Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Tillverkning av tunga extracellulära Matrix och beredning av tungan skivepitelcancer In Vitro

Published: June 20, 2018 doi: 10.3791/57235
Automatic Translation
1, 1, 1
1Key Laboratory of Gene Engineering of the Ministry of Education, State Key Laboratory of Biocontrol, School of Life Sciences, Sun Yat-sen University

Summary

Här visas en metod för beredning av tungan extracellulärmatrix (TEM) med effektiv decellularization. TEM kan användas som funktionella ställningar för återuppbyggnaden av en tunga skivepitelcancer (TSCC) modell statiska eller rörs kultur villkor.

Abstract

För att konstruera en effektiv och realistisk modell för tunga skivepitelcancer cell carcinoma (TSCC) in vitro-, skapades metoderna att producera cell-lösa tungan extracellulär matrix (TEM) som ger funktionella ställningar för TSCC konstruktion. TEM ger en in vitro- nisch för celltillväxt, differentiering och cellmigration. Mikrostrukturer native extracellulär matrix (ECM) och biokemiska kompositioner kvar i cell-lösa matrisen ger vävnadsspecifika nischer för att förankra celler. Tillverkning av TEM kan realiseras av deoxyribonuclease (DNase) matsmältning tillsammans med en allvarlig av organiska eller oorganiska förbehandling. Detta protokoll är lätt att använda och säkerställer hög verkningsgrad för decellularization. TEM visade gynnsamma cytocompatibility för TSCC celler under statiska eller rörs odlingsbetingelser, som möjliggör byggandet av TSCC modellen. En self-made bioreaktor användes också för ihållande rörs villkoret för cellodling. Rekonstruerade TSCC använder TEM visade de kännetecken och egenskaper som liknar kliniska TSCC histopatologi, vilket tyder på en potential i TSCC forskning.

Introduction

Tungan har olika viktiga funktioner, såsom deglutition, artikulation och provsmakning. Således, nedsatt tungan har stor inverkan på patienternas livskvalitet1. Den vanligaste malignitet i munhålan är tungan skivepitelcancer (TSCC), vilket inträffar vanligtvis hos människor som dricker alkohol eller röker tobak2.

Under de senaste åren har små framsteg uppnåtts i grundforskning på TSCC. Bristen på effektiv in vitro- forskning modeller förblir en av de största problemen. Således visar den extracellulär matrixen (ECM) sig vara en möjlig lösning. Eftersom ECM är ett komplext nätverk ramen består av mycket organiserade matrix komponenter, skulle byggnadsställning material med en ECM-liknande struktur och sammansättning vara behöriga för cancerforskning. Cell-lösa ECM kan perfekt ge nischen för cellerna från samma ursprung i vitro, som visar sig vara den mest betydande fördelen med ECM.

ECM kan behållas med cellulära komponenter tas bort från vävnader genom den decellularization som använder tvättmedel och enzymer. Olika ECM komponenter, inklusive kollagen, Fibronektin och laminin i cell-lösa matris ger en native-vävnad-liknande närmiljön för odlade celler, främja den överlevnad, proliferation och differentiering av celler3. Immunogeniciteten för transplantation kan dessutom reduceras till en minimal nivå med avsaknad av cellulära komponenter i ECM.

Hittills, har framställningsmetoder för cell-lösa ECM prövats i olika vävnader och organ, såsom hjärta4,5,6,7, lever8,9,10 ,11, lung12,13,14,15,16,17och njure18,19 , 20. men ingen relevant forskning har hittas på liknande arbete i tungan till bäst av vår kunskap.

I denna studie var cell-lösa tungan extracellulär matrix (TEM) tillverkade både effektivt och billigt av en rad fysiska, kemiska och enzymatisk behandling. Sedan användes TEM att recapitulate TSCC i vitro, visar en lämplig simulering för TSCC beteende och utveckling. TEM har god biokompatibilitet samt förmågan att vägleda cellerna till vävnadsspecifika nisch, vilket indikerar att TEM kan ha stor potential i TSCC forskning3. I protokollet visas här ger ett val för forskare som studerar patogenesen eller kliniska behandlingar av TSCC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla djur arbete utfördes enligt lagen om djurskydd, institutionella riktlinjer och godkänts av institutionella djur vård och användning kommittén, Sun Yat-sen University.

1. beredning av TEM

  1. Kör möss genom cervikal dislokation och ta bort tungor med sterila kirurgiska sax och pincett.
  2. Fördjupa tungor i 75% etanol för 3 min och sedan sätta varje tungan i en 1,5 mL Eppendorf (EP) rör med 1 mL av 10 mM steril fosfat buffrad lösning (PBS).
    Obs: Koncentrationen av PBS i alla stegen är samma som koncentrationen i det här steget.
  3. Cell lysis av frysning upptining: frysa tungor i EP rör vid-80 ° C för 1 h, och sedan Tina tungor i rumstemperatur i 45 min i 3 cykler.
  4. Ladda varje tungan på en bit av kirurgiska suturen kirurgiska barr och Linda slutet av suturen med en liten bit av sterila aluminiumfolie. Utför operationen i en 3,5 cm eller 6 cm kultur maträtt som innehåller 75% etanol i sterila förhållanden.
    Obs: Den lämpliga längden på varje bit av kirurgiska suturer är ca 20 cm och lämpliga storleken av varje bit aluminiumfolie är ca 0,3 cm2 (1 cm x 0,3 cm). Tungan ska läsas nära i aluminiumfolie.
  5. Skölj varje tunga med 3 mL steril fosfatbuffrad Koksaltlösning i en 3,5 cm eller 6 cm kultur maträtt för 30 s. utför denna operation i sterila förhållanden.
  6. Tvätta tungor med ultrarent vatten: Lägg ampicilin i en bred mun flaska med 250 mL Sterilt ultrarent vatten till en slutlig koncentration på 90 µg/mL. Sätta tungor i flaskan som innehåller en uppståndelse bar. Dra åt flasklocket med del av suturen kvar utanför flaskan. Utföra åtgärden i sterila förhållanden.
    Obs: Upp till 5 tungor kan sättas i samma flaska med tanke på slingrande av suturen. Tinfoil är slutet av suturen i flaskan för att hindra tungan glider av. Tungor bör placeras 2 cm höga från botten av flaskan genom att justera längden på suturen kvar inuti flaskan. Denna anmärkning är också för steg 1,8, 1.10, 1.12 och 1.16.
  7. Placera flaskan på en magnetomrörare för 12 h.
  8. Tvätta tungor med NaCl: Lägg ampicilin i en bred mun flaska med 250 mL steril 1 M NaCl till en slutlig koncentration på 90 µg/mL. Flytta tungor och baren uppståndelse i flaskan. Dra åt flasklocket med del av suturen kvar utanför flaskan. Utföra åtgärden i sterila förhållanden.
  9. Placera flaskan på en magnetomrörare för 24 h.
  10. Cell lysis av Triton x-100: lägga till ampicilin till en slutlig koncentration på 90 µg/mL i en bred mun flaska med 250 mL steril 2% Triton x-100 i PBS. Flytta tungor och baren uppståndelse i flaskan. Dra åt flasklocket med del av suturen kvar utanför flaskan. Utföra åtgärden i sterila förhållanden.
  11. Placera flaskan på en magnetomrörare för 48 h.
  12. Tvätta tungor med CaCl2/MgCl2: Lägg ampicilin i en bred mun flaska med 250 mL steril 5 mM CaCl2/MgCl2 till en slutlig koncentration på 90 µg/mL. Flytta tungor och baren uppståndelse i flaskan. Dra åt flasklocket med del av suturen kvar utanför flaskan. Utföra åtgärden i sterila förhållanden.
  13. Placera flaskan på en magnetomrörare för 24 h.
  14. Rötning av DNAS: Tillsätt 1 mL av Hanks balanserad saltlösning (HBSS) till varje EP-röret. Tillsätt DNAS i HBSS respektive till en slutlig koncentration på 300 µM. flytta varje tungan till varje EP-rör, med en del av suturen utanför röret. Utföra åtgärden i sterila förhållanden.
    Obs: Se till att delen av suturen som stannar inuti flaskorna i föregående steg också förblir släpper EP röret i detta steg, och se till att delen av suturen som förblir utanför flaskorna i föregående steg också förblir utanför EP röret i det här steget.
  15. Inkubera tungor i EP rör vid 37 ° C under 24 h.
  16. Tvätta tungor med PBS: Lägg ampicilin i en bred mun flaska med 250 mL steril fosfatbuffrad Koksaltlösning till en slutlig koncentration på 90 µg/mL. Flytta tungor och baren uppståndelse i flaskan. Dra åt flasklocket med del av suturen kvar utanför flaskan. Utföra åtgärden i sterila förhållanden.
  17. Placera flaskan på en magnetomrörare för 24 h.
  18. Lagra den beredda TEM i steril fosfatbuffrad Koksaltlösning vid 4 ° C fram till användning.

2. tredimensionella (3D) beredning av TSCC

  1. Statiska TSCC modellera konstruktion
    1. Utsäde 1,0 x 106 enstaka TSCC celler (Cal27) i en skål med 3,5 cm i kultur. Lägga till 3 mL Dulbeccos ändrade örnens medium/F12 (DF12) innehållande 10% fetalt bovint serum (FBS), 90 µg/mL ampicilin och 90 µg/mL kanamycin.
    2. Kultur Cal27 cellerna vid 37 ° C i 2 till 3 dagar. Se till att cellerna täcker minst 60% område av skålen botten.
    3. Lasta TEM på den Cal27 enskiktslager i kultur skålen.
    4. Sätt skålen i en CO2 inkubator vid 37 ° C för 28 dagar.
    5. Uppdatera odlingssubstratet varje dag under cellodlingsprocessen. Koncentrationen av CO2 i inkubatorn är 5%.
  2. Rörs TSCC modellera konstruktion
    1. Beredning av en self-made rörs minibioreactor
      1. Ta ut kolven från en 10 mL-spruta.
      2. Gräva ett hål (diameter ca 1 cm) nära den lägre terminalen på staven och ladda en uppståndelse bar i hålet.
      3. Gräva ett hål (diameter ca 0,5 cm) i mitten av hatten på flaskan av en plastflaska bred mun och sätta stämpelstången genom den gemensamma jordbrukspolitiken.
      4. Skär hälften av ett 50 mL centrifugrör och svetsa det på utsidan av flasklocket.
      5. Fäst fiskkrokar stången genom att Linda stången med fiskelinor som är bundna till fiskkrokar.
        Obs: Upp till 4 fiskkrokar kan kopplas till en stav.
      6. Autoklav self-made anläggningen före användning.
        Obs: Autoklavera inte bred mun plastflaska. Använd en ny steril bred mun plastflaska medan odla celler.
  3. Dynamiska cellkultur
    1. Utsäde 1,0 x 106 enstaka Cal27 celler i den hemmagjorda minibioreactor. Tillsätt 150 mL DF12 medium som innehåller 10% FBS, 90 µg/mL ampicilin och 90 µg/mL kanamycin.
    2. Lasta TEM på den minibioreactor som använder de fiskkrokar bifogas staven.
    3. Dra åt flasklocket och sätta minibioreactor på en magnetomrörare. Aktivera minibioreactor på 200 rpm i en CO2 inkubator vid 37 ° C i 7 till 14 dagar.
      Obs: Koncentrationen av CO2 i CO2 inkubatorn är 5%.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Detta protokoll för beredning av TEM visar sig vara effektiva och lämpliga. TEM visade perfekt decellularization jämfört med modersmål vävnader. Effekten av decellularization bekräftades av hematoxylin-eosin (han) färgning (figur 1A-B). Han färgning resultat visade fullständig försvinnandet av nukleär färgning i TEM (figur 1B). Dessutom visade DNA innehåll kvantifiering från tidigare arbete att DNA var nästan helt bort från TEM3. Detta protokoll visade också sällsynt skada vävnad integritet medan du tar bort cell komponenter (figur 1B).

3D beredning av TSCC använder TEM och en egengjord minibioreactor (figur 2A-B) uppnått tillfredsställande resultat. Han färgning visade att Cal27 celler i TEM presenteras typiska TSCC patologiska kännetecken (figur 2C-D). Cellerna i rörs odlingsbetingelser presenterade enskild cell migration (figur 2C) eller kollektiva migration (figur 2D) i olika lesion områden. I statiska odlingsbetingelser, Cal27 celler bildas även invasiva strukturer i TEM, men det tog längre tid (figur 2E). Dessutom infördes också en mänsklig osteosarkom cell fodrar U2OS i samma rörs kultur-systemet. Även U2OS celler kunde leva i odlingsmediet, var de inte finns i TEM (figur 2F). TEM visade olika biokompatibilitet för olika typer av cancerceller, vilket tyder på att olika tumörceller kan behöva olika mikromiljö att blomstra.

Figure 1
Figur 1 : Beredning av TEM. (A) han färgning av infödda tungor från möss. Skalstapeln = 100 µm. (B) han färgning av cell-lösa TEM från möss. Skalstapeln = 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Beredning av TSCC av TEM. (A) en översikt över en self-made minibioreactor. (B) Visa TEM-lastning av en self-made minibioreactor ställning. (C) han färgning av 14-dagars rörs odlade TSCC med TEM. Enstaka cell invasion fenomen indikeras av svarta pilar. Skalstapeln = 50 µm. (D) han färgning av 14-dagars rörs odlade TSCC med TEM. Kollektiva invasion fenomen indikeras av svarta pilar. Skalstapeln = 50 µm. (E) han färgning av 28-dagars statisk odlade TSCC med TEM. Enstaka cell invasion fenomen indikeras av svarta pilar. Skalstapeln = 100 µm. (F) han färgning av 14-dagars rörs odlade U2OS celler med TEM. Skalstapeln = 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ett väl etablerat protokoll för cell-lösa ECM fabrication bör behålla infödda ECM sammansättning medan du tar bort cellulära komponenter i vävnader nästan fullständigt21. Trots för närvarande rapporterade decellularization protokoll som kräver perfusion via kärlsystemet att ta cellulära material av konvektiv transport, antogs mekaniska agitation här, känd som en traditionell enkel och billig metod22 , 23 , 24 , 25 , 26. eftersom tungan är rik på lingualis och har några skrymmande vaskulär fartyg, detta protokoll är dessutom mer lämpade för tunga vävnader än andra protokoll som beskrivs ovan.

Dessutom utför detta protokoll för TEM produktion en lämplig måttlig-styrka decellularization, undvika förstöring eller upplösning av bas membranet som kan orsakas av höghållfast decellularization såsom sodium dodecyl sulfate) SDS) behandling3. Dessutom protokollet också fungerat effektivt i tungan av råttan och grisen (inga data anges), vilket tyder på att metoden kan användas vanligen vid tungor från olika arter3.

Det är värt att notera att det finns vissa kritiska moment eller detaljer i detta protokoll, som direkt skulle kunna påverka resultaten. Ett viktigt steg är nedbrytning av tungan celler av DNAS. Om koktiden är inte tillräckligt eller DNAS inte fungerar effektivt, skulle decellularization av tungan knappt uppnås. En annan sak som bör märkas är att roterande hastigheten för bioreaktor inte bör vara alltför snabbt, med tanke på skadorna på TEM. Dessutom är en steril miljö för denna operation mycket viktigt i protokollet.

Trots de strikta reglerna ovan, kan protokollet för TEM förberedelse justeras i viss utsträckning. Tvättmaskin tungor med ultrarent vatten eller PBS för några fler timmar än tiden som protokollet föreslår naturligtvis inte skulle påverka tillverkning av TEM. Dock eftersom protokollet behöver nästan en vecka att förbereda TEM, kan inte det möta omedelbara krav på TEM.

TEM visar stort värde i TSCC modellera konstruktion. Tillsammans med en egengjord minibioreactor, kan svävande Cal27 celler bifoga i TEM och form liknande infiltrativ struktur som liknar mänskliga TSCC histopatologi3. Detta kan vara en idealmodell för övervakning och utreda invasionen och metastas av TSCC in vitro. Modellen kan också gynna arbetet med drogtester på TSCC. Med tanke på alla dessa, kan det protokoll som presenteras här har stor potential i TSCC forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Författarna erkänner stöd av forskningsanslag från National Natural Science Foundation Kina (31371390), programmet för staten High-Tech utvecklingsprojektet (2014AA020702) och programmet för Guangdong vetenskap och teknik (2016B030231001).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57-BL/6J mice Sun Yat-sen University Laboratory Animal Center
Ethanol Guangzhou Chemical Reagent Factory HB15-GR-2.5L
Sodium chloride Sangon Biotech A501218
Potassium chloride Sangon Biotech A100395
Dibasic Sodium Phosphate Guangzhou Chemical Reagent Factory BE14-GR-500G
Potassium Phosphate Monobasic  Sangon Biotech A501211
1.5 mL EP tube Axygen MCT-150-A
Ultra-low temperature freezer  Thermo Fisher Scientific
3.5 cm cell culture dish Thermo Fisher Scientific 153066
6 cm cell culture dish Greiner 628160
Triton X-100 Sigma-Aldrich V900502
Calcium chloride Sigma-Aldrich 746495
Magnesium chloride Sigma-Aldrich 449164
DNase Sigma-Aldrich D5025
Magnesium sulphate Sangon Biotech A601988
Glucose Sigma-Aldrich 158968
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761
Ampicillin Sigma-Aldrich A9393
Kanamycin Sigma-Aldrich PHR1487
Surgical suture Shanghai Jinhuan
250 mL wide-mouth bottle SHUNIU 1407
Magnetic stirrer AS ONE 1-4602-32
CO2 incubator SHEL LAB SCO5A
10 mL syringe Hunan Pingan
50 mL centrifuge tube Greiner 227270
Cal27 cell Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank Tongue squamous cell carcinoma cell line
U2OS cell Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank Human osteosarcoma cell line
DMEM/F12 Sigma-Aldrich D0547
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P5280
Hepes free acid BBI A600264
FBS Hyclone SH30084.03
4 °C fridge Haier
Water purifier ELGA
Hemocytometer BLAU 717805

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Elfring, T., Boliek, C. A., Winget, M., Paulsen, C., Seikaly, H., Rieger, J. M. The relationship between lingual and hypoglossal nerve function and quality of life in head and neck cancer. J. Oral Rehabil. 41, 133-140 (2014).
  2. Patel, S. C., et al. Increasing incidence of oral tongue squamous cell carcinoma in young white women, Age 18 to 44 Years. J. Clin. Oncol. 29, 1488-1494 (2011).
  3. Zhao, L., Huang, L., Yu, S., Zheng, J., Wang, H., Zhang, Y. Decellularized tongue tissue as an in vitro. model for studying tongue cancer and tongue regeneration. Acta Biomaterialia. 58, 122-135 (2017).
  4. Ng, S. L., Narayanan, K., Gao, S., Wan, A. C. Lineage restricted progenitors for the repopulation of decellularized heart. Biomaterials. 32, 7571-7580 (2011).
  5. Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. 14, 213-221 (2008).
  6. Remlinger, N. T., Wearden, P. D., Gilbert, T. W. Procedure for decellularization of porcine heart by retrograde coronary perfusion. J. Vis. Exp. (6), e50059 (2012).
  7. Wainwright, J. M., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart. Tissue Eng. Part C-ME. 16, 525-532 (2010).
  8. Baptista, P. M., Siddiqui, M. M., Lozier, G., Rodriguez, S. R., Atala, A., Soker, S. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53, 604-617 (2011).
  9. Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. Method for the decellularization of intact rat liver. Organogenesis. 6, 134-136 (2010).
  10. Soto-Gutierrez, A., et al. A whole-organ regenerative medicine approach for liver replacement. Tissue Eng. Part C-ME. 17, 677-686 (2011).
  11. Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat. Med. 16, 814-820 (2010).
  12. Bonvillain, R. W., et al. A nonhuman primate model of lung regeneration: detergent-mediated decellularization and initial in vitro recellularization with mesenchymal stem cells. Tissue Eng. Pt A. 18, 2437-2452 (2012).
  13. Daly, A. B., et al. Initial binding and recellularization of decellularized mouse lung scaffolds with bone marrow-derived mesenchymal stromal cells. Tissue Eng. Pt A. 18, 1-16 (2012).
  14. Ott, H. C., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat. Med. 16, 927-933 (2010).
  15. Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329, 538-541 (2010).
  16. Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded. Tissue Eng. Pt A. 16, 2581-2591 (2010).
  17. Wallis, J. M., et al. Comparative assessment of detergent-based protocols for mouse lung de-cellularization and re-cellularization. Tissue Eng. Part C-ME. 18, 420-432 (2012).
  18. Ross, E. A., et al. Embryonic stem cells proliferate and differentiate when seeded into kidney scaffolds. J. Am. Soc. Nephrol. 20, 2338-2347 (2009).
  19. Song, J. J., Guyette, J. P., Gilpin, S., Gonzalez, G., Vacanti, J. P., Ott, H. C. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nat. Med. 19, 646-651 (2013).
  20. Sullivan, D. C., et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 33, 7756-7764 (2012).
  21. Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand. J. Clin. Invest. 122, 3817-3823 (2012).
  22. Song, J. J., Ott, H. C. Organ engineering based on decellularized matrix scaffolds. Trends Mol. Med. 17, 424-432 (2011).
  23. Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).
  24. Shamis, Y., et al. Organ-specific scaffolds for in vitro expansion, differentiation, and organization of primary lung cells. Tissue Eng. Part C-ME. 17, 861-870 (2011).
  25. Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering. Tissue Eng. Pt A. 16, 2207-2216 (2010).
  26. Cortiella, J., et al. Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation. Tissue Eng. Pt A. 16, 2565-2580 (2010).

Tags

Cancerforskning fråga 136 extracellulär matrix decellularization tungan oral skivepitelcancer bioreaktor modellera konstruktion
Tillverkning av tunga extracellulära Matrix och beredning av tungan skivepitelcancer <em>In Vitro</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yao, Y., Lin, W., Zhang, Y.… More

Yao, Y., Lin, W., Zhang, Y. Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro. J. Vis. Exp. (136), e57235, doi:10.3791/57235 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter