Summary
给出了一种有效去细胞的舌胞外基质 (TEM) 的制备方法。透射电镜可作为功能性支架, 用于在静态或搅拌培养条件下重建舌鳞癌 (TSCC) 模型。
Abstract
为了构建一种有效的、逼真的舌鳞癌 (TSCC) 模型, 建立了瓣膜舌细胞外基质 (TEM), 为 TSCC 的构建提供了功能性支架。TEM 为细胞生长、分化和细胞迁移提供了体外小生境。本机细胞外基质 (ECM) 的显微结构和瓣膜基质中保留的生化成分为锚固细胞提供组织特异的龛位。经脱氧核糖核酸酶 (DNase) 消化, 同时具有严重的有机或无机预处理, 可实现透射电镜的制备。该协议易于操作, 并确保了去细胞的高效率。透射电镜显示, 在静态或搅拌培养条件下, TSCC 细胞具有良好的细胞相容性, 使 TSCC 模型得以构建。自制的生物反应器也用于细胞培养的持续搅拌条件。应用 TEM 重建 TSCC 显示了类似临床 TSCC 组织病理学的特点和性质, 提示 TSCC 研究的潜力。
Introduction
舌有多种重要功能, 如吞咽、发音和味觉。因此, 舌功能的损害对患者的生活质量有很大的影响1。口腔内最常见的恶性肿瘤是舌鳞状细胞癌 (TSCC), 通常发生在饮酒或吸烟2的人身上。
近年来, TSCC 的基础研究取得了很小的进展。缺乏有效的体外研究模式仍然是最大的问题之一。因此, 细胞外基质 (ECM) 结果是一个潜在的解决方案。由于 ecm 是由高度组织的矩阵元件组成的复杂网络框架, 因此具有 ecm 类结构和成分的脚手架材料将胜任癌症研究。瓣膜 ecm 能够完美地为细胞从同一来源的体外提供利基, 这是 ecm 最显著的优势。
ECM 可以通过去细胞使用洗涤剂和酶将细胞成分从组织中去除。各种 ECM 组件, 包括胶原蛋白、纤连蛋白和瓣膜基质层粘连蛋白, 为培养细胞提供了一种类似于组织的微环境, 促进了细胞的存活、增殖和分化3。此外, 在 ECM 中缺乏细胞成分的情况下, 移植的免疫原性可降至最低水平。
到目前为止, 瓣膜 ECM 的制备方法已经尝试了不同的组织和器官, 如心脏4,5,6,7, 肝8,9,10 ,11, 肺12,13,14,15,16,17, 和肾脏18,19,20. 然而, 在我们最了解的情况下, 没有就舌头上的类似工作找到相关的研究。
在本研究中, 瓣膜舌外基质 (TEM) 是通过一系列物理、化学和酶处理, 高效、廉价地制备出来的。然后用透射电镜对体外TSCC 进行了重述, 对 TSCC 的行为和发育进行了适当的模拟。tem 具有良好的生物相容性以及引导细胞到组织特异性的能力, 这表明 tem 在 TSCC 研究3中可能具有很大的潜力。此处显示的协议为研究 TSCC 的发病机制或临床治疗的研究者提供了选择。
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Protocol
所有动物工作都是按照《动物福利法》、《机构指南》和中山大学动物保育和使用委员会批准的。
1. 制备 TEM
- 用不育的手术剪刀和镊子来执行小鼠颈椎脱位并去除舌头。
- 浸泡在75% 乙醇3分钟的舌头, 然后把每一个舌头到1.5 毫升离心 (EP) 管与1毫升的10毫米无菌磷酸盐缓冲溶液 (PBS)。
注意: PBS 在以下所有步骤中的浓度与此步骤中的浓度相同。 - 冷冻解冻细胞裂解: 将 EP 管中的舌头冻成-80 摄氏度, 1 小时, 然后在室温下将舌头解冻45分钟3圈。
- 用手术针将每条舌头装入手术缝合线上, 用一小块不育的锡纸包裹缝合的末端。在不育条件下, 在含有75% 乙醇的3.5 厘米或6厘米培养皿中进行操作。
注: 每个手术缝合的适当长度约为20厘米, 每块锡纸的适当尺寸约为0.3 厘米2 (1 厘米 x 0.3 厘米)。舌头应该装在锡纸附近。 - 三十年代用3.5 厘米或6厘米培养皿冲洗每舌3毫升的无菌 PBS. 在无菌条件下执行此操作。
- 用超纯水冲洗舌头: 将 ampicilin 放入一个宽口瓶中, 250 毫升的无菌超纯水, 最终浓度为90µg/毫升。把舌头放进装有搅拌棒的瓶子里。拧紧瓶盖, 部分缝线留在瓶子外。在无菌条件下执行此操作。
注: 可将多达5种舌头放入同一瓶中, 考虑缠绕缝线。锡纸在瓶子的缝合端, 以防止舌头滑脱。舌头应该被放置 2 cm 高从瓶子的底部, 调整长度的缝合留在瓶子内。此注释还用于步骤1.8、1.10、1.12 和1.16。 - 把瓶子放在磁力搅拌器上12小时。
- 用氯化钠冲洗舌头: 将 ampicilin 添加到一个宽口瓶中, 250 毫升无菌1米氯化钠, 最终浓度为90µg/毫升。把舌头和搅拌棒放进瓶子里。拧紧瓶盖, 部分缝线留在瓶子外。在无菌条件下执行此操作。
- 把瓶子放在磁力搅拌器上24小时。
- 细胞裂解的海卫 X-100: 添加 ampicilin 到最后浓度的90µg/毫升成一个宽口瓶与250毫升无菌2% 海卫 X-100 在 PBS。把舌头和搅拌棒放进瓶子里。拧紧瓶盖, 部分缝线留在瓶子外。在无菌条件下执行此操作。
- 把瓶子放在磁力搅拌器上48小时。
- 洗舌头与 CaCl2/氯化镁2: 添加 ampicilin 到一个宽口瓶与250毫升无菌5毫米 CaCl2/氯化镁2到最后浓度90µg/毫升。把舌头和搅拌棒放进瓶子里。拧紧瓶盖, 部分缝线留在瓶子外。在无菌条件下执行此操作。
- 把瓶子放在磁力搅拌器上24小时。
- DNase 消化: 添加1毫升的汉克平衡盐溶液 (HBSS) 到每个 EP 管。将 DNase 分别添加到 HBSS 中, 最终浓度为300µM. 将每一舌移入每个 EP 管, 并将部分缝合到管外。在无菌条件下执行此操作。
注: 在本步骤中, 确保保留在瓶子内的缝合部分也留在 ep 管内, 并确保在前一步骤中保持在瓶外的缝合部分也保持在本步骤的 ep 管之外。 - 在37摄氏度的 EP 管中孵育舌头24小时。
- 用 pbs 冲洗舌头: 将 ampicilin 加入250毫升无菌 pbs 的宽口瓶中, 最终浓度为90µg/毫升。把舌头和搅拌棒放进瓶子里。拧紧瓶盖, 部分缝线留在瓶子外。在无菌条件下执行此操作。
- 把瓶子放在磁力搅拌器上24小时。
- 将所制备的 TEM 在无菌 PBS 中贮存4摄氏度, 直至使用。
2. 三维 (3D) TSCC 的重建
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静态 TSCC 模型构造
- 种子 1.0 x 106单 TSCC 细胞 (Cal27) 成3.5 厘米培养皿。添加3毫升的 Dulbecco 的改良鹰的 medium/F12 (DF12), 含有10% 胎牛血清 (血清), 90 µg/毫升 ampicilin, 90 µg/毫升卡那霉素。
- 培养的 Cal27 细胞在37°c 2 至3天。确保细胞覆盖至少60% 区域的盘子底部。
- 将透射电镜加载到培养皿中的 Cal27 单层上。
- 在37摄氏度的28天内, 将盘子放入 CO2孵化器中。
- 在细胞培养过程中每天刷新培养基。在孵化器中的 CO2浓度是5%。
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搅拌 TSCC 模型施工
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自制搅拌 minibioreactor 的研制
- 从10毫升注射器中取出柱塞。
- 在杆的下端附近挖一个孔 (直径1厘米), 并在孔中装入搅拌杆。
- 在塑料宽口瓶的瓶盖中央挖一个孔 (直径0.5 厘米), 并将活塞杆穿过瓶盖。
- 切割50毫升离心管的一半, 并将其焊接在瓶盖的外侧。
- 通过将拉杆与与鱼钩相连的钓线包裹起来, 将鱼钩连接到拉杆上。
注: 最多可连接4鱼钩杆。 - 在使用前先将自制的复合釜压蒸。
注: 请勿蒸压塑料宽口瓶。在培养细胞时使用新的无菌塑料宽口瓶。
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自制搅拌 minibioreactor 的研制
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动态细胞培养
- 种子 1.0 x 106单 Cal27 细胞在自制的 minibioreactor。添加150毫升的 DF12 培养基, 其中含有10% 的血清, 90 µg/毫升 ampicilin, 90 µg/毫升卡那霉素。
- 使用连接到杆上的鱼钩将 TEM 加载到 minibioreactor 上。
- 拧紧瓶盖, 将 minibioreactor 放在磁力搅拌器上。激活 minibioreactor 在 200 rpm 在 CO2孵化器在37°c 7 到14天。
注: co2孵化器中 co2的浓度为5%。
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Representative Results
本议定书的编写 TEM 证明是有效和适当的。与母语组织相比, 透射电镜显示出完美的去细胞。去细胞的疗效经苏木精-伊红染色 (图 1A B) 证实。he 染色结果显示透射电镜核染色完全消失 (图 1B)。此外, 从先前的工作中 dna 含量的量化表明, dna 几乎完全从 TEM3中去除。该协议在去除细胞成分的同时也显示了对组织完整性的罕见损害 (图 1B)。
3D. 采用 TEM 和自制 minibioreactor (图 2a B) 进行 TSCC 重建, 取得了令人满意的效果。he 染色表明, TEM 中的 Cal27 细胞呈现典型的 TSCC 病理特征 (图 2C D)。搅拌培养条件下的细胞在不同病变区域呈现单细胞迁移 (图 2C) 或集体迁移 (图 2D)。在静态培养条件下, Cal27 细胞在 TEM 中也形成了侵入性结构, 但花了较长的时间 (图 2E)。此外, 人类骨肉瘤细胞系 U2OS 也被引入到相同的搅拌培养系统。虽然 U2OS 细胞可以生活在培养基中, 但在 TEM 中找不到它们 (图 2F)。透射电镜对不同类型的癌细胞具有不同的生物相容性, 表明不同的肿瘤细胞可能需要不同的微环境。
图 1: 制备 TEM.(一) 他用老鼠的母语染色。刻度条 = 100 µm (B) 他从小鼠身上染色瓣膜透射电镜。刻度条 = 100 µm.请点击这里查看这个数字的大版本.
图 2: 经 TEM 重建 TSCC.(a) 自行制作的 minibioreactor 的概览。(B) 自行制作的 minibioreactor 的电镜加载位置的观点。(三) 用 TEM 对14天搅拌培养 TSCC 进行染色。单细胞侵入现象由黑色箭头表示。刻度条 = 50 µm (D) he 染色14天搅拌培养 TSCC 与 TEM。集体入侵现象由黑箭指示。刻度条 = 50 µm (E) he 染色28天静态培养 TSCC 与 TEM。单细胞侵入现象由黑色箭头表示。刻度条 = 100 µm (F) 他用 TEM 染色14天搅拌培养的 U2OS 细胞。刻度条 = 50 µm.请点击这里查看这个数字的大版本.
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Discussion
一个完善的瓣膜 ecm 制造协议应保留本机 ecm 成分, 同时去除组织中的细胞成分几乎完全21。尽管目前报告的去细胞协议需要通过血管灌流来去除蜂窝材料通过对流运输, 这里采用了机械搅拌, 称为传统的简单和廉价的方法22,23,24,25,26. 此外, 由于舌头富含 lingualis, 且有少量体积庞大的血管, 本议定书比上文所述的其他协议更适合舌组织。
此外, 该 TEM 生产的协议进行适当的适度强度去细胞, 避免破坏或解散可能是由高强度去细胞, 如月桂酸钠的基膜 (SDS) 治疗3。此外, 该议定书还有效地在鼠和猪的舌头 (没有显示的数据), 表明该方法可以普遍使用的舌头从不同物种3。
值得注意的是, 该协议中有一些关键步骤或细节, 这可能直接影响到结果。一个重要的步骤是通过 DNase 消化舌细胞。如果消化时间不够, 或者 DNase 工作不有效, 舌头的去细胞就很难实现。另一件值得注意的是, 考虑到 TEM 的损坏, 生物反应器的转速不应该太快。此外, 这种操作的无菌环境在协议中非常重要。
尽管上面有严格的规定, 但在一定程度上可以调整 TEM 准备的协议。用超纯水或 PBS 清洗舌头比议定书建议的时间多几个小时, 不会明显影响 TEM 的制作。然而, 由于该议定书需要将近一周的时间来准备 tem, 它无法满足对 tem 的即时要求。
透射电镜在 TSCC 模型施工中具有重要的价值。与自制的 minibioreactor, 悬浮 Cal27 细胞可以附着在 TEM 中, 形成类似人类 TSCC 病理组织学3的相似浸润结构。这可能是一个理想的模型, 监测和调查 TSCC 的侵袭和转移的体外。该模型还有利于 TSCC 药物试验的工作。考虑到这一切, 这里提出的协议在 TSCC 研究中可能具有很大的潜力。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者对国家自然科学基金 (31371390)、国家高新技术发展项目 (2014AA020702) 和广东省科技计划 (2016B030231001) 的研究资助给予了认可。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57-BL/6J mice | Sun Yat-sen University Laboratory Animal Center | ||
| Ethanol | Guangzhou Chemical Reagent Factory | HB15-GR-2.5L | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A501218 | |
| Potassium chloride | Sangon Biotech | A100395 | |
| Dibasic Sodium Phosphate | Guangzhou Chemical Reagent Factory | BE14-GR-500G | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sangon Biotech | A501211 | |
| 1.5 mL EP tube | Axygen | MCT-150-A | |
| Ultra-low temperature freezer | Thermo Fisher Scientific | ||
| 3.5 cm cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 153066 | |
| 6 cm cell culture dish | Greiner | 628160 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | V900502 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 746495 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 449164 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| Magnesium sulphate | Sangon Biotech | A601988 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 158968 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393 | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | PHR1487 | |
| Surgical suture | Shanghai Jinhuan | ||
| 250 mL wide-mouth bottle | SHUNIU | 1407 | |
| Magnetic stirrer | AS ONE | 1-4602-32 | |
| CO2 incubator | SHEL LAB | SCO5A | |
| 10 mL syringe | Hunan Pingan | ||
| 50 mL centrifuge tube | Greiner | 227270 | |
| Cal27 cell | Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank | Tongue squamous cell carcinoma cell line | |
| U2OS cell | Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank | Human osteosarcoma cell line | |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D0547 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Hepes free acid | BBI | A600264 | |
| FBS | Hyclone | SH30084.03 | |
| 4 °C fridge | Haier | ||
| Water purifier | ELGA | ||
| Hemocytometer | BLAU | 717805 |
References
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