Summary
Метод здесь показан для подготовки язык внеклеточного матрикса (ТЕА) с эффективным decellularization. ТЕА может использоваться как функциональные подмости для реконструкции модели плоскоклеточный рак (ККТС) язык в условиях статического или перемешивают культуры.
Abstract
Для того, чтобы построить эффективную и реалистичную модель для язык плоскоклеточный рак (ККТС) в пробирке, методы были созданы для производства decellularized язык внеклеточного матрикса (ТЕА) которая обеспечивает функциональные леса для строительства ККТС. ТЕА обеспечивает в vitro нишу для роста клеток, дифференциация и миграции клеток. Микроструктур родной внеклеточного матрикса (ECM) и биохимические композиций, сохранить в матрице decellularized обеспечивают ткани конкретных ниш для закрепления клетки. Изготовление ТЕА может быть реализована путем пищеварение дезоксирибонуклеаза (DNase), сопровождается серьезным органических или неорганических предварительной обработки. Этот протокол проста в эксплуатации и обеспечивает высокую эффективность для decellularization. ТЕА показал благоприятные cytocompatibility для ККТС клеток в условиях статического или перемешивают культуры, который позволяет построение модели ККТС. Самодельные биореактор использовался также для стойких перемешивают условия для клеточной культуры. Реконструированный ККТС, используя ТЕА показал характеристики и свойства, напоминающие клинических ККТС гистопатология, предлагая потенциал в области исследований ККТС.
Introduction
Язык имеет различные важные функции, такие как глотания, артикуляции и дегустации. Таким образом нарушение функции язык имеет большое влияние на качество жизни пациентов1. Наиболее распространенным злокачественности в ротовой полости является язык плоскоклеточный рак (ККТС), который обычно возникает у людей, которые пьют алкоголь или дыма табака2.
В последние годы был достигнут незначительный прогресс в фундаментальных исследованиях по ККТС. Отсутствие эффективных в vitro исследования моделей остается одним из самых больших проблем. Таким образом внеклеточная матрица (ECM) оказывается возможного решения. Так как ECM является сложной сети кадр состоит из компонентов высокоорганизованных матрицы, эшафот материалы, имеющие ECM-как структура и состав бы компетентным для исследований рака. Decellularized ECM может прекрасно обеспечить нишу для ячеек из той же происхождения в пробирке, который оказывается наиболее существенным преимуществом ECM.
ECM может быть сохранена с клеточных компонентов, удаляется из тканей через decellularization, с использованием моющих и ферментов. Различные компоненты ECM, включая коллаген, фибронектин и Ламинин decellularized матрицы обеспечивают микроокружения родной ткань как для культивируемых клеток, содействия выживанию, пролиферации и дифференцировки клеток3. Кроме того иммуногенность для трансплантации снижается до минимального уровня с отсутствием клетчатых компонентов в ECM.
До настоящего времени были опробованы методы изготовления для decellularized ECM в различных тканях и органах, таких как сердце4,5,6,7, печени8,9,10 ,11, легких12,13,14,,1516,17и18,почек19 , 20. Однако, не соответствующие исследования показали на аналогичную работу на языке, в меру наших знаний.
В этом исследовании decellularized язык внеклеточного матрикса (ТЕА) был сфабрикованы ряда физических, химических и ферментативные лечение эффективно и недорого. Затем ТЕА был использован для пилки ККТС в пробирке, показаны соответствующие моделирования ККТС поведения и развития. ТЕА имеет хорошие биосовместимость, а также способность направлять клетки ткани конкретных нишу, которая указывает, что ТЕА может иметь большой потенциал в ККТС исследований3. Протокол, показанный здесь обеспечивает выбор для исследователей, изучение патогенеза или клинической терапии ККТС.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все животные работа была выполнена в соответствии с законом животных, институциональных руководящих принципов и утверждена институциональный уход животных и использование Комитетом, Sun Yat-sen University.
1. Подготовка ТЕА
- Выполнение мышей с шейки матки дислокации и удалить языки, используя стерильные хирургические ножницы и щипчики.
- Погружать язычки в 75% этанола на 3 мин, то положить каждый язык в 1,5 мл Эппендорф (EP) трубка с 1 мл стерильного фосфата 10 мм буфер решение (PBS).
Примечание: Концентрация PBS в следующие действия такой же, как концентрация в этом шаге. - Сотовый лизис путем замораживания-оттаивания: заморозить язычки в EP трубок-80 ° C для 1 h и затем разморозить языки при комнатной температуре 45 мин для 3 циклов.
- Загрузить каждый язык на кусок шовного хирургического иглой и оберните конец шва с небольшой кусочек стерильного фольги. Выполните операцию в 3,5 см или 6 см культуры блюдо, содержащие 75% этанола в стерильных условиях.
Примечание: Соответствующие каждый кусок шовного составляет около 20 см, и соответствующий размер каждый кусок фольги составляет примерно 0,3 см2 (1 × 0,3 см). Язык должен быть загружен возле фольги. - Промойте каждый язык с 3 мл стерильного PBS в 3,5 см или 6 см культуры блюдо за 30 с. выполнение этой операции в стерильных условиях.
- Вымойте язычки с ультрачистая вода: добавить ампициллина в широкий рот бутылку с 250 мл стерильного ультрачистая вода в конечной концентрации 90 мкг/мл. Положите язычки в бутылки, содержащие бар stir. Закрутите крышку бутылки с частью шва, остающиеся за пределами бутылки. Выполните эту операцию в стерильных условиях.
Примечание: До 5 языки могут быть введены в такой же бутылке при рассмотрении Твининг шва. В конце шва в бутылке для предотвращения соскальзывания язык фольги. Язычки должны располагаться 2 см в высоту от нижней части бутылки, регулируя длину шва, оставаясь внутри бутылки. Эта заметка является также шаги 1.8, 1.10, 1.12 и 1.16. - Положите бутылку на магнитной мешалкой для 12 h.
- Вымойте язычки с NaCl: добавить ампициллина в широкий рот бутылку с 250 мл стерильного 1 M NaCl в конечной концентрации 90 мкг/мл. Переместите языки и перемешать бар в бутылку. Закрутите крышку бутылки с частью шва, остающиеся за пределами бутылки. Выполните эту операцию в стерильных условиях.
- Положите бутылку на магнитной мешалкой для 24 h.
- Сотовый лизиса на Тритон X-100: добавить ампициллина в конечной концентрации 90 мкг/мл в широкий рот бутылку с 250 мл стерильного 2% Тритон X-100 в PBS. Переместите языки и перемешать бар в бутылку. Закрутите крышку бутылки с частью шва, остающиеся за пределами бутылки. Выполните эту операцию в стерильных условиях.
- Положите бутылку на магнитной мешалкой в течение 48 часов.
- Вымойте язычки с CaCl2/MgCl2: добавить ампициллина в широкий рот бутылку с 250 мл стерильного 5 мм CaCl2/MgCl2 в конечной концентрации 90 мкг/мл. Переместите языки и перемешать бар в бутылку. Закрутите крышку бутылки с частью шва, остающиеся за пределами бутылки. Выполните эту операцию в стерильных условиях.
- Положите бутылку на магнитной мешалкой для 24 h.
- Пищеварение, DNase: добавить 1 мл Хэнка сбалансированного солевого раствора (HBSS) для каждого EP трубки. Добавить DNase в HBSS соответственно в конечной концентрации 300 µM. Переместите каждый язык в каждую пробирку EP, с частью шва за пределами трубки. Выполните эту операцию в стерильных условиях.
Примечание: Убедитесь, что часть шва, которая остается внутри бутылки в предыдущих шагах также остается внутри трубки EP в этот шаг и убедитесь, что часть шва, которая остается за пределами бутылки в предыдущих шагах также остается вне EP трубку в этом шаге. - Инкубируйте язычки в EP трубы при 37 ° C в течение 24 ч.
- Вымойте язычки с PBS: добавить ампициллина в широкий рот бутылку с 250 мл стерильного PBS в конечной концентрации 90 мкг/мл. Переместите языки и перемешать бар в бутылку. Закрутите крышку бутылки с частью шва, остающиеся за пределами бутылки. Выполните эту операцию в стерильных условиях.
- Положите бутылку на магнитной мешалкой для 24 h.
- Храните подготовленный ТЕА в стерильных PBS на 4 ° C до использования.
2. трехмерные (3D) восстановление ККТС
-
Статические модели строительства ККТС
- Семя 1.0 x 106 единого ККТС клетки (Cal27) в культуре блюдо 3,5 см. Добавьте 3 мл Дульбекко изменение среднего/F12 (DF12) содержащий 10% плода бычьим сывороточным (ФБС), ампициллина 90 мкг/мл и 90 мкг/мл канамицин орла.
- Культура клетки Cal27 при 37 ° C 2 до 3 дней. Убедитесь, что клетки охватывать по меньшей мере 60% площади дна блюдо.
- Загрузить ТЕА на монослое Cal27 в культуре блюдо.
- Поместите блюдо в CO2 инкубатора при 37 ° C в течение 28 дней.
- Обновите каждый день во время процесса культуры клеток питательной среды. Концентрация CO2 в инкубаторе составляет 5%.
-
Перемешивают ККТС модель строительства
-
Подготовка самодельные перемешивают minibioreactor
- Выньте поршень от шприц 10 мл.
- Выкопайте яму (диаметр 1 см) возле нижнего терминал стержня и загрузки бар переполох в отверстие.
- Выкопайте яму (диаметр 0,5 см) в центре крышку бутылки пластиковые широкий рот бутылку и поставить шток через крышку.
- Вырезать половины 50 мл пластиковых пробирок и варить его на внешней стороне крышки бутылки.
- Прикрепите fishhooks к стержню, завернув стержень с лески, которые связаны с fishhooks.
Примечание: До 4 fishhooks может быть присоединен к стержню. - Автоклав самодельные комплекс перед использованием.
Примечание: Сделать не автоклав широкий рот бутылку. Используйте новый стерильных пластиковых широкий рот бутылку при культивировании клеток.
-
Подготовка самодельные перемешивают minibioreactor
-
Динамических клеточной культуры
- Семя 1.0 x 106 отдельные ячейки Cal27 в самодельных minibioreactor. Добавьте 150 мл DF12 среда, которая содержит 10% FBS, 90 мкг/мл ампициллина и канамицин 90 мкг/мл.
- Загрузить ТЕА на minibioreactor с помощью fishhooks, прилагается к стержню.
- Завинтите крышку бутылки и поставить minibioreactor на магнитной мешалкой. Активируйте minibioreactor на 200 об/мин в инкубатор CO2 при 37 ° C 7 до 14 дней.
Примечание: Концентрация CO2 в инкубаторе CO2 — 5%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот протокол для подготовки ТЕА оказывается эффективно и целесообразно. ТЕА показал идеальный decellularization, по сравнению с родной язык тканей. Эффективность decellularization было подтверждено гематоксилином эозином, (он) окрашивание (рис. 1A-B). Он пятнать результаты показали полное исчезновение ядерного пятнать в ТЕА (рис. 1Б). Кроме того содержание ДНК количественной оценки от предыдущей работы показали, что ДНК был практически полностью удален из ТЕА3. Этот протокол также показали редкие ущерб целостности тканей при удалении компонентов клеток (рис. 1Б).
3D преобразование ККТС, используя ТЕА и самодельные minibioreactor (рис. 2A-B) достигнуты удовлетворительные результаты. Он пятнать показал, что Cal27 клетки в ТЕА представлены типичные характеристики патологических ККТС (рис. 2C-D). Клетки в условиях перемешивают культуры представил одноклеточных миграции (рис. 2C) или коллективной миграции (Рисунок 2D) в районах различных поражений. В условиях статического культуры Cal27 клетки также образуется инвазивных структур в ТЕА, но он взял больше времени (рис. 2E). Кроме того линия клетки человека остеосаркома U2OS был введен в ту же систему перемешивают культуры. Хотя U2OS клетки могут жить в культурной среде, они не были найдены в ТЕА (Рисунок 2F). ТЕА показал различные биосовместимость для различных типов раковых клеток, предполагая, что различные опухолевые клетки могут потребоваться разные микросреды процветать.
Рисунок 1 : Подготовка ТЕА. (A) он окрашивание родных языках от мышей. Шкалы бар = 100 µm. (B) он окрашивание decellularized ТЕА от мышей. Шкалы бар = 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Восстановление ККТС, ТЕА. (A обзор самодельные minibioreactor. (B) представление ТЕА установочное положение самодельного minibioreactor. (C) он окрашивание 14-дневный перемешивают культивировали ККТС с ТЕА. Одноячеистый вторжения явлений обозначаются черными стрелками. Шкалы бар = 50 µm. (D) он окрашивание 14-дневный перемешивают культивировали ККТС с ТЕА. Коллективные вторжения явлений обозначаются черными стрелками. Шкалы бар = 50 µm. (E), он пятнать 28-дневный статических культивированный ККТС с ТЕА. Одноячеистый вторжения явлений обозначаются черными стрелками. Шкалы бар = 100 µm. (F) он пятнать 14-дневный перемешивают культивируемых клеток U2OS с ТЕА. Шкалы бар = 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Устоявшихся протокол для decellularized ECM изготовления следует сохранить родной ECM состав при удалении клетчатых компонентов в тканях почти полностью21. Несмотря на в настоящее время сообщил decellularization протоколов, которые требуют перфузии через сосудистую удалить ячеистых материалов конвективной транспортом механические агитации был принят здесь, известный как традиционный простой и недорогой способ22 , 23 , 24 , 25 , 26. Кроме того, так как язык богат lingualis и имеет несколько громоздких сосудов сосуды, этот протокол является более подходит для язык тканей, чем другие протоколы, описанные выше.
Кроме того этот протокол для производства ТЕА проводит соответствующие умеренно сила decellularization, избегая уничтожение или роспуска базового мембраны, которая может быть вызвана высокой прочности decellularization, такие как натрия Додециловый сульфат) SDS) лечение3. Кроме того, протокол эффективно работала в язык крыса и свинья (данные не показаны), предполагая, что этот метод может использоваться часто на языки различных видов3.
Стоит отметить, что есть некоторые важнейшие шаги или детали в этом протоколе, который может непосредственно влиять на результаты. Одним из важных шагов является пищеварение язык клеток DNase. Если время переваривания недостаточно или DNase не работает эффективно, decellularization язык вряд ли удастся. -Это еще одна вещь, которая должна быть замеченным что скорость вращения для биореактора не должно быть слишком быстро, учитывая ущерб, нанесенный ТЕА. Кроме того стерильные условия для этой операции очень важно в протоколе.
Несмотря на строгие правила выше протокол для подготовки ТЕА может корректироваться в некоторой степени. Стиральная язычки с ультрачистая вода или PBS для немного больше часов, чем время, которое протокол предполагает, очевидно, не будет затрагивать изготовление ТЕА. Однако поскольку протокол требует почти в одну неделю для подготовки ТЕА, он не может удовлетворить непосредственные потребности для ТЕА.
ТЕА показывает большое значение в ККТС модель строительства. Вместе с самодельных minibioreactor подвесные Cal27 клетки можно прикрепить в ТЕА и формы аналогичные инфильтративный структуры, напоминающие человека ККТС гистопатология3. Это может быть идеальной моделью для мониторинга и расследования вторжения и метастазированием ККТС в пробирке. Модель могла бы также пользу работе тесты на наркотики на ККТС. Учитывая все это протокола, представленные здесь могут иметь большой потенциал в ККТС исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы признают поддержки научно-исследовательских грантов от национального фонда естественных наук Китая (31371390), программа проекта развития хай-тек (2014AA020702) и программа Гуандун науки и технологии (2016B030231001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57-BL/6J mice | Sun Yat-sen University Laboratory Animal Center | ||
| Ethanol | Guangzhou Chemical Reagent Factory | HB15-GR-2.5L | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A501218 | |
| Potassium chloride | Sangon Biotech | A100395 | |
| Dibasic Sodium Phosphate | Guangzhou Chemical Reagent Factory | BE14-GR-500G | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sangon Biotech | A501211 | |
| 1.5 mL EP tube | Axygen | MCT-150-A | |
| Ultra-low temperature freezer | Thermo Fisher Scientific | ||
| 3.5 cm cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 153066 | |
| 6 cm cell culture dish | Greiner | 628160 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | V900502 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 746495 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 449164 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| Magnesium sulphate | Sangon Biotech | A601988 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 158968 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393 | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | PHR1487 | |
| Surgical suture | Shanghai Jinhuan | ||
| 250 mL wide-mouth bottle | SHUNIU | 1407 | |
| Magnetic stirrer | AS ONE | 1-4602-32 | |
| CO2 incubator | SHEL LAB | SCO5A | |
| 10 mL syringe | Hunan Pingan | ||
| 50 mL centrifuge tube | Greiner | 227270 | |
| Cal27 cell | Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank | Tongue squamous cell carcinoma cell line | |
| U2OS cell | Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank | Human osteosarcoma cell line | |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D0547 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Hepes free acid | BBI | A600264 | |
| FBS | Hyclone | SH30084.03 | |
| 4 °C fridge | Haier | ||
| Water purifier | ELGA | ||
| Hemocytometer | BLAU | 717805 |
References
- Elfring, T., Boliek, C. A., Winget, M., Paulsen, C., Seikaly, H., Rieger, J. M. The relationship between lingual and hypoglossal nerve function and quality of life in head and neck cancer. J. Oral Rehabil. 41, 133-140 (2014).
- Patel, S. C., et al. Increasing incidence of oral tongue squamous cell carcinoma in young white women, Age 18 to 44 Years. J. Clin. Oncol. 29, 1488-1494 (2011).
- Zhao, L., Huang, L., Yu, S., Zheng, J., Wang, H., Zhang, Y. Decellularized tongue tissue as an in vitro. model for studying tongue cancer and tongue regeneration. Acta Biomaterialia. 58, 122-135 (2017).
- Ng, S. L., Narayanan, K., Gao, S., Wan, A. C. Lineage restricted progenitors for the repopulation of decellularized heart. Biomaterials. 32, 7571-7580 (2011).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. 14, 213-221 (2008).
- Remlinger, N. T., Wearden, P. D., Gilbert, T. W. Procedure for decellularization of porcine heart by retrograde coronary perfusion. J. Vis. Exp. (6), e50059 (2012).
- Wainwright, J. M., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart. Tissue Eng. Part C-ME. 16, 525-532 (2010).
- Baptista, P. M., Siddiqui, M. M., Lozier, G., Rodriguez, S. R., Atala, A., Soker, S. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53, 604-617 (2011).
- Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. Method for the decellularization of intact rat liver. Organogenesis. 6, 134-136 (2010).
- Soto-Gutierrez, A., et al. A whole-organ regenerative medicine approach for liver replacement. Tissue Eng. Part C-ME. 17, 677-686 (2011).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat. Med. 16, 814-820 (2010).
- Bonvillain, R. W., et al. A nonhuman primate model of lung regeneration: detergent-mediated decellularization and initial in vitro recellularization with mesenchymal stem cells. Tissue Eng. Pt A. 18, 2437-2452 (2012).
- Daly, A. B., et al. Initial binding and recellularization of decellularized mouse lung scaffolds with bone marrow-derived mesenchymal stromal cells. Tissue Eng. Pt A. 18, 1-16 (2012).
- Ott, H. C., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat. Med. 16, 927-933 (2010).
- Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329, 538-541 (2010).
- Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded. Tissue Eng. Pt A. 16, 2581-2591 (2010).
- Wallis, J. M., et al. Comparative assessment of detergent-based protocols for mouse lung de-cellularization and re-cellularization. Tissue Eng. Part C-ME. 18, 420-432 (2012).
- Ross, E. A., et al. Embryonic stem cells proliferate and differentiate when seeded into kidney scaffolds. J. Am. Soc. Nephrol. 20, 2338-2347 (2009).
- Song, J. J., Guyette, J. P., Gilpin, S., Gonzalez, G., Vacanti, J. P., Ott, H. C. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nat. Med. 19, 646-651 (2013).
- Sullivan, D. C., et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 33, 7756-7764 (2012).
- Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand. J. Clin. Invest. 122, 3817-3823 (2012).
- Song, J. J., Ott, H. C. Organ engineering based on decellularized matrix scaffolds. Trends Mol. Med. 17, 424-432 (2011).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).
- Shamis, Y., et al. Organ-specific scaffolds for in vitro expansion, differentiation, and organization of primary lung cells. Tissue Eng. Part C-ME. 17, 861-870 (2011).
- Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering. Tissue Eng. Pt A. 16, 2207-2216 (2010).
- Cortiella, J., et al. Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation. Tissue Eng. Pt A. 16, 2565-2580 (2010).
