Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

In Vivo Fiber-Coupled Pre-Clinical Confocal Laser-Scanning Endomicroscopy (pCLE) של נימי היפוקמפוס בעכברים ערים

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/57220
Automatic Translation
1,2, 2,3, 2,3
1División de Neurociencias, Universidad Pablo de Olavide, 2Barrow Neurological Institute, 3Ophthalmology, Neurology, and Physiology/Pharmacology, SUNY Downstate Medical Center

Summary

בעוד שדימות מולטיפוטונים יעיל רק בעומקים מוגבלים מפני השטח של הרקמה, ניתן להשיג הדמיה ברזולוציה של 3 מיקרומטר בכל עומק באמצעות pCLE. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לביצוע הדמיית pCLE למדידת דינמיקה מיקרו-וסקולרית בהיפוקמפוס של עכברי איקטל ועכברי בר.

Abstract

מטרת פרוטוקול זה היא לתאר אנדומיקרוסקופיה פרה-אופטית-צרורת לייזר פרה-קלינית מצומדת לייזר (pCLE) ביישום הספציפי שלה כדי להבהיר השפעות זרימת דם נימית במהלך התקפים, המונעים על ידי תאי קיר. הדמיות קליפת המוח In vitro ו-in vivo הראו כי התכווצויות נימיות המונעות על ידי פריציטים יכולות לנבוע מפעילות עצבית מקומית תפקודית, כמו גם מיישום תרופות, בבעלי חיים בריאים. כאן, מוצג פרוטוקול כיצד להשתמש ב- pCLE כדי לקבוע את התפקיד של דינמיקה מיקרו-וסקולרית בניוון עצבי באפילפסיה, בכל עומק רקמה (במיוחד בהיפוקמפוס). אנו מתארים טכניקת ריסון ראש שהותאמה לרישום pCLE בבעלי חיים ערים, כדי לטפל בתופעות לוואי אפשריות של חומרי הרדמה על הפעילות העצבית. באמצעות שיטות אלה, רישומים אלקטרופיזיולוגיים והדמיה יכולים להתבצע במשך מספר שעות במבנים עצביים עמוקים של המוח.

Introduction

בניגוד לשיטות הדמיה מיקרוסקופיות אחרות 1,2,3,4,5,6,7,8, מיקרוסקופ קונפוקלי מבוסס סיבים אופטיים in vivo מאפשר למדוד את דינמיקת זרימת הדם בכל אזור במוח, בכל עומק, במהירות גבוהה (עד 240 הרץ בהתאם לשדה הראייה9). גשושית סיב אופטי מאפשרת צילום סריקת לייזר קונפוקלית in vivo ברזולוציה של 3 מיקרומטר מכיוון שקצה הגשושית (מטרה ללא עדשה המורכבת מצרור של סיבים בודדים בקוטר 5000-6000 3 מיקרומטר) יכול להיות ממוקם בדיוק של מיקרואלקטרודה, בטווח של 15 מיקרומטר מהיעד הפלואורסצנטי המעניין. בדומה לדימות דו-פוטוני in vivo, פלואורופורים חייבים להיות מוכנסים קודם לכן למטרת ההדמיה. לדוגמה, דקסטרן פלואורסצאין (או נקודות קוונטיות) עשוי להיות מוזרק לתוך כלי הדם, או חלבונים פלואורסצנטיים מקודדים גנטית יכולים להיות מזוהמים לתוך תאים, או צבעים פלואורסצנטיים כגון אורגון ירוק BAPTA-1 יכול להיות טעון בתפזורת לתוך תאים, לפני הדמיה.

מחקר שנערך לאחרונה תוך שימוש בטכניקות אלה מצא כי פעילות מוטורית של תאי קיר המובילה לוואזוספזם נימי איקטלי – התכווצויות פתאומיות המתרחשות במיקום תאי הקיר במהלך התקפים 9 – יכולה לתרום לניוון עצבי בהיפוקמפוסהאיקטלי 9. בעוד שמחקרי הדמיה קודמים הראו התכווצויות פריציטים במבחנה ו-in vivo הקשורות ליישומים תרופתיים 6,7,10,11,12, Leal-Campanario et al. מצאו את העדות הראשונה להתכווצויות נימים ספונטניות in vivo במוח המוריני. כדי לבסס רלוונטיות לאפילפסיה של האונה הרקתית האנושית, הם חקרו עכברים זכרים (P30-40) נוקאאוט (KO) Kv1.1 (kcna1-null) 14,15 (JAX stock #003532), מודל גנטי של אטקסיה אפיזודית אנושית מסוג 115. פריציטים הניעו התכווצויות כלי דם פתולוגיות ופיזיולוגיות בהיפוקמפוס9 בבעלי חיים אפילפטיים ספונטניים ובחבריהם לפסולת מסוג בר (WT). תצפיות אלה שוכפלו בחיות WT שהפכו לאפילפטיות, עם חומצה קאינית, ובכך הצביעו על הכללתן לצורות אחרות של אפילפסיה. בנוסף, Leal-Campanario ועמיתיו קבעו, תוך שימוש בגישות מיקרוסקופיות סטריאולוגיות חדשניות, כי תאי עצב אפופטוטיים – אך לא בריאים – בבעלי חיים אפילפטיים מוצמדים מרחבית למיקרו-כלי הדם של ההיפוקמפוס. מכיוון שלאקסיטוטוקסיות אין קשר מרחבי ידוע לכלי הדם, תוצאה זו הצביעה על כך שהיפוקסיה לא תקינה של נימי וזאספמיה הנגרמת על ידי איסכמיה תורמת לניוון עצבי באפילפסיה. איור 1 מציג סכמה של ההגדרה הכללית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הפרוטוקול עוקב אחר הנחיות NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. כל ההליכים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המכון הנוירולוגי בארו.

1. מיקום סטריאוטקסי עבור craniotomy

  1. שקלו ולאחר מכן הרדימו את העכבר עם קוקטייל קטמין-קסילזין (100 מ"ג/ק"ג-10 מ"ג/ק"ג). ודא כי בעל החיים מורדם לחלוטין על ידי התבוננות בחוסר התגובה שלו לצביטת זנב ו / או בוהן.
  2. הניחו כרית חימום מתחת לעכבר והשתמשו במדחום רקטלי כדי לנטר ברציפות את טמפרטורת גופו במהלך ניתוח ההשתלה הראשוני בהרדמה (איור 2A).
  3. יש למרוח משחה אופתלמית למניעת יובש בעיניים.
  4. לייצב את ראש החיה במסגרת סטריאוטקסית מכרסם, מצויד מתאם עכבר. כדי לכוון נכון את העכבר במסגרת הסטריאוטקסית, מקמו את שיני החיה בתוך החור של מוט הנשיכה (איור 2A ואיור 3A, פריט g). הדקו את מהדק האף עד שהוא צמוד (איור 2A,B ואיור 3A, פריט h). מיקום הגוף של העכבר צריך להיות ישר ככל האפשר (כמו באיור 2A).
    1. אבטחו עוד יותר את ראשה של החיה באמצעות מוטות אוזניים של עכבר עם אזיקי מחזיק לסת (איור 2A ואיור 3A, פריט i), כדי להדק היטב את התהליכים הזיגומטיים של הגולגולת.
      הערה: לאחר האבטחה, לראש העכבר לא אמור להיות טווח תנועה אופקי.
  5. לאחר התאמת העכבר למסגרת הסטריאוטקסית (איור 3B, פריט j), נקו ועיקרו את הקרקפת על-ידי ניגוב עם פילינג כלור-הקסדין 2-3 פעמים, בכל פעם ולאחר מכן שטיפת אלכוהול. לאחר מכן, יש למרוח לידוקאין מקומי על גבי הראש.
  6. בצע חתך לאורך קו האמצע מהאחורי לקדמי (התחל חתך בבסיס הגולגולת והשלם אותו בין העיניים; 12-15 מ"מ) לאורך קו האמצע של הגולגולת, באמצעות מספריים עדינים או להב. הסירו את גבולות הקרקפת בעזרת ארבעה מהדקי בולדוג בקוטר 28 מ"מ כדי לחשוף את הגולגולת ולמקסם את אזור העבודה (איור 2B ואיור 3C).
  7. השתמשו באזמל או במיקרו-מרית (איור 3C) כדי לגרד את הפריאוסטאום עד לקצוות החתך. השתמשו במספריים או במלקחיים להפרדת רקמות (איור 3C) כדי למשוך בזהירות את השרירים בחלק האחורי של הצוואר (איור 2B).
  8. יבש את החלק העליון של הגולגולת עם מוליך כותנה, רטוב עם אלכוהול או 30% מי חמצן, כדי לייעל הדמיה של תפרים גולגולתיים. יש למרוח מי מלח על הגולגולת לאחר הסרת רקמת החיבור.
  9. לאחר שראש העכבר מיוצב במנגנון הסטריאוטקסי, הניחו קצה מחט מזרק (21 גרם) במחזיק האלקטרודות (איור 3B, פריט l), וחברו את מחזיק האלקטרודה למיקרומניפולטור הסטריאוטקסי, תוך הורדת קצה המחט לגובה הגולגולת (איור 2D).
  10. התאימו את הכיוון האמצעי-צדדי של הגולגולת על-ידי מדידת גובה הגולגולת בכל מרחק אחורי לברגמה (כלומר, -2.0 מ"מ), ושני מרחקים שווים לרוחב מקו האמצע משני צדי הגולגולת (כלומר, ± 1.5 מ"מ) (איור 2D). יש לכוון להפרש גובה בין מיקומים שהוא פחות מ-0.05 מ"מ בכיוון הגב-גחוני.
    1. אם גודלה עולה על 0.05 מ"מ, סובב את גולגולת העכבר באמצעות מוט הנשיכה, או מקם מחדש את ראש העכבר על-ידי שחרור מוטות האוזניים בזהירות, הזזה רוחבית של הראש ומוטות האוזניים לפי הצורך, ולאחר מכן הידוק מחדש של מוטות האוזנייה.
  11. לאחר מיקום הגולגולת במכשיר הסטריאוטקסי, קבע ורשום את הקואורדינטות הסטריאוטקטיות של תפרי הגולגולת ברגמה ולמבדה לאורך הצירים הקדמיים (AP), המדיאלי לטרלי (ML) והגחוני הגבי (DV).
  12. זהה את נקודת המטרה (היפוקמפוס ימני) בעזרת אטלס סטריאוטקסי. לאחר מכן, מצאו על הגולגולת את הקואורדינטות של נקודת המטרה ביחס לברגמה (AP: -2.7 מ"מ, ML: -2.7 מ"מ) (איור 2E).
  13. באמצעות סמן ניתוחי, סמנו ארבע פינות של חלון הדמיה בגודל 1.4 מ"מ x 2 מ"מ על הגולגולת בנקודות, שמרכזו סביב נקודת המטרה ישירות מעל ההיפוקמפוס (איור 2F), עבור קרניוטומיה עוקבת.
  14. השתמשו בסמן הניתוחי כדי לצייר שתי נקודות נוספות: אחת מעל העצם הקודקודית השמאלית העליונה (איור 2G) והשנייה מעל העצם הקדמית הימנית (איור 2H), כדי לציין את המיקום העתידי של שני ברגי עצם (איור 3A, פריט b) שיעגנו את כובע הראש (איור 3B, פריט m) לגולגולת.
  15. השתמשו בסמן הניתוחי כדי לצייר שלוש נקודות נוספות המציינות היכן יוחדרו אלקטרודות רישום EEG אפידורליות: נקודה אחת ממוקמת 1 מ"מ משני צדי קו האמצע, ונקודה נוספת על קו האמצע ממוקמת 1 מ"מ מאחורי למדא (איור 2E, איור 4A ואיור 5B).

2. התקנת כובע ראש

  1. בעזרת בור בקוטר 0.7 מ"מ (איור 3C), קדח בזהירות שני חורים קטנים בגולגולת, במיקומי הנקודות המציינים את מיקום ברגי העצם (ראה שלב 1.15 לעיל). לאחר מכן, קחו שני ברגי עצם (חריצי נירוסטה, אורך: 4 מ"מ; קוטר: 0.85 מ"מ) שעברו חיטוי קודם לכן באתנול 70-80%, והבריגו אותם לגולגולת ליציבות נוספת של כובע הראש (איור 2I-J ואיור 3A, פריט b).
    1. ודא כי קצות הבורג אינם בולטים מעבר לתחתית העצם לתוך חלל הגולגולת, תוך סיכון נזק למוח. שימו לב שאחד משני ברגי העצם יהיה קדמי לשני ברגי כובע הראש, והשני אחורי אליהם (איור 2G-J).
  2. יש להשפריץ מי מלח על הגולגולת כדי לקרר אותה ולנקות אותה. לאחר מכן יבש את הגולגולת לחלוטין ולהחיל שכבה דקה של cyanoacrylate סביב ברגים.
  3. השתמשו בפיסת יישור מותאמת אישית (איור 3A, פריט c) המוצמדת למיקרו-כונן המורכב על המכשיר הסטריאוטקסי (איור 2F-J ואיור 3A, פריט d), כך שמיקום כובע הראש מיושר לאורך קו האמצע, כאשר הרכס הקדמי נמצא מעל ברגמה. פיסת פלדת אל-חלד מותאמת אישית זו היא בצורת L (זוויתית ב-90°), עם שני חורים המופרדים על-ידי 4 מ"מ (איור 2F-J ואיור 3A, פריט c).
    1. השתמש במניפולטור הסטריאוטקסי כדי למקם את חתיכת היישור בצורת L, עם שני ברגי כונן מחורצים של ראש פיליסטר מחוברים (M1.6 x 0.35 גס מטרי, אורך 12 מ"מ; איור 3A, פריט a) מעל הברגמה, עד שבסיס הברגים מונח שטוח על הגולגולת, תוך זהירות שלא להפעיל לחץ על הגולגולת (איור 2I-J).
  4. מרחו ציאנואקרילט ואחריו צמנט דנטלי כדי לחבר את בסיס הברגים לגולגולת. היזהרו לא לחסום את סימני הייחוס של חלון ההדמיה מעל ההיפוקמפוס (איור 2K).

3. ניתוח קרניוטומיה של חלון הדמיה

  1. בכל אחד מהמיקומים של סימני הייחוס של הקרניוטומיה המציינים את פינות חלון ההדמיה (ראה שלב 1.14 לעיל), קדח חור בור בקוטר 0.7 מ"מ, ולאחר מכן תיחם בעדינות את הפריפריה של חלון קרניוטומיה בגודל 1.4 מ"מ x 2 מ"מ עם המקדחה, עם חתכים איטרטיביים עמוקים יותר (איור 2L).
  2. היזהר לא לקדוח עמוק מדי או עם כוח רב מדי על הגולגולת, שהיא דקה ושברירית, בעלת עובי של כ 300 מיקרומטר. לאחר השלמת דש העצם, חטטו את הדש הרופף עם קצה אזמל, תוך זהירות לא לפגוע בדורה מאטר שמתחתיו.
  3. כסו את החלון הפתוח בשעוות עצם (איור 2M).
  4. באמצעות בור בקוטר 0.9 מ"מ, קדחו שלושה חורים למיקום עתידי של אלקטרודות ה-EEG האפידורליות (ראו שלב 1.15 לעיל) תוך הקפדה לא לחתוך דרך הדורה מאטר (איור 2E,L).
  5. מכסים את שלושת החורים בשעוות עצם.
  6. מרחו בעדינות ציאנואקרילט סביב הקצוות של חלון הדימות המכוסה בשעוות עצם וחורי EEG, ונזהרו לא לאטום את הקרניוטומיות (איור 2L).
  7. בנו קיר של מלט דנטלי שמקיף את חלון ההדמיה ואת חורי ה-EEG וקושר אותו לכובע הראש הצמנטי שהיה קודם לכן (איור 2M ואיור 3B, פריט m).
  8. תנו למלט להתייבש לפחות 10 דקות.
  9. סגרו את שולי הפצע הרופפים בעזרת תפרים פשוטים וקטועים, באמצעות משי קלוע שחור 4-0 או 5-0 (איור 2N ואיור 3C).

4. לאחר הניתוח

  1. השתמשו באפליקטור עם קצוות צמר גפן כדי למרוח משחת לידוקאין סביב העור החשוף כדי להקהות את התחושה סביב קצה הפצע.
  2. השתמש אפליקטור כותנה סטרילי כדי להחיל Neosporin על העור החשוף.
  3. הוציאו את החיה מהמסגרת הסטריאוטקסית (איור 2N).
  4. הזריק ketoprofen (5 מ"ג / ק"ג) IP או IM עבור שיכוך כאבים לאחר הניתוח.
  5. התבונן בחיה עד שהיא ערנית ונעה (זה יקרה בדרך כלל תוך דקות).
  6. הניחו את בעל החיים בכלוב חם והמשיכו לעקוב אחר החלמתו עד שהוא שותה או אוכל ומוכן להעברה למגורי בעלי חיים.
  7. בדקו את בעל החיים לפחות פעם ביום במשך כשבוע לאחר הניתוח, ושימו לב לסימנים של התנהגות חסרת שינה ו/או אכילה/שתייה לא מספקת (איור 2O).

5. הזרקת צבע והקלטת EEG

  1. המתן לפחות יום אחד לאחר ניתוח השתלת פיקת הראש כדי להתחיל את ההקלטות.
  2. הניחו את העכבר במכשיר מרסן קצף המעוצב לגופו, בתוך המסגרת הסטריאוטקסית (איור 3B, פריטים n ו-j).
  3. הדקו את מכסה הראש (איור 3 B-I, פריט m) למוט הרכבה מותאם אישית המחובר למסגרת הסטריאוטקסית (איור 3A,B, פריטים e ו-j ואיור 4A). החלק הארוך של פריט e (איור 3A,B) צריך להיות באורך שבין 9.4 – 13 מ"מ. תקן את פריט f (לוח הרכבה במידות 1.5 ס"מ x 0.5 ס"מ, עם שני חורים מופרדים 4 מ"מ מהמרכז למרכז) לפריט e (איור 3A,B, פריטים e, f ו-k). מערכת היישור הזו תמקם את העכבר הער בבטחה למסגרת הסטריאוטקסית לאורך כל מפגשי ההדמיה (איור 4).
  4. הכניסו את אלקטרודות רישום ה-EEG האפידורליות (איור 5A), ומקמו את אלקטרודות הארקה (חוטים לבנים) בתוך החור המרכזי האחורי, ואת אלקטרודות ההקלטה (חוטים אדומים) בתוך החורים הקדמיים השמאלי והימני (איור 2E, איור 4E ואיור 5E). מקמו כל אחד מהחוטים בצורת L בין הגולגולת לדורה מאטר (איור 5C) כדי למטב את המגע החשמלי.
  5. הזריקו לווריד הזנב דקסטרן ירוק הניתן לקיבוע ליזין פלואורסצאין (0.2 מ"ל/25 גרם גוף wt. של פלואורסצאין 5% w/w), כדי להמחיש את זרימת הדם בתוך ההיפוקמפוס.
    1. כדי לשפר את התרחבות הווריד המרכזי של זנב העכבר לפני ההזרקה, השתמש באחת או יותר מהאסטרטגיות הבאות: א) להחיל 70% אתנול על הווריד המרכזי באמצעות מוליך כותנה; ב) טובלים את הזנב במים חמים (35-40 מעלות צלזיוס) למשך 1-3 דקות; ג) חשוף את הזנב למנורת חימום למשך מספר דקות.
    2. אבטחו את זנב העכבר בשתי אצבעות ואתרו את הווריד המרכזי, שנמצא ממש מתחת לעור. הכנס את המחט (מזרק אינסולין דק במיוחד עם מחט משולבת 30G), כאשר השיפוע למעלה, לתוך הווריד, בערך באמצע הדרך לשני שלישים מבסיס הזנב. שמור את המחט מקבילה לזנב במהלך ההזרקה.
    3. להזריק את הצבע לאט ובהתמדה, תוך הקפדה על כל שינוי במיקום המחט או הזנב.
      הערה: לא אמורה להיות התנגדות בעת לחיצה על בוכנה מזרק.
    4. לאחר השלמת ההזרקה, למשוך את המחט ולהפעיל לחץ עדין על אתר הנקב כדי לאטום את כלי הדם.
    5. אפשר לקרישת דם.

6. In vivo סיבים אופטיים-צרור פרה-קליני קונפוקלי לייזר סריקה אנדומיקרוסקופיה (pCLE)

  1. מיד לאחר הזרקת וריד הזנב (שלב 5.5.3 לעיל), הדקו את צרור הסיבים האופטיים המשופעים בגודל 300 מיקרומטר (המכיל 5000–7000 סיבי 3 מיקרומטר בכל צרור) בכיוון כלפי מטה לזרוע הניידת של הכונן הסטריאוטקסי הרובוטי.
  2. הסר את שעוות העצם מן craniotomy.
  3. הסר את הדורה, באמצעות קצה כפוף של מחט מזרק.
  4. באמצעות מערכת המיקום הרובוטית, ראשית הזיזו את מטרת הסיב למיקום הסטריאוטקסי הקדמי-אחורי והשמאלי-ימני המתאים, כאשר הקצה מאופס בציר z על פני קליפת המוח.
  5. התחל את רישום ה-EEG (איור 5D).
  6. התחילו סריקת לייזר קונפוקלית של המישור האחורי של עצם הסיב, ולאחר מכן ירדו ישירות מהמטרה באיטיות בציר z באמצעות פקדי z של המיקרו-כונן הרובוטי, עד שהיא מגיעה לעומק המטרה במוח (איור 4C). הצג את תוצאות ההדמיה בתוכנה המיקרוסקופית בזמן ירידה.
    1. אם קצה הסיב נמצא באזור ההקלטה X-Y-Z של המטרה, ושני כלי שיט או יותר נכנסים ל-FOV של חלון ההדמיה, עצרו את הירידה והתחילו הקלטות וידאו. קבל סרטים חיים בהילוך מלא של זרימת הדם ב- 11.7 הרץ באמצעות תוכנת ההדמיה של Cellvizio Lab. (מהירויות גבוהות יותר ניתן להשיג עם FOV קטן יותר). ההקלטות עשויות להתקיים במשך 4-5 שעות בכל פעם, בימים רצופים במידת הצורך.
  7. באמצעות מזרק 10 מ"ל עם צינור סיליקון משופע המקובע לקצה המחט, להאכיל את החיה במהלך ההקלטות על ידי מתן מעת לעת הדבק שנעשה עם כדוריות עכברים טחון עם מים.
  8. בתום פגישת ההדמיה, סיים את ההקלטות.
  9. הסר בעדינות את מוליכי ה- EEG ונקה אותם עם Tergazyme.
  10. הסר באיטיות את צרור הסיב האופטי ממוחו של בעל החיים על ידי היפוך הסיב לאורך ציר הכניסה Z.
  11. שחררו את בעל החיים מעמוד הראש וממעצורי הגוף.
  12. במידת הצורך, בצע את המתת החסד הדרושה ופרוטוקולים לעיבוד רקמות כדי לדמיין כלי דם ולבצע אימונוהיסטוכימיה.
  13. אם אתם מתכננים להקליט מאותה חיה בפגישה עתידית, כסו את חלון ההדמיה בשעוות עצם או בסילסטיק.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פיתחנו שיטות אלה כדי להעריך אם נימי וזאספזמים חריגים המונעים על ידי פריציטים בהיפוקמפוס – המתרחשים כתוצאה מהתקפים – עלולים לגרום להיפוקסיה גלויה התורמת למוות תאי במוקד האיקטלי 9,13.

פיתוח כובע הראש והתקנתו הנכונה העניקו יציבות גבוהה בהקלטות, ואפשרו רישום סימולטני של EEG וזרימת דם בעומק ההיפוקמפוס של עכברי ער פראיים ואפילפטיים הן בתקופות האיקטליות והן בתקופות הביניים. לכידת אירועי זרימת דם הקשורים להתקפים דורשת רישום לפרקי זמן ממושכים, כך שניתן יהיה ללכוד אירועי זרימת דם מחזוריים (כגון וזוספאזם) בתגובה להתקפים אפילפטיים המושרים וטבעיים כאחד. מערכת הריסון אפשרה רישומי זרימת דם יציבים של כלי הדם העמוקים במוח ותאי הקיר הפרוקסימליים שלהם במשך שעות ארוכות (איור 6A-R). מצאנו שבמיקרו-כלי דם שלמים התרחשו הפסקות זרימת דם במיקומים של תאי ציור קיר מסומנים.

איתרנו באופן אמין כלי שיט בהיפוקמפוס באמצעות מכשיר סטריאוטקסי רובוטי הממוקד בקואורדינטות פנימיות מאטלס סטריאוטקסי סטנדרטי. אימתנו את האיכות של רישומי הסיבים על-ידי השוואתם לרישומי הדמיה ברזולוציה גבוהה של שני פוטונים של זרימת הדם וכלי דם מקבילים מרקמת קליפת המוח, בעומקים שדימות של שני פוטונים יכול להגיע אליהם (איור 6S-AA). בנוסף, אימתנו את תוצאות ה-pCLE באמצעות אימונוהיסטוכימיה באתרי הקלטה, כדי להראות במיקרוסקופ קונפוקלי מסורתי שתאי ציור קיר בהיפוקמפוס כוונו כראוי ושהם לא רק מכווצים אלא גם קשורים מרחבית להיצרות בכלי דם זעירים הרחוקים מעורקים15 (איור 7).

הממצאים שפורסמו בשיטות אלה אכן מראים וזוספזמות נימיות לא תקינות בהיפוקמפוס המונעות על ידי התקפים, כמו גם מוות תאי מתואם בעכברים מוטנטיים אפילפטיים Kv1.1 ובעכברים אפילפטיים מודל קינאט 9,13. תוצאות אלה מצביעות על תפקיד של איסכמיה איקטלית מקומית / היפוקסיה במוות תאי במהלך התקפים, עקב vasospasms חריג, ותורמות לגוף הולך וגדל של עבודה המרחיבה את המנגנונים הפוטנציאליים של מוות תאי ictal.

Figure 1
איור 1: ייצוג סכמטי של תכנון הניסוי. רשמנו EEG תוך כדי ביצוע מיקרוסקופ קונפוקלי בנימי ההיפוקמפוס של עכברים אפילפטיים ערים ושל חברי המלטה WT. לאחר הזרקת פלואורסצאין לווריד הזנב, השתמשנו באנדומיקרוסקופיה פרה-קלינית פרה-קלינית לסריקת לייזר קונפוקלית (pCLE), עם סיב-אובייקטיבי בקוטר קצה של 0.3 מ"מ כדי לתעד דינמיקה של זרימת דם נימית עמוק במוח. צהוב מציין זרימת דם מוגברת, ואדום מציין זרימה יציבה או מופחתת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: פרוטוקול לניתוח השתלת כובע ראש. A) בעל החיים המורדם הונח על כרית חימום והוצב בתוך המסגרת הסטריאוטקסית (ראה איור 3B, פריט j) ואובטח באמצעות מוטות אוזניים של עכבר (איור 3A, פריט i) ואזיקים מחזיקי לסת (איור 3A, פריטים g,h), מעל כרית חימום. ב) חשיפת התפרים הגולגולתיים. ג-ד) מדידות של ברגמה ולמבדה. ה) הדמיה של מיקומי קידוח מעל גולגולת החיה. הנקודות השחורות והריבוע מציינים את החלון מעל ההיפוקמפוס שיאפשר את החדרת ה-pCLE. שני העיגולים האדומים מסמנים את מיקומי ההכנסה של חוטי ההקלטה של EEG. הנקודה הלבנה מסמנת את נקודת הכניסה של חוטי הארקה של EEG. F) ארבע הנקודות השחורות על הגולגולת מסמנות את הפינות העתידיות של חלון ההדמיה קרניוטומיה מעל ההיפוקמפוס. פיסת היישור המותאמת אישית (איור 3A, פריט c), עם שתלי עמוד הראש (איור 3A, פריט a) המחוברים למיקום המיקרו-כונן הסטריאוטקטי (איור 3A, פריט d). ז-ה) שתי נקודות נוספות, אחת אחורית (G) ואחת קדמית (H) מסמנות את המיקום העתידי של ברגי עיגון כובע ראש (איור 3A, פריט b). ט-י) שני ברגים קטנים מעגנים את מכסה הראש לגולגולת (איור 3A, פריט b). K) ציאנואקרילט וצמנט דנטלי מיושמים על ברגי העוגן מלוחות I & J. L) נקדחו קרניוטומיית חלון ההדמיה מעל ההיפוקמפוס, ושלושת החורים לאלקטרודות EEG. M) תא ההדמיה נבנה (איור 3B, פריטים i, m) על-ידי פיסול סולם עם מלט דנטלי נוסף כדי להקיף את שלושת חורי ה-EEG ואת חלון ההדמיה. N) מבט מלמעלה על מכסה הראש המוגמר. O) העכבר התאושש בחזרה בכלוב לאחר ניתוח ההשתלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: חומרים ששימשו בפרוטוקול (פריטים ספציפיים המנויים באותיות קטנות). א) חומרים המשמשים לבניית כובע הראש. (א) שני ברגי מכונה M1.6 x 12 מ"מ (שתלי עמוד הראש). (ב) שני ברגים קטנים כדי לאבטח את כובע הראש לגולגולת. (ג) חתיכת יישור נירוסטה מותאמת אישית בצורת L, עם שני חורים במרחק של 4 מ"מ זה מזה, המאבטח את שני ברגי M1.6 במהלך הניתוח. (ד) מיקרו-כונן סטנדרטי המותקן על התקן סטריאוטקסי מכיל פריט ג. (ה) מוט הרכבה מותאם אישית עם (ו) פיסת יישור המתאימה לשני החורים מפריט ג. (ז) מוט נשיכה ו-(ח) מהדק אף לייצוב מיקום ראשו של בעל החיים. ב) הגדרה במהלך ההקלטות. (i) כובע הראש מאובטח לפריט f במהלך ניתוח ההשתלה המורדמת. (י) מסגרת סטריאוטקסית ממקמת את המיקרו-כונן (פריט d). (יב) מחט 21G מחוברת למיקרו-דרייב (פריט d) ומשמשת לקביעת מיקומם של התפרים הגולגולתיים Bregma ו-Lambda. (יג) בתמונה מצולם כובע ראש מדומה, המצורף לפריט f, כדי להדגים את מיקום העכבר ב-(n) צינור הריסון מרופד הקצף (העכבר אינו נוכח). פריט n מעצב את עצמו לצורת גוף העכבר. ג) מכשירים וציוד הדרושים לביצוע הניתוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: הגדרת הפעלת הקלטה. א) ראשו של בעל החיים קבוע. ב) מיקום חוטי ההקלטה של EEG. חוטי EEG לבנים ממוקמים בנפרד, בכל צד של הגולגולת. חוטי EEG אדומים ממוקמים יחד בחור האמצעי-תחתון (הקרקע). ג) חבילת הסיב האופטי מוכנסת לחלון היעד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: רישומי EEG. א) רישומי EEG אפידורליים מבוצעים באמצעות משדרי Physiotel F20-EET, במקביל לרישומי הסיבים האופטיים pCLE בחיה הערה. ב) מיקום החורים שנקדחו להחדרת הלידים לרישומי EEG. שני המוליכים האדומים הולכים לשני החורים המסומנים בנקודות אדומות. שני העופרים הלבנים מוכנסים יחד לחור המסומן על ידי הנקודה הלבנה. הריבוע האדום מציין את חלון המטרה מעל ההיפוקמפוס של החיה. האות 'B' על גולגולת העכבר מציינת את הברגמה. C) חוטי הרישום של EEG מכופפים בצורת L כדי להגביר את המגע החשמלי בין הגולגולת לחומר הדורה. ד) דוגמאות לרישומי EEG בעכברים ערים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: הקלטות של התכווצויות כלי דם של תאי ציור קיר בעכברים. א-ר) תמונת pCLE דו-פסית בסיב אופטי In vivo של וזוספאזם נימי (כלי דם בירוק, מסומן בדאקסטרן מצומד פלואורסצאין 2MD) מקומי לתאי קיר (אדום, מסומן באמצעות הזרקת זנב ורידי תוך ורידי של Alexa Fluor 647) בעכברי נוקאאוט ערים במהלך התקף (חץ מציין תא קיר וכלי דם הקשורים אליו). ראה סרטון 1 וסרטון 2. ס-ו) In vivo מיקרוסקופ לייזר סורק שני פוטונים (TPLSM) ערימה של כלי דם נימים (ירוק) ותאי קיר (אדום) של עכבר מסוג פראי. צפה בסרטון 3. X-Z) In vivo TPLSM של התכווצות נימים מקומית (אדומה) של עכברים קאיניים. צפה בסרטון 4. א.א.) כימות התכווצות כלי השיט מלוחות X-Z נמדד בקו לבן. סולמות עבור לוחות A-R = 5 מיקרומטר; S-W = 25 מיקרומטר; X-Z= 5 מיקרומטר. הסרטונים הוקלטו בקצב של 11.7 הרץ. מאת Leal-Campanario et al.8. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: אימונוהיסטוכימיה של המוח המתועד. א-ב) כלי בהגדלות שונות מוזרק עם דקסטרן פלואורסצאין (ירוק). גרעיני תאים מוכתמים ב-DAPI בכחול (חיצים לבנים). סרגל קנה מידה עבור A = 200 מיקרומטר; סרגל קנה מידה עבור B = 100 מיקרומטר. C) אזור אחר במוח המוזרק עם פלואורסצאין שבו תא דם אדום (חץ אדום) נראה בבירור. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

סרטון 1: Vasospasm וזרימת הדם של תאי ציור תועדה (11.7 הרץ) בנימי היפוקמפוס KO. ראו פריימים מאותה הקלטה באיור 6A-H. אנא לחץ כאן להורדת סרטון זה.

סרטון 2: Vasospasm, חסימות לויקוציטים, זרימת דם ותאי קיר נרשם נימי היפוקמפוס WT (11.7 הרץ). ראו פריימים מאותה הקלטה באיור 6I-R. אנא לחץ כאן להורדת סרטון זה.

סרטון 3: זרימת דם לא אחידה בקליפת המוח הקודקודית של עכבר in vivo WT נרשמה עם TPLSM. ראו פריימים מאותה הקלטה באיור 6S-W. אנא לחץ כאן להורדת סרטון זה.

סרטון 4: התכווצות נימי (אדום) (ירוק) מקליפת המוח הקודקודית של תפיסת חיה קאינית שנרשמה עם TPLSM. ראו פריימים מאותה הקלטה איור 6X-Z. אנא לחץ כאן להורדת סרטון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פיתחנו מערכת ריסון כובע ראש לניסויים אלקטרופיזיולוגיים וסיבים אופטיים בו-זמנית בעכברים ערים, ובכך הפחיתנו זיהום פוטנציאלי בתגובה כתוצאה מתרופות הרדמה. מכסה הראש ומנגנון ההרכבה פשוטים להרכבה וניתנים לשימוש חוזר בניסויי הדמיה כרוניים של התנהגות ערה. בדקנו את איכות הרישומים מול תקן הזהב להדמיית זרימת דם מיקרוסקופית in vivo, TPLSM.

מיומנויות כירורגיות מיומנות נחוצות כדי ליישם את הפרוטוקול שאנו מתארים כאן. הניתוח חייב להיעשות בתנאים אספטיים ותמיד תחת מיקרוסקופ ניתוח, תוך הקפדה להשאיר את הדורה מאטר שלם בעת קידוח החלון מעל ההיפוקמפוס. היכרות עם כלי הדם הבסיסיים היא חיונית, שכן חיתוך מעל כלי דם מרכזי יוצר סיכון לדימום לא רצוי.

מיקום נכון של בעל החיים ביישור סטריאוטקסי מבטיח שהמישור הקדמי-אחורי יהיה ישר לפני חיבור כובע הראש. הגנה זו מאפשרת איתור מוקדי מוח בעזרת אטלס מוח.

תנועת עכבר עלולה לגרום לנזק לכלי הדם או להקלטה שגויה של כלי הדם (כלומר, תנועת סיבים ולא תנועת כלי דם אמיתית), ולכן חשוב להפחית את תנועת בעלי החיים במהלך ההקלטות. ריפוד קצף בתוך צינור הריסון מסייע להאריך את משך ההקלטה תוך מזעור הלחץ והתנועה מהעכבר. עכברים מעדיפים להשתלב בנוחות בתוך הקצף, כך שהתאמה נכונה מפחיתה תנועה מוגזמת. ללא אמצעי זהירות זה, עכברים עלולים להיאבק. אם העכבר מראה סימני מאבק, יש להפסיק את הפעלת ההקלטה. ההקלטות עשויות להתחדש למחרת, לאחר שתגובות הלחץ הפיזיולוגיות שככו. בהקלטות שלנו, החיות היו כנראה רגועות רוב הזמן.

נציין כי התנועה המשפיעה באופן השלילי ביותר על שיטת ההדמיה pCLE מתרחשת כאשר הגשושית נעה באופן דיפרנציאלי לרקמת המוח. נשימה, התקפים ותנועה של בעל החיים אינם רלוונטיים אלא אם כן הם מחליפים את בדיקת הסיב ביחס לרקמה. כלומר, כאשר גשושית ההדמיה נעה באופן דיפרנציאלי לרקמה, כל שדה ההדמיה נע כיחידה אחת, מה שהופך את תוצרי התנועה לברורים. לכן, זה קריטי תמיד להקליט משני כלי דם או יותר בכל פעם: אם כל כלי הדם נעים בבת אחת, זה יכול להיות בגלל חוסר יציבות סיבים, ואילו אם לפחות כלי אחד לא משתנה, השינויים הנראים בכלי דם אחרים הם כנראה בשל שינויים בפועל בזרימת הדם, כולל vasospasms.

מגבלה אחת של שיטת הדמיה pCLE בהשוואה ל- TPLSM היא שבדיקת הסיב מנקבת את ה- PIA ולכן פולשנית למוח. כאשר הגשושית יורדת, היא גורמת נזק מסוים לרקמה העצבית שהיא עוברת דרכה. לפיכך, הקלטה מאותו כלי שיט במשך יומיים רצופים יכולה להיות קשה ביותר, גם כאשר משתמשים באותן קואורדינטות מדויקות בשני המפגשים (ולעתים קרובות אפשרית רק אם ההקלטה הראשונית נמשכת זמן קצר). לכן קריטי, בעת ביצוע מחקרי הקלטה כרוניים, להקליט בעומקים הולכים וגדלים בהקלטות הבאות.

תוצאות ניסויי זרימת הדם מצביעות על כך שאקסיטוטוקסיות אינה המסלול המכניסטי היחיד למוות תאי איקטלי ולטרשת נפוצהבהיפוקמפוס 13. הממצא כי הגבלת זרימת הדם הנימית ממלאת תפקיד בניוון עצבי איקטלי סולל את הדרך להרחבת השיטות המתוארות כאן לזיהוי שינויים מיקרוסקופיים בזרימת הדם בכל עומק הגוף, ובכל רקמה, למטרות אבחון קליני.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין לנו מה לחשוף.

Acknowledgments

הפרויקט מומן על ידי פרס יוזמת מחקר מהאגודה האמריקאית לאפילפסיה, ופרס מוועדת המחקר הביו-רפואי של אריזונה ל- S.L.M., כמו גם מענק אתגר מ- Research to Prevent Blindness Inc. למחלקה לרפואת עיניים באוניברסיטת SUNY Downstate Health Sciences University, תוכנית החדשנות של האימפריה של מדינת ניו יורק, ומענקים נוספים מהקרן הלאומית למדע (0726113, 0852636 ו-1523614), הקרן הנוירולוגית בארו, גב' מריאן רושל, גברת גרייס וולטון ופרסי Dignity Health SEED, ומענקים פדרליים מהקרן הלאומית למדע (0726113, 0852636 ו-1523614) ומהמכון הלאומי לבריאות (פרסים R01EY031971 ו-R01CA258021), ל-S.L.M ול-S.M.C. עבודה זו נתמכה גם על ידי משרד עוזר מזכיר ההגנה לענייני בריאות תחת פרס מס '. W81XWH-15-1-0138, ל- S.L.M. L.-C. נתמך על ידי מלגת חוסה קסטיליחו ממשרד החינוך הספרדי. אנו מודים ל- O. Caballero ול- M. Ledo על עצתם הטכנית ועזרתם. 

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.7 mm diameter burr Fine Science Tools 19007-07 For Screws No. 19010-00
0.9 mm diameter burr Fine Science Tools 19007-09
ASEPTICO AEU-12C TORQUE PLUS from Handpiece solution AEU12C
Bull dog serrifine clump Fine Science Tools 18050-28
CellVizio dual band Mauna Kea Technologies
CellVizio single band Mauna Kea Technologies
Confocal Microprobe 300 microns (Serie S) Mauna Kea Technologies
Custom-made alignment piece L-shaped (angled at 90 deg) and made of stainless steel with two holes drilled on it, with a 4 mm separation from center to center
Custom-made mounting bar The long section piece of the mounting bar should be between 9.4 - 13mm. Fixed to this piece of the mounting bar, position a stainless-steel plate 1.5 cm long and 0.5 cm wide that has two holes drilled separated 4 mm from center to center, the same distance that the L-shaped alignment piece.
Cyanoacrylate adhesive-Super Glue
Dumont forceps #5 Fine Science Tools 11252-20
DuraLay Inlay Resin – Standard Package Reliance Dental Mfg Co. 602-7395 (from patterson dental)
Fillister Head, Slotted Drive, M1.6x0.35 Metric Coarse, 12mm Length Under Head, Machine Screw MSC industrial direct co. 2834117
Fine Point scissor Fine Science Tools 14090-09
Fluorescein 5% w/w lysine-fixable dextran (2MD) Invitrogen, USA D7137
Halsey smooth needle holder Fine Science Tools 12001-13
Kalt suture needle 3/8 curved Fine Science Tools 12050-03
lab standard stereotaxic, rat and mouse Stoelting Co. 51704 51670
Methocel 2% Omnivision GmbH PZN: 04682367 Eye ointment to prevent dryness.
Mouse Temperature controller, probe (YSI-451), small heating pad-TC-1000 Mouse CWE Inc. 08-13000
PhysioTel F20-EET transmitters DSI 270-0124-001
Robot Stereotaxic, Manipulator Arm, ADD-ON, 3 Axis, LEFT Stoelting Co.C13 51704
Sel-Tapping bone screws Fine Science Tools 19010-10
Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse Stereotaxic Stoelting Co 51648
Suture Thread - Braided Silk/Size 4/0 Fine Science Tools 18020-40
Tissue separating microspatula Fine Science Tools 10091-121

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Denk, W., et al. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 54 (2), 151-162 (1994).
  2. Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 15741-15746 (1998).
  3. Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. A miniature head-mounted two-photon microscope. High-resolution brain imaging in freely moving animals. Neuron. 31, 903 (2001).
  4. Chaigneau, E., Oheim, M., Audinat, E., Charpak, S. Two-photon imaging of capillary blood flow in olfactory bulb glomeruli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 13081-13086 (2003).
  5. Larson, D. R., et al. Water-soluble quantum dots for multiphoton fluorescence imaging in vivo. Science. 300, 1434-1436 (2003).
  6. Hirase, H., Creso, J., Singleton, M., Bartho, P., Buzsaki, G. Two-photon imaging of brain pericytes in vivo using dextran-conjugated dyes. Glia. 46, 95-100 (2004).
  7. Hirase, H., Creso, J., Buzsaki, G. Capillary level imaging of local cerebral blood flow in bicuculline-induced epileptic foci. Neuroscience. 128, 209-216 (2004).
  8. Schaffer, C. B., et al. Two-photon imaging of cortical surface microvessels reveals a robust redistribution in blood flow after vascular occlusion. PLoS Biology. 4, 22 (2006).
  9. Leal-Campanario, R., et al. Abnormal Capillary Vasodynamics Contribute to Ictal Neurodegeneration in Epilepsy. Scientific Reports. 7, 43276 (2017).
  10. Peppiatt, C. M., Howarth, C., Mobbs, P., Attwell, D. Bidirectional control of CNS capillary diameter by pericytes. Nature. 443, 700-704 (2006).
  11. Yemisci, M., et al. Pericyte contraction induced by oxidative-nitrative stress impairs capillary reflow despite successful opening of an occluded cerebral artery. Nature Medicine. 15, 1031-1037 (2009).
  12. Fernandez-Klett, F., Offenhauser, N., Dirnagl, U., Priller, J., Lindauer, U. Pericytes in capillaries are contractile in vivo, but arterioles mediate functional hyperemia in the mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 22290-22295 (2010).
  13. Leal-Campanario, R., Alarcon-Martinez, L., Martinez-Conde, S., Calhoun, M., Macknik, S. Blood Flow Analysis in Epilepsy Using a Novel Stereological Approach. Neurostereology: Unbiased Stereology of Neural Systems. Mouton, P. R. , John Wiley & Sons, Inc. Ames, USA. (2013).
  14. Smart, S. L., et al. Deletion of the K(V)1.1 potassium channel causes epilepsy in mice. Neuron. 20, 809-819 (1998).
  15. Zuberi, S. M., et al. A novel mutation in the human voltage-gated potassium channel gene (Kv1.1) associates with episodic ataxia type 1 and sometimes with partial epilepsy. Brain. 122, 817-825 (1999).

Tags

אנדומיקרוסקופיה פרה-קלינית מצומדת סיבים לסריקת לייזר קונפוקלית PCLE נימי היפוקמפוס עכברים ערים השפעות זרימת דם נימית פרכוסים תאי קיר הדמיה קליפת המוח במבחנה פריציטים פעילות עצבית מקומית תפקודית יישום תרופות בעלי חיים בריאים דינמיקה של כלי דם ניוון עצבי אפילפסיה עומק רקמות טכניקת ריסון ראש בעלי חיים ערים הרדמה רישומים אלקטרופיזיולוגיים הקלטות הדמיה
In Vivo Fiber-Coupled Pre-Clinical Confocal Laser-Scanning Endomicroscopy (pCLE) של נימי היפוקמפוס בעכברים ערים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Leal-Campanario, R., Martinez-Conde, … More

Leal-Campanario, R., Martinez-Conde, S., Macknik, S. L. In Vivo Fiber-Coupled Pre-Clinical Confocal Laser-scanning Endomicroscopy (pCLE) of Hippocampal Capillaries in Awake Mice. J. Vis. Exp. (194), e57220, doi:10.3791/57220 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter