In vivo vezelgekoppelde preklinische confocale laserscanning-endomicroscopie (pCLE) van hippocampuscapillairen bij wakkere muizen

Summary

Terwijl multifotonenbeeldvorming alleen effectief is op beperkte diepten van het weefseloppervlak, is het mogelijk om via pCLE op elke diepte beeldvorming met een resolutie van 3 μm te bereiken. Hier presenteren we een protocol om pCLE-beeldvorming uit te voeren om de microvasculaire dynamiek in de hippocampus van ictale en wildtype muizen te meten.

Abstract

Het doel van dit protocol is het beschrijven van fiber-optic-bundel-gekoppelde preklinische confocale laser-scanning endomicroscopie (pCLE) in zijn specifieke toepassing om capillaire bloedstroomeffecten tijdens aanvallen, aangedreven door murale cellen, op te helderen. In vitro en in vivo corticale beeldvorming heeft aangetoond dat capillaire vernauwingen aangedreven door pericyten het gevolg kunnen zijn van functionele lokale neurale activiteit, evenals van het toedienen van geneesmiddelen bij gezonde dieren. Hier wordt een protocol gepresenteerd over het gebruik van pCLE om de rol van microvasculaire dynamiek bij neurale degeneratie bij epilepsie te bepalen, op elke weefseldiepte (met name in de hippocampus). We beschrijven een hoofdsteuntechniek die is aangepast om pCLE bij wakkere dieren vast te leggen, om mogelijke bijwerkingen van anesthetica op neurale activiteit aan te pakken. Met behulp van deze methoden kunnen elektrofysiologische en beeldvormende opnames gedurende enkele uren worden uitgevoerd in diepe neurale structuren van de hersenen.

Introduction

In tegenstelling tot andere microscopische beeldvormingsmethoden 1,2,3,4,5,6,7,8, maakt confocale microscopie op basis van glasvezel in vivo het mogelijk om de dynamiek van de bloedstroom in elk hersengebied, op elke diepte, met hoge snelheid te meten (tot 240 Hz^, afhankelijk van de grootte van het gezichtsveld⁹). Een glasvezelsonde maakt in vivo confocale laserscanbeeldvorming mogelijk met een resolutie van 3 μm, omdat de punt van de sonde (een lensloos objectief dat bestaat uit een bundel van 5000-6000 individuele vezels met een diameter van 3 μm) kan worden gepositioneerd met de nauwkeurigheid van een micro-elektrode, binnen 15 μm van het fluorescerende doel van belang. Net als bij in vivo beeldvorming met twee fotonen, moeten fluoroforen vooraf in het beeldvormingsdoel worden geïntroduceerd. Fluoresceïne-dextran (of kwantumdots) kunnen bijvoorbeeld in het vaatstelsel worden geïnjecteerd, of genetisch gecodeerde fluorescerende eiwitten kunnen in cellen worden getransfecteerd, of fluorescerende kleurstoffen zoals Oregon Green BAPTA-1 kunnen in bulk in cellen worden geladen, voorafgaand aan beeldvorming.

Recent onderzoek met behulp van deze technieken heeft aangetoond dat motorische activiteit van muurcellen die leidt tot ictale capillaire vasospasmen - plotselinge vernauwingen die optreden op de positie van de muurcellen tijdens aanvallen 9 - kan bijdragen aan neurodegeneratie in de ictale hippocampus⁹. Terwijl eerdere beeldvormende studies in vitro en in vivo pericytenvernauwingen aantoonden die verband hielden met medicijntoepassingen 6,7,10,11,12^, vonden Leal-Campanario et al. het eerste bewijs van in vivo spontane capillaire vernauwingen in de muizenhersenen. Om de relevantie voor epilepsie van de menselijke temporale kwab vast te stellen, bestudeerden ze mannelijke (P30-40 oude) knock-out (KO) Kv1.1 (kcna1-null) muizen ^14,15 (JAX-voorraad #003532), een genetisch model van menselijke episodische ataxie type 1¹⁵. Pericyten veroorzaakten zowel pathologische als fysiologische hippocampale muurschildering vasoconstricties⁹ bij de spontaan epileptische dieren en hun wild-type (WT) nestgenoten. Deze waarnemingen werden gerepliceerd bij WT-dieren die epileptisch waren gemaakt met kaininezuur, wat wijst op hun generalisatie naar andere vormen van epilepsie. Leal-Campanario et al. stelden bovendien vast, met behulp van nieuwe stereologische microscopiebenaderingen, dat apoptotische - maar niet gezonde - neuronen in epileptische dieren ruimtelijk gekoppeld waren aan de hippocampusmicrovasculatuur. Omdat excitotoxiciteit geen bekende ruimtelijke associatie heeft met het vaatstelsel, gaf dit resultaat aan dat abnormale capillaire vasospasmische ischemie-geïnduceerde hypoxie bijdraagt aan neurodegeneratie bij epilepsie. Figuur 1 toont een schema van de algemene opstelling.

Protocol

Het protocol volgt de NIH-richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. Alle procedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van het Barrow Neurological Institute.

1. Stereotactische positionering voor craniotomie

1. Weeg en verdoven de muis vervolgens met een ketamine-xylazinecocktail (100 mg/kg-10 mg/kg i.p.). Zorg ervoor dat het dier volledig verdoofd is door te letten op het uitblijven van een reactie op het beknellen van de staart en/of de tenen.
2. Plaats een verwarmingskussen onder de muis en gebruik een rectale thermometer om de lichaamstemperatuur continu te controleren tijdens de eerste verdoofde implantatieoperatie (Figuur 2A).
3. Breng oogzalf aan om droge ogen te voorkomen.
4. Stabiliseer de kop van het dier in een stereotaxisch frame van knaagdieren, uitgerust met een muisadapter. Om de muis goed te oriënteren in het stereotaxische frame, plaatst u de tanden van het dier in het gat van de bijtbalk (Figuur 2A en Figuur 3A, punt g). Draai de neusklem vast totdat deze goed vastzit (Figuur 2A,B en Figuur 3A, punt h). De lichaamshouding van de muis moet zo recht mogelijk zijn (zoals in figuur 2A).
   1. Zet de kop van het dier verder vast met behulp van oorstaven van muizen met manchetten van de kaakhouder (Figuur 2A en Figuur 3A, punt i), om de jukbeenuitsteeksels van de schedel stevig vast te klemmen.
      NOTITIE: Eenmaal vastgezet, mag het hoofd van de muis geen horizontale bewegingsvrijheid hebben.
5. Zodra de muis is aangepast aan het stereotaxische frame (Figuur 3B, item j), reinigt en steriliseert u de hoofdhuid door deze 2-3 keer af te vegen met chloor-hexedine scrub, elke keer gevolgd door een alcoholspoeling. Breng vervolgens actuele lidocaïne aan op het hoofd.
6. Maak een incisie langs de middellijn van posterieur naar anterieur (begin incisie aan de basis van de schedel en voltooi deze tussen de ogen; 12-15 mm) langs de sagittale middellijn van de schedel, met behulp van een fijne schaar of een mes. Trek de randen van de hoofdhuid in met vier 28 mm bulldog serrefine clamps om de schedel bloot te leggen en het werkgebied te maximaliseren (Figuur 2B en Figuur 3C).
7. Gebruik een scalpel of microspatel (Figuur 3C) om het periosteum naar de randen van de incisie te schrapen. Gebruik een weefselscheidende schaar of pincet (Figuur 3C) om de spieren aan de achterkant van de nek voorzichtig in te trekken (Figuur 2B).
8. Droog de bovenkant van de schedel af met een applicator met wattenstaafje, bevochtigd met alcohol of 30% waterstofperoxide, om de visualisatie van de schedelnaden te optimaliseren. Breng zoutoplossing aan op de schedel zodra het bindweefsel is verwijderd.
9. Zodra de kop van de muis is gestabiliseerd in het stereotaxische apparaat, plaatst u de punt van de naald van een spuit (21 G) in de elektrodehouder (Figuur 3B, punt l) en bevestigt u de elektrodehouder aan de stereotaxische micromanipulator, waarbij u de naaldpunt laat zakken tot het niveau van de schedel (Figuur 2D).
10. Pas de mediaal-laterale richting van de schedel aan door de hoogte van de schedel te meten op elke afstand posterieur van bregma (d.w.z. -2,0 mm), en twee gelijke afstanden lateraal van de middellijn aan weerszijden van de schedel (d.w.z. ± 1,5 mm) (Figuur 2D). Streef naar een hoogteverschil tussen locaties dat minder is dan 0.05 mm in de dorsaal-ventrale richting.
    1. Als de schedel groter is dan 0.05 mm, draait u de schedel van de muis met behulp van de bijtstang, of verplaatst u het hoofd van de muis door de oorbalken voorzichtig los te maken, het hoofd en de oorstangen indien nodig zijdelings te verschuiven en vervolgens de oorstangen weer vast te draaien.
11. Zodra de schedel in het stereotaxische apparaat is geplaatst, bepaalt en registreert u de stereotactische coördinaten van de bregma- en lambdaschedelhechtingen langs de anteroposterieure (AP), mediale laterale (ML) en dorsale ventrale (DV) assen.
12. Identificeer het doelpunt (rechter hippocampus) met behulp van een stereotaxische atlas. Zoek vervolgens op de schedel de coördinaten van het doelpunt ten opzichte van bregma (AP: -2,7 mm, ML: -2,7 mm) (Figuur 2E).
13. Markeer met een chirurgische marker vier hoeken van een beeldvormingsvenster van 1,4 mm x 2 mm op de schedel met stippen, gecentreerd rond het doelpunt direct boven de hippocampus (Figuur 2F), voor daaropvolgende craniotomie.
14. Gebruik de chirurgische marker om twee extra stippen te tekenen: één over het pariëtale bot linksboven (Figuur 2G) en een andere over het rechter frontale bot (Figuur 2H), om de toekomstige plaatsing aan te geven van twee botschroeven (Figuur 3A, item b) die de hoofdkap (Figuur 3B, item m) aan de schedel zullen verankeren.
15. Gebruik de chirurgische marker om nog drie stippen te tekenen die aangeven waar de epidurale EEG-opname-elektroden zullen worden ingebracht: een stip op 1 mm aan weerszijden van de middellijn en een extra stip op de middellijn die 1 mm achter Lambda is geplaatst (Figuur 2E, Figuur 4A en Figuur 5B).

2. Head-Cap installatie

1. Boor met behulp van een braam met een diameter van 0,7 mm (figuur 3C) voorzichtig twee kleine gaatjes in de schedel, op de puntposities die de plaatsing van de botschroeven aangeven (zie stap 1.15 hierboven). Neem vervolgens twee botschroeven (roestvrij staal met sleuf, lengte: 4 mm; diameter: 0,85 mm) die eerder zijn gedesinfecteerd met ethanol 70-80%, en schroef ze op de schedel voor extra stabiliteit van de hoofdkap (Figuur 2I-J en Figuur 3A, item b).
   1. Zorg ervoor dat de schroefpunten niet voorbij de onderkant van het bot in de schedelholte uitsteken, met het risico op schade aan de hersenen. Merk op dat een van de twee botschroeven zich vóór de twee kopkapschroeven bevindt en de andere achter hen (Figuur 2G-J).
2. Spuit zoutoplossing over de schedel om deze af te koelen en schoon te maken. Droog vervolgens de schedel volledig af en breng een dun laagje cyanoacrylaat aan rond de schroeven.
3. Gebruik een aangepast uitlijnstuk (Figuur 3A, item c) dat is vastgeklemd aan de microdrive die op het stereotaxische apparaat is gemonteerd (Figuur 2F-J en Figuur 3A, item d), zodat de positie van de hoofdkap is uitgelijnd langs de middellijn, met de voorste kam boven bregma. Dit op maat gemaakte roestvrijstalen stuk is L-vormig (onder een hoek van 90°), met twee gaten gescheiden door 4 mm (Figuur 2F-J en Figuur 3A, item c).
   1. Gebruik de stereotaxische manipulator om het L-vormige uitlijnstuk te positioneren, met twee cilinderkopsleufschroeven bevestigd (M1,6 x 0,35 metrisch grof, 12 mm lengte; Figuur 3A, punt a) over de bregma, totdat de basis van de schroeven plat op de schedel ligt, waarbij u ervoor moet zorgen dat er geen druk op de schedel wordt uitgeoefend (Figuur 2I-J).
4. Breng cyanoacrylaat aan, gevolgd door tandheelkundig cement om de basis van de schroeven aan de schedel te bevestigen. Zorg ervoor dat u de referentiemarkeringen van het beeldvenster boven de hippocampus niet blokkeert (Figuur 2K).

3. Beeldvorming venster craniotomie chirurgie

1. Boor op elk van de posities van de craniotomiereferentiemarkeringen die de hoeken van het beeldvormingsvenster aangeven (zie stap 1.14 hierboven) een braamgat met een diameter van 0,7 mm, gevolgd door het voorzichtig afbakenen van de omtrek van het craniotomievenster van 1,4 mm x 2 mm met de boor, met iteratief diepere sneden (Figuur 2L).
2. Zorg ervoor dat u niet te diep of met te veel kracht boort op de schedel, die dun en kwetsbaar is en een dikte heeft van ongeveer 300 μm. Zodra de botflap is voltooid, wrikt u de losse flap omhoog met de punt van een scalpel, waarbij u erop let de onderliggende dura mater niet te beschadigen.
3. Bedek het open raam met beenderwas (Figuur 2M).
4. Boor met behulp van een braam met een diameter van 0,9 mm drie gaten voor toekomstige plaatsing van de epidurale EEG-elektroden (zie stap 1.15 hierboven) en zorg ervoor dat u niet door de dura mater snijdt (Figuur 2E,L).
5. Bedek de drie gaten met beenderwas.
6. Breng voorzichtig cyanoacrylaat aan rond de randen van het met beenwas bedekte beeldvormingsvenster en de EEG-gaten, en zorg ervoor dat de craniotomieën niet worden afgedicht (Figuur 2L).
7. Bouw een muur van tandheelkundig cement die het beeldvormingsvenster en de EEG-gaten omvat en deze bindt aan de eerder gecementeerde hoofdkap (Figuur 2M en Figuur 3B, item m).
8. Laat het cement minimaal 10 minuten drogen.
9. Sluit eventuele losse wondranden met eenvoudige onderbroken hechtingen, met behulp van 4-0 of 5-0 zwarte gevlochten zijde (Figuur 2N en Figuur 3C).

4. Na de operatie

1. Gebruik een applicator met wattenstaafje om lidocaïnezalf rond de blootgestelde huid aan te brengen om het gevoel rond de rand van de wond te doven.
2. Gebruik een steriele applicator met wattenstaafje om Neosporin op de onbedekte huid aan te brengen.
3. Verwijder het dier uit het stereotaxische frame (Figuur 2N).
4. Injecteer ketoprofen (5 mg/kg) IP of IM voor postoperatieve analgesie.
5. Observeer het dier totdat het alert is en beweegt (dit gebeurt meestal binnen enkele minuten).
6. Plaats het dier in een warme kooi en blijf het herstel volgen totdat het drinkt of eet en klaar is om naar de dierenhuisvesting te worden overgebracht.
7. Controleer het dier ten minste eenmaal per dag gedurende ongeveer een week na de operatie, let op tekenen van lusteloos gedrag en/of onvoldoende eten/drinken (Figuur 2O).

5. Kleurstofinjectie en EEG-opname

1. Wacht minimaal een dag na de implantatieoperatie van de hoofdkap om de opnames te starten.
2. Plaats de muis in een schuimrubberen beveiligingsapparaat dat naar zijn lichaam is gevormd, binnen het stereotaxische frame (Figuur 3B, items n en j).
3. Bevestig de kopkap (Figuur 3 B-I, item m) aan een aangepaste montagebalk die aan het stereotaxische frame is bevestigd (Figuur 3A,B, items e & j en Figuur 4A). Het lange gedeelte van punt e (figuur 3A,B) moet een lengte hebben tussen 9,4 en 13 mm. Bevestig item f (een montageplaat met afmetingen 1,5 cm x 0,5 cm, met twee gaten die 4 mm van hart naar hart van elkaar verwijderd zijn) aan item e (Figuur 3A,B, items e, f en k). Dit uitlijningssysteem positioneert de wakkere muis tijdens de beeldvormingssessies stevig op het stereotaxische frame (Afbeelding 4).
4. Plaats de epidurale EEG-opname-elektroden (Figuur 5A), plaats de aardelektroden (witte draden) in het achterste centrale gat en de opname-elektroden (rode draden) in de voorste linker- en rechtergaten (Figuur 2E, Figuur 4E en Figuur 5E). Plaats elk van de draden in een L-vorm tussen de schedel en de dura mater (Figuur 5C) om het elektrische contact te optimaliseren.
5. Injecteer de staartader met groene fluoresceïne lysine-fixeerbare dextran (0,2 ml/25 g lichaamsgewicht van fluoresceïne 5% w/w), om de bloedstroom in de hippocampus te visualiseren.
   1. Om de verwijding van de centrale ader van de staart van de muis voorafgaand aan de injectie te verbeteren, gebruikt u een of meer van de volgende strategieën: a) Breng 70% ethanol aan op de centrale ader met behulp van een applicator met wattenstaafjes; b) Dompel de staart 1-3 minuten in warm water (35-40 °C); c) Stel de staart een paar minuten bloot aan een verwarmingslamp.
   2. Zet de staart van de muis met twee vingers vast en zoek de centrale ader, die direct onder de huid ligt. Steek de naald (ultrafijne insulinespuit met geïntegreerde naald 30G), met de schuine kant naar boven, in de ader, ongeveer halverwege tot tweederde van de basis van de staart. Houd de naald evenwijdig aan de staart tijdens de injectie.
   3. Injecteer de kleurstof langzaam en gestaag en zorg ervoor dat de positie van de naald of staart niet verandert.
      OPMERKING: Er mag geen weerstand zijn bij het indrukken van de zuiger van de spuit.
   4. Trek na voltooiing van de injectie de naald terug en oefen lichte druk uit op de prikplaats om het bloedvat af te dichten.
   5. Laat stolling optreden.

6. In vivo glasvezelbundel-gekoppelde preklinische confocale laserscanning endomicroscopie (pCLE)

1. Direct na de injectie van de staartader (stap 5.5.3 hierboven) klemt u de afgeschuinde glasvezelbundel van 300 μm (met 5000-7000 vezels van 3 μm in elke bundel) in de neerwaartse richting naar de mobiele arm van de stereotactische aandrijving van de robot.
2. Verwijder de botwas uit de craniotomie.
3. Verwijder de dura met behulp van de gebogen punt van een injectiespuitnaald.
4. Met behulp van het robotpositioneringssysteem verplaatst u eerst het vezelobjectief naar de juiste anterieure-posterieure en links-rechts stereotaxische locatie, met de punt op nul in de z-as op het oppervlak van de cortex.
5. Start de EEG-opname (Figuur 5D).
6. Start een confocale laserscan van het achterste vlak van het fiberobjectief, direct gevolgd door het objectief langzaam in de z-as af te dalen met behulp van de z-besturing van de robotmicrodrive, totdat het de doeldiepte in de hersenen bereikt (Figuur 4C). Bekijk de beeldvormingsresultaten in de microscopische software terwijl u afdaalt.
   1. Als de vezelpunt zich binnen het beoogde X-Y-Z-opnamegebied bevindt en twee of meer vaten het gezichtsveld van het beeldvenster binnengaan, stopt u de afdaling en start u video-opnamen. Verkrijg live full-field time-lapse-video's van de bloedstroom bij 11,7 Hz met behulp van de beeldvormingssoftware van Cellvizio Lab. (Hogere snelheden kunnen worden verkregen met een kleiner gezichtsveld). Opnames kunnen 4-5 uur per keer plaatsvinden, indien nodig in opeenvolgende dagen.
7. Gebruik een spuit van 10 ml met afgeschuinde siliconenslang die aan de punt van de naald is bevestigd en voer het dier tijdens de opnames door periodiek pasta te geven die is gemaakt met muizenkorrels die met water zijn vermalen.
8. Beëindig aan het einde van de beeldvormingssessie de opnames.
9. Verwijder voorzichtig de EEG-geleidingsdraden en reinig ze met Tergazyme.
10. Verwijder langzaam de glasvezelbundel uit de hersenen van het dier door de vezel om te keren langs de z-as van binnenkomst.
11. Laat het dier los van de hoofdpaal en de lichaamsboeien.
12. Volg indien nodig de nodige euthanasie- en weefselverwerkingsprotocollen om bloedvaten te visualiseren en immunohistochemie uit te voeren.
13. Als u van plan bent om in een toekomstige sessie van hetzelfde dier op te nemen, bedek dan het beeldvenster met bottenwas of silastic.

Representative Results

We hebben deze methoden ontwikkeld om te beoordelen of abnormale pericyt-gedreven capillaire vasospasmen in de hippocampus - optredend als gevolg van aanvallen - openlijke hypoxie kunnen veroorzaken die bijdraagt aan celdood in de ictale focus ^9,13.

De ontwikkeling van de hoofdkap en de juiste installatie ervan zorgden voor een hoge stabiliteit in de opnames, waardoor gelijktijdige registratie van EEG en bloedstroom diep in de hippocampus van wildtype en epileptische wakkere muizen mogelijk was tijdens zowel ictale als interictale perioden. Het vastleggen van bloedstroomgebeurtenissen die verband houden met aanvallen vereist registratie gedurende langere perioden, zodat aperiodieke bloedstroomgebeurtenissen (zoals vasospasmen) kunnen worden vastgelegd als reactie op zowel geïnduceerde als natuurlijk voorkomende epileptische aanvallen. Het fixatiesysteem maakte stabiele bloedstroomopnames mogelijk van diepe hersenmicrovaten en hun proximale wandcellen gedurende lange uren (Figuur 6A-R). We ontdekten dat in hele microvaten bloedstroomonderbrekingen optraden op de posities van gelabelde muurcellen.

We hebben op betrouwbare wijze vaten in de hippocampus gelokaliseerd met behulp van een stereotactisch robotapparaat dat is gericht op interne coördinaten van een standaard stereotaxische atlas. We hebben de kwaliteit van de vezelopnames geverifieerd door ze te vergelijken met hoge-resolutie twee-fotonbeeldvormingsopnames van de bloedstroom en equivalente vasospasmen van corticaal weefsel, op diepten die twee-fotonbeeldvorming kan bereiken (Figuur 6S-AA). We hebben de pCLE-resultaten verder geverifieerd met behulp van immunohistochemie op opnameplaatsen, om met traditionele confocale microscopie aan te tonen dat hippocampus-wandcellen correct werden aangevallen en dat ze niet alleen vernauwend waren, maar ook ruimtelijk geassocieerd met vernauwingen in microvaten ver van arteriolen¹⁵ (Figuur 7).

De gepubliceerde bevindingen met deze methoden tonen inderdaad abnormale hippocampale capillaire vasospasmen aangedreven door epileptische aanvallen, evenals gecorreleerde celdood in Kv1.1 epileptische mutante muizen en kainate model epileptische muizen ^9,13. Deze resultaten wijzen op een rol voor lokale ictale ischemie/hypoxie bij celdood tijdens aanvallen, als gevolg van abnormale vasospasmen, en dragen bij aan een groeiend oeuvre dat de mogelijke mechanismen van ictale celdood uitbreidt.

Figuur 1: Schematische weergave van de experimentele opzet. We registreerden EEG tijdens het uitvoeren van confocale microscopie in hippocampale haarvaten van zowel wakkere epileptische muizen als WT-nestgenoten. Na het injecteren van de staartader met fluoresceïne, gebruikten we een nieuwe preklinische confocale laserscanning-endomicroscopie (pCLE), met een vezelobjectief met een tipdiameter van 0,3 mm om de capillaire bloedstroomdynamiek diep in de hersenen vast te leggen. Geel geeft een verhoogde bloedstroom aan en rood geeft een constante of verminderde doorstroming aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Protocol voor implantatiechirurgie van de hoofdkap. A) Het verdoofde dier werd op een verwarmingskussen geplaatst en in het stereotaxische frame geplaatst (zie figuur 3B, punt j) en vastgezet met oorkappen van muizen (figuur 3A, punt i) en boeien van de kaakhouder (figuur 3A, punten g,h), over een verwarmingskussen. B) Blootstelling van de schedelnaden. C-D) Metingen van Bregma en Lambda. E) Visualisatie van boorlocaties boven de schedel van het dier. De zwarte punten en het vierkant geven het venster over de hippocampus aan dat de pCLE-insertie mogelijk maakt. De twee rode cirkels markeren de insteekposities voor de EEG-opnamedraden. De witte stip markeert het insteekpunt van de EEG-aardingsdraden. F) De vier zwarte stippen op de schedel markeren de toekomstige hoeken van de craniotomie van het beeldvenster over de hippocampus. Het aangepaste uitlijnstuk (Figuur 3A, item c), met de hoofdpostimplantaten (Figuur 3A, item a) bevestigd aan de stereotactische microdrive-positioner (Figuur 3A, item d). G-H) Twee extra stippen, een achterste (G) en een voorste (H), markeren de toekomstige locatie van de ankerschroeven van de kopkap (figuur 3A, item b). I-J) Twee kleine schroeven verankeren de hoofdkap aan de schedel (Figuur 3A, item b). K) Cyanoacrylaat en tandheelkundig cement worden aangebracht op de ankerschroeven van panelen I & J. L) De craniotomie van het beeldvenster over de hippocampus en de drie gaten voor de EEG-elektroden zijn geboord. M) De beeldvormingskamer wordt gebouwd (Figuur 3B, items i, m) door een berm te beeldhouwen met extra tandheelkundig cement om de drie EEG-gaten en het beeldvormingsvenster te omringen. N) Bovenaanzicht van de voltooide hoofdkap. O) De herstelde muis terug in zijn kooi na de implantatieoperatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Materialen die in het protocol worden gebruikt (specifieke items opgesomd met kleine letters). A) Materialen die zijn gebruikt om de hoofdkap te bouwen. (a) Twee machineschroeven van M1,6 x 12 mm (de hoofdpostimplantaten). b) Twee kleine bouten om de hoofdkap aan de schedel te bevestigen. (c) Een op maat gemaakt L-vormig roestvrijstalen uitlijnstuk, met twee gaten op 4 mm van elkaar, waarmee de twee M1.6-schroeven tijdens de operatie worden vastgezet. (d) Een standaard microdrive gemonteerd op een stereotaxisch apparaat bevat item c. (e) Een aangepaste montagestang met een (f) uitlijnstuk dat overeenkomt met de twee gaten van item c. (g) Een bijtstang en (h) neusklem om de positie van de kop van het dier te stabiliseren. B) Instellen tijdens de opnames. (i) De hoofdkap wordt tijdens de verdoofde implantatieoperatie vastgemaakt aan item f. (j) Een stereotaxisch frame positioneert de microdrive (item d). (l) Een naald van 21 G wordt bevestigd aan de microdrive (item d) en gebruikt om de posities van de bregma- en lambda-schedelhechtingen te bepalen. (m) Hier is een gesimuleerde hoofdkap afgebeeld, bevestigd aan punt f, om de positionering van de muis in (n) de met schuim beklede fixatiebuis te demonstreren (muis niet aanwezig). Item n vormt zich naar de vorm van het lichaam van de muis. C) Instrumenten en benodigdheden die nodig zijn om de operatie uit te voeren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Afbeelding 4: Opnamesessie instellen. A) De kop van het dier is gefixeerd. B) Locatie van de EEG-opnamedraden. Witte EEG-draden worden afzonderlijk geplaatst, aan elke kant van de schedel. Rode EEG-draden worden bij elkaar geplaatst in het middelste onderste (grond)gat. C) De glasvezelbundel wordt in het doelvenster gestoken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: EEG-opnames. A) Epidurale EEG-opnames worden uitgevoerd met Physiotel F20-EET-zenders, gelijktijdig met de glasvezel pCLE-opnames bij het wakkere dier. B) Locatie van de geboorde gaten voor het inbrengen van de draden voor EEG-opnamen. De twee rode draden gaan naar de twee gaten die zijn aangegeven met rode stippen. De twee witte draden worden samen in het gat gestoken dat wordt aangegeven door de witte stip. Het rode vierkant geeft het doelvenster boven de hippocampus van het dier aan. De letter 'B' op de schedel van de muis geeft het bregma aan. C) De EEG-opnamedraden zijn in een L-vorm gebogen om het elektrische contact tussen de schedel en de dura-materie te verbeteren. D) Voorbeelden van EEG-opnames bij wakkere muizen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Opnames van wandcelvasoconstricties bij muizen. A-R) In vivo glasvezel dual-band pCLE-beeld van capillair vasospasme (vaten in groen, gelabeld met 2MD fluoresceïne-geconjugeerd dextran) gecolokaliseerd naar murale cellen (rood, gelabeld via intraveneuze aderstaartinjectie van Alexa Fluor 647) in wakkere knock-out muizen tijdens epileptische aanvallen (pijl geeft muurcel en geassocieerd vasospasme aan). Zie video 1 en video 2. Z-W) In vivo twee-foton scanning lasermicroscopie (TPLSM) stapel van capillaire vaten (groen) en muurcellen (rood) van een wildtype muis. Zie video 3. X-Z) In vivo TPLSM van een muurcel-gelokaliseerde (rode) capillaire vernauwing van kaïne muizen. Zie video 4. AA) Kwantificering van de vernauwing van bloedvaten van panelen X-Z gemeten op de witte lijn. Schalen voor panelen A-R= 5 μm; S-W= 25 μm; X-Z= 5 μm. Video's werden opgenomen op 11,7 Hz. Van Leal-Campanario et ^al.8. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Immunohistochemie van de opgenomen hersenen. A-B) Bloedvaten met verschillende vergrotingen geïnjecteerd met fluoresceïne-dextran (groen). DAPI-gekleurde celkernen in blauw (witte pijlen). Schaalbalk voor A= 200 μm; schaalbalk voor B = 100 μm. C) Ander deel van de hersenen geïnjecteerd met fluoresceïne waar een rode bloedcel (rode pijl) duidelijk te zien is. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Filmpje 1: Vasospasme en murale celbloedstroom geregistreerd (11,7 Hz) in een KO hippocampuscapillair. Zie frames van dezelfde opname in figuur 6A-H. Klik hier om deze video te downloaden.

Video 2: Vasospasme, leukocytenblokkades, bloedstroom en wandcellen geregistreerd in een WT hippocampuscapillair (11,7 Hz). Zie frames van dezelfde opname in Figuur 6I-R. Klik hier om deze video te downloaden.

Video 3: Niet-uniforme bloedstroom in in vivo pariëtale cortex van WT-muizen geregistreerd met TPLSM. Zie frames van dezelfde opname in figuur 6S-W. Klik hier om deze video te downloaden.

Video 4: Mural cel-gedreven (rode) capillaire (groene) vernauwing van pariëtale cortex van grijpend kainisch dier geregistreerd met TPLSM. Zie frames van dezelfde opname Figuur 6X-Z. Klik hier om deze video te downloaden.

Discussion

We ontwikkelden een hoofdkapfixatiesysteem voor gelijktijdige elektrofysiologische en glasvezel pCLE-experimenten bij wakkere muizen, waardoor mogelijke responsbesmetting als gevolg van anesthetica wordt verminderd. De hoofdkap en het montageapparaat zijn eenvoudig te construeren en zijn herbruikbaar voor chronisch wakker gedragende beeldvormingsexperimenten. We hebben de kwaliteit van de opnames getoetst aan de gouden standaard voor in vivo microscopische bloedstroombeeldvorming, TPLSM.

Bekwame chirurgische vaardigheden zijn nodig om het protocol dat we hier beschrijven te implementeren. De operatie moet worden uitgevoerd onder aseptische omstandigheden en altijd onder een operatiemicroscoop, waarbij ervoor moet worden gezorgd dat de dura mater intact blijft bij het boren van het raam over de hippocampus. Bekendheid met het onderliggende vaatstelsel is essentieel, omdat het snijden boven een groot bloedvat het risico op ongewenste bloedingen met zich meebrengt.

Door het dier op de juiste manier in stereotactische uitlijning te plaatsen, zorgt u ervoor dat het voorste-achterste vlak waterpas is voordat de hoofdkap wordt bevestigd. Deze beveiliging vergemakkelijkt het lokaliseren van hersenloci met behulp van een hersenatlas.

Muisbewegingen kunnen leiden tot schade aan bloedvaten of foutieve opnames van vasospasmen (dat wil zeggen, vezelbeweging in plaats van echte vasobeweging), dus het is belangrijk om de beweging van dieren tijdens de opnames te verminderen. Schuimvulling in de fixatiebuis helpt de duur van de opnamesessies te verlengen en tegelijkertijd stress en beweging van de muis te minimaliseren. Muizen passen het liefst goed in het schuim, dus een goede pasvorm vermindert overmatige beweging. Zonder deze voorzorgsmaatregel kunnen muizen het moeilijk hebben. Als de muis tekenen van worsteling vertoont, moet de opnamesessie worden beëindigd. De opnames kunnen de volgende dag worden hervat, zodra de fysiologische stressreacties zijn afgenomen. In onze opnames waren de dieren duidelijk het grootste deel van de tijd kalm.

We merken op dat de beweging die de pCLE-beeldvormingsmethode het meest negatief beïnvloedt, optreedt wanneer de sonde differentieel naar het hersenweefsel beweegt. Ademhaling, toevallen en beweging van het dier zijn niet relevant, tenzij ze de vezelsonde verplaatsen ten opzichte van het weefsel. Dat wil zeggen, wanneer de beeldvormingssonde differentieel naar het weefsel beweegt, beweegt het hele beeldvormingsveld als een eenheid, waardoor bewegingsartefacten duidelijk worden. Het is dus van cruciaal belang om altijd van twee of meer vaten tegelijk te registreren: als alle vaten tegelijk bewegen, kan dit te wijten zijn aan vezelinstabiliteit, terwijl als ten minste één vat niet verandert, de veranderingen die in andere vaten worden waargenomen, waarschijnlijk te wijten zijn aan werkelijke variaties in de bloedstroom, waaronder vasospasmen.

Een beperking van de pCLE-beeldvormingsmethode in vergelijking met TPLSM is dat de vezelsonde de pia doorboort en dus invasief is voor de hersenen. Als de sonde afdaalt, veroorzaakt deze enige schade aan het neurale weefsel waar het doorheen gaat. Het opnemen van hetzelfde schip op twee opeenvolgende dagen kan dus buitengewoon moeilijk zijn, zelfs als in beide sessies exact dezelfde coördinaten worden gebruikt (en vaak alleen mogelijk als de eerste opnamesessie van korte duur is). Het is daarom van cruciaal belang om bij het uitvoeren van chronische opnamestudies in volgende opnamesessies op steeds grotere diepte op te nemen.

De resultaten van de bloedstroomexperimenten suggereren dat excitotoxiciteit niet de enige mechanistische route is voor ictale celdood en hippocampale sclerose¹³. De bevinding dat capillaire bloedstroombeperking een rol speelt bij ictale neurodegeneratie maakt de weg vrij om de hier beschreven methoden uit te breiden tot de identificatie van microscopische veranderingen in de bloedstroom op elke diepte van het lichaam en in elk weefsel, voor klinische diagnostische doeleinden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.7 mm diameter burr	Fine Science Tools	19007-07	For Screws No. 19010-00
0.9 mm diameter burr	Fine Science Tools	19007-09
ASEPTICO AEU-12C TORQUE PLUS	from Handpiece solution	AEU12C
Bull dog serrifine clump	Fine Science Tools	18050-28
CellVizio dual band	Mauna Kea Technologies
CellVizio single band	Mauna Kea Technologies
Confocal Microprobe 300 microns (Serie S)	Mauna Kea Technologies
Custom-made alignment piece	L-shaped (angled at 90 deg) and made of stainless steel with two holes drilled on it, with a 4 mm separation from center to center
Custom-made mounting bar	The long section piece of the mounting bar should be between 9.4 - 13mm. Fixed to this piece of the mounting bar, position a stainless-steel plate 1.5 cm long and 0.5 cm wide that has two holes drilled separated 4 mm from center to center, the same distance that the L-shaped alignment piece.
Cyanoacrylate adhesive-Super Glue
Dumont forceps #5	Fine Science Tools	11252-20
DuraLay Inlay Resin – Standard Package	Reliance Dental Mfg Co.	602-7395 (from patterson dental)
Fillister Head, Slotted Drive, M1.6x0.35 Metric Coarse, 12mm Length Under Head, Machine Screw	MSC industrial direct co.	2834117
Fine Point scissor	Fine Science Tools	14090-09
Fluorescein 5% w/w lysine-fixable dextran (2MD)	Invitrogen, USA	D7137
Halsey smooth needle holder	Fine Science Tools	12001-13
Kalt suture needle 3/8 curved	Fine Science Tools	12050-03
lab standard stereotaxic, rat and mouse	Stoelting Co. 51704	51670
Methocel 2%	Omnivision GmbH	PZN: 04682367	Eye ointment to prevent dryness.
Mouse Temperature controller, probe (YSI-451), small heating pad-TC-1000 Mouse	CWE Inc.	08-13000
PhysioTel F20-EET transmitters	DSI	270-0124-001
Robot Stereotaxic, Manipulator Arm, ADD-ON, 3 Axis, LEFT	Stoelting Co.C13	51704
Sel-Tapping bone screws	Fine Science Tools	19010-10
Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse Stereotaxic	Stoelting Co	51648
Suture Thread - Braided Silk/Size 4/0	Fine Science Tools	18020-40
Tissue separating microspatula	Fine Science Tools	10091-121