Summary
El objetivo de este protocolo es demostrar la inyección intra prostática de las células de cáncer de próstata, con la posterior castración. Modelos preclínicos ortotópico de cáncer de próstata andrógeno-dependiente y resistente a la castración son críticos para el estudio de la enfermedad en el contexto de un microambiente tumoral clínicamente relevante y un anfitrión inmunocompetente.
Abstract
Ortotópico tumor modelación es una herramienta valiosa para la investigación del cáncer de próstata clínico previo, ya que tiene múltiples ventajas sobre ambos subcutáneo y transgénicos genéticamente modificados modelos de ratón. A diferencia de los tumores subcutáneos, tumores ortotópicos contienen vasculatura más clínico exacto, microambiente tumoral y respuestas a las terapias múltiples. En contraste a los modelos de ratón modificados genéticamente, orthotopic del modelos pueden realizarse con menor costo y en menos tiempo, implican el uso de ratón altamente complejo y heterogéneo o líneas celulares de cáncer humano, algo solo alteraciones genéticas y estas células las líneas pueden ser genéticamente modificados, como express agentes de imagen. Aquí, presentamos un protocolo quirúrgico inyectar una línea de células expresan luciferasa y mCherry murino de cáncer de próstata en el lóbulo anterior de la próstata de ratones. Estos ratones desarrollaron tumores de orthotopic que fueron monitorizados de forma no invasiva en vivo y más analizan en el volumen del tumor, peso, supervivencia del ratón y la infiltración inmune. Además, ratones con tumores de orthotopic fueron castrados quirúrgicamente, conduce a la regresión del tumor inmediata y posterior recurrencia, que representa el cáncer de próstata resistente a castración. Aunque la habilidad técnica es necesaria para llevar a cabo este procedimiento, este modelo de syngeneic ortotópico de cáncer de próstata andrógeno-dependiente y resistente a la castración es de gran utilidad para todos los investigadores en el campo.
Introduction
El cáncer de próstata se estima que la incidencia más alta (161.360 hombres) y causar las muertes de cáncer masculino más tercera (84.590 hombres) en 20171. Tras el diagnóstico, tumores de próstata son andrógeno dependientes y son tratados por cirugía prostatectomía, radioterapia o terapia de privación androgénica (ADT), sin embargo, cada tratamiento se asocia con múltiples principales morbilidades y complicaciones2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. a pesar de la regresión del tumor después de ADT, se repiten casi todos los tumores como el cáncer de próstata resistente a castración (CPRP). En esta etapa, tratamientos aprobados incluyen docetaxel, inmunoterapia Sipuleucel-T y el antiandrógeno pequeñas moléculas enzalutamide y abiraterona, sin embargo, no hay terapia individual confiere un beneficio de supervivencia de más de 5,2 meses11, 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17. por lo tanto, los hombres en todas las etapas del cáncer de próstata necesitan opciones de mejora del tratamiento y manejo de enfermedades, para que la enfermedad preclínica óptima modelado es crucial.
Con el procedimiento correcto, las líneas celulares de cáncer de próstata pueden ser inculcadas quirúrgicamente dentro de la próstata murina, llevando al desarrollo de ambos tumores ortotópicos syngeneic o xenogeneicos. Modelado de tumor de orthotopic es ideal para todos tumor biología y drogas desarrollo investigación, lo que permite un desarrollo de tumores con un microambiente tumoral clínicamente representativos (TME). Estudios anteriores han demostrado que los tumores subcutáneos (s.c.) tienen una vasculatura tumoral alterado, llevando a diferencial y menos clínico precisas respuestas a anti-angiogenic terapias18,19. Además, varios estudios han observado la eficacia de aumento o disminución de varios quimioterápicos en el tratamiento de la misma línea celular, dependiendo de si es administrado s.c. o orthotopically, que representa mejor lo que se ve en humanos cáncer20,21,22. Además, sólo en un modelo ortotópico de cáncer de colon, pero no en el modelo de s.c., tumores producen las enzimas degradativas correcto necesarias para inducir la metástasis23. Por último, las inmunoterapias siguen apareciendo en la vanguardia de la terapia del cáncer, y especialmente deben proporcionar un beneficio significativo para el cáncer de próstata24,25, syngeneic modelos preclínicos con TME precisa y drenaje linfáticos en anfitriones inmunocompetentes son críticos.
Hay muchos factores responsables de estos resultados inconsistentes en el sitio del tumor. Con un TME diferentes, las células cancerosas están expuestas a diferentes tejidos específicos endotelio y alteración la angiogénesis, afectando tumor desarrollo26,27. Tumores ortotópicos con TME correcto permiten el suministro de medicamentos clínicamente relevantes, condiciones hipóxicas y evaluación de anti-angiogenic terapias28. Mientras que modelos genéticamente (GEMs) contienen un TME precisa, que requieren mucho tiempo épocas de cría, alto costo y son a menudo basan en manipulaciones de uno o pocos genes noqueado o sobre expresa más allá de niveles clínicamente relevantes. En contraste, las líneas celulares de cáncer de próstata humano y murino utilizadas en tumores ortotópicos, como los tumores humanos, son genéticamente más complejas dentro de las células y en Mostrar heterogeneidad entre células29,30. También a diferencia de gemas, ortotópico líneas celulares de cáncer pueden ser diseñadas para expresar modalidades de imágenes o aumentadas o disminución de los niveles de otras moléculas de interés y in vitro e in vivo los resultados experimentales puede compararse directamente. Ortotópica de tumores también pueden ser formados de células derivadas del paciente primarias. Aquí, divulgamos la metodología para la realización de inyecciones intra prostática de las células de cáncer de próstata que forman tumores andrógeno-dependientes de orthotopic y, después de la castración, se repiten como orthotopic del CPRP.
Protocol
Todos los animales procedimientos descritos en este protocolo deben realizarse conforme a las normas éticas y la aprobación de la correspondiente Universidad institucional Animal Care y Comité uso (IACUC).
1. preparación de materiales quirúrgicos y las células cancerosas
- Antes del día de la cirugía, autoclave las tijeras de disección micro, pinzas Graefe, Graefe tejido pinzas, sostenedor de la aguja con los cortadores de sutura y el número apropiado de cortinas. Esterilizar una jeringa de 50 μl y agujas calibre 28 por gas de óxido de etileno (figura 1).
- Antes del día de la cirugía, las células de Myc-CaP de cultura en platos de 10 cm en RPMI suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS) y 1% penicilina/estreptomicina (P/S) en una incubadora de 37 ° C de 5% CO2 . Para el control de tumor bioluminiscente o fluorescente, transfectar las células 293T con los vectores apropiados y posteriormente transducir células Myc-CaP con 0.45 μm filtrado lentivirus31. Ordenar las células para generar una línea celular estable con 100% de positividad de transducción de señales.
Nota: Realizar todos los cultivo de tejidos en condiciones estériles y verificar que todas las líneas de celular están libres de mycoplasma. La línea celular de cáncer de próstata murino utilizada en este estudio, Myc-CaP32, es transduced para estable expresan luciferasa de luciérnaga y mCherry. La iss de línea celular Myc-CaP aislada de un c-myc-expresando ratón Hi-myc y estas células contienen un receptor de andrógenos amplificado (AR), que son andrógeno dependientes32 y formar tumores CPRP después de castración murino33. Todos los ratones en este estudio son ratones FVB/NJ machos de 6 a 8 semanas de edad. Líneas celulares de cáncer de próstata murino alternativa pueden utilizarse con los ratones de fondo genético apropiado, así como líneas celulares de cáncer de próstata humano o las células de cáncer de próstata primario derivado de paciente con ratones inmunodeficientes. El número óptimo de células por inyección debe determinarse empíricamente para líneas celulares alternativos. Además, las modalidades de la proyección de imagen de alternativa puede ser utilizado para visualizar tumores, incluyendo la proyección de imagen de resonancia magnética (MRI), tomografía por emisión de positrones (PET) o tomografía computada (CT), así como de GFP como alternativa a mCherry. - La noche antes de la cirugía, colocar matrigel matriz de la membrana del sótano y sin rojo fenol en hielo a 4 º C para descongelar.
- En el día de la cirugía, recoge las células de lavado con tampón fosfato salino (PBS) y la extracción con 0.25% tripsina-EDTA. Neutralizar la tripsina con RPMI con 10% FBS y 1% P/S.
- Centrifugar las células a 400 x g durante 5 minutos.
- Lavar las células con 10 mL de RPMI sin FBS o P/S.
- Contar las células y resuspender las células en PBS a una concentración de 6.67x107 células/mL (1 x 106 células/15 μl).
- Añadir un volumen igual de matrigel crear una suspensión de células de PBS/matrigel 1:1 a una concentración final de 1 × 106 células/30 μl y mantener las células en hielo hasta la inyección para evitar la solidificación.
Nota: Realizar inyecciones intra prostática dentro de 3 h de preparación de suspensiones celulares de matrigel. Si realizar inyecciones intra prostática en más de 5 ratones, repita los pasos anteriores para preparar una suspensión fresca de matrigel.
2. preparación de mouse preoperatorio
Nota: ratones de la casa en la Universidad Animalario para por lo menos una semana antes de la cirugía para permitir la adecuada adaptación y minimizar el estrés animal. Los pasos 2.1-2.6 son realizados por el Asistente de cirujano. Todos los pasos quirúrgicos subsecuentes son realizados por el cirujano usando herramientas quirúrgicas y guantes estériles con técnica estéril.
- Anestesiar los ratones con isoflurano (2-5% para la inducción a través de la cámara, 1-3% para el mantenimiento a través del cono de nariz). Verificar la inducción completa por la pérdida del reflejo de pellizco del dedo del pie.
- Peso de los ratones y administrar por lo menos de 0,05 mg/kg de buprenorfina analgésico s.c.
Nota: Ratón peso ≥ 20 g es ideal para las inyecciones intra prostática exitosas. - Aplique lubricación ungüento oftálmico en ambos ojos para evitar la sequedad corneal.
- Aféitese todos de piel del abdomen.
- Esterilizar el abdomen por tres rondas de aplicación circular de lavado quirúrgico usando teclas no adherentes estériles seguidos de toallitas de alcohol estéril. Permita que el abdomen se seque.
Nota: Para el resto del procedimiento quirúrgico, instrumentos quirúrgicos y guantes estériles pueden póngase en contacto con el abdomen de ratón esterilizada. - Transferir el ratón decúbito supino sobre una superficie limpia sobre una almohadilla de calefacción directamente en el objetivo de un microscopio quirúrgico limpio.
- Cubre el ratón con un paño estéril con un pequeño orificio sobre el abdomen.
3. Intra prostática inyección
Nota: Realice todos los pasos quirúrgicos en condiciones estériles. Ajuste del microscopio, la colocación del ratón o cualquier otros objetos no estériles deben ser realizados por el Asistente de cirujano.
- Realizar una incisión de aproximadamente 1 cm de la piel externa a lo largo de la línea media del abdomen superior a la del pene y las glándulas prepuciales (figura 1).
- Separar el tejido conectivo entre la piel abdominal y la musculatura abdominal interna abriendo las tijeras entre las capas.
- Realizar una incisión similar de la musculatura abdominal interna durante el uso de fórceps para levantar la musculatura para evitar perforar los intestinos o la vejiga (figura 1).
- Localizar una de las vesículas seminales bilaterales (figura 1A, blanco) / lóbulos de la próstata anteriores (figura 1A, negro), que son a menudo posterior, lateral y ligeramente superior a la vejiga (figura 1A, amarillo), pero esto pueden variar entre ratones . El lóbulos anteriores de la próstata son translúcidos y adjunto a la curvatura menor de las blanco las vesículas seminales.
- Suavemente Levante la punta de la vesícula seminal con el fórceps de tejido de Graefe para crear tensión en el tejido sin pinchar la vesícula seminal (Figura 1E).
- Mezcle la solución de matrigel de Myc-CaP transfiriendo gentile (realizada por el ayudante de cirujano), como las células pueden haber peleteado y aspirar lentamente 30 μl (1 x 106 células) dentro de la aguja para evitar burbujas de aire.
- Introduzca con cuidado el bisel de la URL de la aguja al eje largo del lóbulo anterior de la próstata. Lentamente inyecte 30 μL en el lóbulo y retraiga lentamente la aguja para evitar fugas (Figura 1F). Verificar adecuada inyección por congestión de próstata lóbulo anterior (figura 1).
- Mantener cuidadosamente la vesícula seminal y lóbulo prostático inyectado fuera de ratón de aproximadamente 30 s para permitir matrigel solidificar parcialmente dentro del lóbulo. Durante este tiempo, recoger cualquier fuga de solución de la célula en el abdomen usando un aplicador con punta de poliéster estéril para evitar desarrollo de tumor no ortotópico, sin presionar sobre el lóbulo prostático inyectado.
- Cuidadosamente regrese la vesícula seminal y lóbulo prostático inyectado en el abdomen sin ejercer presión sobre el lóbulo. Reemplazar cualquier tejido externalizada.
- Realizar sutura continua para cerrar la musculatura abdominal interna con suturas de 5-0 vicryl absorbible corte inversa aguja.
- Realizar suturas interrumpidas para cerrar la piel abdominal con suturas de aguja de corte inverso no absorbible de monofilamento de 4-0 nylon.
Nota: Grapas esterilizada de 9 mm pueden utilizarse también para cerrar la piel abdominal externa. Sin embargo, en contraste con las suturas, interfieren con cualquier tumor bioluminiscente y fluorescente posterior señal de imagen. - Limpie todas las herramientas con toallitas estériles etanol (abiertos por el Asistente de cirujano) y colocarlos en un esterilizador de bolas de cristal para permitir s. 30 herramientas para secar antes del uso del ratón siguiente.
- Enjuague la jeringa y la aguja con solución salina estéril (abierta por el Asistente de cirujano) para evitar que se obstruya por remanente matrigel.
Nota: Un asistente del cirujano debe estar presente para todas las operaciones, realizar preparación preoperatoria ratón todo estéril y cuidado postoperatorio del ratón, así como para mezclar la solución de matrigel Myc-CaP antes de las inyecciones. Para minimizar el tiempo, como cada procedimiento intra prostática ratón requiere 20-30 min, el ayudante del cirujano puede comenzar a preparar el próximo ratón como el cirujano sutura el ratón actual.
4. postoperatorio del ratón cuidado
- Administrar 1 mg/kg de meloxicam analgésico s.c. inmediatamente, 24 h y 48 h después de la cirugía.
- Permiten ratones recuperar en una jaula con no ropa de cama colocado a mitad de camino en un cojín de calefacción. Controlar ratones durante al menos 30 minutos después de la cirugía hasta que recuperaran movilidad normal y la actividad, después de que coloque en una jaula limpia con alimento en el piso de la jaula.
- Monitor más ratones diariamente para la correcta cicatrización de heridas, peso corporal, aseo y paseo después de la cirugía. Ratones separados en jaulas individuales sobre cualquier evidencia de la lucha.
- Retire cualquier suturas restantes dentro de 14 días después de la cirugía.
5. proyección de imagen de Tumor bioluminiscente
- Preparar Na filtrado estéril+ o K+ D-luciferin, como descrito por el fabricante y protegido de la luz.
- Inyectar a ratones intra peritoneally con 10 μl/g de peso corporal de luciferin.
- Por lo menos 10 minutos más tarde, ratones de la imagen con un sistema de proyección de imagen de espectro de IVIS, como se describió anteriormente34,35.
- Analizar imágenes usando vida Software de imagen, como describió anteriormente34,35.
Nota: IVIS análisis de imagen es útil para determinar éxito inyecciones intra prostática y el desarrollo de tumor inicial para normalizar la carga del tumor entre los grupos experimentales. Sin embargo, dependiendo de la intensidad de la señal fluorescente o bioluminiscente, saturación puede causar una meseta en la cuantificación de la imagen a pesar de un aumento en el tamaño tumoral real. Por lo tanto, en las últimas etapas del crecimiento del tumor, proyección de imagen de IVIS puede ser más útil para determinar las disminuciones en el tamaño del tumor al tratamiento acertado que aumenta de tamaño después de la saturación de la imagen.
6. tumor colección, análisis del Tumor, supervivencia extremo
- Si recoger el tumor para su análisis, humanamente eutanasia ratones por exposición a CO2 y dislocación cervical secundaria, o por métodos alternativos de IACUC aprobado y diseccionar los tumores del abdomen. Los tumores deben ser orthotopically situado en la próstata.
Nota: Los tumores atado a la pared abdominal anterior o sembradas en todo el abdomen indican pobre o con fugas de inyección intra prostática y no deben considerarse como tumores ortotópicos. - Peso de los tumores.
- Calcular el volumen del tumor como π/6 × L × W × H (L = longitud del eje mayor del tumor, W = ancho perpendicular, H = altura perpendicular).
- Los tumores pueden ser analizadas por la histología (arreglo en 10% formalina tamponada neutra), citometría de flujo (crear suspensiones celulares solo), proteína (preparar tejido lisado en almacenador intermediario RIPA), o el RNA (inmediatamente lugar tejido en RNAlater).
- Para análisis inmunológicos, también recogen los próstata tumor-drenaje paraaórticos ganglios linfáticos (figura 1B, naranja) y el bazo.
Nota: Si después de ratones para la supervivencia, el punto final de este modelo se define como la aparición de ascitis abdominal hemorrágica36 o disminución de ambulación, grooming y piloerección37. Ratones para análisis de supervivencia reciban analgesia pre y postoperatoria (pasos de protocolo 2.2, 4.1) y deben ser vigilados regularmente. Ratones deben ser separados en jaulas individuales si cualquier lucha se produce y debe ser sacrificado humanitariamente a la aparición de cualquiera de las anteriores lecturas de punto final.
7. quirúrgica castración a modelo CPRP
- Para modelo CPRP, realizar el anterior protocolo de inyección intra prostática (pasos 1-5 del Protocolo).
- Por lo menos una semana más tarde, después del desarrollo del tumor, realizar castración quirúrgica mediante cauterización, como se describió anteriormente38.
- Monitorear regresión del tumor y la recurrencia de imágenes bioluminiscentes. Después de la castración, se producirá la regresión del tumor dentro de 3 días y recurrencia tumoral se producirá en aproximadamente 30 días, representando CPRP.
Representative Results
En este manuscrito, quirúrgicamente inyectamos la línea celular de cáncer de próstata murino, Myc-CaP, en el lóbulo anterior de la próstata (figura 1A), llevando al desarrollo de tumores de próstata ortotópico con un TME clínicamente relevante y la correcta próstata-drenaje linfáticos (figura 1B). Esto se realizó con tijeras micro disección Graefe fórceps, Graefe tejido pinzas, un sostenedor de la aguja con los cortadores de sutura y una jeringa de 50 μL con una aguja de calibre 28 (figura 1). Tras realizar una incisión aproximadamente 1 cm de la línea media abdominal por encima de las glándulas prepuciales (figura 1), una vesícula seminal y adjunto anterior lóbulo prostático fueron localizados y exteriorizado (Figura 1E) y 30 μl (1 x 106 células) de un Suspensión 1:1 PBS/matrigel se inyectó en la próstata (Figura 1F), verificada como inicialmente por la hinchazón de los senos del lóbulo y la falta de salida (figura 1).
Para supervisar el crecimiento del tumor ortotópico, nos estable transfected las células Myc-CaP para expresan luciferasa de luciérnaga y mCherry, permitiendo tumores seguida de invasiva en vivo bioluminiscencia (figura 2A) y fluorescencia (figura 2B), respectivamente. Una limitación de esta imagen es que, dependiendo de la intensidad de la señal, la cuantificación de la proyección de imagen puede saturar mientras que el tumor continúa creciendo en tamaño. Por lo tanto, con intensidades de la señal alto, esta en vivo la proyección de imagen es más útil para normalizar inicialmente carga tumoral a través de grupos experimentales y para más adelante determinar disminución en el tamaño del tumor después de tratamientos experimentales. Modalidades de imágenes adicionales también pueden ser utilizadas, como el pequeño animal PET y MRI y CT.
Tumores ortotópicos fueron disecados del abdomen en 30 días después de la inyección intra prostática (Figura 3A). Tumores ortotópicos deben estar ubicados en el sitio del lóbulo anterior de la próstata. Tumor de masas en el abdomen o fijada a la pared abdominal anterior indicar inadecuada inyección intra prostática y fugas. Con la técnica adecuada, se pueden grabar con error estándar relativamente pequeño volumen del tumor (figura 3B) y peso (figura 3). Sin embargo, como se observa, habrá cierta variabilidad con las masas de tumor pequeño y grande. Por lo tanto, su uso inicial de la cuantificación de imágenes de pretratamiento para igualar la carga del tumor entre los brazos experimentales es fundamental para todos los experimentos. Además, como estas células cancerosas murinas fueron inyectadas en ratones FVB/NJ inmunocompetentes, lo TME puede ser analizada por inmunohistoquímica (IHQ) (o citometría de flujo u otras técnicas) de las células de T de CD3 (figura 3D) (u otros tipos de células inmunes). Por último, este modelo proporciona un punto final objetivo de supervivencia, como el tumor primario grande causas masivo hemorrágico ascitis abdominal36 (figura 3E) o disminución de ambulación, grooming y piloerección37. En ocasiones, la muerte también puede ser causada por el crecimiento del tumor bloqueando la salida de la orina.
Por último, este modelo puede ser utilizado para estudiar el cáncer de próstata andrógeno-dependiente y CPRP, el último de los cuales confiere mal pronóstico y necesita opciones de nuevo tratamiento. Después del desarrollo de tumor de orthotopic, ratones fueron castrados quirúrgicamente, como se describió anteriormente38. Es la segunda cirugía mayor supervivencia, adicional debe tener cuidado con seguimiento de recuperación y cualquier eventos adversos o complicaciones. Dentro de 3 días después de la castración, se observó regresión del tumor fuerte, seguido de posteriores recidivas después de aproximadamente 30 días, representando el CPRP (Figura 4A). Tumores CPRP pueden disección y análisis histológico y no muestran ninguna diferenciación neuroendocrina, ya que mantienen altos niveles de AR y son negativos para el marcador neuroendocrino, sinaptofisina (Figura 4B).
Figura 1: lóbulo Anterior próstata, drenaje de los ganglios linfáticos y representante técnica de inyecciones de células intra prostática. Imágenes del lóbulo prostático anterior derecha (A) (negro, *), une la vesícula seminal derecha (blanco), derecha testículo y cojín gordo (verde) y vejiga (amarillo), (B) bilateral próstata drenaje paraaórticos ganglios linfáticos (naranja), (C) tijeras disección micro, Graefe pinza, Graefe tejido pinzas, un sostenedor de la aguja con los cortadores de sutura y 50 μl jeringa con aguja de calibre 28 (de izquierda a derecha), incisiones de la línea media (D) , (E) la vesícula seminal y anterior del lóbulo prostático externalización, (F), inyección intra prostática y congestión (G) del lóbulo anterior de la próstata. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: En vivo bioluminiscente y fluorescente tumor proyección de imagen de. (A) (B) y luciferasa mCherry-expresar tumores ortotópicos Myc-CaP se reflejada mediante un sistema de proyección de imagen de espectro de IVIS. Bioluminescence se cuantificó por flujo total (fotones/s). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Análisis de tumor ortotópico por peso, volumen del tumor, histología de infiltración inmune y la supervivencia. Tumores ortotópicos se diseca el día 30 después de la inyección intra prostática y se analizaron por (A) proyección de imagen, (B) tumor volumen bruto (π/6 × L × W × H; L = longitud del eje mayor del tumor, W = ancho perpendicular, H = altura perpendicular), (C) peso del tumor, (D) CD3 IHC (barra de escala = 100 μm) y (E) la supervivencia, con el criterio de valoración objetiva como la aparición de hemorrágico abdominal ascitis. (A-B) Datos representados como media ± error estándar de la media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: inyecciones Intra prostática posterior castración quirúrgica para cáncer de próstata andrógeno-dependiente y CPRP. (A) ratones tumores expresan luciferasa ortotópico fueron reflejadas por bioluminiscencia pre y post castración (Cx), y (B) se repitió CPRP tumores fueron disecados (negro = orthotopic del tumor de la próstata; amarillo = vejiga) y analizadas por H & E, IHC AR y el synaptophysin IHC (con control positivo murino) (barra de escala = 50 μm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
En este manuscrito Contorneamos el protocolo para realizar inyecciones de células de cáncer prostático intra quirúrgica. Utilizamos el andrógeno-dependiente y MYC -overexpressing (MYC sobreexpresión es vista a 80-90% de cáncer de próstata humano39) línea de celular del murino de cáncer de próstata, Myc-CaP, aislado originalmente de la Hi-Myc ratón32 ,33. Esta línea celular fue transduced estable para expresan luciferasa y mCherry, no invasivo en vivo imagen de tumor bioluminiscente y fluorescente, respectivamente. También se realizó la castración quirúrgica, más después del desarrollo de tumor dependiente de andrógenos, conduce a la regresión del tumor y la recurrencia posterior. Por ello, ofrecemos información para el cáncer de próstata andrógeno-dependiente ortotópico y CPRP en un anfitrión inmunocompetente.
MYC-CaP las células se inyectan en el lóbulo anterior de la próstata de ratones. La próstata del ratón consiste en los lóbulos anteriores, ventrales y dorsolateral de próstata y la próstata humana consiste en una zona periférica, zona transicional y zona central dentro de un solo lóbulo40. Mientras que estudios anteriores han comparado anatómico e histológico del lóbulo dorsolateral del ratón al humano periférico de la zona, el sitio de la mayoría de los cánceres de próstata41y el lóbulo anterior del ratón a la zona central humano42, 43, más reciente y amplio análisis ha demostrado que el lóbulo anterior y lóbulo dorsolateral muestran patrones de expresión de genes estrechamente relacionados, en comparación con el lóbulo ventral. 44 además, desarrollo de cáncer de próstata se ha observado en el lóbulo anterior de gemas40y, para el procedimiento intra prostática, lóbulo anterior permite la inyección del volumen necesario de solución de la célula de cáncer con fuga mínima y variabilidad.
Utilizando s.c. y Gema transgénica modelos de cáncer tienen varios defectos y limitaciones. S.c. los tumores en un TME artificial tienen respuestas diferenciales a las quimioterapias, en contraste con ambos tumores ortotópicos de la misma línea celular y enfermedad humana20,21,22. Esto puede ser debido a la vasculatura alterada de tumores s.c., como ejemplificado por su diferencial respuesta a anti-angiogenic terapia18,19. Por el contrario, los tumores orthotopic desarrollan un TME adecuado drenaje de los ganglios linfáticos y vasculatura y pueden realizarse con líneas celulares murinas, de tal modo también permitiendo análisis de Inmunología tumoral y respuesta a las inmunoterapias.
Gemas de transgénicos desarrollan tumores con un TME apropiado en un anfitrión inmunocompetente, sin embargo, estos modelos normalmente oversimplify cáncer humano mediante el desarrollo de tumores con alteraciones genéticas solo o pocos29. Un análisis de Myc-CaP y otras líneas celulares de cáncer de próstata reveló que contenían mucho mayor alteraciones de número de copia somáticas y alteraciones cromosómicas que los tumores de los ratones Hi-Myc y otras gemas que eran derivados29. Además, gemas están limitadas por el aumento de los costos y el tiempo necesario para los ratones de cría para realizar experimentos de suficiente potencia. Modelado de orthotopic tumor puede superar estas limitaciones. Líneas celulares de cáncer de próstata humano y murino contienen muchas alteraciones genéticas relevantes para la enfermedad humana29y, como cáncer en humanos, también muestran gran heterogeneidad entre las células individuales30. Tumores syngeneic murinos ortotópico permiten análisis inmunológicos, mientras orthotopic tumores xenogeneicos humanos permiten análisis de la terapéutica de células humanas. Finalmente, a diferencia de con gemas, célula líneas pueden ser modificadas antes de la inyección, lo que permite expresión de bioluminiscente o fluorescente de moléculas para controlar el crecimiento del tumor, normaliza la carga del tumor entre los grupos experimentales, vigilar la respuesta al tratamiento y a Siga la regresión del tumor y la recurrencia de CPRP después de la castración quirúrgica.
Pasos críticos en este protocolo incluyen localización y externalizar la vesícula seminal y el adjunto anterior lóbulo prostático sin dañar otros tejidos o punción de la vesícula seminal, realizar un acertado inyección intra prostática de 30 μl de células suspensión sin salida y recogida adecuadamente cualquier fuga para prevenir el desarrollo de tumor no orthotopic en todo el abdomen. La limitación principal de inyecciones intra prostática es lograr la habilidad técnica necesaria para minimizar la variabilidad de tumor entre ratones. Esto es especialmente importante para el modelado de CPRP, que tiene la variable agregada de la castración quirúrgica. Ratones intra-prostatically inyectados y castrados deben también ser seguidos de cerca para la recuperación y los eventos adversos, como han sometido a dos cirugías de mayor supervivencia. Otra limitación es el tiempo de cada inyección intra prostática. Esto se puede reducir a como bajo como 20 min y el cirujano asistente puede preparar el siguiente ratón como el ratón actual está siendo suturado. Por último, los tumores orthotopic Myc-CaP son agresivos, rápido crecimiento tumores que alcanzan el extremo de supervivencia en aproximadamente 46 días (y ya en 35 días) debido al tumor primario total. Estudios que requieren de más lento desarrollo del tumor o tratamientos a largo plazo deben optimizarse empíricamente para el régimen de cuenta y tratamiento de células de inyección inicial. En contraste con las limitaciones de tumores s.c. y joyas, todos de las limitaciones del modelo ortotópico tumor pueden superar, y pueden hacer modificaciones adicionales del protocolo basados en necesidades experimentales.
Como el trasplante orthotopic del modelo de tumor implica el uso de vitro-mango, estas células pueden ser modificadas dependiendo de las necesidades del estudio. Aquí, modificamos estas células para estable expresan luciferasa y mCherry en vivo seguimiento tumoral. También hemos realizado un nocaut en el Cas9 CRISPR del supresor del tumor PTEN, para generar una línea más agresiva, clínicamente relevante de la célula que crece más rápido como tumores ortotópicos (manuscrito en revisión). Con las ventajas del modelo ortotópico de tumor, la capacidad para el estudio de cáncer de próstata andrógeno-dependiente y CPRP tanto el potencial de expresar modalidades de imágenes o caída o sobrexpresan genes selectos, este protocolo sirve como un valioso recurso para todos investigación de cáncer de próstata.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por los institutos nacionales de subvenciones de salud Praveen Thumbikat (NIDDK R01 DK094898), Abdulkadir Sarki (NCI R01 CA167966, NCI R01 CA123484, NCI P50 CA180995) y Jonathan Anker (NCI F30 CA203472).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Myc-CaP cell line | ATCC | CRL-3255 | Verify as mycoplasma-free before use |
| Micro-dissecting scissors | Roboz | RS-5910 | |
| Graege forceps | Roboz | RS-5135 | |
| Graefe tissue forceps | Roboz | RS-5150 | |
| Olsen-Hegar needle holder with suture cutters | FST | 12002-12 | |
| 50 µL Syringe 705 RN SYR | Hamilton | 7637-01 | Sterilize by ethylene oxide gas |
| 28-gauge Needles Small Hub RN | Hamilton | 7803-02 | Point style 4, Angle 45°, Length 0.75 in. Sterilized by ethylene oxide gas |
| RPMI | Gibco | 18875-093 | |
| FBS | Gibco | 10437-028 | |
| Pencillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Matrigel basement membrane matrix, phenol red-free, LDEV-free | Corning | 356237 | Thaw on ice in 4°C overnight before use |
| Isoflurane | Henry Schein | 11695-0500-2 | Acquired from Northwestern University Center for Comparative Medicine (CCM) |
| 26 5/8-gauge syringe | BD | 309597 | For meloxicam and buprenorphine injections |
| Buprenorphine hyrochloride 0.3 mg/mL | 12496-0757-5 | Controlled substance, acquired from Northwestern University CCM | |
| Ophthalmic ointment lubrication | Akron | 17478-162-35 | |
| Betadine surgical scrub (povidone-iodine, 7.5%) | Purdue Products | 67618-151-16 | |
| Sterile non-adhering pads | Moore Medical | 10775 | |
| Sterile alcohol wipes | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Surgical microscope Stemi DV4 | Zeiss | ||
| Sterile polyester tipped applicators | Puritan | 25-806 1PD | |
| 5-0 vicryl absorbable reverse cutting needle sutures | eSutures | J493G | |
| 4-0 nylon monfilament non-absorbable reverse cutting needle sutures | eSutures | 699H | |
| Glass bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Sterile saline 0.9% sodium chloride | Hospira | 0409-4888-02 | |
| Meloxicam (Eloxiject) 5 mg/mL | Henry Schein | 11695-6925-1 | Acquired from Northwestern University CCM |
| D-luciferin Firefly, sodium salt monohydrate | Goldbio | LUCNA | |
| IVIS Spectrum Imaging System | PerkinElmer | ||
| Cauery surgical pen | Bovie Medical Corporation | AA01 | |
| CD3ε antibody (clone 2GV6) | Ventana | 790-4341 | |
| Caliper | Fisher Scientific | 14-648-17 | |
| Androgen receptor antibody | Thermo Scientific | RB-9030-P1 | 1:500 staining dilution |
| Synaptophysin antibody (clone Z66) | Life Technologies | 18-0130 | 1:200 staining dilution |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer Statistics, 2017. CA-Cancer J Clin. 67 (1), 7-30 (2017).
- Alemozaffar, M., et al. Prediction of erectile function following treatment for prostate cancer. JAMA. 306 (11), 1205-1214 (2011).
- Alibhai, S. M., et al. 30-day mortality and major complications after radical prostatectomy: influence of age and comorbidity. J Natl Cancer I. 97 (20), 1525-1532 (2005).
- Chen, R. C., Clark, J. A., Talcott, J. A. Individualizing quality-of-life outcomes reporting: how localized prostate cancer treatments affect patients with different levels of baseline urinary, bowel, and sexual function. J Clin Oncol. 27 (24), 3916-3922 (2009).
- Kohutek, Z. A., et al. Long-Term Impact of Androgen-Deprivation Therapy on Cardiovascular Morbidity after Radiotherapy for Clinically Localized Prostate Cancer. Urology. , (2015).
- Murray, L., et al. Second primary cancers after radiation for prostate cancer: a systematic review of the clinical data and impact of treatment technique. Radiother Oncol. 110 (2), 213-228 (2014).
- Resnick, M. J., et al. Long-term functional outcomes after treatment for localized prostate cancer. N Engl J Med. 368 (5), 436-445 (2013).
- Shahinian, V. B., Kuo, Y. F., Freeman, J., Goodwin, J. S. Risk of fracture after androgen deprivation for prostate cancer. New Engl J Med. 352 (2), 154-164 (2005).
- Wilke, D. R., et al. Testosterone and erectile function recovery after radiotherapy and long-term androgen deprivation with luteinizing hormone-releasing hormone agonists. BJU Int. 97 (5), 963-968 (2006).
- Zhao, J., et al. Androgen deprivation therapy for prostate cancer is associated with cardiovascular morbidity and mortality: a meta-analysis of population-based observational studies. PLoS One. 9 (9), e107516 (2014).
- Berthold, D. R., et al. Docetaxel plus prednisone or mitoxantrone plus prednisone for advanced prostate cancer: updated survival in the TAX 327 study. J Clin Oncol. 26 (2), 242-245 (2008).
- Bono, J. S., et al. Prednisone plus cabazitaxel or mitoxantrone for metastatic castration-resistant prostate cancer progressing after docetaxel treatment: a randomised open-label trial. Lancet. 376 (9747), 1147-1154 (2010).
- Fizazi, K., et al. Abiraterone acetate for treatment of metastatic castration-resistant prostate cancer: final overall survival analysis of the COU-AA-301 randomised, double-blind, placebo-controlled phase 3 study. Lancet Oncol. 13 (10), 983-992 (2012).
- Kantoff, P. W., et al. Sipuleucel-T immunotherapy for castration-resistant prostate cancer. New Engl J Med. 363 (5), 411-422 (2010).
- Parker, C., et al. Alpha emitter radium-223 and survival in metastatic prostate cancer. New Engl J Med. 369 (3), 213-223 (2013).
- Rathkopf, D. E., et al. Updated Interim Efficacy Analysis and Long-term Safety of Abiraterone Acetate in Metastatic Castration-resistant Prostate Cancer Patients Without Prior Chemotherapy (COU-AA-302). Eur Urol. 66 (5), 815-825 (2014).
- Scher, H. I., et al. Increased survival with enzalutamide in prostate cancer after chemotherapy. New Engl J Med. 367 (13), 1187-1197 (2012).
- Field, S. B., et al. Differences in vascular response between primary and transplanted tumours. Brit J Cancer. 63 (5), 723-726 (1991).
- Cowen, S. E., Bibby, M. C., Double, J. A. Characterisation of the vasculature within a murine adenocarcinoma growing in different sites to evaluate the potential of vascular therapies. Acta Oncol. 34 (3), 357-360 (1995).
- Kuo, T. H., et al. Site-specific chemosensitivity of human small-cell lung carcinoma growing orthotopically compared to subcutaneously in SCID mice: the importance of orthotopic models to obtain relevant drug evaluation data. Anticancer Res. 13 (3), 627-630 (1993).
- Fidler, I. J., et al. Modulation of tumor cell response to chemotherapy by the organ environment. Cancer Meta Rev. 13 (2), 209-222 (1994).
- Wilmanns, C., et al. Modulation of Doxorubicin sensitivity and level of p-glycoprotein expression in human colon-carcinoma cells by ectopic and orthotopic environments in nude-mice. Int J Oncol. 3 (3), 413-422 (1993).
- Fidler, I. J. Orthotopic implantation of human colon carcinomas into nude mice provides a valuable model for the biology and therapy of metastasis. Cancer Meta Rev. 10 (3), 229-243 (1991).
- Kwon, E. D., et al. Ipilimumab versus placebo after radiotherapy in patients with metastatic castration-resistant prostate cancer that had progressed after docetaxel chemotherapy (CA184-043): a multicentre, randomised, double-blind, phase 3 trial. Lancet Oncol. 15 (7), 700-712 (2014).
- Topalian, S. L., et al. Safety, activity, and immune correlates of anti-PD-1 antibody in cancer. New Engl J Med. 366 (26), 2443-2454 (2012).
- Pasqualini, R., Ruoslahti, E. Organ targeting in vivo using phage display peptide libraries. Nature. 380 (6572), 364-366 (1996).
- Conway, E. M., Carmeliet, P. The diversity of endothelial cells: a challenge for therapeutic angiogenesis. Genome Biol. 5 (2), 207 (2004).
- Loi, M., et al. The use of the orthotopic model to validate antivascular therapies for cancer. Int J Dev Biol. 55 (4-5), 547-555 (2011).
- Bianchi-Frias, D., Hernandez, S. A., Coleman, R., Wu, H., Nelson, P. S. The landscape of somatic chromosomal copy number aberrations in GEM models of prostate carcinoma. Mol Cancer Res. 13 (2), 339-347 (2015).
- Pan, Y., et al. Characterization of chromosomal abnormalities in prostate cancer cell lines by spectral karyotyping. Cytogenet Cell Genet. 87 (3-4), 225-232 (1999).
- Wang, J., et al. Pim1 kinase synergizes with c-MYC to induce advanced prostate carcinoma. Oncogene. 29 (17), 2477-2487 (2010).
- Watson, P. A., et al. Context-dependent hormone-refractory progression revealed through characterization of a novel murine prostate cancer cell line. Cancer Res. 65 (24), 11565-11571 (2005).
- Ellis, L., Lehet, K., Ramakrishnan, S., Adelaiye, R., Pili, R. Development of a castrate resistant transplant tumor model of prostate cancer. Prostate. 72 (6), 587-591 (2012).
- Nunez-Cruz, S., Connolly, D. C., Scholler, N. An orthotopic model of serous ovarian cancer in immunocompetent mice for in vivo tumor imaging and monitoring of tumor immune responses. J Vis Exp. (45), (2010).
- Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. J Vis Exp. (26), (2009).
- Ellis, L., Lehet, K., Ku, S., Azabdaftari, G., Pili, R. Generation of a syngeneic orthotopic transplant model of prostate cancer metastasis. Oncoscience. 1 (10), 609-613 (2014).
- Wallace, J. Humane endpoints and cancer research. ILAR J. 41 (2), 87-93 (2000).
- Valkenburg, K. C., Amend, S. R., Pienta, K. J. Murine Prostate Micro-dissection and Surgical Castration. J Vis Exp. (111), (2016).
- Koh, C. M., et al. MYC and Prostate Cancer. Genes Cancer. 1 (6), 617-628 (2010).
- Shappell, S. B., et al. Prostate pathology of genetically engineered mice: definitions and classification. The consensus report from the Bar Harbor meeting of the Mouse Models of Human Cancer Consortium Prostate Pathology Committee. Cancer Res. 64 (6), 2270-2305 (2004).
- McNeal, J. E., Redwine, E. A., Freiha, F. S., Stamey, T. A. Zonal distribution of prostatic adenocarcinoma. Correlation with histologic pattern and direction of spread. Am J Surg Pathol. 12 (12), 897-906 (1988).
- Price, D. Comparative Aspects of Development and Structure in the Prostate. Natl Cancer I Monogr. 12, 1-27 (1963).
- Roy-Burman, P., Wu, H., Powell, W. C., Hagenkord, J., Cohen, M. B. Genetically defined mouse models that mimic natural aspects of human prostate cancer development. Endocr-Relat Cancer. 11 (2), 225-254 (2004).
- Berquin, I. M., Min, Y., Wu, R., Wu, H., Chen, Y. Q.
