Summary
Цель настоящего Протокола заключается в демонстрации внутри простаты инъекции клеток рака простаты, с последующее кастрация. Ортотопическая доклинических моделей андроген зависимых и кастрация стойкие рака предстательной железы имеют решающее значение для изучения болезни в контексте микроокружения опухоли клинически значимых и иммунокомпетентных хоста.
Abstract
Ортотопическая опухоли моделирование является ценным инструментом для исследований доклинических рака предстательной железы, поскольку он имеет несколько преимуществ над оба подкожной и трансгенных генетически модифицированные мыши модели. В отличие от подкожной опухоли ортотопическая опухоли содержат более клинически Точная сосудистую, микроокружения опухоли и ответы на несколько терапии. В отличие от генетически модифицированные мыши модели, ортотопическая модели могут выполняться с более низкой стоимости и в меньше времени, связаны с использованием весьма сложной и неоднородной мыши или человеческих раковых клеток линии, скорее, сингл генетические изменения и эти клетки линии могут быть генетически модифицированных, таким образом, чтобы выразить изображений агентов. Здесь мы представляем протокол к хирургическим путем впрыскивать выражая Люцифераза и mCherry линии клетки мышиных рака простаты в передней доле предстательной железы мышей. Эти опухоли ортотопическая мышей разработаны, которые были неинвазивно наблюдаемого в естественных условиях и дополнительно проанализировать объем опухоли, веса, мыши выживания и иммунных инфильтрации. Кроме того ортотопическая опухоль подшипник мышей были хирургически кастрирован, приводит к регрессии опухоли немедленное и последующего рецидива, представляющие кастрация стойкие рака простаты. Хотя технических навыков, необходимых для выполнения этой процедуры, эта модель сингенных ортотопическая андроген зависимых и кастрация стойкие рака простаты является весьма полезным для всех следователей в области.
Introduction
Рак простаты оценивается имеют наиболее высокие показатели заболеваемости (161,360 человек) и вызывает гибель третьего большинство мужчин рак (84,590 человек) в 2017 году1. После диагностики опухоли простаты андроген зависимых и лечатся хирургическим простатэктомии, лучевой терапии и/или лишение терапии андрогена (ADT), но каждый лечение связано с несколько основных заболеваний и осложнений2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. Несмотря на регрессии опухоли после ADT, почти все опухоли повторения как кастрация стойкие рака простаты (УПК). На данном этапе утвержденные терапии включают доцетаксел, иммунотерапия Sipuleucel-T и анти андрогенов малых молекул enzalutamide и abiraterone, но не индивидуальная терапия дает преимущество выживания больше чем 5,2 месяцев11, 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17. Таким образом, мужчины на всех стадиях рака простаты необходимо улучшение лечения и управления заболеваемости, для которых оптимальным доклинические заболевание моделирование имеет решающее значение.
С правильной процедуры линии клеток рака простаты может прививаться хирургическим путем в мышиных простаты, приводя к развитию опухолей как сингенных или культивированная ортотопическая. Ортотопическая опухоль моделирование идеально подходит для всех опухоли биологии и наркотиками развития исследований, позволяя развития опухоли с клинически представитель опухоли микроокружения (ТМЕ). Предыдущие исследования продемонстрировали, что подкожной опухоли (с.к.) у измененных опухолевых сосудистую, ведущих к дифференциальной и менее клинически точные ответы на анти ангиогенных терапии18,19. Кроме того несколько исследований отметил, что увеличение или снижение эффективности нескольких химиотерапии в лечении той же линии клеток, в зависимости от того, было ли управление s.c. или orthotopically, последний из которых лучше всего представлена, что видно в человека Рак в20,21,22. Кроме того только в ортотопическая модели рака толстой кишки, но не в модели s.c., опухоли производят правильный деструктивные ферментов, необходимых побудить метастазов23. Наконец как immunotherapies продолжают появляться на переднем крае терапии рака, и особенно они еще предстоит обеспечить значительные выгоды для рака простаты24,25, сингенных доклинических моделей с точной TME и слива лимфатические узлы в иммунокомпетентных хосты имеют решающее значение.
Есть много факторов, ответственных за эти несовместимые выводов, основанных на опухоли. С другой TME раковые клетки подвергаются воздействию различных тканей конкретных эндотелия и изменены ангиогенеза, влияя тем самым на опухоль развития26,27. Ортотопическая опухоли с правильным TME позволяют клинически значимых лекарств, гипоксических условий и оценке анти ангиогенных терапии28. Хотя генетически модели (ГСМОС) содержат точные TME, они требуют давно раз для разведения, высокой стоимости и часто основаны на манипуляции одного или нескольких генов выбил или оверэкспрессировали за пределами клинически значимых уровней. В отличие от человека или мышиных простаты рак клеточных линий, используемых в ортотопическая опухоли, как человека опухоли, генетически гораздо более сложны, как в пределах одной клетки, так и в отображении гетерогенность между клетки29,30. Также в отличие от драгоценных камней, ортотопическая рак клеточных линий может быть спроектирован, чтобы выразить визуализации формы или увеличение или снижение уровня других молекул интерес и in vitro и in vivo экспериментальные результаты могут сравниваться непосредственно. Ортотопическая опухоли также может быть сформирован из первичных клеток пациента производные. Здесь мы приводим методологии для выполнения внутри простаты инъекции клеток рака простаты, которые формируют ортотопическая андроген зависимых опухолей и, после кастрации, повторяются как ортотопическая УПК.
Protocol
Все животные процедуры, изложенные в настоящем протоколе должны выполняться в соответствии с этических правил и утверждения соответствующих университета институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC).
1. Подготовка хирургических материалов и раковые клетки
- До дня хирургии, автоклав микро Рассекающий ножницы, щипцы Грефе, Грефе ткани щипцы, иглодержатель с шовный материал фрезы и соответствующее количество шторы. Стерилизуют шприц 50 мкл и 28-го калибра иглы газом окиси этилена (рис. 1 c).
- До дня хирургии, культуры клеток Myc-CaP 10 см блюда в RPMI, дополненная плода бычьим сывороточным (ФБС) 10% и 1% пенициллина/стрептомицина (P/S) в 37 ° C 5% CO2 инкубатора. Для мониторинга биолюминесцентных или флуоресцентные опухоли, transfect 293T клетки с соответствующим векторов и впоследствии передают Myc-CaP клетки с 0,45 мкм фильтруют человека31. Сортировать клетки для создания стабильной ячейки строки с 100% трансдукции позитивность.
Примечание: Выполнить все культуры ткани в стерильных условиях и убедитесь, что все клеточные линии, микоплазмы бесплатно. Линии клетки мышиных рака простаты, используемых в этом исследовании, Myc-CaP32, преобразованы выразить стабильно Люцифераза Светлячок и mCherry. Myc-CaP ячейки строки МКС изолированы от c-myc-избытком Hi-myc мыши и эти клетки содержат усиливается андрогена (AR), которые являются андроген зависимых32 и форма опухоли ЦЗПП после кастрации мышиных33. Все мыши в этом исследовании, 6-8 неделе старых мышей-самцов FVB/NJ. Альтернативным мышиных простаты рак клеточных линий может использоваться с мышей соответствующий генетический фон, а также линий клеток человеческого рака простаты или первичной пациента производные раковые клетки простаты с иммунодефицитных мышей. Оптимальное количество ячеек на инъекции должны определяться эпирически для альтернативных клеточных линий. Кроме того альтернативные визуализации формы могут быть использованы для визуализации опухолей, в том числе магнитно-резонансная томография (МРТ), позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) или компьютерная томография (КТ), а также GFP как альтернатива mCherry. - В ночь перед хирургии, место Матрикс matrigel базальной мембраны и свободного фенола красного на льду на 4 ° C до оттаивания.
- В день операции собирайте клетки, мыть их с-фосфатный буфер (PBS) и отсоединение с 0,25% трипсина ЭДТА. Нейтрализовать трипсина с RPMI с 10% FBS и 1% P/S.
- Центрифуга клетки на 400 x g за 5 мин.
- Вымыть клетки с 10 мл RPMI без FBS или P/S.
- Подсчитать количество ячеек и Ресуспензируйте клетки в PBS в концентрации 6.67x107 кл/мл (1 × 106 клеток/15 мкл).
- Добавить равное количество matrigel для создания в конечной концентрации 1 × 106 клеток/30 мкл суспензии клеток PBS/matrigel 1:1 и сохранить клетки на льду до инъекции для предотвращения кристаллизации.
Примечание: Выполнение внутри простаты инъекции в течение 3 ч подготовки matrigel клеточных суспензий. Если выполняет интра простаты инъекции на более чем 5 мышей, повторите вышеуказанные шаги для подготовки суспензию клеток свежим matrigel.
2. мыши предоперационная подготовка
Примечание: домовых мышей в университет животных фонда для по крайней мере за одну неделю до операции для проведения адекватной адаптации и свести к минимуму животных стресс. Ассистент хирурга выполняются действия 2.1-2.6. Все последующие хирургические шаги выполняются с использованием стерильных перчаток и хирургические инструменты с стерильных хирург.
- Анестезировать мышей с изофлюрановая (2-5% для индукции через камеру, 1-3% за обслуживание через носовой конус). Проверьте ознакомительное потерей мыс щепотку рефлекс.
- Взвешивание мышей и администрирование по крайней мере 0,05 мг/кг болеутоляющее бупренорфина s.c.
Примечание: Вес мыши каналов ≥20 g идеально подходит для успешного интра простаты инъекции. - Применить глазная мазь смазки для обоих глаз для предотвращения высыхания роговицы.
- Брить все мех от живота.
- Стерилизация живота три раунда циклическое применение хирургических скраб с помощью стерильных-присоединения колодки, следуют салфетки стерильные алкоголя. Разрешить живота для просушки.
Примечание: Для остальной части хирургической процедуры, только стерильные перчатки и хирургические инструменты могут связаться стерилизованные мыши живота. - Передача лежа на чистую поверхность мыши на грелку непосредственно под цель чистой хирургический Микроскоп.
- Покрытие мыши с стерильных портьера с небольшим отверстием вырезать через живот.
3. интра простаты инъекций
Примечание: Выполните все шаги хирургических стерильных условиях. Регулируя Микроскоп, размещение мыши или любой другие нестерильные объектов должно быть сделано помощником хирурга.
- Выполняют примерно 1 см разрез наружной кожи вдоль средней линии живота выше полового члена и препуция желез (рис. 1 d).
- Отдельной соединительной ткани между наружной коже живота и внутренней брюшной мускулатуры, открыв ножницы между слоями.
- Выполните аналогичные разрез внутренней брюшной мускулатуры во время использования щипцов поднять мускулатура избежать проколов кишечника или мочевого пузыря (рис. 1 d).
- Найдите один из двусторонних семенных пузырьков (рис. 1A, белый) / передней простаты лопастями (рис. 1A, черный), которые часто задних, боковых и слегка превосходит мочевого пузыря (рис. 1A, желтый), но это может варьироваться от мышей . Передней простаты лопастями, полупрозрачные и прилагаемый к меньшей кривизны белый семенных пузырьков.
- Аккуратно поднимите кончик семенных пузырьков, используя пинцет Грефе ткани для создания напряженности на ткани без проколов семенных пузырьков (Рисунок 1E).
- Mix решение matrigel Myc-CaP, язычника дозирование (исполняют помощник хирурга), как клетки могут гранулированных и медленно аспирационная 30 мкл (1 х 106 клеток) в иглу, чтобы избежать воздушных пузырей.
- Осторожно вставьте скос иглы параллельно длинной оси передней доле предстательной железы. Медленно вдохнуть 30 мкл в мочку и медленно втягивать иглы для предотвращения утечки (Рисунок 1F). Проверьте адекватные инъекции, нагрубание передней доле предстательной железы (рис. 1 g).
- Тщательно удерживать семенных пузырьков и вводят простаты Лобе вне мыши для приблизительно 30 s чтобы позволить matrigel частично затвердеть в доле. В это время Соберите любой ячейки решения утечки в животе с помощью стерильных полиэстер наконечником аппликатором для предотвращения развития опухоли не ортотопическая, без нажатия на введенный простаты Лобе.
- Осторожно вернуть семенных пузырьков и простаты Лобе вводят в брюшную полость без оказания давления на мочку. Замените любые externalized тканей.
- Выполнение непрерывной швы закрыть внутренней брюшной мускулатуры с 5-0 Викрил рассасывающиеся обратный резки иглы швами.
- Выполняйте Прерванный швы закрыть наружной брюшной кожи с 4-0 нейлон Мононить не рассасывающиеся обратный резки иглы швами.
Примечание: Стерилизованные 9 мм скобы также может использоваться для закрытия внешних кожи живота. Однако в отличие от швов, они мешают любые последующие биолюминесцентных и флуоресцентные опухоли, изображений сигнала. - Очистить все инструменты с салфетки стерильные этанола (открыл помощник хирурга) и поместите их в стеклянный шарик стерилизатор для 30 s. разрешить инструменты для сухой перед использованием на следующий мыши.
- Флеш для предотвращения засорения остаток matrigel шприц и иглу в стерильного физиологического раствора (открыл помощник хирурга).
Примечание: Помощник хирурга должны присутствовать для всех операций, выполняя все нестерильные мыши предоперационной подготовки и послеоперационного мыши ухода, а также относительно смешать раствор matrigel Myc-CaP до инъекции. Чтобы свести к минимуму время, как каждая процедура внутри предстательной железы мыши потребует 20-30 мин, помощник хирурга может начать подготовку следующий мыши, как хирург ушивание текущий указатель мыши.
4. послеоперационные мыши Уход
- Управлять 1 мг/кг болеутоляющее мелоксикама s.c. немедленно, 24 h и 48 ч после операции.
- Разрешить мышей, чтобы восстановить в клетке не постельные, размещены на полпути на грелку. Монитор мыши для по крайней мере 30 минут после операции до тех пор, пока они восстановить нормальный мобильность и активности, после которые ставят их в чистой клетке с пищей на пол клетки.
- Далее, контролировать мышей ежедневно для правильного заживления ран, вес тела, груминг и передвигаться после операции. Отдельный мышей в отдельные клетки после каких-либо доказательств боевых действий.
- Удалите любые оставшиеся швы в течение 14 дней после операции.
5. биолюминесцентных опухоли изображений
- Подготовьте стерильной фильтрации Na+ или K+ D-люциферин, как описано изготовителем и защищенный от света.
- Внутри peritoneally придать мышей с 10 мкл/г веса тела люциферин.
- По крайней мере 10 минут позже, изображение мышей с ИВИС Spectrum Imaging системой, как описано ранее34,35.
- Анализ изображений с помощью живет образ программного обеспечения, как описано в34,35.
Примечание: ИВИС изображений анализ полезен для определения успешных интра простаты инъекции и развитие первоначальной опухоли нормализовать опухоли бремени среди экспериментальных групп. Однако в зависимости от интенсивности сигнала биолюминесцентных или флуоресцентные, насыщение может привести к плато в квантификации изображения несмотря на увеличение размера фактической опухоли. Таким образом на более поздних этапах роста опухоли, ИВИС изображений может быть более полезным для определения уменьшение размера опухоли после успешного лечения, а не увеличивается в размере после насыщения изображений.
6. опухоли выживания сбора, анализа опухоли, конечная точка
- Если сбор опухоли для анализа, гуманно усыпить мышей CO2 экспозиции и средней шейки матки дислокации, или альтернативные методы IACUC утверждения и вскрыть опухоли от живота. Опухоли должны быть расположены orthotopically на простаты.
Примечание: Опухоли прилагается к передней брюшной стенке или семенами во всем животе указывают бедные или Дырявый интра простаты инъекции и не должен рассматриваться в ортотопическая опухоли. - Весят опухоли.
- Рассчитать объем опухоли как π/6 × L × W × H (L = длина длинной оси опухоли, W = перпендикулярно ширина, H = высота перпендикулярно).
- Опухоли могут быть проанализированы по гистологии (исправления в нейтральных буферизации формалина 10%), проточная цитометрия (создание единого клеточных суспензий), белка (подготовка ткани lysate в буфер RIPA), или РНК (немедленно место ткани в RNAlater).
- Для иммунологического анализа также Соберите простаты опухоль слив пункт аортальный лимфатические узлы (рис. 1B, оранжевый) и селезенки.
Примечание: Если после мышей для выживания, конечной точки этой модели определяется как появление лейкопении брюшной полости асцит36 или снизилась37передвигаться, груминг и/или piloerection. Мышь для выживания анализа получают пред- и послеоперационного обезболивания (протокол шаги 2.2, 4.1) и должны регулярно контролироваться. Мышей должны быть разделены в отдельные клетки, если любые боевые действия и должно быть гуманно euthanized на внешний вид любого из выше индикацию конечной точки.
7. хирургическая кастрация для моделирования ЦЗПП
- Для моделирования КПНИ, выполните выше интра простаты инъекции протокол (протокол шаги 1-5).
- По крайней мере одну неделю спустя после развития опухоли, выполняют хирургическая кастрация через прижигания, как описано выше38.
- Отслеживать регрессии опухоли и повторения, биолюминесцентных изображений. После кастрации регрессии опухоли будет происходить в течение 3 дней и рецидива опухоли будет происходить в течение около 30 дней, представляющие КПНИ.
Representative Results
В этой рукописи мы хирургическим путем инъекции мышиных рака простаты клеток линии, Myc-CaP, в передней доле предстательной железы (Рисунок 1A), приводит к развитию опухоли простаты ортотопическая с клинически значимых TME и правильно простаты дренаж лимфатических узлов (рис. 1B). Это была выполнена с помощью микро Рассекающий ножницы, Грефе щипцы, Грефе ткани щипцы, иглодержатель с резцами шовные и шприц 50 мкл с 28-иглы (рис. 1 c). После выполнения примерно 1 см срединной брюшной разрез выше препуция желез (рис. 1 d), один из семенных пузырьков и прилагаемый передней доле предстательной железы были расположены и экстернализации (Рисунок 1E) и 30 мкл (1 х 106 клеток) 1:1 PBS/matrigel суспензию клеток вводили простаты (Рисунок 1F), первоначально verified by нагрубание мочку и отсутствием утечки (рис. 1 g).
Для мониторинга роста опухоли ортотопическая, мы стабильно transfected клеток Myc-CaP выразить Люцифераза Светлячок и mCherry, позволяя опухолей последует неинвазивные в vivo биолюминесценции (рисунок 2A) и флуоресценции (Рисунок 2b), соответственно. Одно ограничение этой изображений является, что, в зависимости от силы сигнала, визуализации количественная оценка может насытить пока опухоль продолжает увеличиваться в размерах. Таким образом с интенсивностью сигнал высокого уровня, это в vivo изображений является более полезным, первоначально нормализации бремя опухоли в экспериментальных группах и позднее определения уменьшение размера опухоли после экспериментального лечения. Дополнительные изображения формы также могут быть использованы, как мелких животных, МРТ, ПЭТ или КТ.
Ортотопическая опухоли были расчленены от живота в день 30 после инъекции внутри предстательной железы (рис. 3A). Ортотопическая опухоли должны быть расположены на месте передней доле предстательной железы. Опухоль массы во всем животе или прилагается к передней брюшной стенке указывают неправильное интра простаты инъекций и утечки. С правильной техники объем опухоли (рис. 3B) и вес (рис. 3 c) может быть записано с относительно небольшой стандартной ошибки. Однако как отмечалось, будет некоторые изменчивости с малые и большие опухолевые массы. Таким образом первоначальное использование предварительной обработки изображений квантификации для выравнивания опухоли бремя между экспериментального оружия имеет решающее значение для всех экспериментов. Кроме того как эти мышиных раковых клеток вводили в иммунокомпетентных FVB/NJ мышей, ТМЕ могут быть проанализированы по иммуногистохимия (IHC) (или проточной цитометрии или другие методы) для CD3 T-клетки (рис. 3D) (или других типов иммунных клеток). Наконец эта модель обеспечивает конечную цель выживания, как большой первичной опухоли массового причины лейкопении брюшной полости асцит36 (Рисунок 3E) и/или снижение передвигаться, груминг и/или piloerection37. Иногда смерти также может быть вызвано ростом опухоли, блокирование мочи.
Наконец эта модель может использоваться для изучения андроген зависимых рака простаты и КПНИ, последний из которых дает плохой прогноз и нуждается в новых методов лечения. После ортотопическая развития опухоли мышей были хирургически кастрирован, как описано выше38. Как это второй операции основных выживания, особую осторожность следует следить за восстановление и любых неблагоприятных событий или осложнений. В течение 3 дней после кастрации было отмечено сильная опухоль регрессии, следуют последующих опухоли рецидив после примерно 30 дней, представляющие ЦЗПП (рис. 4A). ЦЗПП опухоли может быть диссекции и гистологический анализ и не отображать любые нейроэндокринной дифференциации, как они поддерживают высокий уровень AR и негативными для нейроэндокринной маркер, synaptophysin (рис. 4B).
Рисунок 1: передней простаты Лобе, слива лимфатические узлы и представитель техника для инъекций интра простаты клеток. Изображения (A) право передней доле предстательной железы (черный, *), придает право семенных пузырьков (белый), правой яичко и жировой ткани (зеленый) и мочевого пузыря (желтый), (B) двусторонних простаты слив пункт аортальный лимфатические узлы (оранжевый), (C) микро Рассекающий ножницы, Грефе щипцы, Грефе ткани щипцы, иглодержатель с резцами шовные и 50 мкл шприц с 28-иглы (слева направо), средней линии разреза (D) , (E) семенных пузырьков и передней простаты Лобе экстернализация, (F), внутри простаты инъекций и (G) нагрубание передней доле предстательной железы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: В vivo биолюминесцентных и флуоресцентные опухоли томографии. (A) Люцифераза - и (B) mCherry выражая ортотопическая Myc-CaP опухоли были образы с помощью системы визуализации ИВИС спектра. Биолюминесценции была выполнена количественная оценка общего потока (фотоны/s). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: анализ ортотопическая опухоли опухоль объем, вес, гистология иммунной инфильтрации и выживания. Ортотопическая опухоли были расчленены на день 30 после инъекции интра простаты и анализируются (A) изображений, (B) опухоли объем брутто (π/6 × L × W × H; L = длина длинной оси опухоли, W = перпендикулярно ширина, H = перпендикулярно высота), вес опухоли (C) , (D) CD3 IHC (шкалы бар = 100 мкм) и выживание (E) , с объективной конечной точкой как появление лейкопении брюшной асцит. (A-B) Данные, представленные как среднее ± Среднеквадратичная ошибка среднего значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: интра простаты инъекции с последующим хирургическая кастрация для моделирования андроген зависимых рака простаты и ЦЗПП. (A) мышей, принимая ортотопическая Люцифераза выражая опухоли были образы по биолюминесценции до и после кастрации (Cx) и (B) повторялись ЦЗПП опухоли были расчленены (черный = ортотопическая опухоли простаты; желтый = мочевого пузыря) и анализируются H & E, AR IHC и synaptophysin МГС (с позитивным мышиных управления) (шкалы бар = 50 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
В этой рукописи мы наметим протокол для выполнения инъекции хирургические интра простаты рак клеток. Мы использовали андроген зависимых и MYC -экспрессирующих (MYC гиперэкспрессия рассматривается до 80-90% человеческого рака простаты39) мышиных рака простаты линия клетки, Myc-CaP, первоначально изолирован от Hi-Myc мыши32 ,33. Эта линия клетки было стабильно преобразованы выразить Люцифераза и mCherry, для неинвазивной в vivo биолюминесцентных и флуоресцентные опухоли изображений, соответственно. Кроме того, хирургическая кастрация была исполнена после развития андроген зависимых опухолей, приводит к регрессии опухоли и последующего повторения. Таким образом мы предоставляем детали для моделирования ортотопическая андроген зависимых рака простаты и УПК в иммунокомпетентных хоста.
Myc-CaP клеток вводили в передней доле предстательной железы мышей. Мышь простаты состоит из передней, брюшной и Дорсолатеральное простаты долей, и человека простаты состоит из центральной зоны в пределах одного лепестка40периферийная зона и переходной зоны. В то время как предыдущие исследования анатомически и гистологически сравнили мочку Дорсолатеральное мыши для человека периферической зоне, на сайте большинство рака простаты41и доле передней мыши для человека центральной зоны42, 43, более недавние и всесторонний анализ показал, что передней доли и Дорсолатеральное доли отображать шаблоны выражений тесно связанных генов, по сравнению с брюшной мочку. 44 далее, в передней доле камней40наблюдается развитие рака простаты, и, для внутри простаты процедуры, передней доле позволяет для инъекций необходимый объем раствора раковых клеток с минимальной утечки и изменчивости.
С помощью s.c. и трансгенных GEM рака модели имеют несколько недостатков и ограничений. S.c. опухоли, выращенных в искусственных TME имеют дифференциального ответы к химиотерапии, в отличие от обоих ортотопическая опухоли же клеточных линий и болезней человека20,21,22. Это может быть из-за измененных сосудистую s.c. опухоли, что подтверждается их дифференцированный ответ на анти ангиогенных терапии18,19. Напротив ортотопическая опухоли развиваться с надлежащей TME, слива лимфатические узлы и сосудистую и может быть выполнена с мышиных клеточных линий, тем самым позволяя для анализа иммунологии опухоли и ответ immunotherapies.
Трансгенные камни развиваться опухоли с надлежащей TME в иммунокомпетентных узла, но эти модели обычно упрощать человеческого рака путем развития опухоли с одного или нескольких генетические изменения29. Анализ Myc-CaP и других линий клеток рака простаты, показал, что они содержат гораздо более соматических копии номер изменения и хромосомные изменения, чем опухоли от Hi-Myc мышей и других драгоценных камней, из которых они были производных29. Кроме того камни ограничены повышает стоимость и время, необходимое для мышей, разводить для выполнения экспериментов достаточной мощности. Ортотопическая опухоль моделирования можно преодолеть эти ограничения. Линии клетки человека и мышиных рака простаты содержат многие генетические изменения, отношение к болезни человека29и, как человека рак, также показывают большой гетерогенность между отдельными ячейками30. Ортотопическая мышиных сингенных опухоли позволяют иммунологические анализы, а ортотопическая человека культивированная опухоли позволяют для анализа терапии на клетки человека. Наконец в отличие от с драгоценными камнями, ячеек, строк может быть изменено до инъекции, позволяя для выражения биолюминесцентных или флуоресцентных изображений молекул для мониторинга роста опухоли, нормализовать опухоли бремени среди экспериментальных групп, контролировать ответ на лечение и Следуйте регрессии опухоли и ЦЗПП рецидивов после хирургической кастрации.
Важные шаги в этом протоколе включают обнаружение и экстернализации прилагаемый передней доле предстательной железы и семенных пузырьков без повреждения других тканей или прокола семенных пузырьков, выполняя успешным интра простаты инъекций 30 мкл ячейки подвески без утечки и надлежащим образом собирать любые утечки для предотвращения развития опухоли не ортотопическая во всем животе. Основные ограничения внутри простаты инъекции является достижение технических навыков, необходимых для сведения к минимуму опухоль изменчивость между мышей. Это особенно важно для моделирования КПНИ, которая была добавлена переменная хирургической кастрации. Интра prostatically вводят и кастрированный мышей должны также быть внимательно следил за для восстановления и неблагоприятных событий, как они прошли два крупных выживания хирургических операций. Еще одним ограничением является время каждого внутри простаты инъекции. Это может быть уменьшена для как низкого как 20 мин и хирург помощник может подготовить следующий мыши как текущий мыши зашивается. Наконец ортотопическая Myc-CaP опухоли являются агрессивными, быстро растущих опухолей, которые достигают конечной выживание приблизительно 46 дней (и еще в 35 дней) из-за первичной опухоли массы. Исследования, требующие медленнее развития опухоли или долгосрочного лечения должны быть оптимизированы эпирически для первоначального инъекции клеток граф и лечения режима. В отличие от ограничений s.c. опухоли и драгоценные камни все выше ограничения модели ортотопическая опухоли могут быть преодолены, и дополнительные изменения протокола может производиться на основании экспериментальных индивидуальных потребностей.
Как ортотопическая опухоли модель предполагает использование в vitro-обработанные клетки, эти клетки могут быть изменены в зависимости от потребностей исследования. Здесь мы изменили эти клетки выразить стабильно Люцифераза и mCherry мониторинга в vivo опухоли. Мы также выступали ТРИФОСФАТЫ-Cas9 нокаут супрессора опухолевого роста PTEN, для создания более агрессивным, клинически значимых клеточная линия, которая растет быстрее, как ортотопическая опухоли (рукопись в обзоре). С преимущества модели ортотопическая опухоли, возможность изучить как андроген зависимых рака простаты и КПНИ, так и потенциал, чтобы выразить визуализации формы или выберите генов нокдаун или overexpress, этот протокол служит в качестве ценного ресурса для всех исследования рака простаты.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана национальными институтами здравоохранения грантов Praveen Thumbikat (NIDDK R01 DK094898), Сарки Абдулкадир (NCI R01 CA167966, NCI R01 CA123484, NCI Р50 CA180995), и Джонатан Anker (NCI F30 CA203472).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Myc-CaP cell line | ATCC | CRL-3255 | Verify as mycoplasma-free before use |
| Micro-dissecting scissors | Roboz | RS-5910 | |
| Graege forceps | Roboz | RS-5135 | |
| Graefe tissue forceps | Roboz | RS-5150 | |
| Olsen-Hegar needle holder with suture cutters | FST | 12002-12 | |
| 50 µL Syringe 705 RN SYR | Hamilton | 7637-01 | Sterilize by ethylene oxide gas |
| 28-gauge Needles Small Hub RN | Hamilton | 7803-02 | Point style 4, Angle 45°, Length 0.75 in. Sterilized by ethylene oxide gas |
| RPMI | Gibco | 18875-093 | |
| FBS | Gibco | 10437-028 | |
| Pencillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Matrigel basement membrane matrix, phenol red-free, LDEV-free | Corning | 356237 | Thaw on ice in 4°C overnight before use |
| Isoflurane | Henry Schein | 11695-0500-2 | Acquired from Northwestern University Center for Comparative Medicine (CCM) |
| 26 5/8-gauge syringe | BD | 309597 | For meloxicam and buprenorphine injections |
| Buprenorphine hyrochloride 0.3 mg/mL | 12496-0757-5 | Controlled substance, acquired from Northwestern University CCM | |
| Ophthalmic ointment lubrication | Akron | 17478-162-35 | |
| Betadine surgical scrub (povidone-iodine, 7.5%) | Purdue Products | 67618-151-16 | |
| Sterile non-adhering pads | Moore Medical | 10775 | |
| Sterile alcohol wipes | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Surgical microscope Stemi DV4 | Zeiss | ||
| Sterile polyester tipped applicators | Puritan | 25-806 1PD | |
| 5-0 vicryl absorbable reverse cutting needle sutures | eSutures | J493G | |
| 4-0 nylon monfilament non-absorbable reverse cutting needle sutures | eSutures | 699H | |
| Glass bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Sterile saline 0.9% sodium chloride | Hospira | 0409-4888-02 | |
| Meloxicam (Eloxiject) 5 mg/mL | Henry Schein | 11695-6925-1 | Acquired from Northwestern University CCM |
| D-luciferin Firefly, sodium salt monohydrate | Goldbio | LUCNA | |
| IVIS Spectrum Imaging System | PerkinElmer | ||
| Cauery surgical pen | Bovie Medical Corporation | AA01 | |
| CD3ε antibody (clone 2GV6) | Ventana | 790-4341 | |
| Caliper | Fisher Scientific | 14-648-17 | |
| Androgen receptor antibody | Thermo Scientific | RB-9030-P1 | 1:500 staining dilution |
| Synaptophysin antibody (clone Z66) | Life Technologies | 18-0130 | 1:200 staining dilution |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer Statistics, 2017. CA-Cancer J Clin. 67 (1), 7-30 (2017).
- Alemozaffar, M., et al. Prediction of erectile function following treatment for prostate cancer. JAMA. 306 (11), 1205-1214 (2011).
- Alibhai, S. M., et al. 30-day mortality and major complications after radical prostatectomy: influence of age and comorbidity. J Natl Cancer I. 97 (20), 1525-1532 (2005).
- Chen, R. C., Clark, J. A., Talcott, J. A. Individualizing quality-of-life outcomes reporting: how localized prostate cancer treatments affect patients with different levels of baseline urinary, bowel, and sexual function. J Clin Oncol. 27 (24), 3916-3922 (2009).
- Kohutek, Z. A., et al. Long-Term Impact of Androgen-Deprivation Therapy on Cardiovascular Morbidity after Radiotherapy for Clinically Localized Prostate Cancer. Urology. , (2015).
- Murray, L., et al. Second primary cancers after radiation for prostate cancer: a systematic review of the clinical data and impact of treatment technique. Radiother Oncol. 110 (2), 213-228 (2014).
- Resnick, M. J., et al. Long-term functional outcomes after treatment for localized prostate cancer. N Engl J Med. 368 (5), 436-445 (2013).
- Shahinian, V. B., Kuo, Y. F., Freeman, J., Goodwin, J. S. Risk of fracture after androgen deprivation for prostate cancer. New Engl J Med. 352 (2), 154-164 (2005).
- Wilke, D. R., et al. Testosterone and erectile function recovery after radiotherapy and long-term androgen deprivation with luteinizing hormone-releasing hormone agonists. BJU Int. 97 (5), 963-968 (2006).
- Zhao, J., et al. Androgen deprivation therapy for prostate cancer is associated with cardiovascular morbidity and mortality: a meta-analysis of population-based observational studies. PLoS One. 9 (9), e107516 (2014).
- Berthold, D. R., et al. Docetaxel plus prednisone or mitoxantrone plus prednisone for advanced prostate cancer: updated survival in the TAX 327 study. J Clin Oncol. 26 (2), 242-245 (2008).
- Bono, J. S., et al. Prednisone plus cabazitaxel or mitoxantrone for metastatic castration-resistant prostate cancer progressing after docetaxel treatment: a randomised open-label trial. Lancet. 376 (9747), 1147-1154 (2010).
- Fizazi, K., et al. Abiraterone acetate for treatment of metastatic castration-resistant prostate cancer: final overall survival analysis of the COU-AA-301 randomised, double-blind, placebo-controlled phase 3 study. Lancet Oncol. 13 (10), 983-992 (2012).
- Kantoff, P. W., et al. Sipuleucel-T immunotherapy for castration-resistant prostate cancer. New Engl J Med. 363 (5), 411-422 (2010).
- Parker, C., et al. Alpha emitter radium-223 and survival in metastatic prostate cancer. New Engl J Med. 369 (3), 213-223 (2013).
- Rathkopf, D. E., et al. Updated Interim Efficacy Analysis and Long-term Safety of Abiraterone Acetate in Metastatic Castration-resistant Prostate Cancer Patients Without Prior Chemotherapy (COU-AA-302). Eur Urol. 66 (5), 815-825 (2014).
- Scher, H. I., et al. Increased survival with enzalutamide in prostate cancer after chemotherapy. New Engl J Med. 367 (13), 1187-1197 (2012).
- Field, S. B., et al. Differences in vascular response between primary and transplanted tumours. Brit J Cancer. 63 (5), 723-726 (1991).
- Cowen, S. E., Bibby, M. C., Double, J. A. Characterisation of the vasculature within a murine adenocarcinoma growing in different sites to evaluate the potential of vascular therapies. Acta Oncol. 34 (3), 357-360 (1995).
- Kuo, T. H., et al. Site-specific chemosensitivity of human small-cell lung carcinoma growing orthotopically compared to subcutaneously in SCID mice: the importance of orthotopic models to obtain relevant drug evaluation data. Anticancer Res. 13 (3), 627-630 (1993).
- Fidler, I. J., et al. Modulation of tumor cell response to chemotherapy by the organ environment. Cancer Meta Rev. 13 (2), 209-222 (1994).
- Wilmanns, C., et al. Modulation of Doxorubicin sensitivity and level of p-glycoprotein expression in human colon-carcinoma cells by ectopic and orthotopic environments in nude-mice. Int J Oncol. 3 (3), 413-422 (1993).
- Fidler, I. J. Orthotopic implantation of human colon carcinomas into nude mice provides a valuable model for the biology and therapy of metastasis. Cancer Meta Rev. 10 (3), 229-243 (1991).
- Kwon, E. D., et al. Ipilimumab versus placebo after radiotherapy in patients with metastatic castration-resistant prostate cancer that had progressed after docetaxel chemotherapy (CA184-043): a multicentre, randomised, double-blind, phase 3 trial. Lancet Oncol. 15 (7), 700-712 (2014).
- Topalian, S. L., et al. Safety, activity, and immune correlates of anti-PD-1 antibody in cancer. New Engl J Med. 366 (26), 2443-2454 (2012).
- Pasqualini, R., Ruoslahti, E. Organ targeting in vivo using phage display peptide libraries. Nature. 380 (6572), 364-366 (1996).
- Conway, E. M., Carmeliet, P. The diversity of endothelial cells: a challenge for therapeutic angiogenesis. Genome Biol. 5 (2), 207 (2004).
- Loi, M., et al. The use of the orthotopic model to validate antivascular therapies for cancer. Int J Dev Biol. 55 (4-5), 547-555 (2011).
- Bianchi-Frias, D., Hernandez, S. A., Coleman, R., Wu, H., Nelson, P. S. The landscape of somatic chromosomal copy number aberrations in GEM models of prostate carcinoma. Mol Cancer Res. 13 (2), 339-347 (2015).
- Pan, Y., et al. Characterization of chromosomal abnormalities in prostate cancer cell lines by spectral karyotyping. Cytogenet Cell Genet. 87 (3-4), 225-232 (1999).
- Wang, J., et al. Pim1 kinase synergizes with c-MYC to induce advanced prostate carcinoma. Oncogene. 29 (17), 2477-2487 (2010).
- Watson, P. A., et al. Context-dependent hormone-refractory progression revealed through characterization of a novel murine prostate cancer cell line. Cancer Res. 65 (24), 11565-11571 (2005).
- Ellis, L., Lehet, K., Ramakrishnan, S., Adelaiye, R., Pili, R. Development of a castrate resistant transplant tumor model of prostate cancer. Prostate. 72 (6), 587-591 (2012).
- Nunez-Cruz, S., Connolly, D. C., Scholler, N. An orthotopic model of serous ovarian cancer in immunocompetent mice for in vivo tumor imaging and monitoring of tumor immune responses. J Vis Exp. (45), (2010).
- Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. J Vis Exp. (26), (2009).
- Ellis, L., Lehet, K., Ku, S., Azabdaftari, G., Pili, R. Generation of a syngeneic orthotopic transplant model of prostate cancer metastasis. Oncoscience. 1 (10), 609-613 (2014).
- Wallace, J. Humane endpoints and cancer research. ILAR J. 41 (2), 87-93 (2000).
- Valkenburg, K. C., Amend, S. R., Pienta, K. J. Murine Prostate Micro-dissection and Surgical Castration. J Vis Exp. (111), (2016).
- Koh, C. M., et al. MYC and Prostate Cancer. Genes Cancer. 1 (6), 617-628 (2010).
- Shappell, S. B., et al. Prostate pathology of genetically engineered mice: definitions and classification. The consensus report from the Bar Harbor meeting of the Mouse Models of Human Cancer Consortium Prostate Pathology Committee. Cancer Res. 64 (6), 2270-2305 (2004).
- McNeal, J. E., Redwine, E. A., Freiha, F. S., Stamey, T. A. Zonal distribution of prostatic adenocarcinoma. Correlation with histologic pattern and direction of spread. Am J Surg Pathol. 12 (12), 897-906 (1988).
- Price, D. Comparative Aspects of Development and Structure in the Prostate. Natl Cancer I Monogr. 12, 1-27 (1963).
- Roy-Burman, P., Wu, H., Powell, W. C., Hagenkord, J., Cohen, M. B. Genetically defined mouse models that mimic natural aspects of human prostate cancer development. Endocr-Relat Cancer. 11 (2), 225-254 (2004).
- Berquin, I. M., Min, Y., Wu, R., Wu, H., Chen, Y. Q.
