Summary
هلام-seq تمكن الباحثين في نفس الوقت إعداد مكتبات لكلا الحمض النووي--والحمض النووي الريبي-seq في التكلفة المضافة ضئيلة بدءاً من 100-1000 الخلايا باستخدام جهاز هيدروجيل بسيطة. وتعرض هذه الورقة نهجاً مفصلة لتصنيع الجهاز، فضلا عن البروتوكول البيولوجي لإنشاء مكتبات المزدوجة.
Abstract
إلا تحقق القدرة على تضخيم وتسلسل الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي من عينات صغيرة في البداية في السنوات الخمس الماضية. ولسوء الحظ، البروتوكولات القياسية لتوليد الجينوم أو مكتبات ترانسكريبتوميك تتنافى والباحثين يجب أن تختار ما إذا كنت تريد تسلسل الحمض النووي الريبي أو لنموذج معين. هلام-seq يحل هذه المشكلة عن طريق تمكين الباحثين في نفس الوقت إعداد مكتبات للحمض النووي والجيش الملكي النيبالي بدءاً من 100-1000 الخلايا باستخدام جهاز هيدروجيل بسيطة. وتعرض هذه الورقة نهجاً مفصلة لتصنيع الجهاز، فضلا عن البروتوكول البيولوجي لإنشاء مكتبات المزدوجة. نحن تصميم seq جل بحيث يمكن تنفيذه بسهولة من الباحثين الآخرين؛ مختبرات علم الوراثة كثيرة لديها بالفعل المعدات اللازمة لإنتاج تصنيع الجهاز جل seq. لدينا بروتوكول يستخدم مجموعات المواد المستخدمة بشكل شائع لكلا التضخيم كل نسخة (الرغبة) وإعداد مكتبة، الذي من المرجح أيضا أن تكون مألوفة للباحثين بالفعل على دراية بتوليد الجينوم وترانسكريبتوميك المكتبات. نهجنا يسمح للباحثين لكي تتحمل سلطة تسلسل الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي على عينة واحدة دون تقسيم ومع التكلفة المضافة لا يعتد بها.
Introduction
الجيل التالي التسلسل (خ ع) كان لها تأثير عميق على الطريقة التي تجري بحوث علم الوراثة. حيث مرة ركز الباحثين على تسلسل الجينوم أكمله الأنواع، من الممكن الآن تسلسل الجينوم من ورم واحد أو حتى خلية واحدة في تجربة واحدة. 1 خ ع أيضا جعلها فعالة من حيث التكلفة تسلسل وقائع الجيش الملكي النيبالي وجدت داخل خلية، عبارة عن مجموعة من البيانات المعروفة باسم الترنسكربيتوم. إلا تحقق القدرة على تضخيم وتسلسل الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي من عينات صغيرة في البداية في السنوات الخمس الماضية. 2 , 3 , ولسوء الحظ، 4 البروتوكولات القياسية غير متوافقة والباحثين يجب أن تختار ما إذا كنت تريد تسلسل الحمض النووي الريبي أو لنموذج معين. عند انطلاق عينة كبيرة بما يكفي، فإنه يمكن تقسيم في النصف. في جداول صغيرة، ومع ذلك، الخسائر المادية بسبب تقسيم العينات يمكن أن يؤثر على نوعية المكتبة، وتجميع عينات يمكن متوسط من الاختلافات مثيرة للاهتمام بين الخلايا. 5 وعلاوة على ذلك، الباحثين مهتما متزايدة في فحص العينات التي لا يمكن تقسيم، مثل خلايا مفردة أو الخزعات الصغيرة الورم غير متجانسة. 6
ولمعالجة هذه المشكلة، وضعت مؤخرا ثلاثة بروتوكولات لتسلسل الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي من نفس العينة انطلاق: جل seq7، ز & T-seq8والدكتور seq9. تعرض هذه المقالة بروتوكول مفصل لجل-seq، التي يمكن استخدامها لإنشاء مكتبات الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي في وقت واحد من عدد قليل من الخلايا 100 في التكلفة المضافة لا يعتد بها. الجانب رواية لجل seq هو القدرة على فصل الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي تستند حصرا إلى حجم استخدام مصفوفات المائية منخفضة التكلفة. الابتكار الأساسية للبروتوكول Seq جل هو الفصل المادي للحمض النووي من الجيش الملكي النيبالي. ويتحقق هذا الفصل اليكتروفوريتيكالي باستخدام مزيج من الأغشية polyacrylamide التي تستفيد من حجم الاختلافات بين هذه الجزيئات. لوضع هذه الاختلافات في الحجم وفي السياق، تنظر كيف يتم تصويرها الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي: بينما الحمض النووي موجود بمقياس ميكرون، ويمكن عرضها باستخدام المجاهر التقليدية، الحمض النووي الريبي موجود بمقياس نانومتر ويجب تصويرها باستخدام تقنيات معقدة مثل البرد-إلكترون الفحص المجهري. 10
ويرد في الشكل 1النهج المتبع في فصل الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي في هذا البروتوكول. اللوحة اليسرى يظهر الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي حرة عائمة في الحل بالقرب غشاء. عندما يتم تطبيق مجال الكهربائي، كما هو مبين في اللوحة اليمنى، الحمض النووي، والجيش الملكي النيبالي تجربة قوة الغرواني الكهربي الحث على الهجرة من خلال الغشاء. وقد أنشأنا بضبط خصائص الغشاء، غشاء شبه منفذ يفصل الحمض النووي الريبي. جزيئات الحمض النووي يتم الضغط ضد الغشاء، ولكن أصبح متشابكاً في الحافة بسبب حجمها الكبير. جزيئات الحمض النووي الريبي صغيرة، من ناحية أخرى، يمكن تكوين ونسج طريقهم عبر الغشاء. تشبه هذه العملية، المعروفة باسم ريبتيشن، على طريقة ثعبان يتحرك من خلال العشب. في نهاية المطاف توقفت هذه جزيئات الحمض النووي الريبي غشاء عالي الكثافة، والثاني أن من الصعب جداً للبوليمرات حتى أصغر (> 200 قاعدة أزواج) التملص من خلال. مرة واحدة مفصولة ماديا، يمكن استرداد الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي وتجهيزها لتوليد معلومات عن الجينوم والترنسكربيتوم على السواء. وفي حين أننا يمكن فصل الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي، وجدنا يتم الحصول على نتائج أفضل إذا كان الجيش الملكي النيبالي عكس نسخها إلى كدنا قبل الانفصال. هجن كدنا/الحمض النووي الريبي هي أكثر استقرارا من الحمض النووي الريبي وحدها ولا يزال يمكن أن تمر عبر غشاء منخفضة الكثافة.
الشكل 1 . مبدأ التشغيل جل seq. والمبدأ الأساسي المستخدمة فعلياً فصل الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي. في مجال الكهربائي المطبق، جزيئات الحمض النووي الريبي صغيرة تهاجر عبر غشاء منخفضة الكثافة ولكن جزيئات الحمض النووي كبيرة محاصرون في السطح. واستنسخ هذا الرقم من الرقم 7 بإذن من "المجتمع الملكي للكيمياء". الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
وتصف هذه الورقة بالتفصيل كلا تصنيع الجهاز seq جل وإقران البروتوكول البيولوجي لإنشاء مكتبات الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي. ويبين الشكل 2نظرة عامة على حد سواء. الجهاز مختلق من طبقات ثلاثة مختلفة الكثافة polyacrylamide الجل فوق بعضها البعض في عملية مماثلة لإنشاء معيار الجل التراص. 11 البروتوكول البيولوجي يبدأ مع خلايا 100-1000 تعليق في برنامج تلفزيوني. يتم تفكيك الخلايا والحمض النووي الريبي يتم تحويلها إلى كدنا قبل استخدام الجهاز بفصل الدنا الجينومي الهجينة كدنا/الجيش الملكي النيبالي. بعد الانفصال، والانتعاش، والجينوم وترانسكريبتوميك تعد المكتبات باستخدام عملية أن يتابع عن كثب البروتوكول طقم الإعداد القياسي جينوم كل مكتبة. يمكن قراءة المزيد من التفاصيل حول التنمية والتحقق من الصحة لجل seq في مختبر على رقاقة منشور "seq جل: كل الجينوم وتسلسل الترنسكربيتوم عن طريق المتزامنة ذات المدخلات المنخفضة الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي مكتبة الإعداد باستخدام الحواجز المائية شبه نفاذية ." 7
الشكل 2 . بروتوكول جل seq. إقران لمحة عامة عن الخطوات لاختلاق الجهاز seq جل والبروتوكول إنشاء مكتبات الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي. استنسخت أجزاء من هذا الرقم من الرقم 7 بإذن من "المجتمع الملكي للكيمياء". الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
لإنشاء مكتبات الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي من الخلايا المفردة، وينبغي النظر في استخدام أما ز & T-seq أو ما يليها الدكتور ز & T-Seq، مثل seq جل الباحثين، يعتمد على فصل المادي للجيش الملكي النيبالي من الحمض النووي. هذا النهج يعتمد على رسول رنا (مرناً) 3 ' بوليادينيلاتيد الذيل كهدف سحب لأسفل. يتم التقاط مرناً على حبة مغناطيسي باستخدام تمهيدي اليغو-dT بيوتينيلاتيد. متى تم التقاط مرناً الخرز وتعقد في مكان مع مغناطيس ويمكن إزالة المادة طافية تحتوي على الحمض النووي الجينومي وتحويلها إلى أنبوب آخر. بعد الانتهاء من هذا الفصل المادي، يمكن إنشاء مكتبات منفصلة من مرناً والحمض النووي. 8 هذا النهج يعمل جيدا إذا كان الجيش الملكي النيبالي للاهتمام بوليادينيلاتيد، ولكن لا يمكن استخدامه لدراسة النصوص غير بوليادينيلاتيد، مثل الرنا الريباسي، الحمض الريبي النووي النقال، أو الحمض النووي الريبي من بدائيات النوى.
الدكتور seq يعتمد على خطوة ما قبل تضخيم حيث تتضخم الحمض النووي وكدنا المستمدة من الجيش الملكي النيبالي في الأنبوب نفسه. العينة ثم تقسيم في اثنين وتجهيزها بالتوازي مع إعداد مكتبات تسلسل الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي. للتمييز بين الحمض النووي وكدنا المستمدة من الجيش الملكي النيبالي، الدكتور seq نهجاً حسابية. تسلسلات التي تتواجد فيها إلا exons تقمع حسابياً في بيانات الحمض النووي الجينوم، كتلك التي يمكن نشأت من الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي. ميزة هذا النهج أن الحمض النووي وكدنا/الجيش الملكي النيبالي بحاجة لا يمكن فعلياً فصل كما الحال في جل seq وز & T-ما يليها 9 العيب، ومع ذلك، هو أن الدكتور seq يتطلب معرفة مسبقة بالجينوم والترنسكربيتوم (أي، exons مقابل introns)، وقد لا تكون مثالية لتطبيقات مثل تسلسل نويات، فيها العديد من النصوص لا بعد تماما تقسم ولا يزال يحتوي على إينترونس. 12
الجانب رواية لجل seq هو القدرة على فصل الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي في مئات خلايا استناداً إلى حجم حصرا. يتطلب هذا الأسلوب لا المعرفة مسبقاً من الجينوم أو الترنسكربيتوم، هو قوي ضد الربط غير مكتملة، ولا تقتصر على النصوص بولي-أدينيلاتيد. للتطبيقات حيث يمكن أن يبدأ باحث مع خلايا على الأقل 100، يوفر جل seq نهج مباشرة باستخدام مواد رخيصة ومتاحة على نطاق واسع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-إعداد الحل الأسلحة الكيميائية
ملاحظة: الخطوات التالية لإعداد المحاليل الكيميائية المطلوبة في خطوات لاحقة. وهذه يمكن إجراؤها بكميات كبيرة وتخزينها لعدة أشهر.
- للبدء، إعداد 50 مل مياه النقية، ومنزوع تعقيم في 254 نانومتر الأشعة فوق البنفسجية crosslinking فرن لمدة 15 دقيقة (15 مللي جول/سم2 إجمالي التعرض) لتحييد أي تلويث الحمض الخلوي الصبغي. الحرارة إلى 37 درجة مئوية للاستخدام في الخطوات التالية.
- جعل 10 مل 40% إجمالي (T) و crosslinker 3.3 في المائة (ج) (فيها) polyacrylamide السلائف الحل. وزن ز 3.867 مونومر الاكريلاميد و 0.133 ز من مونومر مكررا-مادة اكريلاميد. الجمع بين وإعادة التخزين يصل إلى 10 مل مع تنقية المياه الدافئة ودوامه حتى يذوب. مخزن محمية من الضوء في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: خلط 40% T، 3.3% C (فيها) polyacrylamide الحلول يمكن شراؤها تجارياً. - جعل 10 مل من 50% T، 5 ٪ ج جل الحل. وزن ز 4.750 مونومر الاكريلاميد و 0.250 غرام من مركب الاكريلاميد مكررا. الجمع بين وإعادة التخزين يصل إلى 10 مل باستخدام تنقية المياه الدافئة ودوامه حتى يذوب. مخزن محمية من الضوء في درجة حرارة الغرفة.
- جعل 10 مل محلول السكروز 50% (w/v). إضافة السكروز 5 غ إلى اسطوانة وإضافة تنقية المياه الحارة تصل إلى إجمالي حجم 10 مل. ودوامه حتى يذوب وتخزين في درجة حرارة الغرفة.
- جعل مل 10% 10 وكالة الأنباء الجزائرية (w/v). إضافة 1 ز من فوق كبريتات الأمونيوم (الجزائرية) اسطوانة. إضافة الباردة (~ 4 درجة مئوية) تنقية المياه تصل إلى إجمالي حجم 10 مل ودوامه حتى يذوب. فورا تجميد في مختبرين من 200 ميليلتر.
2-جل-seq كاسيت تلفيق
ملاحظة: وضعت جل seq أصلاً مع شرائط تستقيم (انظر الجدول للمواد لمزيد من المعلومات)؛ بيد أن هذا البروتوكول يمكن تكييفها للعمل مع أي كاسيت التفريد هلام القياسية.
- تحضير هلام السلائف في ثلاثة أنابيب بلاستيكية منفصلة عن طريق إضافة الكواشف كما هو موضح أدناه في الجدول 1 . لا إضافة وكالة الأنباء الجزائرية أو تيتراميثيليثيلينيدياميني (تيميد) حتى توجه في الخطوات التالية. دوامة المكونات مزيج دقيق.
| حشو جل السلائف | السلائف جل عالي الكثافة | السلائف جل منخفض الكثافة | |||
| 40% T، 3.3%C الاكريلاميد بيساكريلاميدي الحل | 1.6 مل | 50% T، 5% C الاكريلاميد بيساكريلاميدي الحل | 2.4 مل | 40% T، 3.3%C الاكريلاميد بيساكريلاميدي الحل | 0.6 مل |
| المياه. | 10.2 مل | المياه. | مل 1.0 | المياه. | 4.8 مل |
| محلول السكروز (50% w/v) | 2.6 مل | محلول السكروز (50% w/v) | 0.6 مل | ||
| 10 X تريس-بورات-يدتا | 1.6 مل | 10 X تريس-بورات-يدتا | 0.6 مل | ||
| فوق كبريتات الأمونيوم (10% w/v) | 104.0 ميليلتر | فوق كبريتات الأمونيوم (10% w/v) | ميليلتر 50.0 | فوق كبريتات الأمونيوم (10% w/v) | ميليلتر 39.0 |
| تيميد | ميليلتر 6.0 | تيميد | ميليلتر 1.0 | تيميد | 2.2 ميليلتر |
| الحجم الإجمالي | مل 16.1 | الحجم الإجمالي | مل 4.1 | الحجم الإجمالي | مل 6.0 |
الجدول 1. هلام الكواشف التوليف. هلام polyacrylamide السلائف الكواشف كافية لتصنيع أشرطة الكاسيت 2.
- الغاز دي الحلول مونومر هلام بإدخال إبرة من خلال عملية النداءات الموحدة للأنبوب وربط هذه الإبرة إلى خط فراغ بيت. غمر هذه الجمعية في مجموعة حمام الموجات فوق الصوتية إلى أعلى وانتظر حتى تتوقف فقاعات الخارجة من السائل قبل الانتقال إلى الخطوة التالية (~ 60 ثانية/أنبوب).
ملاحظة: نوعية الفراغ والطاقة للحوض بالموجات فوق الصوتية ليست حاسمة طالما يمكن رؤية الفقاعات الخارجة من الحل. - إضافة تيميد ووكالة الأنباء الجزائرية حشو جل السلائف ودوامه بإيجاز. فورا إضافة 6 مل السلائف جل حشو لكل كاسيت جل قبل بيبيتينج الحل في الجزء العلوي من الكاسيت. استخدام ميكروبيبيتي 1 مل لإضافة السلائف تزايدات الستة لتجنب إراقة. الوقت الإجمالي لهذه الخطوة ينبغي أن يكون أقل من 3 دقائق.
- ضمان السائل هو المستوى بوضع أشرطة الكاسيت تستقيم على مستوى جدول. ملء ما تبقى الكاسيت بماء منزوع، ويطرد. "الماصة؛" الماء، مرة أخرى باستخدام زيادات 1 مل، ببطء داخل مركز الكاسيت التقليل من الاختلاط. تسمح البوليمر لعلاج لمدة ساعة واحدة على الأقل، تصل بين عشية وضحاها.
- بعد الشفاء من البوليمر، وقد عكس الأشرطة هلام عبر بالوعة إلى إزالة تراكب المياه. يمكن استخدام بندقية هواء المضغوط للطف جاف الواجهة التي تهب الهواء من خلال فتح الكاسيت أعلى من مسافة 6 بوصات.
- إضافة تيميد ووكالة الأنباء الجزائرية بالسلائف جل عالي الكثافة ودوامه بإيجاز. فورا إضافة ميليلتر 320 من السلائف عالي الكثافة للكاسيت، مرة أخرى باستخدام ماصة 1 مل. ضمان السائل بالتساوي المعاطف طبقة جل حشو بالتأرجح في الكاسيت ذهابا وإيابا حوالي 3 مرات. وينبغي أن تتخذ هذه الخطوة أقل من ثلاث دقائق.
- ملء ما تبقى الكاسيت بماء منزوع، ويطرد. "الماصة؛" ببطء مع ماصة 1 مل داخل مركز الكاسيت التقليل من الاختلاط. تسمح البوليمر لعلاج لمدة خمسة عشر دقيقة على الأقل، ويفضل أن تكون ساعة.
- ومرة أخرى، عكس الأشرطة جل لإزالة تراكب المياه. يمكن استخدام الهواء المضغوط الجاف بلطف للواجهة. إضافة تيميد ووكالة الأنباء الجزائرية بالسلائف جل منخفضة الكثافة ودوامه بإيجاز. ملء ما تبقى الكاسيت (~1.65 مل) مع السلائف جل الكثافة على الفور وإدراج مشط هلام.
- "الماصة؛" فائض الاحتياطي السلائف في الجزء العلوي من المشط كما أنه سيتم استيعابها خلال البلمرة. تسمح البوليمر لعلاج 4 ساعات على الأقل، يفضل أن يكون ذلك بين عشية وضحاها. ويمكن تخزين المواد الهلامية لمدة أسبوع أو أكثر في المخزن مؤقت لحمض تريس-بورات-الإيثيلين (يدتا) (TBE العازلة).
3-نموذج إعداد وعكس النسخ
- بدءاً بتعليق للخلايا ذات الاهتمام، وتعمل في غطاء الاندفاق الصفحي بوليميريز سلسلة من ردود فعل (PCR)، استخدام هيموسيتوميتير أو عداد خلية تلقائي لحساب تركيز الخلية. تمييع الخلايا لتركيز خلايا 100 إلى 1000 كل ميليلتر في مخزنة الفوسفات المالحة (PBS).
ملاحظة: تم التحقق من هذا البروتوكول على نطاق من الخلايا بما في ذلك PC3 والحلة وخلايا الكبد الماوس. - استخدام الكواشف في التنس المحترفات كيت (انظر الجدول للمواد)، مزيج ميليلتر 19 من المخزن المؤقت لتحلل والأسهم 1 ميليلتر من رناسي مثبط لإعداد 10 X حل من رد فعل المخزن المؤقت. خلق مزيج رئيسي تحلل كافية التخزين التي تحتوي على 0.5 ميليلتر من رد فعل المخزن المؤقت وميليلتر 2.75 نوكلاس المياه مجاناً لكل عينة.
- "الماصة؛" تعليق خلية صعودا وهبوطاً 5 مرات على إعادة تعليق الخلايا تمت تسويتها، وثم "الماصة؛" 1 ميليلتر من العينة في أنبوب حرة قطاع نوكلاس 200 ميليلتر للتعقيم بالأشعة فوق البنفسجية. كرر حسب الضرورة تبعاً لعدد العينات. تأكد من تضمين عنصر تحكم سلبية التي بيبيتينج ميليلتر 1 نوكلاس المياه مجاناً بدلاً من الخلايا لرد فعل واحد. بعد ذلك، إضافة 3.25 ميليلتر من تحلل مزيج الرئيسي لكل عينة ومزيج من بيبيتينج برفق صعودا وهبوطاً 5 مرات.
- يسخن cycler حرارية (مع غطاء ساخن) إلى 72 درجة مئوية. إضافة 1 ميليلتر من التمهيدي RT و 1 ميليلتر من 20 ميكرومتر عشوائي هيكسامير مع محول اتحاد لاعبات التنس (5-آجكاجتجتات-كاكجكاجاجتاك-NNNNNN-3) لكل عينة. نحتفظ بأنبوب واحد على الأقل كعنصر إيجابي لإعداد مكتبة جدنا وإضافة 2 ميليلتر من الماء بدلاً من الإشعال.
ملاحظة: هيكسامير عشوائي مع اتحاد لاعبات التنس محول اختياري وله تأثير ضئيل على تسلسل النتائج. - احتضان عينات في 72 درجة مئوية في cycler الحرارية مسخن لمدة 3 دقائق الخلايا. إزالة خلايا من cycler الحرارية ومكان على الجليد لمدة دقيقتين. تخزين عنصر التحكم الإيجابي في 4 درجات مئوية حتى الخطوة 5.
- بينما يتم ليسينج الخلايا، إنشاء وحدة تخزين كافية من مزيج الرئيسي النسخ العكسي لجميع عينات الحمض النووي الريبي التي تحتوي على نسب كاشف التالية: 2 ميليلتر من أول حبلا العازلة، 0.5 ميليلتر من القالب التبديل اليغنوكليوتيد (TSO)، ميليلتر 0.25 من مثبط رناسي، و 1 ميليلتر من المنتسخة العكسية (100 يو/ميليلتر).
- يسخن cycler الحرارية إلى 42 درجة مئوية. إضافة ميليلتر 3.75 من مزيج الرئيسي النسخ العكسي للعينات المتبقية، يصل حجم العينة الإجمالية إلى 10 ميليلتر. مزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً 5 مرات.
- إجراء النسخ العكسي عن طريق وضع العينات فورا في cycler حرارية مسخن. تشغيل البرنامج التالي: 42 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة، 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، 4 درجة مئوية إلى الأبد. وهذا نقطة توقف آمنة.
4-الفصل جل ونموذج الاسترداد
- بعناية قم بتنظيف حجرة التفريد جل استخدام منتج إزالة الحمض النووي. تطبيق مل عدة من عامل التنظيف السائلة إلى مسح لينت المتاح مجاناً ومسح عبر جميع الأسطح للدائرة، ثم قم بملء الدائرة مع 0.5 نظيفة x TBE. لتحقيق أفضل النتائج، ضع الجهاز برمته في فرن نانومتر الأشعة فوق البنفسجية 254 crosslinking وتعقيم لمدة 15 دقيقة (15 مللي جول/سم2).
- إدراج كاسيت جل seq في قاعة التفريد جل وتأمينه في مكانة. ببطء بإزالة المشط جل عن طريق سحب شكل مستقيم. تتحرك ببطء لتجنب تمزق الهلام أو التمزيق أي من الأسلحة.
- حفظ العينات من الخطوة 3 على الجليد، نحتفظ بعينه واحدة على الأقل كعنصر إيجابي لكدنا مكتبة الجيل. تخزين عنصر التحكم هذا في 4 درجات مئوية حتى الخطوة 6. إضافة 2 ميليلتر من 6 × تحميل صبغ للعينات المتبقية، ويصل الحجم الإجمالي إلى ميليلتر ~ 12. دقة خلط العينات التي بيبيتينج صعودا وهبوطاً 5 مرات.
- الجمع بين 1 ميليلتر سلم الحمض النووي 2 ميليلتر من 6 × تحميل صبغ و 7 ميليلتر من الماء. "الماصة؛" هذا الخليط في حارة 1 من كاسيت seq هلام كعنصر تحكم التفريد. "الماصة؛" العينات المأخوذة من الخطوة السابقة في ممرات منفصلة للكاسيت جل seq. كن حذراً لمنع التلوث بين الآبار بإدراج الماصة الكامل في كل بئر وإزالتها استخدام فقط حركة رأسية.
- استخدام هلام قياسية التفريد الكهربي، تطبيق مجال الكهربائي من 250 الخامس عبر الكاسيت جل seq لمدة 30 دقيقة لفصل جدنا من هجن كدنا/الجيش الملكي النيبالي. بمجرد فصل، إزالة كاسيت seq جل من قاعة التفريد جل وفتح نصفي الكاسيت بالتحديق الحواف مع أداة إلغاء.
- استخدام مشرط، قطع الهلام في نصف أسفل طبقة عالية الكثافة. تجاهل في النصف الذي يحتوي على جل حشو بالتقاط بيدك القفاز. بلطف قشر هلام المتبقية قبالة الكاسيت بإلغاء ذلك مع مكشطة طلاء أو أداة أخرى مشابهة. وضع هذا القسم من الجل في طبق يحتوي على ~ 30 مل 0.5 x TBE مع 3 ميليلتر من جل وصمة عار.
- تغطية الحاوية للتقليل من فوتوبليتشينج وامتصاص الجل بينما تهز الحاوية برفق لمدة 5 دقائق. ضع الجل في غلاف بلاستيكي وتأخذ صورة الأشعة فوق البنفسجية باستخدام نظام توثيق هلام (لمزيد من التفصيل انظر الرقم 13). تعرض ثاني 30 عادة ما تنتج صوراً واضحة. التحقق من حدوث الانفصال.
- نقل الجل إلى ترانسيلوميناتور الأشعة فوق البنفسجية لتسهيل تصور الأحماض النووية. ارتداء نظارات الأشعة فوق البنفسجية المناسبة، تأكيد النتائج من نظام التوثيق هلام. ينبغي أن يكون جدنا يقع بداية الجل منخفضة الكثافة وكدنا في واجهة المناطق المنخفضة الكثافة وعالي الكثافة.
- استخدام مشرط، قطع مناطق الجل تحتوي على جدنا وكدنا. يتم استرداد عينات أفضل بقطع 4 ملم 10 ملم قسم مستطيلة من جل؛ ومع ذلك، الهندسة الدقيقة سوف تعتمد على نظام التفريد جل المستخدمة. تذكر أن تقوم بقص حارة محملة بمراقبة سلبية أيضا.
- وضع كل مقطع قصت جل في أنبوب قطاع باستخدام زوج من ملاقط نهاية غير حادة. يجب الحرص على عدم تطبيق الكثير من القوة أو الهلام سيتم تقسيم إلى أجزاء متعددة. أن هذا يحدث ببساطة التقاط كل قطعة وإضافة إلى الأنبوب.
- طحن الهلام في كل أنبوبة استخدام تلميح ماصة (200 ميليلتر ماصة نصائح تعمل بشكل جيد) بتحريك طرف الماصة بطريقة دائرية على الجزء السفلي من الأنبوب. إضافة نوكلاس المياه مجاناً (40 ميليلتر في عينات جدنا وميليلتر 80 في عينات كدنا) لكل أنبوبة قبل إزالة تلميح الماصة المستخدمة لطحن هلام للتقليل من فقدان عينة.
- مكان القطاع أنابيب إلى خالط دوامة داخل حاضنة 37 درجة مئوية، ويهز لمدة 8-12 ساعة. وهذا يسمح الأحماض النووية لنزع فتيل من الجل وهو وقف طبيعية نقطة لهذا البروتوكول يوم متعدد.
- "الماصة؛" العينات في صفيحة تصفية مش 8 ميكرومتر وتدور اللوحة في 2600 س ز لمدة 5 دقائق لسلالة من الشظايا هلام. أرفع لوحة تصفية مش بعيداً عن لوحة السكن و "الماصة؛" عينات المياه خالية من جل في أنبوب قطاع جديد 200 ميليلتر.
- أضف 1 ميليلتر من البروتياز (0.9 الاتحاد الأفريقي/mL) لكل عينة تحتوي على جدنا، مزيج جيد من قبل بيبيتينج صعودا وهبوطاً، واحتضان عند 50 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة تليها من المنظمة حرارة عند 70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. هذه الخطوة الحاسمة لاستنفاد nucleosomes ويجعل جدنا موجوداً للخطوات اللاحقة من رد الفعل.
- باستخدام إبرة قياس 18، كزة ثقوب في قبعات كل عينة أنابيب. وضع العينات في فاكوفوجي لتقليل حجم السائل. ينبغي خفض عينات جدنا إلى 5 ميليلتر وكدنا عينات خفضت إلى 10 ميليلتر.
- اعتماداً على فاكوفوجي وعدد العينات، سوف تختلف الوقت التبخر الكلي بين 30 و 60 دقيقة. إذا كان حجم العينة تقل وحدة التخزين الهدف، ببساطة إضافة نوكلاس المياه مجاناً لزيادة حجم العينة.
5-إعداد مكتبة جدنا
- باستخدام فلوروميتير أو تقنية مشابهة، قياس تركيز الحمض النووي في كل عينة جدنا من الخطوة 4، فضلا عن مراقبة إيجابية من الخطوة 3. لبروتوكول مفصلاً راجع دليل مرجع fluorometer. 14
- تمييع هذه العينات إلى 0.2 نانوغرام/ميليلتر من الحمض النووي. تبعاً لنوع الخلية انطلاق ونوعية النتائج المطلوبة، قد لا يزال ينتج تركيزات أقل مكتبات قابلة للحياة. وسوف يلزم بعض التجريب؛ غير أن المؤلفين النجاح مع مكتبات منخفضة تصل إلى 0.1 نانوغرام/ميليلتر.
- إكمال إعداد مكتبة جدنا باتباع البروتوكول حجم رد فعل نصف إعداد مكتبة في الخطوة 7.
6-كدنا إعداد المكتبة
- بدءاً من 10 عينات كدنا ميليلتر ومراقبة إيجابية من الخطوة 4، إضافة ميليلتر 12.5 2 X qPCR ميكس 0.5 ميليلتر كدنا PCR التمهيدي والمياه خالية من نوكلاس 2 ميليلتر.
- إجراء PCR في ثيرموسيكلير في الوقت الحقيقي استخدام بروتوكول التالية: بداية ساخنة في 95 درجة مئوية لمدة دقيقة 3، تليها دورات 20-30 من 98 درجة مئوية لمدة 10 ق، 65 درجة مئوية 30 ثانية، و 72 درجة مئوية لحجم العينة الإجمالية 3 الحد الأدنى هو 25 ميليلتر. رصد رد فعل المنحنيات ووقف التضخيم قبل عشر ترك ردود فعل ه المرحلة الأسية (زيادة إشارة خطية مقابل عدد دورة) تفاديا للتحف بكر بسبب أوفيرامبليفيكيشن. لمزيد من المعلومات حول تجنب أوفيرامبليفيكيشن، انظر المقطع مناقشة هذه الورقة، فضلا عن الرقم 15.
- وبعد التضخيم، تنظيف المنتج باستخدام الخرز التثبيت عكسها (سبري) المرحلة الصلبة يتبع البروتوكول في الخطوة 8. وبمجرد الانتهاء، تابع إلى الخطوة التالية.
- باستخدام فلوروميتير أو تقنية مشابهة، قياس تركيز الحمض النووي في كل عينة كدنا، فضلا عن مراقبة إيجابية من الخطوة 4. تمييع العينات إذا لزم الأمر لاحتواء حوالي 0.2 نانوغرام/ميليلتر من الحمض النووي. لا يزال إنتاج تركيزات أقل بشكل طفيف مكتبات قابلة للحياة. بعض التجريب سيكون مطلوباً، إلا أن الكتاب كان النجاح مع مكتبات منخفضة تصل إلى 0.1 نانوغرام/ميليلتر.
- خطوة اختيارية: تنفيذ فصل الكهربي قياسية polyacrylamide هلام على 1-2 ميليلتر لكل عمل المنتج qPCR للتحقق من صحة رد فعل الجيل مكتبة. ويرد في الشكل 4صورة عينة لنتيجة ناجحة. لبروتوكول مفصلة بشأن كيفية إجراء التفريد polyacrylamide هلام، انظر الرقم 16.
- إكمال إعداد مكتبة كدنا باتباع عدة إعداد مكتبة رد فعل نصف حجم البروتوكول في الخطوة 7.
7-المكتبة إعداد مع نصف حجم ردود الفعل
- إعداد مكتبة يتبع البروتوكول طقم إعداد المكتبة باستخدام نصف حجم ردود الفعل. 17 جميع الكواشف المشار إليها في هذا الجزء من البروتوكول من إعداد مكتبة كيت (انظر الجدول للمواد). ابدأ بالأشعة فوق البنفسجية تعقيم عدد كاف من قطاع أنابيب لعدد العينات بحيث تتم معالجتها.
- القيام برد فعل ترانسبوساسي بإضافة 5 ميليلتر ترانسبوساسي العازلة لكل أنبوبة قطاع لاستخدامها في المقايسة. قم بإضافة 2.5 الدنا ميليلتر الإدخال في 0.2 نانوغرام/ميليلتر (0.5 نانوغرام المجموع) تليها ترانسبوساسي 2.5 ميليلتر. مزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً 5 مرات.
- احتضان في 55 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، ثم عقد في 10 درجة مئوية. بعد العينة يصل إلى 10 درجات مئوية، إزالته من ثيرموسيكلير وإضافة ترانسبوساسي ميليلتر 2.5 إيقاف المخزن المؤقت فورا لكل عينة. تبقى العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- إعداد رد فعل PCR لتضخيم العينة transpose تعامل بإضافة مكتبة ميليلتر 7.5 الإعدادية PCR ميكس، 2.5 ميليلتر من التمهيدي فهرس 1 وميليلتر 2.5 من التمهيدي فهرس 2. كبسولة تفجير هذه الملكية وهي موفر من قبل الشركة المصنعة لمجموعة إعداد المكتبة. مزيج جيد من قبل بيبيتينج صعودا وهبوطاً 5 مرات.
ملاحظة: تأكد من أن يتم استخدام تركيبات التمهيدي فريدة من نوعها لكل عينة. وهناك 12 مؤشر مختلفة 1 الإشعال والإشعال مؤشر مختلفة 2 8، مما يجعل من الممكن لتسمية فريد ما يصل إلى 96 من عينات مختلفة. اختر مجموعة فريدة من كبسولة تفجير لكل عينة. - إجراء PCR باستخدام البرنامج التالي في ثيرموسيكلير. هو حجم العينة 25 ميليلتر.
72 درجة مئوية لمدة 3 دقائق
95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية
12 دورات:
95 درجة مئوية لمدة 10 ثوان
72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية
55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية
72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق
يعقد في 10 درجة مئوية - تنظيف المكتبات المعدة باستخدام سبري الخرز يتبع البروتوكول في الخطوة 8. يجب التحقق من المكتبات استخدام التفريد هلام أو مقايسة مماثلة. الرجوع إلى دليل مجموعة أدوات إعداد المكتبة للحصول على تفاصيل حول كيفية التحقق من المكتبات. 17
8. مكتبة حبة التثبيت عكسها المرحلة الصلبة التنظيف
- المرحلة الصلبة الخرز التثبيت عكسها (سبري) ينبغي أن تكون مخزنة في مختبرين 1.5 مل، وينبغي أن تكون جلبت إلى درجة حرارة الغرفة قبل كل استعمال. كما يوصي بإعداد جديدة من الإيثانول 80% لكل تجربة. الخطوات التالية هي أساس البروتوكول حبة سبري في دليل مجموعة اتحاد لاعبات التنس. 18
- أضف 1 ميليلتر المخزن المؤقت تحلل مجموعة اتحاد لاعبات التنس لكل منتج PCR. دوامة الخرز سبري حتى بالتساوي مختلطة، ثم إضافة 50 ميليلتر من حبات سبري لكل عينة. مزيج من بيبيتينج العينة صعودا وهبوطاً 10 مرات وثم احتضان هذه العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 8 دقائق.
- باختصار تدور العينات لجمع السائل من الجانب من الأنابيب. وضع العينات في جهاز فصل مغناطيسي ~ 5 دقائق حتى يظهر السائل واضحة تماما.
- في حين العينات على جهاز الفصل المغناطيسي، ببطء "الماصة؛" بعيداً عن المادة طافية وتجاهل-ينبغي الحرص على عدم الإخلال بحلقة الخرز على الأنبوب. بعد إضافة 200 ميليلتر من الإيثانول 80% لكل عينة دون الإخلال بالخرز. انتظر لمدة 30 ثانية، وبعد ذلك بعناية "الماصة؛" إيقاف المادة طافية. كرر هذه الخطوة (الإيثانول الغسيل) مرة واحدة.
- تسمح العينات الجافة لمدة 30 ثانية-1 دقيقة. عدم الإفراط الجاف للعينات كالشظايا الكبيرة سوف تصبح ملزمة بشكل دائم الخرز.
ملاحظة: يوصي بفترة وجيزة جافة ضمان إزالة جميع آثار الإيثانول. وينبغي أن تظل كميات نزرة من الإيثانول وراء أنها يمكن أن تمنع قليلاً ردود فعل المتلقين للمعلومات. - إزالة العينات من جهاز الفصل المغناطيسي وإضافة 15 ميليلتر من الماء لكل عينة الحمض النووي من الخرز الوت. "الماصة؛" صعودا وهبوطاً، وضمان إزالة الخرز من الجانبين من الأنابيب. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة. باختصار تدور العينات وثم وضعها على جهاز الفصل المغناطيسي ل ~ 1 دقيقة حتى يظهر الحل واضح.
- في حين العينات على جهاز الفصل المغناطيسي، ببطء "الماصة؛" حتى المادة طافية وتحويلها إلى أنابيب نظيفة. أن الحرص على عدم تعكير حلقة الخرز في الأنبوب. تجاهل هذه الأنابيب مع الخرز.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يمكن تصور الفصل المادي هجن جدنا وكدنا/الجيش الملكي النيبالي في الجهاز seq جل من خلال تصوير جل الفلورية؛ ويبين الشكل 3نتيجة ممثل. تظهر لوحة بالجهاز جل seq ملفقة؛ أضيفت إلى التمييز بين مناطق مختلفة جل اللون كاذبة. لوحة ب يظهر إغلاق أربع نسخ فصل الألوان المختلفة المستخدمة للتحقق من الصحة. الممر الثالث، عنصر تحكم سلبية، يمثل الخلفية ويظهر أنه لا يوجد أي أوتوفلوريسسينسي من الجل في الواجهات. نحن تحميل الحارات الأولى والثانية مع سلالم الحمض النووي. وتظهر هذه الممرات فقط عصابة الظلام في الواجهة بين الأغشية دينسيتي المنخفضة والمرتفعة، تكشف عن أن الأجزاء الصغيرة يمكن أن تمر عبر هلام منخفضة الكثافة. لين الرابع يظهر سلوك عينة بيولوجية من الفائدة: 500 PC3 الخلايا. نحن تحميل لين أربعة كما هو موضح في الخطوة 3 من البروتوكول. وتوضح الصورة فصل الحمض النووي والهجينة كدنا/الجيش الملكي النيبالي. عصابة الظلام في الجزء العلوي من الغشاء منخفض الكثافة هو مقياس ميجاباسي الحمض النووي في حين هجن كدنا/رنا مكدسة في واجهة مناطق منخفضة وعالية الكثافة. بخلاف الممرات محملة بسلم، وهناك أيضا عدة عصابات موجودة داخل منطقة عالية الكثافة من الجل. هذه الشظايا، أصغر من 100 شركة بريتيش بتروليوم، هي المنتجات خارج الهدف المتولدة من النوكليوتيد التمهيدي أثناء النسخ العكسي. تظهر لوحة ج صورة تمثيلية للجهاز seq جيل كامل من تجربة ناجحة. تم تجهيز الممرات المسماة الجيش الملكي النيبالي/كدنا مع البروتوكول seq هلام، بينما تظهر الممرات المسماة الجيش الملكي النيبالي انفصال فقط جدنا والجيش الملكي النيبالي. تظهر لوحة د تجربة فاشلة مع عصابات سوداء في الجزء العلوي من كل حارة من الغشاء منخفضة الكثافة. وهذا ناجم عن المخزن المؤقت التفريد الملوثة مع الحمض النووي مجزأة. في هذه الخطوة، يجب أن تبحث الباحثين عناصر سلبية نظيفة وشريطين سوداء مميزة تشير إلى وجود جدنا المنفصلين عن ذويهم، والجيش الملكي النيبالي/كدنا الهجينة.
الشكل 3 . نتائج الانفصال جل Seq. الجهاز جل seq (A) وصورة فلورية عرض فصل الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي/كدنا الهجينة (ب). أضيفت إلى أكثر بسهولة التمييز بين مختلف مناطق الكثافة داخل الجل اللون كاذبة. (C و D) صور الفلورسنت الممثل من الجهاز seq جيل كامل من الناجحة (C)، وفشل التجربة (د). المجلس الوطني الانتقالي = لا قالب عنصر التحكم. استنسخت أجزاء من هذا الرقم من الرقم 7 بإذن من "المجتمع الملكي للكيمياء". الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
متى تم فصل الهجينة الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي/كدنا وإكمال ما تبقى البروتوكول seq هلام، فمن الممكن لإنشاء مكتبات التسلسل. للتحقق من صحة إعداد المكتبات، ونحن تشغيل تجربة التفريد هلام قياسية (الشكل 4) أو من بيواناليزير. وتظهر النتائج في الشكل 4 المكتبات التي تم إنشاؤها من 500 PC3 الخلايا والخلايا هيلا 750. ويوضح الشكل توزيع جزء لمكتبات المتطابقة التي تم إنشاؤها من جل-seq (المسمى 'جل') مقارنة بالعينات لا مثيل لها التي تم إنشاؤها مع البروتوكولات القياسية (المسمى 'أنبوب'). تظهر أحجام جزء لجل seq بين 200 و 800 باسيبيرس كما هو متوقع عند إعداد المكتبات باستخدام أدوات إعداد مكتبة الجامعة-الجينوم القياسية. إذا لم تظهر مكتبة شظايا في نطاق الحجم الصحيح في هذه الخطوة، قد فشل إعداد المكتبة.
الشكل 4 . مقارنة حجم جزء المكتبة. صورة التفريد جل فلورسنت مقارنة توزيع حجم مكتبة بين جل-seq (جل) وعناصر التحكم القياسية (أنبوب). الممر الأيسر يحتوي على سلم الحمض النووي شامل منخفضة مع جزء الأحجام 100 و 200، 400، 800، 1200 و 2000 باسيبيرس. جزء الأحجام لجميع المكتبات تقع بين 200 و 800 باسيبيرس، كما هو متوقع للمكتبات التي أعدت مع هذه المجموعة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
التحقق من الصحة في نهاية المطاف من البروتوكول seq جل يستند إلى تحليل نتائج التسلسل. اخترنا خلايا PC3 لتجاربنا التحقق من الصحة، هذه الخلايا لديها ملامح التعبير متجانسة تسمح العينات أن يكون تقسيم ومعالجتها باستخدام seq جل والأساليب التقليدية؛ انظر الشكل 5. مقارنة بين الحمض النووي للخلايا PC3 يبين الأرقام 5أ و 5. الشكل 5 أ يظهر من ملامح التباين (المسيحي) رقم نسخة على نطاق الجينوم المتولدة من PC3 مقارنة استخدام seq هلام أو فعل الإعدادية مكتبة الجامعة-الجينوم قياسية (أنبوب التحكم). كل نقطة عدد يعني بن تم تسويتها؛ يتم تعريف صناديق من بيانات الجينوم مرجع له كل بن تساوي العد المتوقعة في خلية ضعفاني صحية، أي، خط مسطح، يمثل نسخاً متساوية لكل منطقة في كل جسمي (باستثناء X و Y) الكروموسومات. PC3 يحتوي على نسخ متعددة من نفس المناطق التي تظهر كطفرات أعلاه عدد نسخ خلفية اثنين. هلام-seq غلة صورة متعددة مماثلة نوعيا كرد فعل أنبوب القياسية. ويمكن تقييم الاتفاق بين قطعتي كمياً بالانحدار الخطي، كما هو مبين في لوحة ب ارتباط بيرسون من R = 0.90 يشير إلى أن الجينوم البيانات التي تم جمعها من الأسلوب أما ما يعادل وظيفيا.
الشكل 5 . مكتبة التحقق من الصحة- هلام-seq للتحقق من صحة الجينوم (A و B) وترانسكريبتوميك (جيم ودال وهاء) البيانات التي تم إنشاؤها من الخلايا PC3 والحلة. تظهر لوحة بمقارنة على نطاق الجينوم الذي التشكيلات الجانبية المتولدة من PC3 استخدام هلام-seq (جل-seq) أو فعل قياسية (أنبوب). معبد = متوسط الفرق العشوائية المطلقة. لوحة ب انحدار خطي بين العينتين في الفريق A، مع R = 0.90 التي تشير إلى بيانات الجينوم معادلة وظيفيا. إظهار المحاور بن تطبيع log2 التهم. لوحات ج ود مقارنة البيانات ترانسكريبتوميك من الخلايا PC3، مع كل نقطة عرض عد في نصوص كل كيلوباسي كل مليون (TPM). المحاور تظهر المقارنة بين عينتين ك log2 طبعت نسخة التهم الموجهة إليه. تظهر لوحة ج مقارنة replicates التقنية التي تم إنشاؤها باستخدام seq هلام، ويبين "د الفريق" يوضح مقارنة بين seq جل والتقليدي ه الفريق ما يليها الجيش الملكي النيبالي أن جل seq يمكن حل نوع الخلية استناداً إلى الجيش الملكي النيبالي التعبير استخدام تحليل مكونات رئيسية. وتبين أن محور س حسابات العنصر الرئيسي الأول 91.6 في المائة من الاختلاف بين العينات بينما المحور y وتبين أن الحسابات المكون الرئيسي الثاني 6.5 في المائة فقط من الفرق. استنسخت أجزاء من هذا الرقم من الرقم 7 بإذن من "المجتمع الملكي للكيمياء". الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
وبالمثل، نحن مقارنة البيانات ترانسكريبتوميك من بروتوكولنا جل seq في بروتوكول Seq الذكية في أنبوب القياسية. ويبين الشكل 5 العلاقة المتبادلة بين كلا replicates هلام seq التقنية (الشكل 5ج) وبين جل seq واﻷسلوب القياسي (الشكل 5د). كل نقطة يتم عد في نصوص كل كيلوباسي كل مليون (TPM) لكل الجينات التي تم اكتشافها في TPM > 5 في مجموعات البيانات على حد سواء. يتم إظهار التراجع الخطي كخطوط حمراء، ومعامل ارتباط Pearson يظهر في الزاوية اليسرى العليا. Replicates التقنية من جل seq اتفق (R ∼ 0.8)، ولكن ترتبط أقل بالطريقة المعتادة (R < 0.7). وهذا يوحي بأن جل seq يدخل تحيز في تهم بالجينات. ولحسن الحظ، هذا التحيز المنهجي، وكما يتبين من خلال تحليل العنصر الرئيسي في الشكل 5ه، لا يزال يمكن استخلاص استنتاجات ذات مغزى بين العينات البيولوجية المختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وهناك العديد من الخطوات الهامة المرتبطة بتصنيع جهاز seq هلام، فضلا عن البروتوكول نفسه. أثناء التصنيع، ونحن نوصي بدءاً بسمك الطبقة المحددة لمختلف المناطق من الجل. قضينا قدرا كبيرا من الوقت في اختبار خيارات مختلفة من تلفيق والبروتوكول الموصوفة هنا ينتج أفضل الأجهزة لأشرطة الكاسيت المدرجة في الجدول للمواد والمواد الكاشفة. إذا كان الباحثون استخدام نظام كاسيت بديلة، قد وجدوا أنها ضرورية للقرص وحدات التخزين المستخدمة عند إنشاء الأجهزة. أن التحدي الرئيسي في تصنيع أنه إذا المنطقة جل عالي الكثافة كبيرة جداً ويمكن ديلاميناتي من الحواف للكاسيت وإنشاء جيوب هوائية في داخل الكاسيت التي سوف تخل بالتفريد. بصب عدة أشرطة مع عدة وحدات تخزين طبقة مختلفة، الباحثين ينبغي أن يكون قادراً على تحديد التكوين الأمثل للأجهزة الخاصة بهم بسرعة.
وقد جل-تسلسل البروتوكول أيضا العديد من الخطوات الحاسمة التي يمكن التحقق من صحتها قبل اكتمال البروتوكول. نقطة الفشل المحتملة واحد هو الفصل بين جدنا والجيش الملكي النيبالي/كدنا الهجينة. وهذا يمكن التحقق من صحتها بالتصوير الجهاز seq جل بعد الانفصال (انظر الشكل 3ب). في مجموعة واحدة من التجارب، وجدنا أن إمداداتنا مختبر من المخزن المؤقت قد تصبح ملوثة بالحمض النووي وكان يسبب أوتوفلوريسسينسي كبيرة في الجهاز لدينا (انظر الشكل 3د). وهذا يجعل من الصعب على تحديد إذا كان الفصل قد حدثت. التصوير الفلورسنت ساعدتنا على تحديد وتصحيح هذه المشكلة قبل استخدام أي من الكواشف باهظة التكلفة لإنشاء مكتبات التسلسل.
نقطة هامة أخرى هي الخطوة 6.2، التضخيم qPCR لكدنا بعد الانفصال. الباحثون وينبغي إيلاء اهتمام دقيق ليس أوفيرامبليفي في هذه الخطوة، فإنه سوف يقلل من جودة البيانات تسلسل الحمض النووي الريبي. هذا الاعتبار ليست فريدة من نوعها لجل seq، لكن جانبا مشتركة لإعداد مكتبة تسلسل الحمض النووي الريبي المدخلات المنخفضة. [بكر] تضخيم أثناء تسلسل إعداد مكتبة غالباً ما اللازمة، ولكن فإنه يمكن إدخال تسلسل الأخطاء والتحيز. العدد المطلوب من دورات ل PCR يعتمد على كمية العينة والتعقيد. فمن المستحسن عموما إلى الحد من عدد دورة PCR إلى الحد الأدنى المطلوب تسفر عن تجميع كافية عندما يتم تعيين تسلسل المكتبات. ومن الناحية النظرية، يمكن أن يكون بروتوكول الأمثل لتحديد عدد دورة الدقيقة التي تسفر عن عدد كاف من النسخ دون إدخال القطع المفرط. في الممارسة العملية، بيد أوجه عدم الاتساق في نوعية العينة، تحميل، أو التعامل مع مطلع عام البروتوكول يمكن هائلة تؤثر على توزيع الجزيئية القوالب المتوفرة للمكتبة الإعدادية بكر، الذي بدوره يؤثر على عدد دورة بكر الأمثل. الحل الأكثر عمومية وقد وجدنا لرصد التقدم المحرز في ردود فعل التضخيم باستخدام صبغة فلورسنت، تشغيل ردود الفعل على ثيرموسيكلير بكر في الوقت الحقيقي، والتوقف عن ردود الفعل في إس (الخطية مقابل عدد دورة) المرحلة. في تجربتنا، رصد في الوقت الحقيقي ذات أهمية خاصة عند وضع أو تكييف أو اعتماد بروتوكول جديد.
الخطوة الحاسمة الأخيرة هو توليد الجينوم والمكتبات ترانسكريبتوميك. المفتاح لهذه الخطوة لتعيين تركيز عينة انطلاق لرد فعل الإعدادية مكتبة الحمض النووي أقرب إلى 0.2 نانوغرام/ميليلتر (0.5 نانوغرام المجموع) قدر الإمكان. هذا بسيط نسبيا لكدنا qPCR تتضخم عادة ما يكون هناك فائض في كدنا، ولكن يمكن أن يكون أكثر صعوبة للعينات جدنا. ووجدنا عناية الانتباه إلى الخطوة فاكوفوجي كان المطلوب في حين تركزت العينات. كما هو متوقع، في تجارب مع خلايا 1000، والخطوة فاكوفوجي يمكن وقف الكثير عاجلاً من التجارب مع 100 الخلايا. عدد العينات في فاكوفوجي أثرت أيضا أن معدل التبخر في تجاربنا. وجدنا أن استخدام فلوروميتير للتحقق من الحمض النووي من المحتوى في منتصف الطريق من خلال هذه الخطوة تركيز يمكن أن تكون مفيدة عند تنفيذ البروتوكول مع عينات غير مألوف. لحسن الحظ، إذا كانت المياه الباحثين على مدى تركيز عينة، نوكلاس الحرة يمكن أن تضاف إلى تمييع العينة. نظرياً، من الممكن أن تستخدم في فاكوفوجي الجاف للحمض النووي وثم ريسوسبيند أنه في وحدة التخزين المطلوبة؛ ومع ذلك، فإننا نقترح تجنب التبخر كاملة.
ونرى ثلاثة الأساليب الحالية لتوليد مكتبات الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي المتزامنة، جل seq7، ز & T-seq8، والدكتور seq9، المجاملة. هلام-seq مثالية للعينات في نطاق الخلية 100-1000 ولا يتطلب أي أهداف المنسدلة أو المعرفة مسبقاً من الجينوم. طريقتين أخرى أكثر ملاءمة لتطبيقات خلية مفردة. وكان من أهدافنا في تطوير هلام seq إنشاء بروتوكول التي يمكن تنفيذها بسهولة من الباحثين الآخرين. ولذلك قررنا أن اختﻻق أجهزة داخل عامل النموذج القياسي لكاسيت جل polyacrylamide. بينما الأسلوب يمكننا استخدامه لتعريف لدينا الأغشية المختلفة رواية، معظم مختبرات علم الوراثة لديها بالفعل جميع المعدات اللازمة لاختلاق الجهاز جل seq. وعلاوة على ذلك، أن تكلفة الجهاز تافهة-5.25 دولار فقط لجهاز الذي يمكنه معالجة العينات 12. وقال أنه كما مع أي بروتوكول إعداد المكتبة باستخدام الكواشف التجارية، التكلفة الإجمالية لإنشاء مكتبات لا يزال مرتفعا. وكان لدينا تكلفة كاشف كل عينة 50 دولاراً لتضخيم كل نسخة و 28 دولار لإعداد مكتبة للحمض النووي والجيش الملكي النيبالي. لحسن الحظ، هو الجهاز seq هلام نفسها الملحد البروتوكول. على سبيل المثال، أثناء التطوير ونحن اختبرت بنجاح الجهاز باستخدام خلايا من الثقافة و كبار الجيش الملكي النيبالي مكتبة تضخيم بروتوكول19، على الرغم من أننا وجدنا أنه لم يكن مناسباً لعينات الأنسجة من الفئران. التطلع إلى المستقبل، كما يجري تطوير بدائل أرخص لإعداد مكتبة، لدينا بروتوكول يمكن تكييفها للعمل مع هذه التقنيات الجديدة. نعتقد أن الباحثين سوف تجد أنها واضحة لتنفيذ جل seq في المعامل الخاصة بهم. نأمل أن هذا سوف ييسر الإسراع في اعتماد التكنولوجيا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
كز هو مؤسس والمستشار العلمي لشركة سينجليرا علم الجينوم
Acknowledgments
وكان التمويل اللازم لهذا العمل المقدمة من جامعة سان دييغو، "البرنامج الوطني للعلوم مؤسسة الدراسات العليا بحوث الزمالة"، المعاهد الوطنية للصحة منح R01-HG007836، وعن طريق الوزارة الكورية للعلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات وتخطيط المستقبل.
الإصدارات السابقة من عدد من الشخصيات كانت نشرت لأول مرة في "و Hoople، زاي د et al. هلام-seq: الجامع-الجينوم وتسلسل الترنسكربيتوم عن طريق المتزامنة ذات المدخلات المنخفضة الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي مكتبة الإعداد باستخدام الحواجز المائية شبه نفاذه. مختبر في 17 رقاقة، 2619-2630، doi:10.1039/c7lc00430c (2017). " وقد يعاقب مختبر على رقاقة إعادة استخدام الأرقام الواردة في هذا المنشور.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Acrylamide Monomer | Sigma Aldrich | A8887-100G | |
| Ammonium Persulfate | Sigma Aldrich | A3678-25G | |
| Ampure XP Beads | Beckman Coulter | A63880 | Referred to in the text as solid phase reversible immobilization (SPRI) beads |
| DNA Gel Loading Dye (6x) | ThermoFisher Scientific | R0611 | Referred to in the text as 6X loading dye |
| Ethyl alcohol | Sigma Aldrich | E7023-500ML | |
| KAPA SYBR FAST One-Step qRT-PCR Kits | Kapa BioSystems | 7959613001 | Referred to in the text as 2X qPCR mix |
| N,N′-Methylenebis(acrylamide) | Sigma Aldrich | 146072-100G | Also known as bis-acrylamide |
| NexteraXT DNA Library Preparation Kit (referred to in the text as library preparation kit) | Illumina | FC-131-1024 | Includes: TD (referred to in the text as transposase buffer), ATM (referred to in the text as transposase), NT (referred to in the text as transposase stop buffer), and NPM (Referred to in the text as library prep PCR mix) |
| Nuclease Free Water | Millipore | 3098 | |
| Protease | Qiagen | 19155 | |
| SMART-Seq v4 Kit (referred to in the text as whole-transcript amplification (WTA) kit) | Takara/Clontech | 634888 | Includes: Lysis buffer, RNase inhibitor, 3’ SMART-Seq CDS Primer II A (referred to in the text as RT primer), 5X Ultra Low First Strand Buffer (referred to in the text as first strand buffer), SMART-Seq v4 Oligonucleotide (referred to in the text as template switch oligonucleotide (TSO)), SMART-Scribe Reverse Transcriptase (referred to in the text as reverse transcriptase), and PCR Primer II A (referred to in the text as cDNA PCR primer) |
| Random hexamer with WTA adapter | IDT | n/a | 5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC-NNNNNN-3′ |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389-500G | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281-25ML | |
| DNA AWAY Surface Decontaminant | ThermoFisher Scientific | 7010PK | Referred to in the text as DNA removal product |
| Tris-Borate-EDTA buffer (10X concentration) | Sigma Aldrich | T4415-1L | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000X Concentrate in DMSO) | ThermoFisher Scientific | S11494 | Referred to in the text as gel stain |
| Equipment | |||
| BD Precisionglide syringe needles, gauge 18 | Sigma Aldrich | Z192554 | Any equivalent hardware is acceptable |
| Branson CPX series ultrasonic bath | Sigma Aldrich | Z769363 | Any equivalent hardware is acceptable |
| Empty Gel Cassettes, mini, 1.0 mm | ThermoFisher Scientific | NC2010 | Any equivalent hardware is acceptable |
| Mesh Filter Plate - Corning HTS Transwell 96 well permeable supports - 8.0 µm pore size | Sigma Aldrich | CLS3374 | Referred to in the text as 8 um mesh filter plate |
| PowerPac HC Power Supply | Bio-Rad | 1645052 | Any equivalent hardware is acceptable |
| Qubit Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33216 | Any equivalent hardware is acceptable |
| Vacufuge Concentrator | Eppendorf | 22822993 | Any equivalent hardware is acceptable |
| XCell SureLock Mini-Cell system | ThermoFisher Scientific | EI0001 | Any equivalent hardware is acceptable |
| Bio-Rad CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855195 | Any equivalent hardware is acceptable |
| Amersham UVC 500 Ultraviolet Crosslinker | GE Healthcare Life Sciences | UVC500-115V | Discontinued, any equivalent hardware is acceptable |
| Gel Doc XR+ Gel Documentation System | Bio-Rad | 1708195 | Referred to in the text as gel imager |
| Dark Reader Transilluminator | Clare Chemical Research | DR89 | Referred to in the text as UV transilluminator |
| Ultrasonic Bath | Bransonic | 1207K35 | Any equivalent ultrasonic bath is acceptable. |
References
- Mawy, T. Single-cell sequencing. Nat Methods. 11 (1), 18 (2014).
- Gole, J., et al. Massively parallel polymerase cloning and genome sequencing of single cells using nanoliter microwells. Nat Biotech. 31 (12), 1126-1132 (2013).
- Sasagawa, Y., et al. Quartz-Seq: a highly reproducible and sensitive single-cell RNA-Seq reveals non-genetic gene expression heterogeneity. Genome Biol. 14 (4), 31 (2013).
- Ramsköld, D., et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol. 30 (8), 777-782 (2012).
- Shapiro, E., Biezuner, T., Linnarsson, S. Single-cell sequencing-based technologies will revolutionize whole-organism science. Nat Rev Genet. 14 (9), 618-630 (2013).
- Navin, N., et al. Tumour evolution inferred by single-cell sequencing. Nature. 472 (7341), 90-94 (2011).
- Hoople, G. D., et al. Gel-seq: whole-genome and transcriptome sequencing by simultaneous low-input DNA and RNA library preparation using semi-permeable hydrogel barriers. Lab Chip. 17, 2619-2630 (2017).
- Macaulay, I. C., et al. G&T-seq: parallel sequencing of single-cell genomes and transcriptomes. Nat Methods. 12 (6), 519-522 (2015).
- Dey, S. S., Kester, L., Spanjaard, B., Bienko, M., van Oudenaarden, A. Integrated genome and transcriptome sequencing of the same cell. Nat Biotechnol. 33 (3), 285-289 (2015).
- Gopal, A., Zhou, Z. H., Knobler, C. M., Gelbart, W. M. Visualizing large RNA molecules in solution. RNA. 18 (2), 284-299 (2012).
- SDS-PAGE Gel. Cold Spring Harb Protoc. 2015 (7), 087908 (2015).
- Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352 (6293), at http://science.sciencemag.org/content/352/6293/1586 (2016).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
- Qubit 3.0 Fluorometer Manual. MAN0010866. Life Technologies. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/qubit_3_fluorometer_man.pd (2017).
- Vitak, S. A., et al. Sequencing thousands of single-cell genomes with combinatorial indexing. Nat Methods. 14 (3), 302-308 (2017).
- A Guide to Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Detection. Bulletin 6040 Rev B. Bio Rad. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6040.pdf (2017).
- Illumina. Nextera ® XT DNA Library Preparation Kit. , (2017).
- Takara Bio USA Inc. SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit for Sequencing User Manual. , (2016).
- Kurimoto, K., Yabuta, Y., Ohinata, Y., Saitou, M. Global single-cell cDNA amplification to provide a template for representative high-density oligonucleotide microarray analysis. Nat Protoc. 2 (3), 739-752 (2007).
