Summary
Um método é mostrado aqui para a preparação da matriz extracelular de língua (TEM) com decellularization eficiente. A temperatura pode ser usada como andaimes funcionais para a reconstrução de um modelo de carcinoma de células escamosas (TSCC) língua sob as condições de cultura estático ou mexido.
Abstract
A fim de construir um modelo eficaz e realista para língua escamosas carcinoma (TSCC) em vitro, os métodos foram criados para produzir decellularized língua matriz extracelular (TEM) que fornece andaimes funcionais para construção de TSCC. TEM fornece um nicho em vitro para crescimento celular, diferenciação e migração celular. As microestruturas de nativo da matriz extracelular (ECM) e composições bioquímicas retidas na matriz decellularized fornecem nichos de tecido-específica para ancoragem de células. Fabricação de temperatura pode ser realizada por digestão desoxirribonuclease (DNase), acompanhada de uma séria de pré-tratamento orgânico ou inorgânico. Este protocolo é fácil de operar e garante alta eficiência para o decellularization. A temperatura mostrou favorável cytocompatibility para células TSCC sob condições de cultura estático ou mexido, que permite a construção do modelo de TSCC. Um biorreator self-made também foi utilizado para a condição de mexido persistente para cultura de células. TSCC reconstruída usando TEM mostrou as características e propriedades, assemelhando-se a clínica histopatologia TSCC, sugerindo o potencial em investigação TSCC.
Introduction
A língua tem várias funções importantes, tais como deglutição, articulação e degustação. Assim, o comprometimento da função da língua tem grande impacto na qualidade de vida de1 pacientes. A malignidade mais comum na cavidade oral é a língua carcinoma de células escamosas (TSCC), que normalmente ocorre em pessoas que bebem álcool ou fumam tabaco2.
Nos últimos anos, pouco progresso foi alcançado na investigação fundamental na TSCC. A falta de investigação eficiente em vitro modelos permanece para ser um dos maiores problemas. Assim, a matriz extracelular (ECM) acaba por ser uma solução em potencial. ECM é um quadro de rede complexo composto de componentes de matriz altamente organizada, tendo um ECM-como a estrutura e a composição de materiais de andaime seria competentes para pesquisa do câncer. Decellularized ECM perfeitamente pode fornecer o nicho de células de mesma origem em vitro, que acaba por ser a mais significativa vantagem de ECM.
ECM pode ser mantido com componentes celulares, sendo retirados os tecidos através da decellularization, usando detergentes e enzimas. Vários componentes de ECM, incluindo colágeno, fibronectina e laminina na matriz decellularized fornecem um microambiente nativo-tecido-como para culturas de células, promovendo a sobrevivência, proliferação e diferenciação das células3. Além disso, a imunogenicidade para transplante pode ser reduzida a um nível mínimo, com a ausência de componentes celulares em ECM.
Até agora, os métodos de fabricação para ECM decellularized têm sido tentados em diferentes tecidos e órgãos, como coração4,5,6,7, fígado8,9,10 ,11, pulmão12,13,14,15,16,17e18,de rim19 , 20. no entanto, nenhuma pesquisa relevante tem ser encontrado em trabalho semelhante na língua com o melhor de nosso conhecimento.
Neste estudo, matriz extracelular de língua decellularized (TEM) foi fabricada tanto de forma eficiente e barata por uma série de tratamento físico, químico e enzimático. A temperatura foi usada para recapitulate TSCC em vitro, mostrando uma simulação apropriada para o desenvolvimento e comportamento TSCC. TEM tem boa biocompatibilidade, bem como a capacidade de guiar as células para o nicho de tecido-específica, que indica que TEM pode ter grande potencial em TSCC pesquisa3. O protocolo mostrado aqui fornece uma escolha para pesquisadores estudando na patogênese ou terapias clínicas de TSCC.
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Protocol
Todo o trabalho animal foi efectuado de acordo com o ato do bem-estar animal, as orientações institucionais e aprovado pela Comissão de uso, Sun Yat-sen University e institucional Cuidado Animal.
1. preparação de TEM
- Executar os ratos por deslocamento cervical e remover as línguas usando uma pinça e tesoura cirúrgica estéril.
- Mergulhe as línguas em etanol a 75% por 3 min, em seguida, coloque cada língua em um 1,5 mL tubo Eppendorf (EP) com 1 mL de fosfato estéril de 10 mM em buffer solução (PBS).
Nota: A concentração de PBS em todas as etapas a seguir é o mesma que a concentração nesta etapa. - Lise de células por congelar descongelar: congelar as línguas em tubos de EP a-80 ° C durante 1 h e depois descongelar as línguas à temperatura de 45 min por 3 ciclos.
- Carregar a cada língua em um pedaço de sutura cirúrgica, usando uma agulha cirúrgica e enrole a extremidade da sutura com um pequeno pedaço de papel alumínio estéril. Execute a operação em um prato de cultura 3,5 cm ou 6 cm contendo 75% de etanol em condições estéreis.
Nota: O comprimento adequado de cada pedaço de sutura cirúrgica é de cerca de 20 cm, e o tamanho adequado de cada pedaço de papel alumínio é cerca de 0,3 cm2 (1 cm x 0,3 cm). A língua deve ser carregada perto o papel alumínio. - Enxague cada língua com 3 mL de PBS estéril em um prato de cultura 3,5 cm ou 6 cm por 30 s. executar esta operação em condições estéreis.
- Lave a língua com água ultrapura: Adicionar ampicilina em um frasco de boca larga com 250 mL de água ultrapura esterilizada para uma concentração final de 90 µ g/mL. Colocar a língua no frasco que contém uma barra de agitação. Aperte a tampa de garrafa com parte da sutura permanecendo fora da garrafa. Execute esta operação em condições estéreis.
Nota: Até 5 línguas podem ser colocadas no mesmo frasco na consideração de entrelaçamento da sutura. O papel alumínio é no final da sutura na garrafa para impedir que a língua deslizar fora. As línguas devem ser colocadas 2 cm de altura do fundo da garrafa, ajustando o comprimento da sutura permanecendo dentro da garrafa. Esta nota é também para etapas 1.8, 1.10, 1.12 e 1,16. - Coloque a garrafa em um agitador magnético para 12h.
- Lave a língua com NaCl: Adicionar ampicilina em um frasco de boca larga com 250 mL de estéril 1 M NaCl a uma concentração final de 90 µ g/mL. Mova as línguas e a barra de agitação para a garrafa. Aperte a tampa de garrafa com parte da sutura permanecendo fora da garrafa. Execute esta operação em condições estéreis.
- Coloque a garrafa em um agitador magnético para 24h.
- Lise por Triton X-100 de célula: Adicionar ampicilina para uma concentração final de 90 µ g/mL em um frasco de boca larga com 250 mL de estéril 2% Triton X-100 em PBS. Mova as línguas e a barra de agitação para a garrafa. Aperte a tampa de garrafa com parte da sutura permanecendo fora da garrafa. Execute esta operação em condições estéreis.
- Coloque a garrafa em um agitador magnético por 48 h.
- Lave as línguas com CaCl2/MgCl2: Adicionar ampicilina em um frasco de boca larga com 250 mL de estéril 5 mM CaCl2/MgCl2 para uma concentração final de 90 µ g/mL. Mova as línguas e a barra de agitação para a garrafa. Aperte a tampa de garrafa com parte da sutura permanecendo fora da garrafa. Execute esta operação em condições estéreis.
- Coloque a garrafa em um agitador magnético para 24h.
- Digestão por DNase: adicionar 1 mL de Hank está equilibrada solução salina (HBSS) para cada tubo de EP. Adicionar DNase em HBSS, respectivamente, a uma concentração final de 300 µM. mover cada língua em cada tubo de EP, com parte da sutura do lado de fora do tubo. Execute esta operação em condições estéreis.
Nota: Certifique-se de que a parte da sutura que permanece dentro as garrafas nas etapas anteriores também permanece no interior do tubo EP nesta etapa e certifique-se de que a parte da sutura que permanece fora as garrafas nas etapas anteriores também permanece fora do tubo EP nesta etapa. - Incube as línguas em tubos de EP a 37 ° C por 24 h.
- Lave a língua com PBS: Adicionar ampicilina em um frasco de boca larga com 250 mL de PBS estéril para uma concentração final de 90 µ g/mL. Mova as línguas e a barra de agitação para a garrafa. Aperte a tampa de garrafa com parte da sutura permanecendo fora da garrafa. Execute esta operação em condições estéreis.
- Coloque a garrafa em um agitador magnético para 24h.
- Armazene a temperatura preparada em PBS estéril, a 4 ° C até o uso.
2. tridimensional (3D) reconstituição de TSCC
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Construção de modelo estática TSCC
- Semente de 1,0 x 106 TSCC células únicas (Cal27) em um prato de cultura de 3,5 cm. Adicione 3 mL de Dulbecco modificado da águia médio/F12 (DF12) contendo 10% fetal de soro bovino (FBS), 90 µ g/mL ampicilina e 90 µ g/mL canamicina.
- Células de cultura a Cal27 a 37 ° C por 2 a 3 dias. Certifique-se que as células cobrem pelo menos 60% a área da parte inferior do prato.
- Carregar TEM para a monocamada Cal27 a placa de cultura.
- Coloque o prato em uma incubadora de CO2 a 37 ° C por 28 dias.
- Atualize o meio de cultura todos os dias durante o processo de cultura de células. A concentração de CO2 na incubadora é de 5%.
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Construção de modelo mexida TSCC
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Preparação de um self-made minibioreactor mexido
- Retire o êmbolo de uma seringa de 10 mL.
- Escavar um furo (diâmetro de 1 cm) perto do terminal inferior da haste e carregar uma barra de agitação no buraco.
- Cavar um buraco (de 0,5 cm de diâmetro) no centro da rolha de uma garrafa de plástico de boca larga e colocar a haste do pistão através da tampa.
- Cortar a metade de um tubo de centrífuga de 50 mL e solda-lo no lado exterior da tampa da garrafa.
- Anexe anzóis na haste envolvendo a haste com linhas de pesca, que são amarrados para os anzóis.
Nota: Até 4 anzóis podem ser anexados a uma haste. - O complexo auto-suficiente antes do uso de autoclave.
Nota: Fazer não Autoclavar o frasco plástico de boca larga. Use um novo frasco plástico estéril de boca larga, enquanto o cultivo de células.
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Preparação de um self-made minibioreactor mexido
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Cultura celular dinâmico
- Semente de 1,0 x 106 Cal27 células únicas no self-made minibioreactor. Adicione 150 mL de meio de DF12 que contém 10% FBS, 90 µ g/mL ampicilina e canamicina 90 µ g/mL.
- Carregar TEM para o minibioreactor usando anzóis anexados à haste.
- Aperte a tampa do frasco e colocar o minibioreactor em um agitador magnético. Ative o minibioreactor a 200 rpm numa incubadora de CO2 a 37 ° C por 7 a 14 dias.
Nota: A concentração de CO2 , a incubadora de CO2 é de 5%.
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Representative Results
Este protocolo para a preparação de TEM acaba por ser eficiente e adequada. A temperatura mostrou decellularization perfeito, em comparação com os tecidos de língua nativa. A eficácia do decellularization foi confirmada pela hematoxilina-eosina (HE) coloração (Figura 1A-B). O HE coloração resultados revelados completo desaparecimento da coloração nuclear na temperatura (Figura 1B). Além disso, conteúda quantificação de DNA do trabalho anterior mostrou que o DNA foi quase completamente removido do TEM3. Este protocolo também mostrou raro danos à integridade do tecido ao remover componentes celulares (Figura 1B).
Reconstituição 3D de TSCC usando um self-made minibioreactor (Figura 2A-B) e o TEM alcançado resultados satisfatórios. Coloração mostrou que células Cal27 no TEM apresentaram características patológicas típicas TSCC (Figura 2C-D). As células em condições de cultura mexido apresentaram migração única célula (Figura 2C) ou migração coletiva (Figura 2D) em áreas diferentes da lesão. Em condições de cultura estático, Cal27 células também formaram estruturas invasivas na temperatura, mas demorou mais tempo(Figura 2). Além disso, uma linha de celular humana osteossarcoma U2OS também foi introduzida no mesmo sistema de cultura mexido. Embora as células U2OS podem viver no meio de cultura, eles não foram encontrados na temperatura (Figura 2-F). A temperatura mostrou biocompatibilidade diferente para diferentes tipos de células cancerosas, sugerindo que células tumorais diferentes podem precisar microambiente diferentes para florescer.
Figura 1 : Preparação de TEM. (A) que a coloração de línguas nativas dos ratos. Barra de escala = 100 µm. (B) a coloração de decellularized TEM de ratos. Barra de escala = 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Reconstituição de TSCC pela TEM. (A) a visão de um self-made minibioreactor. (B) a visualização da posição TEM-carregamento de um self-made minibioreactor. (C) que a coloração de 14 dias mexido TSCC cultivada com TEM. Fenômenos de invasão única célula são indicados por setas pretas. Barra de escala = 50 µm. (D) ele mancha de 14 dias mexido TSCC cultivada com TEM. Fenômenos coletivos de invasão são indicados por setas pretas. Barra de escala = 50 µm. (E) ele mancha de 28 dias estático cultivadas TSCC com TEM. Fenômenos de invasão única célula são indicados por setas pretas. Barra de escala = 100 µm. (F) a coloração de células U2OS culturas mexidas por 14 dias com temperatura. Barra de escala = 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Um protocolo bem estabelecido para a fabricação de ECM decellularized deve manter a composição de ECM nativa ao remover componentes celulares nos tecidos quase completamente21. Apesar de protocolos decellularization atualmente relatado que exigem perfusão através de vasculatura para remover materiais celulares por transporte convectivo, agitação mecânica foi adotada aqui, conhecido como um método simples e barato tradicional22 , 23 , 24 , 25 , 26. Além disso, desde que a língua é rica em lingualis e tem poucos vasos vasculares volumosos, este protocolo é mais adequado para tecidos de língua do que outros protocolos descritos acima.
Além disso, este protocolo para a produção TEM realiza uma decellularization de moderada resistência adequada, evitando a destruição ou a dissolução da membrana base que pode ser causada por decellularization de alta resistência, tais como sódio Dodecil sulfato ( Tratamento de SDS)3. Além disso, o protocolo também trabalhou efetivamente na língua de rato e porco (dados não mostrados), sugerindo que o método poderia ser usado comumente sobre línguas de várias espécie3.
É interessante notar que existem alguns passos críticos ou detalhes no presente protocolo, que poderia influenciar directamente os resultados. Um passo importante é a digestão das células da língua por DNase. Se o tempo de digestão não é suficiente ou o DNase não funciona eficientemente, a decellularization da língua dificilmente poderia ser alcançado. Outra coisa que deve ser observada é que a velocidade giratória para o biorreator não deve ser muito rápida, considerando o dano que TEM. Além disso, um ambiente estéril para esta operação é muito importante no protocolo.
Apesar das estritas regras acima, o protocolo para a preparação de temperatura pode ser ajustado em certa medida. Lavar as línguas com água ultrapura ou PBS por mais algumas horas que o tempo que o protocolo sugere obviamente não afetaria a fabricação de TEM. No entanto, desde que o protocolo precisa quase uma semana para preparar o TEM, ele não pode atender pedidos imediatos de TEM.
A temperatura mostra grande valor na construção do modelo TSCC. Juntamente com um self-made minibioreactor, células de Cal27 suspensas podem anexar TEM forma semelhante infiltrativa estrutura e assemelhando-se a humana TSCC histopatologia3. Este poderia ser um modelo ideal para o monitoramento e a investigar a invasão e metástase de TSCC em vitro. O modelo também poderia beneficiar o trabalho em testes de drogas em TSCC. Tendo em consideração todos estes, o protocolo apresentado aqui pode ter grande potencial em pesquisa TSCC.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores reconhecem o apoio de bolsas de investigação da Fundação Nacional de ciências naturais da China (31371390), o programa de projeto de desenvolvimento de alta tecnologia do estado (2014AA020702) e o programa de Guangdong de ciência e tecnologia (2016B030231001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57-BL/6J mice | Sun Yat-sen University Laboratory Animal Center | ||
| Ethanol | Guangzhou Chemical Reagent Factory | HB15-GR-2.5L | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A501218 | |
| Potassium chloride | Sangon Biotech | A100395 | |
| Dibasic Sodium Phosphate | Guangzhou Chemical Reagent Factory | BE14-GR-500G | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sangon Biotech | A501211 | |
| 1.5 mL EP tube | Axygen | MCT-150-A | |
| Ultra-low temperature freezer | Thermo Fisher Scientific | ||
| 3.5 cm cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 153066 | |
| 6 cm cell culture dish | Greiner | 628160 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | V900502 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 746495 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 449164 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| Magnesium sulphate | Sangon Biotech | A601988 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 158968 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393 | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | PHR1487 | |
| Surgical suture | Shanghai Jinhuan | ||
| 250 mL wide-mouth bottle | SHUNIU | 1407 | |
| Magnetic stirrer | AS ONE | 1-4602-32 | |
| CO2 incubator | SHEL LAB | SCO5A | |
| 10 mL syringe | Hunan Pingan | ||
| 50 mL centrifuge tube | Greiner | 227270 | |
| Cal27 cell | Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank | Tongue squamous cell carcinoma cell line | |
| U2OS cell | Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank | Human osteosarcoma cell line | |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D0547 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Hepes free acid | BBI | A600264 | |
| FBS | Hyclone | SH30084.03 | |
| 4 °C fridge | Haier | ||
| Water purifier | ELGA | ||
| Hemocytometer | BLAU | 717805 |
References
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