Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Fabrikasjon av tungen ekstracellulær Matrix og rekonstituering tungen Squamous celle Carcinoma In Vitro

Published: June 20, 2018 doi: 10.3791/57235
Automatic Translation
1, 1, 1
1Key Laboratory of Gene Engineering of the Ministry of Education, State Key Laboratory of Biocontrol, School of Life Sciences, Sun Yat-sen University

Summary

En metode er vist her for utarbeidelse av tungen ekstracellulær matrix (TEM) med effektiv decellularization. TEM kan brukes som funksjonell stillaser for gjenoppbyggingen av tungen squamous celle carcinoma (TSCC) modell under statisk eller rørt kultur forhold.

Abstract

For å bygge en effektiv og realistisk modell for tunge squamous celle carcinoma (TSCC) i vitro, ble metodene skapt til å produsere decellularized tunge ekstracellulær matrix (TEM) som funksjonell stillaser TSCC konstruksjon. TEM gir en i vitro nisje for cellevekst, differensiering og celle migrasjon. Microstructures opprinnelige ekstracellulær matrix (ECM) og biokjemiske komposisjoner beholdes i decellularized matrise inneholder vev-spesifikke nisjer for forankring celler. Fabrikasjon av TEM kan realiseres ved deoxyribonuclease (DNase) fordøyelsen sammen med en alvorlig av organisk eller uorganisk forbehandling. Denne protokollen er enkel å betjene og sikrer høy effektivitet for decellularization. TEM viste gunstig cytocompatibility for TSCC celler under statisk eller rørt kultur forhold, som gjør at byggingen av TSCC modellen. En Self-Made bioreactor ble også brukt for vedvarende rørt betingelsen for cellekultur. Rekonstruert TSCC bruker TEM viste egenskaper og egenskaper ligner klinisk TSCC histopatologi, tyder potensialet i TSCC forskning.

Introduction

Tungen har ulike viktige funksjoner som deglutition, artikulasjon og smaker. Dermed har svekkelse av tungen funksjonen stor innvirkning på pasienter livskvalitet1. Den vanligste kreft i munnhulen er tunge squamous celle carcinoma (TSCC), som vanligvis skjer i mennesker som drikker alkohol eller røyke tobakk2.

De siste årene, har liten fremgang blitt oppnådd i grunnforskning på TSCC. Mangel på effektiv i vitro forskning modeller gjenstår å være en av de største problemene. Dermed viser den ekstracellulære matrisen (EFM) seg for å være en potensiell løsning. Siden ECM er et komplekst nettverk ramme består av svært organiserte matrix komponenter, vil skafottet materialer har en ECM-lignende struktur og sammensetning være kompetent til kreftforskning. Decellularized ECM gir perfekt nisje for cellene fra samme opprinnelse i vitro, som viser seg for å være den viktigste fordelen av ECM.

ECM kan beholdes med cellulære komponenter fjernet fra vev gjennom decellularization vaskemidler og enzymer. Ulike ECM-komponenter, inkludert kollagen, fibronectin og laminin i decellularized matrise gir kulturperler celler, fremme den overlevelse, spredning og differensiering cellene3en innfødt-vev som microenvironment. Videre reduseres immunogenisitet for transplantasjon til et minimalt nivå med fravær av cellulære komponenter i ECM.

Så langt, har fabrikasjon metoder for decellularized ECM vært prøvd i ulike vev og organer, som hjertet4,5,6,7, lever8,9,10 ,11, lunge12,13,14,15,16,17og nyre18,19 , 20. ingen relevante forskning har imidlertid finnes på tilsvarende arbeid i tungen til best av vår kunnskap.

I denne studien, ble decellularized tunge ekstracellulær matrix (TEM) fabrikkert både effektiv og billig en rekke fysiske, kjemiske og enzymatiske behandling. Deretter ble TEM brukt til recapitulate TSCC i vitro, viser en riktig simulering for TSCC atferd og utvikling. TEM har god biocompatibility samt muligheten til å veilede cellene til vev-spesifikk nisje, som angir at TEM kan ha stort potensial i TSCC forskning3. Protokollen vises her gir et valg for forskere studere patogenesen eller klinisk behandling av TSCC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyr arbeidet ble utført i samsvar med dyrevelferd handling, institusjonelle retningslinjer og godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteen, Sun Yat-sen-universitetet.

1. utarbeidelse av TEM

  1. Utføre mus cervical forvridning og fjerne tunger sterilt kirurgisk saks og pinsett.
  2. Fordype tunger i 75% etanol for 3 min, og hver tunge inn en 1,5 mL Eppendorf (EP) rør med 1 mL av 10 mM sterilt fosfat bufret løsning (PBS).
    Merk: Konsentrasjonen av PBS i alle fremgangsmåten er den samme som konsentrasjonen i dette trinnet.
  3. Celle lysis av fryse tine: fryse tunger i EP rør ved-80 ° C i 1 time, og deretter tine tunger ved romtemperatur for 45 min for 3 sykluser.
  4. Laste hver tungen på et stykke kirurgisk Sutur bruker en kirurgisk nål og vikle slutten av suture med en liten bit av sterile tinfoil. Utføre operasjonen i en 3,5 cm eller 6 cm kultur parabol med 75% etanol i sterile forhold.
    Merk: Den aktuelle lengden av kirurgiske Sutur er ca 20 cm, og riktig størrelse for hvert stykke tinfoil er om 0,3 cm2 (1 cm x 0,3 cm). Tungen skal lastes nær tinfoil.
  5. Skyll hver tunge med 3 mL steril PBS i en 3,5 cm eller 6 cm kultur parabol for 30 s. Utfør denne operasjonen i sterile forhold.
  6. Vask tunger med ultrapure vann: legge til ampicilin i en bred munn flasken med 250 mL steril ultrapure vann i en siste konsentrasjon av 90 µg/mL. Satt tunger i flasken inneholder oppstuss bar. Skru av korken med en del av suture gjenværende utenfor flasken. Utfør denne operasjonen i sterile forhold.
    Merk: Opptil 5 tunger kan settes inn i samme flasken behandling twining av suture. Tinfoil er på slutten av suture i flasken for å hindre at tungen glir av. Tunger plasseres 2 cm høy fra bunnen av flasken ved å justere lengden på suture igjen inne i flasken. Dette notatet er også for trinn 1.8, 1,10, 1.12 og 1,16.
  7. Sette flasken på en magnetisk rørestang 12 h.
  8. Vask tunger med NaCl: Legg ampicilin til en bred munn flaske med 250 mL steril 1 M NaCl til en siste konsentrasjon av 90 µg/mL. Flytte tunger og baren rør inn i flasken. Skru av korken med en del av suture gjenværende utenfor flasken. Utfør denne operasjonen i sterile forhold.
  9. Sette flasken på en magnetisk rørestang 24 h.
  10. Celle lysis av Triton X-100: Legg ampicilin til en siste konsentrasjon av 90 µg/mL i en bred munn flasken med 250 mL steril 2% Triton X-100 i PBS. Flytte tunger og baren rør inn i flasken. Skru av korken med en del av suture gjenværende utenfor flasken. Utfør denne operasjonen i sterile forhold.
  11. Sette flasken på en magnetisk rørestang 48 h.
  12. Vask tunger med CaCl2/MgCl2: legge til ampicilin i en bred munn flaske med 250 mL steril 5 mM CaCl2/MgCl2 en endelig konsentrasjon av 90 µg/mL. Flytte tunger og baren rør inn i flasken. Skru av korken med en del av suture gjenværende utenfor flasken. Utfør denne operasjonen i sterile forhold.
  13. Sette flasken på en magnetisk rørestang 24 h.
  14. Fordøyelsen av DNase: Legg 1 mL av Hanks balansert salt løsning (HBSS) til hver EP tube. Legge til DNase i HBSS henholdsvis i en siste konsentrasjon av 300 µM. flytte hver tungen inn hver EP-tube, med en del av suture utenfor røret. Utfør denne operasjonen i sterile forhold.
    Merk: Kontroller at delen av Sutur som forblir i flaskene i trinnene også fortsatt inne i EP røret i dette trinnet, og kontroller at delen av Sutur som forblir utenfor flasker i trinnene også forblir utenfor EP røret i dette trinnet.
  15. Inkuber tunger i EP rør ved 37 ° C i 24 timer.
  16. Vask tunger med PBS: legge til ampicilin i en bred munn flaske med 250 mL steril PBS en siste konsentrasjon av 90 µg/mL. Flytte tunger og baren rør inn i flasken. Skru av korken med en del av suture gjenværende utenfor flasken. Utfør denne operasjonen i sterile forhold.
  17. Sette flasken på en magnetisk rørestang 24 h.
  18. Lagre den forberedt TEM i sterilt PBS på 4 ° C før bruk.

2. tredimensjonale (3D) rekonstituering av TSCC

  1. Statisk TSCC modell konstruksjon
    1. Frø 1.0 x 106 TSCC enkeltceller (Cal27) i en 3,5 cm kultur parabol. Legge 3 mL Dulbeccos endret Eagle's medium/F12 (DF12) inneholder 10% fosterets bovin serum (FBS), 90 µg/mL ampicilin og 90 µg/mL kanamycin.
    2. Kultur Cal27 cellene på 37 ° C i 2 til 3 dager. Kontroller at cellene dekker minst 60% området parabolen bunnen.
    3. Laste inn TEM på Cal27 monolayer i kultur parabolen.
    4. Sette retten i en CO2 inkubator på 37 ° C i 28 dager.
    5. Oppdater kultur medium hver dag i celle kultur prosessen. CO2 konsentrasjonen i inkubator er 5%.
  2. Rørt TSCC modell konstruksjon
    1. Utarbeidelse av en Self-Made rørt minibioreactor
      1. Ta ut stempelet fra en 10 mL sprøyte.
      2. Grave et hull (diameter på 1 cm) i nærheten av lavere terminalen av stangen og belaste en røre bar i hullet.
      3. Grave hull (diameter på 0,5 cm) i midten av flaskelokket av en bred munn plastflaske og sette stempelstang gjennom cap.
      4. Skjær halvparten av en 50 mL sentrifuge rør og sveise den på yttersiden av flaske cap.
      5. Koble fishhooks til stangen av emballasjen stangen med fiske linjer som er knyttet til fishhooks.
        Merk: Opptil 4 fishhooks kan knyttes til en stang.
      6. Autoclave Self-Made komplekset før bruk.
        Merk: Gjør ikke autoklav plastflaske bred munn. Bruk en ny sterilt bred munn plastflaske mens dyrking celler.
  3. Dynamisk cellekultur
    1. Frø 1.0 x 106 Cal27 enkeltceller i selv-laget minibioreactor. Legge til 150 mL DF12 medium som inneholder 10% FBS, 90 µg/mL ampicilin og 90 µg/mL kanamycin.
    2. Laste inn TEM på minibioreactor bruker fishhooks festet til stangen.
    3. Skru av korken og sette minibioreactor på en magnetisk rørestang. Aktivere minibioreactor på 200 rpm i en CO2 inkubator på 37 ° C for 7 til 14 dager.
      Merk: Konsentrasjonen av CO2 i CO2 inkubator er 5%.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne protokollen for utarbeidelse av TEM viser seg for å være effektiv og hensiktsmessig. TEM viste perfekt decellularization sammenlignet med morsmål vev. Effekten av decellularization ble bekreftet av hematoxylin-eosin (han) flekker (figur 1A-B). Han fargeresultatene avslørte komplette forsvinningen av kjernefysiske farging i TEM (figur 1B). Videre viste DNA innhold kvantifisering fra tidligere arbeid at DNA var nesten helt fjernet fra TEM3. Denne protokollen viste også sjelden skade vev integritet under fjerning celle komponenter (figur 1B).

3D rekonstituering av TSCC TEM og en selv-laget minibioreactor (figur 2A-B) oppnådd tilfredsstillende resultater. Han flekker viste at Cal27 celler i TEM presentert typiske TSCC patologisk egenskaper (figur 2C-D). Cellene i rørt oppdrettsforholdene presentert encellede migrasjon (figur 2C) eller kollektiv migrasjon (figur 2D) i ulike lesjon områder. I statiske oppdrettsforholdene, Cal27 cellene også dannet invasiv strukturer i TEM, men det tok lengre tid (figur 2E). Videre ble en menneskelig osteosarcoma cellen linje U2OS også introdusert til det samme rørt kultur-systemet. Selv om U2OS celler kan bor i kultur medium, ble de ikke funnet i TEM (figur 2F). TEM viste ulike biocompatibility for ulike typer av kreftceller, antyder at ulike kreftceller må forskjellige microenvironments blomstre.

Figure 1
Figur 1 : Utarbeidelse av TEM. (A) han flekker av morsmål fra mus. Skala bar = 100 µm. (B) han farging av decellularized TEM fra mus. Skala bar = 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Rekonstituering av TSCC av TEM. (A) en oversikt over en selv-laget minibioreactor. (B) visningen av TEM-lasting plasseringen av en selv-laget minibioreactor. (C) han flekker av 14 dagers hisset kulturperler TSCC med TEM. Enkelt celle invasjonen fenomener angis av svarte piler. Skala bar = 50 µm. (D) han flekker av 14 dagers rørt kulturperler TSCC med TEM. Kollektive invasjonen fenomener angis av svarte piler. Skala bar = 50 µm. (E) han flekker av 28-dagers statisk kultivert TSCC med TEM. Enkelt celle invasjonen fenomener angis av svarte piler. Skala bar = 100 µm. (F) han flekker av 14 dagers rørt kulturperler U2OS celler med TEM. Skala bar = 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En godt etablert protokoll decellularized ECM fabrikasjon bør beholde opprinnelige ECM sammensetningen mens fjerne cellulære komponenter i vev nesten helt21. Til tross for øyeblikket rapporterte decellularization protokoller som krever perfusjon gjennom blodkar fjerne cellulære materialer med konvektive transport, ble mekanisk agitasjon vedtatt her, kjent som en tradisjonell enkel og billig metode22 , 23 , 24 , 25 , 26. videre siden tungen er rik på lingualis og har noen store vaskulær fartøy, denne protokollen er mer egnet for tunge vev enn andre protokoller som beskrevet ovenfor.

Videre utfører denne protokollen for TEM produksjon en passende moderat-styrke decellularization, unngå ødeleggelse eller oppløsningen av base membranen som kan skyldes høy styrke decellularization slik som natrium dodecyl sulfate) SDS) behandling3. I tillegg protokollen også jobbet effektivt i tungen av rotte og gris (data ikke vist), tyder på at metoden kan brukes vanligvis ved tunger fra ulike arter3.

Det er verdt å merke seg at det er noen viktige trinn eller detaljer i denne protokollen, som kan direkte påvirke resultatene. Ett viktig skritt er fordøyelsen av tungen celler av DNase. Hvis fordøyelsen tiden er ikke nok eller DNase ikke arbeide effektivt, kan decellularization av tungen knapt oppnås. En annen ting som bør bli lagt merke til er at hastigheten på roterende bioreactor ikke bør være for fort, vurderer skader TEM. Videre er et sterilt miljø for denne operasjonen svært viktig i protokollen.

Til tross for strenge reglene ovenfor, kan protokollen for TEM forberedelse justeres til en viss grad. Vaske tunger med ultrapure vann eller PBS noen mer timer enn som protokollen antyder ikke vil åpenbart påvirke fabrikasjon av TEM. Men siden protokollen trenger nesten en uke å forberede TEM, kan ikke det møte umiddelbare krav til TEM.

TEM viser stor verdi i TSCC modell konstruksjon. Sammen med en selv-laget minibioreactor, kan suspendert Cal27 celler knytte TEM og form lignende infiltrasjon strukturen ligner menneskelige TSCC histopatologi3. Dette kan være en ideell modell for overvåking og undersøke invasjon og metastasering av TSCC i vitro. Modellen kan også ha nytte arbeidet på narkotika tester på TSCC. Hensyn til alle disse, kan protokollen presenteres her ha stort potensial i TSCC forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne bekrefter støtte fra forskningsmidler fra National Natural Science Foundation i Kina (31371390), programmet av statlige høyteknologiske utbyggingsprosjektet (2014AA020702) og programmet Guangdong vitenskap og teknologi (2016B030231001).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57-BL/6J mice Sun Yat-sen University Laboratory Animal Center
Ethanol Guangzhou Chemical Reagent Factory HB15-GR-2.5L
Sodium chloride Sangon Biotech A501218
Potassium chloride Sangon Biotech A100395
Dibasic Sodium Phosphate Guangzhou Chemical Reagent Factory BE14-GR-500G
Potassium Phosphate Monobasic  Sangon Biotech A501211
1.5 mL EP tube Axygen MCT-150-A
Ultra-low temperature freezer  Thermo Fisher Scientific
3.5 cm cell culture dish Thermo Fisher Scientific 153066
6 cm cell culture dish Greiner 628160
Triton X-100 Sigma-Aldrich V900502
Calcium chloride Sigma-Aldrich 746495
Magnesium chloride Sigma-Aldrich 449164
DNase Sigma-Aldrich D5025
Magnesium sulphate Sangon Biotech A601988
Glucose Sigma-Aldrich 158968
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761
Ampicillin Sigma-Aldrich A9393
Kanamycin Sigma-Aldrich PHR1487
Surgical suture Shanghai Jinhuan
250 mL wide-mouth bottle SHUNIU 1407
Magnetic stirrer AS ONE 1-4602-32
CO2 incubator SHEL LAB SCO5A
10 mL syringe Hunan Pingan
50 mL centrifuge tube Greiner 227270
Cal27 cell Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank Tongue squamous cell carcinoma cell line
U2OS cell Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank Human osteosarcoma cell line
DMEM/F12 Sigma-Aldrich D0547
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P5280
Hepes free acid BBI A600264
FBS Hyclone SH30084.03
4 °C fridge Haier
Water purifier ELGA
Hemocytometer BLAU 717805

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Elfring, T., Boliek, C. A., Winget, M., Paulsen, C., Seikaly, H., Rieger, J. M. The relationship between lingual and hypoglossal nerve function and quality of life in head and neck cancer. J. Oral Rehabil. 41, 133-140 (2014).
  2. Patel, S. C., et al. Increasing incidence of oral tongue squamous cell carcinoma in young white women, Age 18 to 44 Years. J. Clin. Oncol. 29, 1488-1494 (2011).
  3. Zhao, L., Huang, L., Yu, S., Zheng, J., Wang, H., Zhang, Y. Decellularized tongue tissue as an in vitro. model for studying tongue cancer and tongue regeneration. Acta Biomaterialia. 58, 122-135 (2017).
  4. Ng, S. L., Narayanan, K., Gao, S., Wan, A. C. Lineage restricted progenitors for the repopulation of decellularized heart. Biomaterials. 32, 7571-7580 (2011).
  5. Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. 14, 213-221 (2008).
  6. Remlinger, N. T., Wearden, P. D., Gilbert, T. W. Procedure for decellularization of porcine heart by retrograde coronary perfusion. J. Vis. Exp. (6), e50059 (2012).
  7. Wainwright, J. M., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart. Tissue Eng. Part C-ME. 16, 525-532 (2010).
  8. Baptista, P. M., Siddiqui, M. M., Lozier, G., Rodriguez, S. R., Atala, A., Soker, S. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53, 604-617 (2011).
  9. Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. Method for the decellularization of intact rat liver. Organogenesis. 6, 134-136 (2010).
  10. Soto-Gutierrez, A., et al. A whole-organ regenerative medicine approach for liver replacement. Tissue Eng. Part C-ME. 17, 677-686 (2011).
  11. Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat. Med. 16, 814-820 (2010).
  12. Bonvillain, R. W., et al. A nonhuman primate model of lung regeneration: detergent-mediated decellularization and initial in vitro recellularization with mesenchymal stem cells. Tissue Eng. Pt A. 18, 2437-2452 (2012).
  13. Daly, A. B., et al. Initial binding and recellularization of decellularized mouse lung scaffolds with bone marrow-derived mesenchymal stromal cells. Tissue Eng. Pt A. 18, 1-16 (2012).
  14. Ott, H. C., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat. Med. 16, 927-933 (2010).
  15. Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329, 538-541 (2010).
  16. Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded. Tissue Eng. Pt A. 16, 2581-2591 (2010).
  17. Wallis, J. M., et al. Comparative assessment of detergent-based protocols for mouse lung de-cellularization and re-cellularization. Tissue Eng. Part C-ME. 18, 420-432 (2012).
  18. Ross, E. A., et al. Embryonic stem cells proliferate and differentiate when seeded into kidney scaffolds. J. Am. Soc. Nephrol. 20, 2338-2347 (2009).
  19. Song, J. J., Guyette, J. P., Gilpin, S., Gonzalez, G., Vacanti, J. P., Ott, H. C. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nat. Med. 19, 646-651 (2013).
  20. Sullivan, D. C., et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 33, 7756-7764 (2012).
  21. Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand. J. Clin. Invest. 122, 3817-3823 (2012).
  22. Song, J. J., Ott, H. C. Organ engineering based on decellularized matrix scaffolds. Trends Mol. Med. 17, 424-432 (2011).
  23. Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).
  24. Shamis, Y., et al. Organ-specific scaffolds for in vitro expansion, differentiation, and organization of primary lung cells. Tissue Eng. Part C-ME. 17, 861-870 (2011).
  25. Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering. Tissue Eng. Pt A. 16, 2207-2216 (2010).
  26. Cortiella, J., et al. Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation. Tissue Eng. Pt A. 16, 2565-2580 (2010).

Tags

Kreftforskning problemet 136 ekstracellulær matrix decellularization tunge muntlig squamous celle carcinoma bioreactor modell konstruksjon
Fabrikasjon av tungen ekstracellulær Matrix og rekonstituering tungen Squamous celle Carcinoma <em>In Vitro</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yao, Y., Lin, W., Zhang, Y.… More

Yao, Y., Lin, W., Zhang, Y. Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro. J. Vis. Exp. (136), e57235, doi:10.3791/57235 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter