Summary
Hier wird eine Methode für die Vorbereitung der Zunge extrazellulären Matrix (TEM) mit effizienten Decellularization angezeigt. Die TEM kann als funktionelle Gerüste für den Wiederaufbau eines Zunge Squamous Zelle Krebsgeschwür (TSCC) Modells unter statischen oder gerührt Kulturbedingungen verwendet werden.
Abstract
Um eine effektive und realistische Modell für Zunge Plattenepithelkarzinom Karzinom (TSCC) in Vitrozu konstruieren, die Methoden zu produzieren decellularized Zunge extrazelluläre Matrix (TEM) entstanden funktionelle Gerüste für TSCC Bau bietet. TEM bietet eine in-vitro- Nische für Zellwachstum und Differenzierung Zellmigration. Die Mikrostrukturen der native extrazelluläre Matrix (ECM) und biochemische Kompositionen aufbewahrt in der decellularized Matrix bieten gewebespezifischen Nischen für die Verankerung von Zellen. Die Herstellung von TEM kann durch Deoxyribonuclease (DNase) Verdauung begleitet mit einer schweren organischen oder anorganischen Vorbehandlung realisiert werden. Dieses Protokoll ist einfach zu bedienen und sorgt für hohe Effizienz für die Decellularization. Die TEM zeigte günstige Cytocompatibility für TSCC Zellen unter statischen oder gerührt Kulturbedingungen, ermöglicht den Bau des Modells TSCC. Ein self-made-Bioreaktor wurde auch für die anhaltende gerührt Bedingung für die Zellkultur verwendet. Rekonstruierte TSCC mit TEM zeigte die Merkmale und Eigenschaften ähnlich klinische TSCC Histopathologie, was darauf hindeutet das Potenzial in der TSCC Forschung.
Introduction
Die Zunge hat verschiedene wichtige Funktionen wie Schlucken, Artikulation und Verkostung. Die Beeinträchtigung der Funktion der Zunge hat so großen Einfluss auf Patienten Lebensqualität1. Die häufigsten malignen Erkrankungen in der Mundhöhle ist Zunge Squamous Zelle Krebsgeschwür (TSCC), die in der Regel tritt bei Menschen, die Alkohol trinken oder Rauchen Tabak2.
In den letzten Jahren wurden in der Grundlagenforschung auf TSCC wenig Fortschritte erzielt. Der Mangel an effizienter in-vitro- Forschung Modelle bleibt eines der größten Probleme sein. So entpuppt sich die extrazelluläre Matrix (ECM) eine mögliche Lösung sein. Da ECM ein komplexes Netzwerk Frame hochorganisierte Matrix Komponenten zusammengesetzt ist, wäre eine ECM-artige Struktur und Zusammensetzung Gerüstmaterial zuständigen für die Krebsforschung. Decellularized ECM bieten perfekt die Nische für die Zellen aus der gleichen Herkunft in Vitro, die entpuppt sich als der wichtigste Vorteil von ECM.
ECM kann mit zellulären Komponenten aus dem Gewebe durch die Decellularization mit Wasch- und Enzyme entfernt wird einbehalten. Verschiedenen ECM-Komponenten, einschließlich Kollagen, Fibronektin und Laminin in decellularized Matrix bieten eine Native-Gewebe-Like Mikroumgebung für kultivierten Zellen, fördert das Überleben, Proliferation und Differenzierung von Zellen3. Darüber hinaus kann die Immunogenität zur Transplantation auf einem minimalen Niveau mit der Abwesenheit von zellulären Bestandteilen in ECM reduziert werden.
Bisher sind Fertigungsverfahren für decellularized ECM in verschiedenen Geweben und Organen, wie Herz4,5,6,7, Leber8,9,10 versucht worden ,11, Lunge12,13,14,15,16,17und Niere18,19 , 20. keine relevanten Forschung hat jedoch auf ähnliche Arbeiten in der Zunge nach bestem Wissen und gewissen gefunden werden.
In dieser Studie wurde decellularized Zunge extrazelluläre Matrix (TEM) durch eine Reihe von physikalischen, chemischen und enzymatischen Behandlung effizient und kostengünstig hergestellt. Dann wurde die TEM zur TSCC in Vitrorekapitulieren zeigt eine entsprechende Simulation für TSCC Verhalten und Entwicklung. TEM hat gute Biokompatibilität sowie die Fähigkeit, die Zellen der Gewebe-spezifische Nische zu führen gibt an, dass TEM ein großes Potenzial in TSCC Forschung3haben kann. Die hier gezeigte Protokoll bietet eine Auswahl für Forscher auf Pathogenese oder Therapien von TSCC.
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Protocol
Alle tierische Arbeit war gemäss Tierschutzgesetz, institutionellen Richtlinien durchgeführt und durch institutionelle Animal Care and Use Committee, Sun Yat-Sen-Universität genehmigt.
1. Vorbereitung der TEM
- Ausführen von Mäusen durch zervikale Dislokation und entfernen Sie die Zungen mit sterile chirurgische Scheren und Pinzetten.
- Tauchen Sie die Zungen in 75 % Ethanol für 3 min, dann setzen jede Zunge in 1,5 mL Eppendorf (EP)-Röhrchen mit 1 mL 10 mM steril Phosphat gepufferte Lösung (PBS).
Hinweis: Die Konzentration der PBS in den folgenden Schritten ist identisch mit der Konzentration in diesem Schritt. - Zell-Lyse durch Frost-Tau-wechseln: Einfrieren der Zungen in EP-Rohre bei-80 ° C für 1 h, und dann auftauen die Zungen bei Raumtemperatur für 45 min 3 Zyklen.
- Laden Sie jede Zunge auf ein Stück der chirurgischen Naht mit einer chirurgischen Nadel und wickeln Sie das Ende der Naht mit einem kleinen Stück sterile Alufolie. Führen Sie den Vorgang in der Kulturschale 3,5 cm oder 6 cm mit 75 % igem Ethanol unter sterilen Bedingungen.
Hinweis: Die entsprechende Länge der einzelnen chirurgischen Naht ist ca. 20 cm und die entsprechende Größe der jedes Stück Alufolie ist etwa 0,3 cm2 (1 cm × 0,3 cm). Die Zunge sollte in der Nähe der Alufolie geladen werden. - Spülen Sie jede Zunge mit 3 mL sterile PBS 30 S. führen diese Operation unter sterilen Bedingungen in der Kulturschale 3,5 cm oder 6 cm.
- Waschen Sie die Zungen mit Reinstwasser: eine Endkonzentration von 90 µg/mL Ampicilin in eine breit-Mund-Flasche mit 250 mL steriles ultrapure Wasser hinzufügen. Legen Sie die Zungen in die Flasche mit einer Stir Bar. Ziehen Sie die Kronkorken mit Bestandteil der Naht bleibt außerhalb der Flaschenhals. Führen Sie diesen Vorgang unter sterilen Bedingungen.
Hinweis: Bis zu 5 Sprachen können in der gleichen Flasche unter Berücksichtigung des Nahtmaterials Schlinger genommen werden. Die Alufolie ist am Ende der Naht in der Flasche zu verhindern, dass die Zunge rutscht. Die Zungen sollte 2 cm hoch vom Boden der Flasche durch Einstellen der Länge des Nahtmaterials in der Flasche verbleibende platziert werden. Dieser Hinweis ist auch für Schritte 1,8, 1.10 und 1.12 1.16. - Setzen Sie die Flasche auf einen Magnetrührer für 12 h.
- Waschen Sie die Zungen mit NaCl: Fügen Sie Ampicilin in einer breit-Mund-Flasche mit 250 mL sterile 1 M NaCl, eine Endkonzentration von 90 µg/mL. Bewegen Sie die Zungen und Stir Bar in der Flasche. Ziehen Sie die Kronkorken mit Bestandteil der Naht bleibt außerhalb der Flaschenhals. Führen Sie diesen Vorgang unter sterilen Bedingungen.
- Setzen Sie die Flasche auf einen Magnetrührer für 24 h.
- Zell-Lyse von Triton x-100: Ampicilin hinzufügen, eine Endkonzentration von 90 µg/mL in eine breit-Mund-Flasche mit 250 mL sterile 2 % Triton x-100 mit PBS-Puffer. Bewegen Sie die Zungen und Stir Bar in der Flasche. Ziehen Sie die Kronkorken mit Bestandteil der Naht bleibt außerhalb der Flaschenhals. Führen Sie diesen Vorgang unter sterilen Bedingungen.
- Setzen Sie die Flasche auf einen Magnetrührer für 48 h.
- Zungen mit CaCl2/MgCl2waschen: eine Endkonzentration von 90 µg/mL Ampicilin in eine breit-Mund-Flasche mit 250 mL sterile 5 mm CaCl2/MgCl2 hinzufügen. Bewegen Sie die Zungen und Stir Bar in der Flasche. Ziehen Sie die Kronkorken mit Bestandteil der Naht bleibt außerhalb der Flaschenhals. Führen Sie diesen Vorgang unter sterilen Bedingungen.
- Setzen Sie die Flasche auf einen Magnetrührer für 24 h.
- Verdauung durch DNase: Fügen Sie 1 mL Hank es ausgewogen Salzlösung (HBSS) zu jedem EP-Röhrchen. Fügen Sie DNase in HBSS bzw. um eine Endkonzentration von 300 µM. verschieben Sie jede Zunge in jedes EP-Rohr, mit einem Teil des Nahtmaterials außerhalb der Röhre. Führen Sie diesen Vorgang unter sterilen Bedingungen.
Hinweis: Stellen Sie sicher, dass der Teil der Naht, die in die Flaschen in den vorherigen Schritten bleibt auch in der EP-Röhre in diesem Schritt bleibt, und stellen Sie sicher, dass der Teil der Naht, die außerhalb der Flaschen in den vorherigen Schritten bleibt auch außerhalb der EP-Rohr in diesem Schritt bleibt. - Inkubieren Sie die Zungen in EP-Röhrchen bei 37 ° C für 24 h.
- Die Zungen mit PBS waschen: Fügen Sie Ampicilin in einer breit-Mund-Flasche mit 250 mL sterile PBS, eine Endkonzentration von 90 µg/mL. Bewegen Sie die Zungen und Stir Bar in der Flasche. Ziehen Sie die Kronkorken mit Bestandteil der Naht bleibt außerhalb der Flaschenhals. Führen Sie diesen Vorgang unter sterilen Bedingungen.
- Setzen Sie die Flasche auf einen Magnetrührer für 24 h.
- Die vorbereitete TEM in sterilen PBS bei 4 ° C bis zur Verwendung aufbewahren.
(2) dreidimensionale (3D) Rekonstitution von TSCC
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Statische TSCC-Modellbau
- 1.0 x 106 einzelne TSCC Samenzellen (Cal27) in einer Kulturschale 3,5 cm. Fügen Sie 3 mL Dulbecco des Adlers Medium/F12 (DF12) mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 90 µg/mL Ampicilin und 90 µg/mL Kanamycin modifiziert.
- Kultur der Cal27 Zellen bei 37 ° C für 2 bis 3 Tage. Stellen Sie sicher, dass die Zellen von mindestens 60 % decken Bereich der unteren Schale.
- Laden Sie TEM auf der Cal27-Monolayer in der Kulturschale.
- Setzen Sie die Schale in eine CO2 Inkubator bei 37 ° C für 28 Tage.
- Aktualisieren Sie das Kulturmedium jeden Tag bei der Zelle Kultur. Die CO2 -Konzentration in den Inkubator beträgt 5 %.
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Gerührten TSCC-Modellbau
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Vorbereitung von einem selbstgebauten gerührten minibioreactor
- Nehmen Sie den Kolben aus einer 10 mL Spritze.
- Graben Sie ein Loch (Durchmesser von 1 cm) in der Nähe der Talstation des Stabes und Laden einer Stir Bar in das Loch.
- Graben Sie ein Loch (Durchmesser von 0,5 cm) in der Mitte der Deckel der Flasche eine Plastikflasche breit-Mund und legte die Kolbenstange durch die GAP.
- Schneiden Sie die Hälfte einer 50 mL Zentrifugenröhrchen und auf der äußeren Seite der Deckel der Flasche zu Schweißen.
- Legen Sie Angelhaken auf der Rute durch Umwickeln mit Angelschnüre, die an den Angelhaken gebunden sind.
Hinweis: Können bis zu 4 Angelhaken zu einem Stab angebracht werden. - Autoklaven der selbstgemachten Komplex vor Gebrauch.
Hinweis: Führen Sie nicht Autoklaven die Plastikflasche breit-Mund. Verwenden Sie eine neue sterile Plastikflasche breit-Mund während der Kultivierung von Zellen.
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Vorbereitung von einem selbstgebauten gerührten minibioreactor
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Dynamische Zellkultur
- Samen 1.0 x 106 Cal27 Einzelzellen in selbstgebauten Minibioreactor. Hinzugeben Sie 150 mL DF12 Medium enthält 10 % FBS, 90 µg/mL Ampicilin und 90 µg/mL Kanamycin.
- Laden Sie TEM auf der Minibioreactor mit den Angelhaken an der Rute befestigt.
- Ziehen Sie den Deckel und legen Sie die Minibioreactor auf einen Magnetrührer. Aktivieren Sie die Minibioreactor bei 200 u/min in einem CO2 Inkubator bei 37 ° C für 7 bis 14 Tage.
Hinweis: Die Konzentration von CO2 in die CO2 Inkubator beträgt 5 %.
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Representative Results
Dieses Protokoll für die Vorbereitung der TEM entpuppt sich als effizient und angemessen. Die TEM zeigte perfekte Decellularization im Vergleich mit Muttersprache Gewebe. Hämatoxylin-Eosin (HE) Färbung (Abbildung 1A-B) bestätigte die Wirksamkeit von Decellularization. Die HE-Färbung Ergebnisse ergab völlige Verschwinden der nuklearen Färbung in TEM (Abbildung 1B). Darüber hinaus zeigten DNA Inhalt Quantifizierung von früheren Arbeiten, dass DNA von TEM3fast vollständig entfernt wurde. Dieses Protokoll zeigte auch seltene Schäden an Gewebe Integrität beim Entfernen von Zellkomponenten (Abbildung 1B).
3D Rekonstruktion des TSCC TEM mit einer selbstgemachten Minibioreactor (Abbildung 2A-B) erzielt zufriedenstellende Ergebnisse. ER Färbung zeigte, dass Cal27 Zellen in der TEM typische TSCC pathologischen Merkmale (Abbildung 2C-D) vorgestellt. Die Zellen in gerührten Kulturbedingungen dargestellt einzellige Migration (Abbildung 2C) oder kollektiven Migration (Abbildung 2D) in verschiedenen Läsion Bereichen. In statischen Kulturbedingungen Cal27 Zellen auch invasive Strukturen in der TEM gebildet, aber es hat länger gedauert (Abb. 2E). Darüber hinaus wurde eine menschlichen Osteosarkom-Zelllinie U2OS auch mit dem gleichen gerührt Kultursystem eingeführt. Obwohl U2OS Zellen in das Kulturmedium Leben konnte, waren sie nicht in der TEM (Abbildung 2F) gefunden. Die TEM zeigte verschiedene Biokompatibilität für verschiedene Arten von Krebszellen, was darauf hindeutet, dass verschiedene Tumorzellen möglicherweise unterschiedliche Mikroumgebungen zu florieren.
Abbildung 1 : Vorbereitung der TEM. (A) HE Färbung der Muttersprachen von Mäusen. Maßstabsleiste = 100 µm. (B) HE Färbung des decellularized TEM von Mäusen. Maßstabsleiste = 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Wiederherstellung der TSCC durch TEM. (A) den Überblick über ein self-made Minibioreactor. (B) die Ansicht der TEM Ladeposition ein self-made Minibioreactor. (C) er Färbung des 14-tägigen gerührt kultivierten TSCC mit TEM. Einzelne Zelle Invasion Phänomene sind durch Schwarze Pfeile angedeutet. Maßstabsleiste = 50 µm. (D) er Färbung des 14-tägigen gerührt kultivierten TSCC mit TEM. Kollektive Invasion Phänomene sind durch Schwarze Pfeile angedeutet. Maßstabsleiste = 50 µm. (E) er Färbung der 28-Tage-statische TSCC mit TEM kultiviert. Einzelne Zelle Invasion Phänomene sind durch Schwarze Pfeile angedeutet. Maßstabsleiste = 100 µm. (F) HE Färbung des 14-tägigen gerührt kultivierten U2OS Zellen mit TEM. Maßstabsleiste = 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Ein gut etabliertes Protokoll für decellularized ECM-Herstellung sollten die native ECM Zusammensetzung beim Entfernen von zellulären Bestandteilen in Geweben behalten fast komplett21. Trotz aktuell gemeldete Decellularization Protokolle erfordern Perfusion durch das Gefäßsystem, zellulare Werkstoffe durch konvektiven Transport entfernen, mechanische Agitation hier, wurde bekannt als eine traditionelle einfache und preiswerte Methode22 , 23 , 24 , 25 , 26. außerdem, da die Zunge reich an Lingualis ist und einige sperrige vaskulären Schiffe hat, dieses Protokoll eignet sich für Zunge Gewebe als andere Protokolle, die oben beschriebenen.
Darüber hinaus führt dieses Protokolls für TEM-Produktion eine entsprechende Moderate Stärke Decellularization, Vermeidung der Zerstörung oder Auflösung der Basis Membran, die durch hochfeste Decellularization verursacht werden kann, wie z. B. Sodium Dodecyl Sulfat ( SDS) Behandlung3. Darüber hinaus das Protokoll auch effektiv gearbeitet in der Muttersprache des Ratte und Schwein (Daten nicht gezeigt), was darauf hindeutet, dass die Methode häufig auf Zungen von verschiedenen Arten3verwendet werden könnte.
Es ist erwähnenswert, dass es gibt einige wichtige Schritte oder Details in diesem Protokoll, die direkt die Ergebnisse beeinflussen könnten. Ein wichtiger Schritt ist die Verdauung der Zunge Zellen durch DNase. Wenn die Dauer der Verdauung nicht genug ist oder die DNase nicht effizient funktioniert, würde die Decellularization der Zunge kaum erreicht werden. Eine andere Sache, die beachtet werden sollte ist, dass die Drehzahl für den Bioreaktor sollte nicht zu schnell, wenn man bedenkt die Schäden an TEM. Darüber hinaus ist eine sterile Umgebung für diesen Vorgang sehr wichtig im Protokoll.
Trotz der strengen Regeln oben kann das Protokoll für TEM-Vorbereitung zu einem gewissen Grad eingestellt werden. Waschen die Zungen mit Reinstwasser oder PBS für ein paar Stunden mehr als die Zeit die das Protokoll schlägt die Herstellung von TEM offensichtlich nicht beeinträchtigen würde. Aber, da das Protokoll fast eine Woche benötigt um die TEM vorzubereiten, kann nicht es sofort für TEM Anforderungen.
Die TEM zeigt großen Wert in TSCC-Modellbau. Zusammen mit einem selbstgebauten Minibioreactor können hängende Cal27 Zellen in TEM und Form ähnliche infiltrative Struktur ähnelt menschlichen TSCC Histopathologie3anbringen. Dies wäre ein ideales Modell für die Überwachung und Untersuchung der Invasion und Metastasierung von TSCC in Vitro. Das Modell könnte auch die Arbeit an Drogen-Tests auf TSCC profitieren. Unter Berücksichtigung all dieser kann das Protokoll hier großes Potenzial in TSCC Forschung haben.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die Autoren erkennen die Unterstützung von Forschungsstipendien von National Natural Science Foundation of China (31371390), das Programm des staatlichen Hightech-Development Project (2014AA020702) und das Programm von Guangdong Wissenschaft und Technik (2016B030231001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57-BL/6J mice | Sun Yat-sen University Laboratory Animal Center | ||
| Ethanol | Guangzhou Chemical Reagent Factory | HB15-GR-2.5L | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A501218 | |
| Potassium chloride | Sangon Biotech | A100395 | |
| Dibasic Sodium Phosphate | Guangzhou Chemical Reagent Factory | BE14-GR-500G | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sangon Biotech | A501211 | |
| 1.5 mL EP tube | Axygen | MCT-150-A | |
| Ultra-low temperature freezer | Thermo Fisher Scientific | ||
| 3.5 cm cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 153066 | |
| 6 cm cell culture dish | Greiner | 628160 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | V900502 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 746495 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 449164 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| Magnesium sulphate | Sangon Biotech | A601988 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 158968 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393 | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | PHR1487 | |
| Surgical suture | Shanghai Jinhuan | ||
| 250 mL wide-mouth bottle | SHUNIU | 1407 | |
| Magnetic stirrer | AS ONE | 1-4602-32 | |
| CO2 incubator | SHEL LAB | SCO5A | |
| 10 mL syringe | Hunan Pingan | ||
| 50 mL centrifuge tube | Greiner | 227270 | |
| Cal27 cell | Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank | Tongue squamous cell carcinoma cell line | |
| U2OS cell | Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank | Human osteosarcoma cell line | |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D0547 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Hepes free acid | BBI | A600264 | |
| FBS | Hyclone | SH30084.03 | |
| 4 °C fridge | Haier | ||
| Water purifier | ELGA | ||
| Hemocytometer | BLAU | 717805 |
References
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