록의 예. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 생쥐의 벽화 세포 혈관 수축 기록. A-R) 발작 중 깨어 있는 녹아웃 마우스에서 벽화 세포(빨간색, Alexa Fluor 647의 정맥 정맥 꼬리 주입을 통해 라벨링됨)에 공동 국소화된 모세관 혈관 경련(녹색의 혈관, 2MD 플루오레세인 접합 덱스트란으로 라벨링됨)의 생체 내 광섬유 이중 대역 pCLE 이미지(화살표는 벽화 세포 및 관련 혈관 경련을 나타냄). 비디오 1 및 비디오 2를 참조하십시오. S-W)를 선택합니다. 야생형 쥐의 모세관 혈관(녹색)과 벽화 세포(빨간색)의 생체 내 이광자 스캐닝 레이저 현미경(TPLSM) 스택. 동영상 3을 참조하십시오. X-Z)를 사용합니다. 카이닉 마우스의 벽화 세포 국소화(빨간색) 모세관 수축의 생체 내 TPLSM. 동영상 4를 참조하십시오. AA)를 사용합니다. 흰색 선에서 측정된 패널 X-Z의 혈관 수축 정량화. 패널 스케일 A-R = 5 μm; SW = 25 μm; X-Z= 5 μm입니다. 동영상은 11.7Hz로 녹화되었습니다. Leal-Campanario et al.8에서 발췌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 기록된 뇌의 면역조직화학. A-B)를 사용합니다. 플루오레세인 덱스트란(녹색)을 주입한 다양한 배율의 혈관. 파란색(흰색 화살표)의 DAPI 염색 세포핵. A= 200 μm의 스케일 바; B = 100 μm에 대한 눈금 막대. C) 플루오레세인을 주입한 뇌의 다른 부분에서 적혈구(빨간색 화살표)가 명확하게 보입니다. 눈금 막대 = 50μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
동영상 1: KO 해마 모세혈관에서 기록된 혈관경련 및 벽화 세포 혈류(11.7Hz). 그림 6AH에서 동일한 기록의 프레임을 참조하십시오. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
동영상 2: 혈관 경련, 백혈구 막힘, 혈류 및 벽화 세포는 WT 해마 모세관(11.7Hz)에 기록되었습니다. 그림 6I-R에서 동일한 기록의 프레임을 참조하십시오. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
동영상 3: TPLSM으로 기록된 생체 내 WT 마우스 두정엽 피질의 불균일한 혈류. 그림 6SW에서 동일한 기록의 프레임을 참조하십시오. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
동영상 4: TPLSM으로 기록된 카이닉 동물을 포획하는 두정엽 피질의 벽화 세포 구동(빨간색) 모세관(녹색) 수축. 동일한 레코딩의 프레임 그림 6X-Z를 참조하십시오. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
우리는 깨어 있는 쥐에서 전기생리학 및 광섬유 pCLE 실험을 동시에 수행할 수 있는 헤드 캡 구속 시스템을 개발하여 마취제로 인한 잠재적인 반응 오염을 줄였습니다. 헤드 캡과 장착 장치는 구성이 간단하며 만성 각성 행동 이미징 실험에 재사용할 수 있습니다. 생체 내 현미경 혈류 영상(TPLSM)의 황금 표준과 비교하여 기록의 품질을 확인했습니다.
여기에 설명된 프로토콜을 구현하려면 숙련된 수술 기술이 필요합니다. 수술은 무균 상태에서 항상 현미경을 사용하여 수행해야 하며, 해마 위에 창문을 뚫을 때는 경막이 손상되지 않도록 주의해야 합니다. 주요 혈관 위를 절단하면 원치 않는 출혈의 위험이 있으므로 기본 혈관에 대한 친숙함이 필수적입니다.
동물을 입체 정렬에 올바르게 배치하면 헤드 캡을 부착하기 전에 전방-후방 평면이 수평이 되도록 합니다. 이 보호 장치는 뇌 지도책의 도움으로 뇌 위치를 찾는 것을 용이하게 합니다.
마우스 움직임은 혈관 손상이나 혈관 경련의 잘못된 기록(즉, 실제 혈관 운동이 아닌 섬유 운동)을 초래할 수 있으므로 기록 중에 동물의 움직임을 줄이는 것이 중요합니다. 구속 튜브 내의 폼 패딩은 마우스의 스트레스와 움직임을 최소화하면서 녹음 세션의 지속 시간을 연장하는 데 도움이 됩니다. 생쥐는 폼 안에 꼭 맞는 것을 선호하므로 적절한 피팅은 과도한 움직임을 줄입니다. 이 예방 조치가 없으면 쥐가 어려움을 겪을 수 있습니다. 마우스가 몸부림치는 징후를 보이면 기록 세션을 종료해야 합니다. 생리적 스트레스 반응이 완화되면 다음 날 녹음을 재개할 수 있습니다. 우리가 녹음한 바에 따르면, 동물들은 대부분의 시간 동안 침착한 것이 분명했다.
pCLE 이미징 방법에 가장 부정적인 영향을 미치는 움직임은 프로브가 뇌 조직으로 차등적으로 이동할 때 발생합니다. 동물의 호흡, 발작 및 움직임은 조직과 관련하여 섬유 프로브를 대체하지 않는 한 관련이 없습니다. 즉, 이미징 프로브가 조직에 차등적으로 이동할 때 전체 이미징 필드가 하나의 단위로 이동하여 모션 아티팩트가 분명해집니다. 따라서 항상 한 번에 두 개 이상의 혈관에서 기록하는 것이 중요합니다: 모든 혈관이 동시에 움직이는 경우 섬유의 불안정성 때문일 수 있는 반면, 적어도 하나의 혈관이 변하지 않으면 다른 혈관에서 나타나는 변화는 혈관 경련을 포함한 혈류의 실제 변화로 인한 것일 수 있습니다.
TPLSM과 비교했을 때 pCLE 이미징 방법의 한 가지 한계는 광섬유 프로브가 피아에 구멍을 뚫어 뇌에 침범적이라는 것입니다. 프로브가 하강함에 따라 통과하는 신경 조직에 약간의 손상을 입힙니다. 따라서 이틀 연속으로 동일한 선박에서 녹음하는 것은 두 세션에서 동일한 정확한 좌표를 사용하는 경우에도 매우 어려울 수 있습니다(초기 녹음 세션의 지속 시간이 짧은 경우에만 가능한 경우가 많음). 따라서 만성 녹음 연구를 수행할 때 후속 녹음 세션에서 점점 더 깊은 깊이로 녹음하는 것이 중요합니다.
혈류 실험의 결과는 흥분독성이 ictal 세포 사멸과 해마 경화증에 대한 유일한 기계론적 경로가 아니라는 것을 시사한다13. 모세혈관 혈류 제한이 ictal 신경 퇴행에 중요한 역할을 한다는 발견은 임상 진단 목적을 위해 신체의 모든 깊이와 모든 조직에서 미세한 혈류 변화를 식별하기 위해 여기에 설명된 방법을 확장하기 위한 길을 열어줍니다.
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Disclosures
우리는 공개할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 프로젝트는 미국 간질 학회(American Epilepsy Society)의 연구 이니셔티브 상(Research Initiative Award)과 애리조나 생물의학 연구 위원회(Arizona Biomedical Research Commission)의 S.L.M. 상, SUNY 다운스테이트 보건 과학 대학(SUNY Downstate Health Sciences University)의 안과에 대한 실명 예방 연구(Research to Prevent Blindness Inc.)의 챌린지 보조금, 뉴욕주 엠파이어 혁신 프로그램(New York State Empire Innovation Program)의 자금 지원을 받았습니다. 미국 국립과학재단(National Science Foundation, 0726113, 0852636, & 1523614), 배로우 신경학 재단(Barrow Neurological Foundation), 마리안 로셸(Marian Rochelle), 그레이스 웰튼(Grace Welton), 디그니티 헬스 시드(Dignity Health SEED) 상, 국립과학재단(National Science Foundation, 0726113, 0852636, & 1523614) 및 국립보건원(National Institute of Health, R01EY031971 및 R01CA258021)의 연방 보조금, S.L.M 및 S.M.C.이 작업은 또한 국방부 보건 담당 차관보실의 지원을 받았습니다. W81XWH-15-1-0138, S.L.M. 에L.-C.는 스페인 교육부의 José Castillejo 펠로우십의 지원을 받았습니다. 기술적 조언과 도움을 주신 O. Caballero와 M. Ledo에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.7 mm diameter burr | Fine Science Tools | 19007-07 | For Screws No. 19010-00 |
| 0.9 mm diameter burr | Fine Science Tools | 19007-09 | |
| ASEPTICO AEU-12C TORQUE PLUS | from Handpiece solution | AEU12C | |
| Bull dog serrifine clump | Fine Science Tools | 18050-28 | |
| CellVizio dual band | Mauna Kea Technologies | ||
| CellVizio single band | Mauna Kea Technologies | ||
| Confocal Microprobe 300 microns (Serie S) | Mauna Kea Technologies | ||
| Custom-made alignment piece | L-shaped (angled at 90 deg) and made of stainless steel with two holes drilled on it, with a 4 mm separation from center to center | ||
| Custom-made mounting bar | The long section piece of the mounting bar should be between 9.4 - 13mm. Fixed to this piece of the mounting bar, position a stainless-steel plate 1.5 cm long and 0.5 cm wide that has two holes drilled separated 4 mm from center to center, the same distance that the L-shaped alignment piece. | ||
| Cyanoacrylate adhesive-Super Glue | |||
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| DuraLay Inlay Resin – Standard Package | Reliance Dental Mfg Co. | 602-7395 (from patterson dental) | |
| Fillister Head, Slotted Drive, M1.6x0.35 Metric Coarse, 12mm Length Under Head, Machine Screw | MSC industrial direct co. | 2834117 | |
| Fine Point scissor | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Fluorescein 5% w/w lysine-fixable dextran (2MD) | Invitrogen, USA | D7137 | |
| Halsey smooth needle holder | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| Kalt suture needle 3/8 curved | Fine Science Tools | 12050-03 | |
| lab standard stereotaxic, rat and mouse | Stoelting Co. 51704 | 51670 | |
| Methocel 2% | Omnivision GmbH | PZN: 04682367 | Eye ointment to prevent dryness. |
| Mouse Temperature controller, probe (YSI-451), small heating pad-TC-1000 Mouse | CWE Inc. | 08-13000 | |
| PhysioTel F20-EET transmitters | DSI | 270-0124-001 | |
| Robot Stereotaxic, Manipulator Arm, ADD-ON, 3 Axis, LEFT | Stoelting Co.C13 | 51704 | |
| Sel-Tapping bone screws | Fine Science Tools | 19010-10 | |
| Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse Stereotaxic | Stoelting Co | 51648 | |
| Suture Thread - Braided Silk/Size 4/0 | Fine Science Tools | 18020-40 | |
| Tissue separating microspatula | Fine Science Tools | 10091-121 |
References
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