Summary
Le but du présent protocole est de démontrer l’injection intra prostatique de cellules de cancer de la prostate, avec castration ultérieure. Orthotopique des modèles précliniques de cancer de la prostate androgéno-dépendants et résistant à la castration sont essentielles pour étudier la maladie dans le contexte d’un micro-environnement tumeur cliniquement pertinents et un hôte immunocompétent.
Abstract
Modélisation de tumeur orthotopique est un outil précieux pour la recherche sur le cancer de la prostate précliniques, car il a plusieurs avantages par rapport aux deux sous-cutanée et génétiquement transgéniques modèles murins. Contrairement aux tumeurs sous-cutanées, orthotopique tumeurs contiennent des vaisseaux plus cliniquement précis, microenvironnement tumoral et les réponses aux multiples thérapies. En revanche pour les modèles de souris génétiquement modifiées, orthotopique modèles peuvent être effectuées avec un coût moindre et en moins de temps, impliquent l’utilisation de souris extrêmement complexe et hétérogène ou lignées de cellules cancéreuses humaines, plutôt que les célibataires des altérations génétiques et ces cellules lignes peuvent être génétiquement modifiés, de nature à exprimer des agents d’imagerie. Nous présentons ici un protocole pour l’injection chirurgicalement une lignée de cellules de cancer de la prostate murine luciférase et mCherry-exprimant dans le lobe antérieur de la prostate de souris. Ces souris ont développé des tumeurs orthotopique qui étaient surveillés de manière non invasive en vivo et analyse plus poussée pour le volume de la tumeur, le poids, la survie de souris et infiltration immunitaire. En outre, souris avec tumeur orthotopique ont été castrés chirurgicalement, conduisant à une régression tumorale immédiate et des récidives ultérieures, ce qui représente de cancer de la prostate résistant à la castration. Bien que la compétence technique requise pour effectuer cette procédure, ce modèle de syngénique orthotopique du cancer de la prostate androgéno-dépendants et résistant à la castration est d’une grande utilité pour tous les chercheurs dans le domaine.
Introduction
Cancer de la prostate est estimé pour avoir la plus forte incidence (161 360 hommes) et causent la mort de troisième cancer masculin (84 590 hommes) en 20171. Après avoir diagnostiqué, tumeurs de la prostate sont androgéno-dépendants et sont traitées par chirurgie prostatectomie, radiothérapie et/ou traitement de privation androgénique (ADT), mais chaque traitement est associé à plusieurs comorbidités et complications principales2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. Malgré une régression tumorale après ADT, presque toutes les tumeurs réapparaissent dans le cancer de la prostate résistant à la castration (fonciers). À ce stade, traitements approuvés incluent docetaxel immunothérapie Sipuleucel-T et les petites molécules anti-androgène enzalutamide et l’abiratérone, pourtant aucune thérapie individuelle ne confère un avantage de survie de plus de 5,2 mois11, 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17. par conséquent, les hommes à tous les stades du cancer de la prostate besoin des options de traitement améliorée et la gestion de morbidités, pour quelle maladie pré-clinique optimale, la modélisation est cruciale.
Avec une procédure correcte, lignées cellulaires de cancer de la prostate peuvent être chirurgicalement instillées dans la prostate murine, menant à l’élaboration de deux tumeurs orthotopique syngéniques ou xénogéniques. Modélisation de tumeur orthotopique est idéale pour toutes les tumeurs biologie et drogues recherche développement, permettant le développement de tumeurs avec un micro-environnement tumeur cliniquement représentatif (TME). Des études antérieures ont démontré que sous-cutanée (s.c.) tumeurs ont une vascularisation tumorale altérée, conduisant à des réponses cliniquement précises différentielles et moins de18,des thérapies anti-angiogéniques19. En outre, plusieurs études ont observée une augmentation ou une diminution de l’efficacité de multiples agents chimiothérapeutiques dans le traitement de la même lignée cellulaire, selon s’il s’agissait administré s.c. ou orthotopically, dont le dernier le mieux représenté ce qui est vu dans l’homme cancer du20,21,22. En outre, que dans un modèle orthotopique de cancer du côlon, mais pas dans le modèle de l.c., tumeurs produisit les enzymes de dégradation correctes nécessaires pour induire la métastase23. Enfin, comme les immunothérapies continuent d’émerger à l’avant-garde de la thérapie du cancer, et autant qu’ils n’ont pas encore présente des avantages importants pour cancer de la prostate24,25, syngéniques modèles précliniques avec TME exacte et ganglions lymphatiques de drainage chez les hôtes immunocompétents sont essentielles.
Il y a de nombreux facteurs responsables de ces conclusions contradictoires, basées sur le site de la tumeur. Avec un TME différente, les cellules cancéreuses sont exposés à différent tissus-spécifiques endothélium et altéré l’angiogenèse, cela n’affecte la tumeur développement26,27. Orthotopique tumeurs avec TME correcte permettant de medicaments cliniquement pertinents, des conditions d’hypoxie et évaluation de thérapies anti-angiogéniques28. Tandis que les modèles issus du génie génétique (MGG) contiennent un TME précis, dont ils ont besoin de temps temps d’élevage, coût élevé et sont souvent basé sur des manipulations des gènes simples ou peu assommé ou surexprimés au-delà des niveaux cliniquement pertinentes. En revanche, les lignées cellulaires de cancer de la prostate humain ou murin utilisées dans les tumeurs orthotopique, comme les tumeurs humaines, sont génétiquement beaucoup plus complexes au sein de cellules individuelles et en affichant l’hétérogénéité entre les cellules29,30. Aussi contrairement aux pierres précieuses, lignées de cellules cancéreuses orthotopique peuvent être conçues pour exprimer des modalités d’imagerie ou augmentées ou une baisse des taux d’autres molécules d’intérêt et in vitro et in vivo des résultats expérimentaux peuvent être directement comparés. Orthotopique tumeurs peuvent également être formées de cellules primaires dérivés de patient. Nous rapportons ici la méthodologie permettant d’effectuer des injections intra-hypertrophie des cellules de cancer de la prostate qui forment des tumeurs androgéno-dépendants orthotopique et, après la castration, se reproduisent comme orthotopique fonciers.
Protocol
Toutes les procédures animaux décrits dans le présent protocole sont à effectuer dans le respect de règles éthiques et l’approbation de l’Université appropriée animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC).
1. préparation du matériel chirurgical et des cellules cancéreuses
- Avant le jour de la chirurgie, autoclave les ciseaux micro-dissection, Graefe forceps, Graefe forceps de tissue, porte-aiguille avec des fraises de suture et le nombre approprié de rideaux. Stériliser une seringue de 50 µL et aiguilles de calibre 28 à l’oxyde d’éthylène (Figure 1).
- Avant le jour de l’opération, les cellules de Myc-CaP culture dans les plats de 10 cm dans RPMI additionné de 10 % sérum fœtal (SVF) et 1 % la pénicilline/streptomycine (P/S) dans une étuve à 37 ° C 5 % CO2 . Pour la surveillance des tumeurs bioluminescent ou fluorescentes, transfecter les cellules 293 t avec les vecteurs appropriés et ensuite transmettre cellules Myc-CaP avec 0,45 µm filtré lentivirus31. Trier les cellules pour produire une lignée cellulaire stable avec positivité de transduction de 100 %.
Remarque : Effectuer tous les culture de tissus dans des conditions stériles et vérifier que toutes les lignées cellulaires sont exemptes de mycoplasme. La lignée cellulaire de cancer de la prostate murin utilisée dans cette étude, Myc-CaP32, est transduite pour exprimer stablement fois luciférase firefly et mCherry. L’iss de ligne Myc-CaP cellule isolée d’un c-myc-sur-exprimant souris Hi-myc et ces cellules contiennent un récepteur d’androgène amplifié (AR), qui sont androgéno-dépendants32 et forment des tumeurs fonciers après castration murine33. Toutes les souris dans cette étude sont des souris FVB/NJ 6-8 semaines de vieux mâles. Lignées cellulaires de cancer de la prostate murine alternative peuvent être utilisées avec les souris du bagage génétique appropriée, ainsi que lignées cellulaires de cancer de la prostate humain ou patient dérivé primaire cancer de la prostate avec des souris immunodéficientes. Le nombre optimal de cellules par injection doit être déterminé empiriquement pour les lignées cellulaires alternatifs. En outre, alternative modalités d’imagerie peut être utilisé pour visualiser des tumeurs, y compris l’imagerie par résonance magnétique (IRM), tomographie par émission de positrons (PET) ou la tomodensitométrie (TDM), ainsi que de la GFP comme alternative au mCherry. - La nuit avant l’opération, placez matrigel membrane basale matrice et exempt de rouge de phénol sur glace à 4 ° C à dégeler.
- Le jour de la chirurgie, collecter les cellules en les lavant avec du sérum physiologique tamponné au phosphate (PBS) et détacher avec 0,25 % de trypsine-EDTA. Neutraliser la trypsine avec RPMI avec 10 % de SVF et 1 % P/S.
- Centrifuger les cellules à 400 x g pendant 5 min.
- Laver les cellules avec 10 mL de milieu RPMI sans FBS ou P/S.
- Compter les cellules et remettre en suspension les cellules dans du PBS à une concentration de 6.67x107 cellules/mL (1 × 106 cellules/15 µL).
- Ajouter un volume égal de matrigel pour créer une suspension cellulaire de 1:1 PBS/matrigel à une concentration finale de 1 × 106 cellules/30 µL et maintenir les cellules sur la glace jusqu'à injection afin d’éviter la solidification.
Remarque : Effectuer des injections intra-prostatique dans les 3 h de préparation des suspensions cellulaires de matrigel. Si vous effectuez des injections intra-prostatique sur plus de 5 souris, répétez les étapes ci-dessus pour préparer une suspension de cellules fraîches matrigel.
2. préparation souris préopératoire
Remarque : les souris de maison dans l’Université animalerie pendant au moins une semaine avant la chirurgie afin de permettre une adaptation appropriée et à minimiser le stress animal. Étapes de 2,1 à 2,6 sont effectuées par l’assistante du chirurgien. Toutes les étapes chirurgicales subséquentes sont effectuées par le chirurgien à l’aide de gants stériles et outils chirurgicaux avec une technique stérile.
- Anesthésier les souris à l’isoflurane (2-5 % pour l’induction par chambre, 1-3 % pour l’entretien par l’intermédiaire de coiffe). Vérifiez l’induction complète par la perte du réflexe de pincement orteil.
- Peser les souris et d’administrer au moins 0,05 mg/kg de la buprénorphine analgésique l.c.
NOTE : Souris poids ≥ 20 g est idéal pour les injections intra-prostatique réussies. - S’appliquent à lubrification pommade ophtalmique à deux yeux pour éviter le dessèchement cornéenne.
- Se raser tous les fourrures de l’abdomen.
- Stériliser à l’abdomen par trois séries de circulaire application du chirurgien à des touches non adhérents stériles suivies de lingettes d’alcool stérile. Permettre à l’abdomen pour sécher.
Remarque : Pour le reste de l’intervention chirurgicale, uniquement des gants stériles et des instruments chirurgicaux peuvent contacter l’abdomen souris stérilisées. - Transférer la souris en position couchée sur une surface propre sur un coussin chauffant directement sous l’objectif d’un microscope chirurgical propre.
- Couvrir la souris avec un drap stérile avec un petit trou percé sur l’abdomen.
3. Intra-prostatique injection
Remarque : Effectuez toutes les étapes chirurgicales dans des conditions stériles. Régler le microscope, le placement de la souris ou tout autres objets non stériles doivent être effectués par l’assistant de chirurgien.
- Effectuer un environ 1 cm incision de la peau extérieure le long de la ligne médiane de l’abdomen supérieur au pénis et les glandes préputiales (Figure 1).
- Séparer le tissu conjonctif entre l’épiderme abdominal et de la musculature abdominale interne en ouvrant les ciseaux entre les couches.
- Effectuer une incision semblable de la musculature abdominale interne tout en utilisant des pinces pour soulever la musculature pour éviter la perforation de l’intestin ou la vessie (Figure 1).
- Localisez l’une des vésicules séminales bilatérales (Figure 1 a, blanc) / anterior lobes de la prostate (Figure 1 a, noir), qui sont souvent postérieures, latérales et légèrement supérieure à la vessie (Figure 1 a, jaune), mais cela peuvent varier entre souris . Les lobes de la prostate antérieures sont translucides et attaché à la petite courbure des vésicules séminales blancs.
- Soulevez doucement l’extrémité de la vésicule séminale à l’aide de la pince de tissu Graefe de créer des tensions sur le tissu sans perforation de la vésicule séminale (Figure 1E).
- Mélanger la solution de matrigel de Myc-CaP par gentile pipetage (effectuée par l’assistante du chirurgien), comme les cellules peuvent avoir granulées et aspirer lentement 30 µL (1 x 106 cellules) dans l’aiguille pour éviter les bulles d’air.
- Insérez avec précaution le biseau du parallèle à l’axe longitudinal du lobe antérieur la prostate aiguille. Injecter lentement 30 µL dans le lobe et rétracter lentement l’aiguille pour éviter les fuites (Figure 1F). Vérifier injection adéquate par l’engorgement du lobe antérieur de la prostate (Figure 1).
- Tenir soigneusement la vésicule séminale et injecté lobe de la prostate en dehors de la souris pendant environ 30 s pour permettre le matrigel à solidifier partiellement dans le lobe. Pendant ce temps, recueillir toute fuite de solution de cellules dans l’abdomen à l’aide d’un applicateur à bout de polyester stérile pour empêcher le développement de tumeurs non-orthotopique, sans appuyer sur le lobe de la prostate injecté.
- Retournez soigneusement vésicule séminale et lobe la prostate injectée dans l’abdomen sans exercer de pression sur le lobe. Remplacez n’importe quel tissus externalisés.
- Effectuer des sutures continus pour fermer la musculature abdominale interne avec 5-0 vicryl résorbables coupe inverse aiguille des sutures.
- Effectuer des sutures interrompus pour fermer la peau abdominale externe avec 4-0 en nylon monofilament non résorbable coupe inverse aiguille sutures.
NOTE : Peuvent aussi utiliser des agrafes stérilisé de 9 mm pour fermer la peau abdominale externe. Cependant, contrairement aux sutures, ils interfèrent avec n’importe quel ultérieur tumeur bioluminescente et fluorescent signal d’imagerie. - Nettoyer tous les outils avec des lingettes stériles de l’éthanol (ouverts par l’assistante du chirurgien) et les placer dans un stérilisateur de perle de verre de 30 s. autoriser les outils nécessaires pour sécher avant de l’utiliser sur la prochaine souris.
- Rincer la seringue et l’aiguille dans du sérum physiologique stérile (ouvert par l’assistante du chirurgien) pour éviter tout colmatage de matrigel vestige.
Remarque : Un assistant chirurgien devrait être présent pour toutes les opérations, effectuer tout non stériles préparation préopératoire souris et soins post-opératoires souris, aussi bien quant à mélanger la solution de matrigel Myc-bouchon avant les injections. Pour minimiser le temps, car chaque procédure de souris intra-prostate nécessitera 20-30 min, l’assistante du chirurgien peut commencer à préparer la prochaine souris car le chirurgien est suture la souris actuelle.
4. post-opératoire souris soins
- Administrer 1 mg/kg de l’analgésique meloxicam s.c. immédiatement, 24 h et 48 h après la chirurgie.
- Autoriser les souris récupérer dans une cage avec aucune literie placé à mi-chemin sur un coussin chauffant. Surveiller les souris pendant au moins 30 min après la chirurgie jusqu'à ce qu’ils retrouver mobilité normale et l’activité, après qui les placent dans une cage propre avec de la nourriture sur le plancher de la cage.
- Outre surveiller souris quotidiennement pour la bonne cicatrisation des plaies, poids corporel, toilettage et ambulation après la chirurgie. Souris séparées dans des cages individuelles sur n’importe quel témoignage de combats.
- Enlever les sutures restants dans les 14 jours après la chirurgie.
5. bioluminescentes tumeur imagerie
- Préparer stérile filtré Na+ ou K+ D-luciférine, tel que décrit par le fabricant et protégée de la lumière.
- Injecter la souris intra-peritoneally avec 10 µL/g de poids corporel de la luciférine.
- Au moins 10 min plus tard, souris d’image avec un système d’imagerie IVIS du spectre, comme décrit plus haut34,35.
- Analyser les images logiciel Living Image, comme précédemment décrit34,35.
NOTE : IVIS analyse d’imagerie est utile pour déterminer les injections intra-prostatique avec succès et le développement de la tumeur primitive pour normaliser la charge tumorale chez les groupes expérimentaux. Toutefois, selon l’intensité du signal bioluminescent ou fluorescente, saturation peut provoquer un plateau dans la quantification de l’image malgré l’augmentation de la taille de la tumeur réelle. Par conséquent, dans les derniers stades de la croissance tumorale, l’imagerie IVIS peut être plus utile pour déterminer des diminutions de la taille de la tumeur après un traitement réussi plutôt qu’augmentations de taille après saturation de l’image.
6. tumeur collecte, l’analyse de la tumeur, survie Endpoint
- Si collecte de tumeur pour analyse, humainement euthanasier souris par une exposition au CO2 et dislocation cervicale secondaire, ou par des méthodes alternatives de IACUC approuvé et disséquer les tumeurs de l’abdomen. Les tumeurs devraient être situé orthotopically à la prostate.
NOTE : Les tumeurs attaché à la paroi abdominale antérieure ou de graines tout au long de l’abdomen indiquent l’injection intra prostatique de pauvre ou qui fuite et ne sauraient orthotopique tumeurs. - Peser les tumeurs.
- Calculer le volume des tumeurs comme π/6 × L × W × H (L = longueur de l’axe le plus long de la tumeur, W = largeur, H = hauteur perpendiculaire).
- Les tumeurs peuvent être analysés par histologie (solution à 10 % de formol tamponné neutre), cytométrie en flux (créer des suspensions unicellulaires), protéines (préparer tissus lysat dans un tampon RIPA), ou ARN (immédiatement lieu tissu en RNAlater).
- Pour l’analyse immunologique, également recueillir la prostate tumeur-vidange para-aortique ganglions lymphatiques (Figure 1 b, orange) et la rate.
Remarque : Si après la souris pour la survie, le point de terminaison de ce modèle est défini comme l’apparition de l’ascite abdominale hémorragique36 et/ou d’amoindrir les ambulation, toilettage, et/ou horripilation37. Souris pour l’analyse de survie recevoir pré- et post-opératoire analgésie (étapes de protocole 2.2, 4.1) et doivent être surveillées régulièrement. Souris doivent être séparés dans des cages individuelles, si n’importe quel combat se produit et devrait être humainement euthanasié dès l’apparition de toute les lectures de point de terminaison ci-dessus.
7. chirurgie Castration pour modéliser fonciers
- Pour modéliser les fonciers, accomplir ce qui précède protocole d’injection intra-prostatique (étapes 1 à 5 du protocole).
- Au moins une semaine plus tard, après le développement de tumeurs, effectuer une castration chirurgicale par cautérisation, comme précédemment décrit38.
- Surveiller une régression tumorale et la récurrence par imagerie bioluminescent. Après castration, une régression tumorale se produira dans les 3 jours et une récidive tumorale se produira dans les 30 jours environ, représentant fonciers.
Representative Results
Dans ce manuscrit, nous avons injecté chirurgicalement la lignée cellulaire de cancer de la prostate murine, Myc-CaP, dans le lobe antérieur de la prostate (Figure 1 a), menant à l’apparition de tumeurs prostatiques orthotopique avec un TME cliniquement pertinent et la bonne drainage de la prostate ganglions lymphatiques (Figure 1 b). Cela a été réalisée à l’aide de ciseaux micro-dissection, Graefe forceps, Graefe forceps tissue, un porte-aiguilles avec des fraises de suture et une seringue de 50 µL avec une aiguille de calibre 28 (Figure 1). Après avoir effectuer un environ 1 incision abdominale médiane de cm au-dessus les glandes préputiales (Figure 1) et attaché lobe antérieur de la prostate, une vésicule séminale situaient trouvaient et externalisées (Figure 1E) et 30 µL (1 x 106 cellules) d’une Suspension cellulaire de 1:1 PBS/matrigel a été injectée dans la prostate (Figure 1F), initialement vérifiée par l’engorgement du lobe et l’absence de fuites (Figure 1).
Pour surveiller la croissance de tumeur orthotopique, nous transfectées stablement cellules Myc-CaP pour exprimer la luciférase firefly et mCherry, ce qui permet pour les tumeurs qui sera suivie de non invasif en vivo bioluminescence (Figure 2 a) et la fluorescence (Figure 2 b), respectivement. Une des limites de cette imagerie, c’est que, selon la force du signal, imagerie quantification peut saturer alors que la tumeur ne cesse d’augmenter en taille. Par conséquent, avec des intensités de signal élevé, cette imagerie in vivo est plus utile pour normaliser initialement fardeau tumoral dans les groupes expérimentaux et pour déterminer plus tard la diminution de taille de la tumeur après des traitements expérimentaux. Modalités d’imagerie complémentaires peuvent également être utilisées, comme le petit animal, IRM, PET ou CT.
Orthotopique tumeurs ont été disséqués de l’abdomen sur 30 jours après l’injection intra prostatique (Figure 3 a). Les tumeurs orthotopique doivent être placés sur le site du lobe antérieur de la prostate. Tumeur des masses tout au long de l’abdomen ou attaché à la paroi abdominale antérieure indiquent une mauvaise injection intra-prostatique et fuite. Avec une technique adaptée, volume des tumeurs (Figure 3 b) et poids (Figure 3) peuvent être enregistrées avec écart-type relativement faible. Toutefois, tel qu’observé, il y aura certaine variabilité avec des masses tumorales petites et grandes. Première utilisation de quantification d’imagerie prétraitement pour égaliser la charge tumorale entre bras expérimentales est donc essentielle pour toutes les expériences. En outre, comme ces cellules cancéreuses murins ont été injectées à des souris immunocompétentes de FVB/NJ, TME peut être analysé par immunohistochimie (IHC) (cytométrie en flux ou autres techniques) pour les cellules T CD3 (Figure 3D) (ou d’autres types de cellules immunitaires). Enfin, ce modèle fournit un point de terminaison de survie objective, comme la grande tumeur primaire causes masse hémorragique ascite abdominale36 (Figure 3E) et/ou d’amoindrir l’ambulation, toilettage, et/ou horripilation37. Occasionnellement, mort peut aussi être causée par croissance de la tumeur bloque la production d’urine.
Enfin, ce modèle peut être utilisé pour étudier les cancer de la prostate androgéno-dépendants et fonciers, laquelle confère un pronostic sombre et a besoin de nouveaux traitements. Après le développement de tumeur orthotopique, souris ont été chirurgicalement castrés, comme précédemment décrit38. Comme c’est la deuxième chirurgie majeure de survie, redoublez de prudence il faut surveiller pour récupération et des événements indésirables ou de complications. Dans les 3 jours après la castration, une régression tumorale forte a été observée, suivie d’une récidive tumorale ultérieure après environ 30 jours, ce qui représente fonciers (Figure 4 a). Les tumeurs fonciers peuvent être dissection et analysées sur le plan histologique et ne s’affichent pas toute différenciation neuroendocrine, car ils maintiennent des niveaux élevés d’AR et sont négatifs pour le marqueur neuroendocrine, synaptophysine (Figure 4 b).
Figure 1 : lobe antérieur de la prostate, ganglions lymphatiques de drainage et représentant technique pour des injections intra-hypertrophie cellulaire. Images du lobe droit antérieur la prostate (A) (noir, *), attaché la vésicule séminale droite (blanc), droite testicule et coussinets adipeux (vert) et la vessie (jaune), (B) bilatéraux drainage prostatique para-aortique ganglions lymphatiques (orange), (C) ciseaux micro-dissection, Graefe forceps, Graefe forceps tissue, un porte-aiguilles avec des fraises de suture et 50 µL seringue avec aiguille de calibre 28 (de gauche à droite), incisions de la ligne médiane (D) , vésicule séminale (E) et le lobe antérieur de la prostate externalisation, (F), injection intra-prostatique et l’engorgement (G) du lobe antérieur de la prostate. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : L’imagerie In vivo tumeur bioluminescentes et fluorescents. (A) (B) et luciférase - mCherry exprimant orthotopique Myc-CaP des tumeurs ont été imagées à l’aide d’un système d’imagerie de spectre IVIS. Bioluminescence a été quantifié par le flux total (photons/s). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : analyses de tumeur orthotopique par volume de la tumeur, poids, histologie pour infiltration immunitaire et la survie. Orthotopique tumeurs ont été disséqués sur 30 jours après l’injection intra prostatique et analysées par (A) d’imagerie, (B) tumeur volume brut (π/6 × L × W × H ; L = longueur de l’axe le plus long de la tumeur, W = largeur, H = hauteur perpendiculaire), poids de tumeur (C) , (D) CD3 IHC (barre d’échelle = 100 µm) et la survie de (E) , avec le point de terminaison objective que l’apparence de hémorragique abdominale ascite. (A-B) Données représentées sous la forme moyenne ± écart-type de la moyenne. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : injections Intra-prostatique avec une castration chirurgicale ultérieure pour modéliser les cancer de la prostate androgéno-dépendants et fonciers. (A) souris porteuses de tumeurs de luciférase exprimant orthotopique ont été photographiés par bioluminescence avant et après castration (Cx), et (B) est revenue fonciers des tumeurs ont été disséqués (noir = orthotopique tumeur de la prostate ; jaune = vessie) et analysées par H & E, AR IHC et synaptophysine IHC (avec le contrôle positif de murin) (section Echelle = 50 µm). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Discussion
Dans ce manuscrit, nous décrivent le protocole pour effectuer des injections de cellules chirurgical intra-prostate cancer. Nous avons utilisé l’androgéno-dépendants et MYC -surexprimant (surexpression deMYC est vu jusqu'à 80-90 % de cancer de la prostate humaine39) lignée cellulaire murine cancer de la prostate, Myc-CaP, isolée à l’origine de la Hi-Myc souris32 ,33. Cette lignée cellulaire a été solidement transduite pour exprimer la luciférase et mCherry, pour non invasif in vivo l’imagerie tumorale bioluminescentes et fluorescents, respectivement. En outre, chirurgie castration a également été effectuée après le développement de tumeurs androgéno-dépendants, conduisant à une régression tumorale et des récidives ultérieures. Par conséquent, nous donner des précisions pour modéliser les cancer de la prostate androgéno-dépendants orthotopique et fonciers dans un hôte immunocompétent.
Myc-CaP cellules ont été injectées dans le lobe antérieur de la prostate de souris. La prostate souris comprend les lobes de la prostate dorso-latérales, ventrales et antérieures, et l’homme la prostate se compose d’une zone périphérique, zone de transition et la zone centrale au sein d’un seul lobe40. Tandis que les études antérieures ont comparé, anatomique et histologique, le lobe de souris dorso-latérale au périphérique humain de la zone, le site de la majorité des cancers de la prostate,41et le lobe antérieur de la souris à la zone centrale humaine42, 43, plus récente et complète l’analyse a démontré que le lobe antérieur et le lobe dorso-latérale présentent des modèles d’expression de gènes étroitement liés, par rapport au lobe ventral. 44 en outre, développement de cancer de la prostate a été observé dans le lobe antérieur de gemmes40, et, pour la procédure intra-prostatique, le lobe antérieur permet l’injection du volume nécessaire de solution cellulaire du cancer avec un minimum de fuite et la variabilité.
À l’aide de s.c. et GEM transgénique modèles de cancer ont de multiples défauts et limitations. S.c. tumeurs cultivés dans un TME artificiel ont des réactions différentes aux chimiothérapies, par contraste avec les deux tumeurs orthotopique du même lignées cellulaires et la maladie humaine20,21,22. Cela peut être dû à l’altération vascularisation des tumeurs de l.c., comme en témoigne leur réponse différentielle à anti-angiogénique thérapie18,19. Au contraire, orthotopique tumeurs se développent avec un bon TME, ganglions lymphatiques de drainage et le système vasculaire et peuvent être effectuées avec des lignées de cellules murines, ainsi permettant une analyse d’immunologie tumorale et la réponse immunothérapies.
GEMs transgéniques des tumeurs avec un bon TME dans un hôte immunocompétent, mais ces modèles généralement simplifient les cancéreuses humaines par le développement des tumeurs avec une seule ou quelques altérations génétiques29. Une analyse de Myc-PAC et autres lignées cellulaires de cancer de la prostate a révélé qu’ils contenaient beaucoup plues altérations numéros copie somatique et altérations chromosomiques que les tumeurs des souris Hi-Myc et autres pierres précieuses, d'où ils ont été dérivées29. En outre, gemmes sont limitées par l’augmentation des coûts et le temps nécessaire pour la souris d’élevage pour réaliser des expériences d’une puissance suffisante. Modélisation de tumeur orthotopique peut surmonter ces limites. Lignées cellulaires humaines et murines cancer de la prostate contiennent de nombreuses altérations génétiques des maladies humaines29et, comme le cancer humain, montrent aussi grande hétérogénéité entre les cellules individuelles30. Orthotopique murins syngéniques tumeurs permettent des analyses immunologiques, alors que d’orthotopique tumeurs xénogéniques humaines permettent des analyses de produits thérapeutiques sur les cellules humaines. Enfin, contrairement à avec des gemmes, cellule lignes peuvent être modifiés avant injection, permettant l’expression de bioluminescent ou imagerie molécules fluorescentes pour surveiller la croissance de la tumeur, normaliser le fardeau de la tumeur chez les groupes expérimentaux, surveiller la réponse au traitement et à Suivez une régression tumorale et fonciers une récurrence après castration chirurgicale.
Des étapes cruciales dans le présent protocole comprennent la localisation et de l’extériorisation de la vésicule séminale et attaché lobe antérieur de la prostate sans endommager les autres tissus ou perforation de la vésicule séminale, effectuant une injection intra-prostatique réussie de la 30 µL de cellules suspension sans fuite et correctement capter toute fuite afin d’éviter le développement de tumeurs non-orthotopique tout au long de l’abdomen. La limitation majeure des injections intra-prostate atteint les compétences techniques nécessaires pour réduire au minimum la variabilité de la tumeur entre les souris. Ceci est particulièrement important pour la modélisation de fonciers, qui a la variable supplémentaire de la castration chirurgicale. Souris intra-prostatically injectés et castrés doivent également être suivies de près pour récupération et indésirables, car ils ont subi deux chirurgies majeurs de survie. Une autre limite est le temps de chaque injection intra-prostatique. Ce nombre peut être réduit à basse que 20 min, et le chirurgien adjoint peut préparer la prochaine souris comme la souris actuelle est être suturée. Enfin, les tumeurs orthotopique Myc-CaP sont agressifs, à croissance rapide des tumeurs qui atteignent le point de terminaison de survie en 46 jours environ (et aussi tôt que 35 jours) en raison de la tumeur primitive massive. Les études nécessitant le développement de tumeurs plus lent ou des traitements à long terme doivent être optimisées empiriquement pour le schéma thérapeutique à la comte et le traitement des cellules à injection initiale. Contrairement à des limitations de tumeurs s.c. et de pierres précieuses, toutes les limitations ci-dessus du modèle orthotopique tumeur peuvent être surmontés, et des modifications supplémentaires du protocole peuvent être pries en fonction de besoins expérimentaux.
Comme l’orthotopic modèle de tumeur implique l’utilisation de in vitro-manipulés, ces cellules peuvent être modifiées selon les besoins de l’étude. Ici, nous avons modifié ces cellules pour exprimer stablement luciférase et mCherry pour la surveillance des tumeurs in vivo . Nous avons également réalisé un knock-out CRISPR-Cas9 du suppresseur de tumeur PTEN, pour produire une lignée de cellules plus agressive et cliniquement pertinents qui pousse plus vite comme les tumeurs orthotopique (manuscrit en examen). Avec les avantages du modèle de tumeur orthotopique, la possibilité d’étudier les cancer de la prostate androgéno-dépendants et fonciers et la possibilité d’exprimer des modalités d’imagerie ou précipitation ou overexpress certains gènes, ce protocole sert comme une ressource précieuse pour tous recherche sur le cancer de la prostate.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par les instituts nationaux de santé subventions Praveen Thumbikat (NIDDK R01 DK094898), Abdulkadir Sarki (NCI R01 CA167966, NCI R01 CA123484, NCI P50 CA180995) et Jonathan Anker (NCI F30 CA203472).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Myc-CaP cell line | ATCC | CRL-3255 | Verify as mycoplasma-free before use |
| Micro-dissecting scissors | Roboz | RS-5910 | |
| Graege forceps | Roboz | RS-5135 | |
| Graefe tissue forceps | Roboz | RS-5150 | |
| Olsen-Hegar needle holder with suture cutters | FST | 12002-12 | |
| 50 µL Syringe 705 RN SYR | Hamilton | 7637-01 | Sterilize by ethylene oxide gas |
| 28-gauge Needles Small Hub RN | Hamilton | 7803-02 | Point style 4, Angle 45°, Length 0.75 in. Sterilized by ethylene oxide gas |
| RPMI | Gibco | 18875-093 | |
| FBS | Gibco | 10437-028 | |
| Pencillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Matrigel basement membrane matrix, phenol red-free, LDEV-free | Corning | 356237 | Thaw on ice in 4°C overnight before use |
| Isoflurane | Henry Schein | 11695-0500-2 | Acquired from Northwestern University Center for Comparative Medicine (CCM) |
| 26 5/8-gauge syringe | BD | 309597 | For meloxicam and buprenorphine injections |
| Buprenorphine hyrochloride 0.3 mg/mL | 12496-0757-5 | Controlled substance, acquired from Northwestern University CCM | |
| Ophthalmic ointment lubrication | Akron | 17478-162-35 | |
| Betadine surgical scrub (povidone-iodine, 7.5%) | Purdue Products | 67618-151-16 | |
| Sterile non-adhering pads | Moore Medical | 10775 | |
| Sterile alcohol wipes | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Surgical microscope Stemi DV4 | Zeiss | ||
| Sterile polyester tipped applicators | Puritan | 25-806 1PD | |
| 5-0 vicryl absorbable reverse cutting needle sutures | eSutures | J493G | |
| 4-0 nylon monfilament non-absorbable reverse cutting needle sutures | eSutures | 699H | |
| Glass bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Sterile saline 0.9% sodium chloride | Hospira | 0409-4888-02 | |
| Meloxicam (Eloxiject) 5 mg/mL | Henry Schein | 11695-6925-1 | Acquired from Northwestern University CCM |
| D-luciferin Firefly, sodium salt monohydrate | Goldbio | LUCNA | |
| IVIS Spectrum Imaging System | PerkinElmer | ||
| Cauery surgical pen | Bovie Medical Corporation | AA01 | |
| CD3ε antibody (clone 2GV6) | Ventana | 790-4341 | |
| Caliper | Fisher Scientific | 14-648-17 | |
| Androgen receptor antibody | Thermo Scientific | RB-9030-P1 | 1:500 staining dilution |
| Synaptophysin antibody (clone Z66) | Life Technologies | 18-0130 | 1:200 staining dilution |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer Statistics, 2017. CA-Cancer J Clin. 67 (1), 7-30 (2017).
- Alemozaffar, M., et al. Prediction of erectile function following treatment for prostate cancer. JAMA. 306 (11), 1205-1214 (2011).
- Alibhai, S. M., et al. 30-day mortality and major complications after radical prostatectomy: influence of age and comorbidity. J Natl Cancer I. 97 (20), 1525-1532 (2005).
- Chen, R. C., Clark, J. A., Talcott, J. A. Individualizing quality-of-life outcomes reporting: how localized prostate cancer treatments affect patients with different levels of baseline urinary, bowel, and sexual function. J Clin Oncol. 27 (24), 3916-3922 (2009).
- Kohutek, Z. A., et al. Long-Term Impact of Androgen-Deprivation Therapy on Cardiovascular Morbidity after Radiotherapy for Clinically Localized Prostate Cancer. Urology. , (2015).
- Murray, L., et al. Second primary cancers after radiation for prostate cancer: a systematic review of the clinical data and impact of treatment technique. Radiother Oncol. 110 (2), 213-228 (2014).
- Resnick, M. J., et al. Long-term functional outcomes after treatment for localized prostate cancer. N Engl J Med. 368 (5), 436-445 (2013).
- Shahinian, V. B., Kuo, Y. F., Freeman, J., Goodwin, J. S. Risk of fracture after androgen deprivation for prostate cancer. New Engl J Med. 352 (2), 154-164 (2005).
- Wilke, D. R., et al. Testosterone and erectile function recovery after radiotherapy and long-term androgen deprivation with luteinizing hormone-releasing hormone agonists. BJU Int. 97 (5), 963-968 (2006).
- Zhao, J., et al. Androgen deprivation therapy for prostate cancer is associated with cardiovascular morbidity and mortality: a meta-analysis of population-based observational studies. PLoS One. 9 (9), e107516 (2014).
- Berthold, D. R., et al. Docetaxel plus prednisone or mitoxantrone plus prednisone for advanced prostate cancer: updated survival in the TAX 327 study. J Clin Oncol. 26 (2), 242-245 (2008).
- Bono, J. S., et al. Prednisone plus cabazitaxel or mitoxantrone for metastatic castration-resistant prostate cancer progressing after docetaxel treatment: a randomised open-label trial. Lancet. 376 (9747), 1147-1154 (2010).
- Fizazi, K., et al. Abiraterone acetate for treatment of metastatic castration-resistant prostate cancer: final overall survival analysis of the COU-AA-301 randomised, double-blind, placebo-controlled phase 3 study. Lancet Oncol. 13 (10), 983-992 (2012).
- Kantoff, P. W., et al. Sipuleucel-T immunotherapy for castration-resistant prostate cancer. New Engl J Med. 363 (5), 411-422 (2010).
- Parker, C., et al. Alpha emitter radium-223 and survival in metastatic prostate cancer. New Engl J Med. 369 (3), 213-223 (2013).
- Rathkopf, D. E., et al. Updated Interim Efficacy Analysis and Long-term Safety of Abiraterone Acetate in Metastatic Castration-resistant Prostate Cancer Patients Without Prior Chemotherapy (COU-AA-302). Eur Urol. 66 (5), 815-825 (2014).
- Scher, H. I., et al. Increased survival with enzalutamide in prostate cancer after chemotherapy. New Engl J Med. 367 (13), 1187-1197 (2012).
- Field, S. B., et al. Differences in vascular response between primary and transplanted tumours. Brit J Cancer. 63 (5), 723-726 (1991).
- Cowen, S. E., Bibby, M. C., Double, J. A. Characterisation of the vasculature within a murine adenocarcinoma growing in different sites to evaluate the potential of vascular therapies. Acta Oncol. 34 (3), 357-360 (1995).
- Kuo, T. H., et al. Site-specific chemosensitivity of human small-cell lung carcinoma growing orthotopically compared to subcutaneously in SCID mice: the importance of orthotopic models to obtain relevant drug evaluation data. Anticancer Res. 13 (3), 627-630 (1993).
- Fidler, I. J., et al. Modulation of tumor cell response to chemotherapy by the organ environment. Cancer Meta Rev. 13 (2), 209-222 (1994).
- Wilmanns, C., et al. Modulation of Doxorubicin sensitivity and level of p-glycoprotein expression in human colon-carcinoma cells by ectopic and orthotopic environments in nude-mice. Int J Oncol. 3 (3), 413-422 (1993).
- Fidler, I. J. Orthotopic implantation of human colon carcinomas into nude mice provides a valuable model for the biology and therapy of metastasis. Cancer Meta Rev. 10 (3), 229-243 (1991).
- Kwon, E. D., et al. Ipilimumab versus placebo after radiotherapy in patients with metastatic castration-resistant prostate cancer that had progressed after docetaxel chemotherapy (CA184-043): a multicentre, randomised, double-blind, phase 3 trial. Lancet Oncol. 15 (7), 700-712 (2014).
- Topalian, S. L., et al. Safety, activity, and immune correlates of anti-PD-1 antibody in cancer. New Engl J Med. 366 (26), 2443-2454 (2012).
- Pasqualini, R., Ruoslahti, E. Organ targeting in vivo using phage display peptide libraries. Nature. 380 (6572), 364-366 (1996).
- Conway, E. M., Carmeliet, P. The diversity of endothelial cells: a challenge for therapeutic angiogenesis. Genome Biol. 5 (2), 207 (2004).
- Loi, M., et al. The use of the orthotopic model to validate antivascular therapies for cancer. Int J Dev Biol. 55 (4-5), 547-555 (2011).
- Bianchi-Frias, D., Hernandez, S. A., Coleman, R., Wu, H., Nelson, P. S. The landscape of somatic chromosomal copy number aberrations in GEM models of prostate carcinoma. Mol Cancer Res. 13 (2), 339-347 (2015).
- Pan, Y., et al. Characterization of chromosomal abnormalities in prostate cancer cell lines by spectral karyotyping. Cytogenet Cell Genet. 87 (3-4), 225-232 (1999).
- Wang, J., et al. Pim1 kinase synergizes with c-MYC to induce advanced prostate carcinoma. Oncogene. 29 (17), 2477-2487 (2010).
- Watson, P. A., et al. Context-dependent hormone-refractory progression revealed through characterization of a novel murine prostate cancer cell line. Cancer Res. 65 (24), 11565-11571 (2005).
- Ellis, L., Lehet, K., Ramakrishnan, S., Adelaiye, R., Pili, R. Development of a castrate resistant transplant tumor model of prostate cancer. Prostate. 72 (6), 587-591 (2012).
- Nunez-Cruz, S., Connolly, D. C., Scholler, N. An orthotopic model of serous ovarian cancer in immunocompetent mice for in vivo tumor imaging and monitoring of tumor immune responses. J Vis Exp. (45), (2010).
- Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. J Vis Exp. (26), (2009).
- Ellis, L., Lehet, K., Ku, S., Azabdaftari, G., Pili, R. Generation of a syngeneic orthotopic transplant model of prostate cancer metastasis. Oncoscience. 1 (10), 609-613 (2014).
- Wallace, J. Humane endpoints and cancer research. ILAR J. 41 (2), 87-93 (2000).
- Valkenburg, K. C., Amend, S. R., Pienta, K. J. Murine Prostate Micro-dissection and Surgical Castration. J Vis Exp. (111), (2016).
- Koh, C. M., et al. MYC and Prostate Cancer. Genes Cancer. 1 (6), 617-628 (2010).
- Shappell, S. B., et al. Prostate pathology of genetically engineered mice: definitions and classification. The consensus report from the Bar Harbor meeting of the Mouse Models of Human Cancer Consortium Prostate Pathology Committee. Cancer Res. 64 (6), 2270-2305 (2004).
- McNeal, J. E., Redwine, E. A., Freiha, F. S., Stamey, T. A. Zonal distribution of prostatic adenocarcinoma. Correlation with histologic pattern and direction of spread. Am J Surg Pathol. 12 (12), 897-906 (1988).
- Price, D. Comparative Aspects of Development and Structure in the Prostate. Natl Cancer I Monogr. 12, 1-27 (1963).
- Roy-Burman, P., Wu, H., Powell, W. C., Hagenkord, J., Cohen, M. B. Genetically defined mouse models that mimic natural aspects of human prostate cancer development. Endocr-Relat Cancer. 11 (2), 225-254 (2004).
- Berquin, I. M., Min, Y., Wu, R., Wu, H., Chen, Y. Q.
