Gel-seq: En metode for samtidige sekvensering biblioteket utarbeidelse av DNA og RNA bruker Hydrogel matriser

Summary

Gel-seq kan forskere samtidig forberede biblioteker for begge DNA - og RNA-seq ubetydelig ekstra kostnad fra 100-1000 celler ved hjelp av en enkel hydrogel enhet. Dette dokumentet presenterer en detaljert tilnærming til fabrikasjon av enheten samt biologiske protokollen for å generere sammenkoblede biblioteker.

Abstract

Muligheten til å forsterke og sekvensielt DNA eller RNA fra små start utvalg er bare oppnådd de siste fem årene. Dessverre standardprotokoller for generering genomisk eller transcriptomic biblioteker er inkompatible og forskere må velge om du vil sekvens DNA eller RNA for en spesiell prøve. Gel-seq løser dette problemet ved å aktivere forskere samtidig forberede biblioteker både DNA og RNA starter med 100-1000 celler ved hjelp av en enkel hydrogel enhet. Dette dokumentet presenterer en detaljert tilnærming til fabrikasjon av enheten samt biologiske protokollen for å generere sammenkoblede biblioteker. Vi designet Gel-seq slik at det lett kan implementeres av andre forskere; mange genetikk labs har allerede det nødvendig utstyret for å reprodusere Gel-seq apparat fabrikasjon. Våre protokollen bruker brukte Kit for både hel-transkripsjon forsterkning (WTA) og biblioteket forberedelse, som også er sannsynlig å være kjent for forskere allerede bevandret i generere genomisk og transcriptomic biblioteker. Vår tilnærming kan forskere å få til å bære kraften i både DNA og RNA sekvensering på et enkelt utvalg uten deling og med ubetydelig ekstra kostnad.

Introduction

Neste generasjons sekvensering (NGS) har hatt en betydelig innflytelse på måten genetikk forskning er utført. Der forskere når fokusert på sekvensering genomet av en hel Art, er det nå mulig å sekvens genomet av en enkelt svulst eller selv en enkeltcelle i ett eksperiment. ¹ NGS har også gjort det kostnadseffektivt å sekvens RNA transkripsjoner funnet i en celle, en samling av data kjent som transcriptome. Muligheten til å forsterke og sekvensielt DNA eller RNA fra små start utvalg er bare oppnådd de siste fem årene. ^{2 , 3 , 4} dessverre standardprotokoller er inkompatible og forskere må velge om du vil sekvens DNA eller RNA for et gitt utvalg. Når en første prøve er stor nok, kan det deles i to. På mindre skalaer, men tap av materiale på grunn av deling prøver kan påvirke biblioteket kvalitet, og av prøver kan jevne ut interessante variasjoner mellom celler. ⁵ videre forskere er stadig mer interessert i å undersøke prøver som ikke kan deles, for eksempel enkeltceller eller liten heterogene svulst biopsier. ⁶

For å løse dette problemet, tre protokoller har nylig blitt bebygget for å sekvens både DNA og RNA fra samme Start eksempel: Gel-seq⁷G & T-seq⁸og DR-seq⁹. Denne artikkelen presenterer en detaljert protokoll for Gel-seq, som kan brukes samtidig generere DNA og RNA biblioteker fra så lite som 100 celler ubetydelig ekstra kostnad. Romanen aspekt av Gel-seq er evnen til å skille DNA og RNA basert på størrelse med lavpris hydrogel matriser. I kjernen av Gel-Seq-protokollen er fysisk separasjon av DNA fra RNA. Denne separasjon er oppnådd electrophoretically med en kombinasjon av polyakrylamid membraner som utnytter størrelse forskjellene mellom disse molekyler. For å sette disse størrelse forskjeller i sammenheng, vurdere hvordan DNA og RNA er avbildet: mens DNA finnes på mikro-skala og kan vises ved hjelp av tradisjonelle mikroskop, RNA finnes på nanometer skala og må avbildes bruker komplekse teknikker som cryo-elektron mikroskopi. ¹⁰

Tilnærming til skille DNA og RNA i denne protokollen er vist i figur 1. Informasjonsvinduet viser DNA og RNA fri flyt i løsning nær en membran. Når et elektrisk felt brukes, som vist i panelet til høyre, oppleve DNA og RNA en electrophoretic kraft som induserer migrasjon gjennom membranen. Ved å justere egenskapene membran, har vi opprettet et halvt gjennomtrengelig membran som skiller DNA fra RNA. DNA-molekyler er skjøvet mot membranen, men ettersittende ytterst på grunn av den store filstørrelsen. Små RNA molekyler, derimot, kan konfigurere og veve seg gjennom membranen. Denne prosessen kalles reptation, ligner måten en slange beveger seg gjennom gresset. Slutt disse RNA molekyler er stoppet av en andre, høy tetthet membran som er for vanskelig for enda mindre polymerer (> 200 base parene) å vri seg gjennom. Når fysisk skilt, kan DNA og RNA gjenopprettet og behandles for å generere informasjon om både genomet og transcriptome. Mens vi kan skille DNA og RNA, har vi funnet bedre resultater er oppnådd hvis RNA er omvendt transkribert til cDNA før separasjon. CDNA/RNA hybrider er mer stabile enn RNA alene og kan fortsatt passere gjennom lav membran.

Figur 1 . Gel-seq drift prinsippet. Underliggende prinsippet fysisk mellom DNA og RNA. I en anvendt elektrisk felt, små RNA molekyler overføre gjennom lav membran men store DNA molekyler er fanget på overflaten. Dette tallet ble reprodusert Ref. 7 med tillatelse fra Royal Society of Chemistry. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Dette dokumentet beskriver i detalj både fabrikasjon av Gel-seq enheten og biologiske protokollen for å generere sammen DNA og RNA biblioteker. En oversikt over begge vises i figur 2. Enheten er fabrikkert av lagdeling tre forskjellige tetthet polyakrylamid gels oppå hverandre i en prosess som ligner til å skape standard stabling gels. ¹¹ biologiske protokollen starter med 100-1000 celler suspendert i PBS. Cellene er lysed og RNA konverteres til cDNA før enheten brukes til å skille genomisk DNA fra cDNA/RNA hybrider. Etter separasjon og utvinning, genomisk og transcriptomic lages biblioteker av en prosess som følger tett hele-genome standardbiblioteket forberedelse kit protokollen. Ytterligere detaljer om utvikling og validering av Gel-seq kan leses i laboratoriet med en Chip publikasjon "Gel-seq: hele-genom og transcriptome sekvensering av samtidige lav-input DNA og RNA biblioteket forberedelse på halvt gjennomtrengelig hydrogel barrierer ." ⁷

Figur 2 . Gel-seq protokollen. En oversikt over trinnene for å dikte Gel-seq enheten og protokollen generert sammen DNA og RNA biblioteker. Deler av dette tallet ble reprodusert Ref. 7 med tillatelse fra Royal Society of Chemistry. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Vil generere DNA og RNA biblioteker fra enkeltceller, forskere bør vurdere å bruke enten G & T-seq eller DR-seq. G & T-Seq, som Gel-seq, avhengig av en fysisk separasjon av fra genomisk DNA. Denne tilnærmingen er avhengig av budbringer RNA (mRNA) 3 polyadenylated halen som rullegardin mål. MRNA fanges opp på en magnetisk perle ved hjelp av en biotinylated oligo-dT primer. Når mRNA har blitt fanget perlene holdes på plass med en magnet og nedbryting inneholder genomisk DNA kan fjernet og overført til en annen tube. Når denne fysisk separasjon er fullført, kan separat biblioteker genereres fra mRNA og DNA. ⁸ denne tilnærmingen fungerer godt hvis RNA rundt polyadenylated, men den kan ikke brukes til å studere ikke-polyadenylated utskrifter, for eksempel ribosomal RNA, tRNA eller RNA fra prokaryoter.

DR-seq er avhengig av en før forsterkning trinn der både DNA og cDNA avledet fra RNA er forsterket i samme rør. Prøven er deretter delt i to og behandles parallelt å forberede DNA og RNA seq biblioteker. Du kan skille mellom genomisk DNA og cDNA avledet fra RNA, tar DR-seq en beregningsorientert tilnærming. Sekvenser hvor bare exons finnes undertrykt beregningsmessig i genomisk DNA data, som de kan ha sin opprinnelse fra DNA eller RNA. ⁹ en fordel med denne tilnærmingen er at DNA og cDNA/RNA ikke trenger være fysisk atskilt som er gjort i Gel-seq og G & T-seq. Ulempen er imidlertid at DR-seq krever en priori kunnskap om genomet og transcriptome (dvs., exons versus introns), og kan ikke være perfekt for programmer som sekvensering av kjerner, der mange transkripsjoner ikke er ennå fullt skjøtes og fremdeles inneholde introns. ¹²

Romanen aspekt av Gel-seq er muligheten til å skille DNA og RNA i hundrevis av cellene basert på størrelse. Denne metoden krever ikke en priori kunnskap om genomet eller transcriptome, er robuste mot ufullstendig skjøting, og er ikke begrenset til poly-adenylated utskrifter. For applikasjoner der en forsker kan starte med minst 100 celler, gir Gel-seq en enkel tilnærming med billig og lett tilgjengelig.

Protocol

1. kjemisk løsning forberedelse

Merk: Følgende er for å forberede kjemiske lobbyer i senere trinn. Dette kan gjøres i bulk og lagret i flere måneder.

1. For å begynne, forberede 50 mL av renset, deionisert vann ved sterilisering i en 254 nm UV crosslinking ovnen i 15 minutter (15 mJ/cm² total eksponering) for å nøytralisere eventuelle skadelige DNA. Varme 37 ° c for bruk i følgende.
2. Gjøre 10 mL av en 40% total (T) og 3,3% crosslinker (C) (29:1) polyakrylamid forløper løsning. Veie 3.867 g av akrylamid monomer og 0.133 g bis-akrylamid monomer. Kombinere og få volum opp til 10 mL med renset vann og vortex til oppløst. Lagre beskyttet fra lys ved romtemperatur.
   Merk: Ferdigblandet 40% T, 3,3% C (29:1) polyakrylamid løsninger kan kjøpes kommersielt.
3. Gjøre 10mL av 50% T, 5% C gel løsning. Veie 4.750 g av akrylamid monomer og 0.250 g bis-akrylamid monomer. Kombinere og få volum opp til 10 mL renset vann og vortex til oppløst. Lagre beskyttet fra lys ved romtemperatur.
4. Gjøre 10 mL av en 50% (w/v) sucrose løsning. Legg 5 g sukrose til en uteksaminert sylinder og Legg renset vann til et totalt volum på 10 mL. Vortex til oppløst og butikken ved romtemperatur.
5. Gjøre 10 mL av 10% APS (w/v). Legge 1 g av ammonium persulfate (APS) til en uteksaminert sylinder. Legge til kalde (~ 4° C) renset vann til et totalt volum på 10 mL og vortex til oppløst. Umiddelbart fryse i dele 200 µL.

2. gel-seq kassett fabrikasjon

Merk: Gel-seq ble opprinnelig utviklet med oppreist kassetter (se Tabell for materiale for mer informasjon); men kan denne protokollen tilpasses til å arbeide med alle standard gel geleelektroforese kassett.

1. Forberede gel forløpere i tre separate plast rør ved å legge reagenser som vist nedenfor i tabell 1. Ikke enten APS eller Tetramethylethylenediamine (TEMED) til rettet i fremgangsmåten. Vortex ingredienser til bland godt.

Filler Gel forløper		Høy tetthet Gel forløper		Lav tetthet Gel forløper
40 %T, 3.3%C akrylamid Bisacrylamide løsning	1.6 mL	50 %T, 5 %C akrylamid Bisacrylamide løsning	2.4 mL	40 %T, 3.3%C akrylamid Bisacrylamide løsning	0,6 mL
Deionisert vann	10.2 mL	Deionisert vann	1,0 mL	Deionisert vann	4.8 mL
Sucrose løsning (50% w/v)	2.6 mL	Sucrose løsning (50% w/v)	0,6 mL
10 X Tris-Borate-EDTA	1.6 mL			10 X Tris-Borate-EDTA	0,6 mL
Ammonium persulfate (10% w/v)	104.0 ΜL	Ammonium persulfate (10% w/v)	50.0 ΜL	Ammonium persulfate (10% w/v)	39.0 ΜL
TEMED	6.0 ΜL	TEMED	1.0 ΜL	TEMED	2.2 ΜL
Totalt volum	16,1 mL	Totalt volum	4.1 mL	Totalt volum	6.0 mL

Tabell 1. Gel syntese reagenser. Polyakrylamid gel forløper reagenser tilstrekkelig for fabrikasjon av 2 kassetter.

2. De gass gel monomer løsninger ved å stikke en nål gjennom hetten av røret og koble denne p til huset vakuum linje. Senk denne samlingen i en ultralydbad satt til høy og vent til bobler stoppe nye fra væsken før neste trinn (~ 60 sekunder / rør).
   Merk: Kvaliteten på vakuum og kraften i ultralydbad er ikke kritisk så lenge bobler kan sees som kommer ut av løsningen.
3. Legg TEMED og APS filler gel forløper og vortex kort. Umiddelbart legge 6 mL av filler gel forløperen til hver gel kassett av pipettering løsningen på toppen av kassetten. Bruk 1 mL brønnene forløperen i seks trinn å unngå søl. Total tid for dette trinnet bør være mindre enn 3 minutter.
4. Kontroller væsken er nivået av posisjonering kassettene stående på et nivå bord. Fylle resten av kassetten med degassed deionisert vann. Pipetter vannet, igjen med 1 mL intervallene, sakte inn i sentrum av kassetten for å minimere miksing. Tillate polymer Cure for minst en time, opp å over natten.
5. Etter at polymer har helbredet, invertere gel kassettene over en vask fjerne vann overlegget. En trykkluft-pistol kan brukes å forsiktig tørke grensesnittet ved å blåse luft gjennom topp åpningen av kassetten fra en avstand på 6 tommer.
6. Legg TEMED og APS høy tetthet gel forløper og vortex kort. Umiddelbart legge 320 µL av høy tetthet forløperen til kassetten, igjen med en 1 mL pipette. Sikre væsken jevnt strøk filler gel laget av rocking kassetten og tilbake rundt 3 ganger. Dette trinnet bør ta mindre enn tre minutter.
7. Fylle resten av kassetten med degassed deionisert vann. Pipetter sakte med en 1 mL pipette i midten av kassetten for å minimere miksing. Tillate polymer Cure minst femten minutter, fortrinnsvis time.
8. Igjen, invertere gel kassettene å fjerne vann overlegget. Trykkluft kan brukes å forsiktig tørke grensesnittet. Legg TEMED og APS lav tetthet gel forløper og vortex kort. Umiddelbart fylle resten av kassetten (~1.65 mL) med lav tetthet gel forløperen og sett gel kammen.
9. Pipetter et overskudd av reserve forløper øverst på kammen som det vil bli absorbert i polymerisasjon. Tillate polymer å kurere minst 4 timer, helst over natten. Gels kan lagres i en uke eller mer i en buffer med Tris-Borate-Ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) (TBE buffer).

3. eksempel forberedelse og reversere transkripsjon

1. Begynner med en suspensjon av cellene rundt, og arbeider i polymerase kjedereaksjon (PCR) laminær strømning hette, bruke en hemocytometer eller en automatisk celle teller for å beregne celle konsentrasjonen. Fortynne cellene til en konsentrasjon av 100-1000 celler per µL i fosfat-bufret saltvann (PBS).
   Merk: Denne protokollen er validert på et celleområde inkludert PC3, jakten og mus leveren celler.
2. Reagenser i WTA kit (se Tabell for materiale), blanding 19 µL av lyseringsbuffer og 1 µL av RNase hemmer å forberede en 10 X lagerløsning reaksjon bufferen. Opprette en lysis master blanding av tilstrekkelig volum som inneholder 0,5 µL reaksjon bufferen og 2,75 µL nuclease gratis vann for hvert utvalg.
3. Pipetter celle suspensjon opp og ned 5 ganger å suspendere utlignede celler og deretter Pipetter 1 µL av prøve i et 200 µL nuclease gratis strip rør sterilisert av UV. Gjenta etter behov avhengig av antallet eksempler. Husk å ta en negativ kontroll av pipettering 1 µL nuclease gratis vann i stedet for celler for en reaksjon. Deretter legge 3,25 µL lysis master Mix til hvert utvalg og blande av pipettering forsiktig opp og ned 5 ganger.
4. Forvarm en termisk cycler (med oppvarmet lokk) til 72 ° C. Legg 1 µL av RT primer og 1 µL av 20 µM tilfeldig praktiske med WTA kort (5 '-AAGCAGTGGTAT-CAACGCAGAGTAC-NNNNNN-3) til hvert utvalg. Reserver minst en tube som en positiv for gDNA biblioteket forberedelse og legge 2 µL av vann i stedet for primere.
   Merk: Tilfeldig praktiske med WTA adapter er valgfri og har minimal påvirkning på sekvensering resultater.
5. Inkuber samples ved 72 ° C i forvarmet termisk cycler i 3 minutter til lyse cellene. Fjerne celler fra termisk cycler og sted på isen i 2 minutter. Lagre positiv kontrollen på 4 ° C til trinn 5.
6. Cellene er lysing, opprette et tilstrekkelig antall omvendt transkripsjon master blanding for alle RNA utvalg som inneholder følgende reagens forholdstallene: 2 µL første strand bufferen, 0,5 µL av malen bryteren oligonucleotide (TSO), 0,25 µL av RNase hemmer og 1 µL av revers transkriptase (100 U/µL).
7. Forvarm termisk cycler til 42 ° C. Legge til 3.75 µL av omvendt transkripsjon master mix gjenværende prøvene, bringe totale eksempel volumet til 10 µL. blanding av pipettering opp og ned 5 ganger.
8. Utføre omvendt transkripsjon ved umiddelbart å plassere prøver i en forvarmet termisk cycler. Kjøre følgende program: 42 ° C i 90 min., 70 ° C i 10 min, 4 ° C alltid. Dette er en trygg sluttpunkt.

4. gel separasjon og gjenoppretting

1. Rengjør en gel geleelektroforese kammer via en DNA fjerning produktet. Bruke flere mL til flytende rengjøringsmiddel disponibel lo gratis tørke og tørk på alle overflater av kammeret, og deretter fylle kammeret med ren 0,5 x TBE. For optimale resultater, plassere hele apparatet i 254 nm UV crosslinking ovn og sterilisere i 15 minutter (15 mJ/cm²).
2. Gel-seq kassetten inn gel geleelektroforese kammer og lås det på plass. Fjern sakte gel kammen ved å trekke rett opp. Gå sakte å unngå rive gel eller rippe noen av armene.
3. Holde prøvene fra trinn 3 på is, reserver minst ett utvalg som en positiv for cDNA biblioteket generasjon. Lagre denne kontrollen på 4 ° C til trinn 6. Legg 2 µL av 6 X lasting fargestoff til gjenværende prøvene, bringe det totale volumet til ~ 12 µL. grundig blande prøvene av pipettering opp og ned 5 ganger.
4. Kombiner 1 µL av en DNA stige med 2 µL av 6 x lasting fargestoff og 7 µL av vann. Pipetter denne blandingen i lane 1 av Gel-seq kassetten som en geleelektroforese-kontroll. Pipetter prøvene fra det tidligere trinnet i separate felt av Gel-seq kassetten. Være forsiktig for å unngå forurens mellom brønner ved å sette inn pipette fullt i hver brønn og fjerne den med bare en vertikal bevegelse.
5. Bruker en standard gel geleelektroforese strømforsyning, bruke et elektrisk felt på 250 V over Gel-seq kassetten i 30 minutter for å skille gDNA fra cDNA/RNA hybrider. Når skilt, fjerner Gel-seq kassetten fra gel geleelektroforese kammeret og åpne de to halvdelene av kassetten ved nysgjerrige kantene med en skraperedskap.
6. Bruker en skalpell, halvert gel bare under høy tetthet laget. Forkaste halvparten som inneholder filler gel ved å plukke den med din gloved hånd. Forsiktig skrelle den gjenværende geléen av kassetten ved skraping det med maling skraper eller andre lignende verktøy. Plasser denne gel i en tallerken med ~ 30 mL 0,5 x TBE med 3 µL av gel flekken.
7. Dekk beholderen for å redusere photobleaching og nyt gel mens forsiktig risting beholderen i 5 minutter. Plasser gel på plastfolie og ta en UV-avbildning ved å bruke en gel dokumentasjon (for ytterligere detaljer se Ref. 13). En 30 sekunds eksponering produserer vanligvis klare bilder. Kontroller at separasjon har oppstått.
8. Flytte gel til en UV transilluminator å lette visualisering av nucleic syrer. Iført passende UV briller, bekrefte resultatene fra gel dokumentasjon systemet. GDNA skal plasseres i begynnelsen av lav tetthet gel og cDNA på grensesnittet i lav og høy tetthet.
9. Bruke en skalpell, kutte ut regionene gel inneholder gDNA og cDNA. Eksempler er best gjenvunnet ved å kutte en 4 mm av 10 mm firkantet del av gel; men avhenger den nøyaktige geometrien gel geleelektroforese systemet brukes. Husk å også kutte kjørefelt lastet med kontrollen negative.
10. Plass hver forbrukeravgift gel i en stripe rør ved hjelp av et par sløv slutten pinsett. Vær forsiktig med å bruke for mye kraft eller gel deles i stykker. Dette skulle skje, plukke opp hver brikke og legge den til røret.
11. Grind gel i hver rør med spissen av en pipette (200 µL pipette tips fungerer bra) ved å flytte pipette spissen på en sirkulær måte mot bunnen av røret. Legg nuclease gratis vann (40 µL i gDNA prøvene og 80 µL i cDNA prøvene) til hver tube før pipette spissen pleide å male gel for å unngå tap av prøven.
12. Sted stripen rør til en vortex mikser i en 37 ° C inkubator og riste for 8-12 timer. Dette gjør nukleinsyrer å spre av gel og er en naturlig stoppestedet for denne multi dag protokollen.
13. Pipetter prøvene i en 8 µm maske filter plate og spinne platen 2600 x g i 5 minutter å stamme ut gel fragmenter. Løft maske filter platen fra bolig platen og Pipetter gel-fritt vann prøvene i en ny 200 µL stripe tube.
14. Legge til 1 µL av protease (0.9 AU/mL) i hvert eksempel som inneholder gDNA, bland godt av pipettering opp og ned, og ruge ved 50 ° C i 15 min etterfulgt av en varme inaktivering på 70 ° C i 15 min. Dette trinnet er viktig for tappe nucleosomes og gjør gDNA tilgjengelig for etterfølgende reaksjon trinn.
15. Bruker en 18 gauge nål, poke hull i caps alle eksempel rør. Sett prøvene i en vacufuge å redusere flytende volum. gDNA prøver skal reduseres til 5 µL og cDNA prøver redusert til 10 µL.
16. Avhengig av vacufuge og antall utdrag, vil den totale fordampning variere mellom 30 og 60 minutter. Hvis prøven volumet faller under målet kvantum, å legge nuclease gratis vann for å øke eksempel volumet.

5. gDNA biblioteket forberedelse

1. Bruker en fluorometer eller lignende teknologi, kvantifisere DNA konsentrasjonen i hvert gDNA utvalg fra trinn 4 i tillegg til positive kontrollen fra trinn 3. Se den fluorometer reference manualen for en detaljert protokoll. ¹⁴
2. Fortynne prøvene å 0,2 ng/µL av DNA. Avhengig av Start celle type og kvalitet resultater kreves, kan lave konsentrasjoner fortsatt gi levedyktig biblioteker. Litt eksperimentering vil være nødvendig; men hadde forfatterne suksess med biblioteker så lavt som 0,1 ng/µL.
3. Fullføre gDNA biblioteket forberedelse følger biblioteket forberedelse halv reaksjon volum protokollen i trinn 7.

6. cDNA biblioteket forberedelse

1. Starter med 10 µL cDNA prøver og positiv kontroll fra trinn 4, legge 12.5 µL av 2 X qPCR blanding, 0,5 µL cDNA PCR primer og 2 µL nuclease-fritt vann.
2. Utføre PCR i en sanntids thermocycler ved hjelp av følgende protokollen: hot-start ved 95 ° C i 3 min, etterfulgt av 20-30 sykluser av 98 ° C for 10 s, 65 ° C for 30 s og 72 ° C for 3 min. totale eksempel volum er 25 µL. overvåke reaksjon kurvene og stoppe forsterkning før th e reaksjoner la den eksponentielle fasen (lineær signal økning versus syklus nummer) for å unngå PCR gjenstander på grunn av overamplification. For mer om unngå overamplification, kan du se Drøftingen av denne papir samt Ref. 15.
3. Etter forsterkning, rengjør produktet bruker robust fase reversibel immobilisering (SPRI) perler følger protokollen i trinn 8. En gang fullført, fortsetter du til neste trinn.
4. Bruker en fluorometer eller lignende teknologi, kvantifisere DNA konsentrasjonen i hvert cDNA utvalg i tillegg til positive kontrollen fra trinn 4. Fortynne prøvene eventuelt inneholder ca 0.2 ng/µL av DNA. Litt lavere konsentrasjoner produserer fortsatt levedyktig biblioteker. Litt eksperimentering vil være nødvendig, men forfatterne hadde suksess med biblioteker så lavt som 0,1 ng/µL.
5. Valgfritt trinn: utfører en standard polyakrylamid gel geleelektroforese separasjon på 1-2 µL av hver qPCR produktet å validere biblioteket generasjon reaksjonen arbeidet. Et testbilde vellykket resultat er vist i Figur 4. For en detaljert protokoll om hvordan å gjennomføre polyakrylamid gel geleelektroforese, se Ref. 16.
6. Fullføre cDNA biblioteket forberedelse følger biblioteket forberedelse kit halvparten reaksjon protokollen i trinn 7.

7. biblioteket forberedelse med halvparten reaksjoner

1. Biblioteket forberedelse følger biblioteket forberedelse kit protokollen bruker halvreaksjoner volum. ¹⁷ reagenser i denne delen av protokollen er fra biblioteket forberedelse kit (se Tabell for materiale). Begynn med UV sterilisering et tilstrekkelig antall stripe rør av prøvene skal behandles.
2. Utføre transposase reaksjonen ved å legge til 5 µL transposase buffer hver stripe rør i analysen. Deretter Legg 2,5 µL inn DNA på 0,2 ng/µL (0,5 ng totalt) etterfulgt av 2,5 µL transposase. Bland ved pipettering opp og ned 5 ganger.
3. Inkuber ved 55 ° C i 5 minutter, så hold på 10 ° C. Når prøven når 10 ° C, fjerne den fra thermocycler og umiddelbart legge 2,5 µL transposase stopp buffer til hvert utvalg. Holde prøvene i romtemperatur i 5 minutter.
4. Forberede PCR reaksjonen å forsterke TRANSPONER behandlet prøven ved å legge til 7,5 µL biblioteket prep PCR blanding, 2,5 µL av en indeks 1 primer og 2,5 µL av en indeks 2 primer. Disse veiledningene er proprietær og leveres av produsenten av biblioteket forberedelse kit. Bland godt av pipettering opp og ned 5 ganger.
   Merk: Kontroller at unike primer kombinasjoner brukes for hvert utvalg. Det er 12 ulike indeksen 1 primere og 8 forskjellige indeksen 2 primere, gjør det mulig å entydig merke til 96 forskjellige prøver. Velg en unik kombinasjon av primere for hvert utvalg.
5. Utføre PCR bruker følgende program på en thermocycler. Eksempel volumet er 25 µL.
   72 ° C i 3 minutter
   95 ° C i 30 sekunder
   12 sykluser av:
   95 ° C i 10 sekunder
   72 ° C i 30 sekunder
   55 ° C i 30 sekunder
   72 ° C i 5 minutter
   Hold på 10 ° C
6. Rengjør forberedt bibliotekene bruker SPRI perler følger protokollen i trinn 8. Bibliotekene skal valideres gel geleelektroforese eller en lignende analysen. Se håndboken for kit til bibliotek-forberedelse for detaljer om hvordan du validerer biblioteker. ¹⁷

8. solid fase reversibel immobilisering perle biblioteket rengjøring

1. Solid fase reversibel immobilisering (SPRI) perler bør lagres på 1,5 mL dele og bør være brakt til romtemperatur før bruk. Det anbefales også å forberede frisk 80% etanol hvert eksperiment. Følgende er basert SPRI perle protokollen i WTA kit manualen. ¹⁸
2. Legge til 1 µl av WTA kit lyseringsbuffer hvert PCR-produkt. Vortex SPRI perler før jevnt blandet, deretter legge 50 µl av SPRI perler til hvert utvalg. Blande av pipettering prøven opp og ned 10 ganger og deretter ruge prøvene i romtemperatur i 8 minutter.
3. Kort spinne prøvene å samle væske fra siden av rør. Sett prøvene på en magnetisk separasjon enhet for ~ 5 minutter til væsken vises helt klart.
4. Mens prøvene er magnetisk separasjon, sakte Pipetter av nedbryting og kast - Vær forsiktig med å forstyrre ringen av perler på røret. Neste legge 200 µL av 80% etanol hvert utvalg uten å forstyrre perler. Vent 30 sekunder og deretter nøye Pipetter av nedbryting. Gjenta dette trinnet (etanol vask) når.
5. Tillate prøvene tørke 30 s - 1 min. Ikke over tørr prøvene store fragmenter vil bli permanent bundet til perler.
   Merk: En kort tørketid anbefales å sikre alle spor av etanol er fjernet. Bør spormengder av etanol igjen kan de litt hemme nedstrøms reaksjoner.
6. Fjerne prøvene fra magnetiske separasjon enheten og legge 15 µL av vann til hver prøve å elute DNA fra perler. Pipetter opp og ned og sikre perlene er fjernet fra sidene av rør. Inkuber ved romtemperatur i 2 minutter. Kort spinn prøvene, og plasser dem på magnetiske separasjon enheten ~ 1 minutt til løsningen vises klart.
7. Mens prøvene er magnetisk separasjon, sakte Pipetter opp nedbryting og overføre den til ren rør. Pass på at du ikke forstyrrer ringen av perler på røret. Kast rør med perler.

Representative Results

Fysisk separasjon av gDNA og cDNA/RNA hybrider i Gel-seq enheten kan bli visualisert gjennom fluorescerende gel avbildning; en representant resultatet er vist i Figur 3. Panelet A viser fabrikkerte Gel-seq enheten. falske farge er lagt til å skille de ulike gel regionene. Panelet B viser et nært fire forskjellige separasjonene brukes for validering. Tredje kjørefelt, en negativ kontroll, representerer bakgrunn og viser at det er ingen autoflourescence i gel i grensesnittene. Vi lastet de første og andre banene med DNA stiger. Disse banene viser bare en mørk band på grensesnittet mellom lav - og høy - density membraner, avslører at små fragmenter kan passere gjennom lav tetthet gel. Fjerde kjørefelt viser virkemåten til en biologisk utvalg av interesse: 500 PC3 celler. Vi lastet lane fire som beskrevet i trinn 3 i protokollen. Bildet viser separasjon av genomisk DNA og cDNA/RNA hybrider. En mørk band på toppen av lav membranen er megabase skala genomisk DNA mens cDNA/RNA hybrider er stablet på grensesnittet i lav og høy tetthet. I motsetning til banene lastet med stigen, er det også flere band stede i regionen høy tetthet av gel. Disse fragmentene, mindre enn 100 bp, off-målet produkter generert fra primer oligonucleotides under omvendt transkripsjon. Panelet C viser et representativt bilde av hele Gel-seq enheten fra en vellykket eksperiment. Filer merket RNA/cDNA ble behandlet med Gel-seq-protokollen, mens baner merket RNA viser en separasjon av bare gDNA og RNA. Panelet D viser mislyktes forsøket med svarte bånd øverst i hver kjørefelt av lav membranen. Dette var forårsaket av geleelektroforese buffer forurenset med fragmentert DNA. På dette trinnet, bør forskere se både rene negative kontroller og to distinkte sorte indikerer atskilt gDNA og RNA/cDNA hybrider.

Figur 3 . Gel-Seq separasjon resultater. Gel-seq enheten (A) og et fluorescerende bilde som viser separasjon av DNA og RNA/cDNA hybrider (B). Falske farge er lagt til mer lett skjelner mellom de ulike regionene i tetthet i gel. (C og D) Representant fluorescerende bilder av hele Gel-seq enheten fra en vellykket (C) og mislyktes (D) forsøket. NTC = ingen mal kontroll. Deler av dette tallet ble reprodusert Ref. 7 med tillatelse fra Royal Society of Chemistry. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Når de DNA og RNA/cDNA hybrider har vært separert og resten av Gel-seq protokollen fullført, er det mulig å generere sekvensering biblioteker. For å validere forberedt bibliotekene, kjører vi en standard gel geleelektroforese eksperiment (Figur 4) eller en bioanalyzer. Resultatene i Figur 4 viser biblioteker fra 500 PC3 celler og 750 HeLa celler. Figuren viser de fragment distribusjonene for samsvarende biblioteker fra Gel-seq (merket 'Gel') sammenlignet med uovertruffen prøver generert med standardprotokoller (merket "Tube"). Fragment størrelsene for Gel-seq vises mellom 200 og 800 basepairs som forventet når du forbereder biblioteker ved hjelp av hele-genome standardbiblioteket forberedelse kit. Hvis biblioteket fragmenter ikke vises i riktig størrelse området i dette trinnet, ikke biblioteket forberedelse.

Figur 4 . Biblioteket Fragment størrelse sammenligning. En fluorescerende gel geleelektroforese bilde sammenligne biblioteket størrelsesDistribusjon mellom Gel-seq (Gel) og standard kontroller (Tube). Venstre veibane inneholder en lav masse DNA stige med fragment størrelser 100, 200, 400, 800, 1200 og 2000 basepairs. Fragment størrelsene for alle biblioteker faller mellom 200 og 800 basepairs, som forventet for biblioteker med dette settet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Ultimate valideringen av Gel-seq-protokollen er basert på analyse av sekvensering resultater. Vi valgte PC3 celler av våre validering eksperimenter, disse cellene har homogen uttrykket profiler som tillater å bli delt og behandles ved hjelp av både Gel-seq og tradisjonelle metoder; se figur 5. En sammenligning mellom genomisk DNA for PC3 celler vises i figurer 5et og 5B. Figur 5 En viser en sammenligning av genomet hele kopi nummer variant (CNV) profiler generert fra PC3 Gel-seq eller en hel-genome standardbiblioteket prep reaksjon (rør kontroll). Hvert punkt er mener normalisert bin; hyller defineres fra Genova referansedata slik at hver hylle har lik forventet antall i en sunn diploide celle, i.e., en rett linje, som representerer lik kopier for hver region av alle autosomalt (unntatt X og Y) kromosomer. PC3 inneholder flere kopier av de samme områdene som vises som toppene over en bakgrunn kopi nummer to. Gel-seq gir et kvalitativt lignende CNV profil som standard rør reaksjon. Avtale mellom to tomter kan bli vurdert kvantitativt av lineær regresjon, som vist i panelet B. En Pearson sammenheng av R = 0.90 angir at genomic data samlet inn fra disse metodene er tilsvarende.

Figur 5 . Biblioteket validering. Gel-seq validering for den genomisk (A og B) og transcriptomic (C, D og E) data generert fra PC3 og Hela celler. Panelet A viser en sammenligning av genomet hele CNV profiler generert fra PC3 bruker Gel-seq (Gel-seq) eller en standard reaksjon (rør). MAPD = Median absolutt parvis forskjell. Panelet B er en lineær regresjon mellom de to utvalgene i panelet A, med R = 0,90 indikerer genomic dataene er tilsvarende. Aksene viser log2 normalisert hyllen teller. Paneler C og D sammenligne transcriptomic data fra PC3 celler, med hvert punkt viser et tall i utskrifter per kilobase per million (TPM). Aksene viser sammenligningen mellom to prøvene som log2 normalisert transkripsjon teller. Panelet C viser en sammenligning av tekniske replikat generert ved hjelp av Gel-seq, og panelet D viser en sammenligning mellom Gel-seq og tradisjonelle RNA-seq. panelet E viser at Gel-seq kan løse celle type basert på RNA uttrykk med en viktigste komponenten analyse. X-aksen viser at de første viktigste komponenten står for 91,6% av variasjon mellom prøvene mens y-aksen viser at andre viktigste komponenten kontoene for bare 6,5% av varians. Deler av dette tallet ble reprodusert Ref. 7 med tillatelse fra Royal Society of Chemistry. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tilsvarende sammenlignet vi med transcriptomic data fra våre Gel-seq-protokollen i-tube Smart-Seq standardprotokollen. Figur 5 viser sammenhengen mellom begge Gel-seq tekniske replikat (figur 5C) og mellom Gel-seq og standard metode (figur 5D). Hvert punkt er i transkripsjoner per kilobase per million (TPM) for hver genet oppdaget på TPM > 5 i begge datasett. Lineære regresjoner vises som røde linjer, og Pearson korrelasjonskoeffisient vises i øvre venstre hjørne. Teknisk gjentak fra Gel-seq enig (R ∼ 0,8), men relatere mindre godt med standard metode (R < 0,7). Dette tyder på at Gel-seq introduserer en skjevhet i genet teller. Heldigvis denne bias er systematisk og, som kan sees av de viktigste komponenten analysen i figur 5E, meningsfull konklusjoner kan fortsatt trekkes mellom ulike biologiske prøver.

Discussion

Det er flere viktige trinn forbundet med Gel-seq apparat fabrikasjon samt protokollen. Under fabrikasjon anbefaler vi starter med de foreskrevne Sjikttykkelse for de ulike regionene i gel. Vi brukte betydelig tid tester forskjellige fabrikasjon alternativer og protokollen beskrevet her gir de beste enhetene for kassettene oppført i tabell av materialer og reagenser. Hvis forskerne bruker en alternativ kassett-system, kan de finne det nødvendig å justere volumene brukes ved opprettelse av enhetene. Den store utfordringen i fabrikasjon er at hvis regionen høy tetthet gel er for stor kan delaminate fra kantene på kassetten og opprette luftlommer på indre av kassetten som vil forstyrre geleelektroforese. Ved å kaste flere kassetter med flere forskjellige lag volumer, skal forskere kunne raskt avgjøre den optimale konfigurasjonen for deres bestemt maskinvare.

Gel-seq protokollen har også flere avgjørende skritt som kan valideres før protokollen er fullført. Én potensielle feil poenget er skillet mellom gDNA og RNA/cDNA hybrider. Dette kan valideres av imaging Gel-seq enheten etter separasjonen (se Figur 3B). I ett sett av eksperimenter, fant vi at våre lab tilførsel av buffer hadde blitt forurenset med DNA og forårsaket betydelig autoflourescence i vår enhet (se Figur 3D). Dette gjorde det vanskelig å avgjøre hvis separasjon hadde funnet sted. Fluorescerende imaging hjalp oss med å identifisere og løse problemet før du bruker kostbare reagenser generere sekvensering biblioteker.

En annen kritisk punkt er skritt 6.2, qPCR forsterkningen på cDNA etter separasjonen. Forskere bør betale forsiktig oppmerksomhet ikke å overamplify i dette trinnet som det vil redusere kvaliteten på RNA-seq dataene. Denne vurderingen er ikke unikt for Gel-seq, men er en vanlig del av lav-input RNA-seq biblioteket forberedelse. PCR forsterkning under sekvensering biblioteket forberedelse er ofte nødvendig, men det kan introdusere sekvens feil og biases. Antall sykluser for PCR avhenger av prøveantall og kompleksitet. Det er vanligvis lurt å begrense PCR syklus nummer på minimum nødvendig å gi tilstrekkelig klynging når bibliotekene er i rekkefølge. I teorien, kan en protokoll optimaliseres for å fastslå hvor nøyaktig syklus som gir tilstrekkelig antall kopier uten introdusere overdreven gjenstander. I praksis, men inkonsekvenser i utvalg kvalitet, lasting, eller håndtering tidlig i protokollen kan dramatisk påvirke fordelingen av molekylære maler tilgjengelig for biblioteket prep PCR, som igjen påvirker det optimale PCR syklus nummeret. Den mest generelle løsningen vi har funnet for å overvåke fremdriften av forsterkning reaksjoner med et fluorescerende fargestoff, kjøre reaksjonene på en sanntid PCR-thermocycler, og stoppe reaksjonene i eksponenten (lineær versus syklus nummer) fase. I vår erfaring er sanntids overvåking spesielt relevant når utvikle, tilpasse eller vedta en ny protokoll.

Det siste kritiske trinnet genererer genomisk og transcriptomic biblioteker. Nøkkelen til dette trinnet er å sette start eksempel konsentrasjonen for DNA biblioteket prep reaksjonen så nær 0,2 ng/µL (0,5 ng totalt) som mulig. Dette er relativt enkelt for qPCR forsterket cDNA som det er vanligvis et overskudd av cDNA, men det kan være mer utfordrende for gDNA prøvene. Vi fant forsiktig oppmerksomhet til vacufuge trinn var nødvendig mens prøvene var å være konsentrert. Som forventet, eksperimenter med 1000 celler, vacufuge trinnet kan stanses mye tidligere enn eksperimenter med 100 celler. Antall prøver i vacufuge også påvirket Fordampningshastighet i vårt forsøk. Vi fant som en flourometer til å validere DNA innhold midtveis konsentrasjon trinn kan være nyttig når du utfører protokollen med ukjent prøver. Heldigvis hvis forskere over konsentrat en prøve, nuclease gratis vann kan legges til fortynne prøven. Teoretisk sett, er det mulig å bruke vacufuge tørke DNA og så resuspend det i ønsket volum; Imidlertid bør unngå fullstendig fordampning.

Vi se tre gjeldende metoder for å generere samtidige DNA og RNA biblioteker, Gel-seq⁷, G & T-seq⁸og DR-seq⁹, som gratis. Gel-seq er ideell for prøver i 100-1000 celleområdet og krever ingen rullegardin mål eller en priori kunnskap om genomet. De to andre metodene er bedre egnet for enkelt celle programmer. Et av våre mål å utvikle Gel-seq var å skape en protokoll som lett kan implementeres av andre forskere. Vi har derfor besluttet å dikte enheter standard formfaktor for kassetteninn polyakrylamid gel. Teknikken vi brukes til å definere våre forskjellige membraner er romanen, har de fleste genetikk labs allerede alt nødvendig utstyr for å dikte Gel-seq enheten. Videre enheten er trivielt - bare $5,25 for en enhet som kan behandle 12 prøver. Når det er sagt, som med alle bibliotek forberedelse protokollen bruker kommersielle reagenser, totalkostnad for generering av biblioteker er fortsatt høy. Våre reagens kostnader per eksempel var $50 for hele-transkripsjon forsterkning og $28 for biblioteket forberedelse for både DNA og RNA. Heldigvis, Gel-seq enheten er protokollen agnostiker. For eksempel under utvikling testet vi enheten bruker celler fra kultur og en eldre RNA biblioteket forsterkning protokollen¹⁹, selv om vi fant det ikke var egnet for vevsprøver fra mus. Ser mot fremtiden, som billigere alternativer for biblioteket forberedelse er utviklet, kan våre protokollen tilpasses til å arbeide med disse nye teknikkene. Vi tror forskere vil finne det enkelt å implementere Gel-seq i egne labs. Vi håper dette vil lette rask adopsjon av teknologien.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Acrylamide Monomer	Sigma Aldrich	A8887-100G
Ammonium Persulfate	Sigma Aldrich	A3678-25G
Ampure XP Beads	Beckman Coulter	A63880	Referred to in the text as solid phase reversible immobilization (SPRI) beads
DNA Gel Loading Dye (6x)	ThermoFisher Scientific	R0611	Referred to in the text as 6X loading dye
Ethyl alcohol	Sigma Aldrich	E7023-500ML
KAPA SYBR FAST One-Step qRT-PCR Kits	Kapa BioSystems	7959613001	Referred to in the text as 2X qPCR mix
N,N′-Methylenebis(acrylamide)	Sigma Aldrich	146072-100G	Also known as bis-acrylamide
NexteraXT DNA Library Preparation Kit (referred to in the text as library preparation kit)	Illumina	FC-131-1024	Includes: TD (referred to in the text as transposase buffer), ATM (referred to in the text as transposase), NT (referred to in the text as transposase stop buffer), and NPM (Referred to in the text as library prep PCR mix)
Nuclease Free Water	Millipore	3098
Protease	Qiagen	19155
SMART-Seq v4 Kit (referred to in the text as whole-transcript amplification (WTA) kit)	Takara/Clontech	634888	Includes: Lysis buffer, RNase inhibitor, 3’ SMART-Seq CDS Primer II A (referred to in the text as RT primer), 5X Ultra Low First Strand Buffer (referred to in the text as first strand buffer), SMART-Seq v4 Oligonucleotide (referred to in the text as template switch oligonucleotide (TSO)), SMART-Scribe Reverse Transcriptase (referred to in the text as reverse transcriptase), and PCR Primer II A (referred to in the text as cDNA PCR primer)
Random hexamer with WTA adapter	IDT	n/a	5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC-NNNNNN-3′
Sucrose	Sigma Aldrich	S0389-500G
TEMED	Sigma Aldrich	T9281-25ML
DNA AWAY Surface Decontaminant	ThermoFisher Scientific	7010PK	Referred to in the text as DNA removal product
Tris-Borate-EDTA buffer (10X concentration)	Sigma Aldrich	T4415-1L
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000X Concentrate in DMSO)	ThermoFisher Scientific	S11494	Referred to in the text as gel stain
Equipment
BD Precisionglide syringe needles, gauge 18	Sigma Aldrich	Z192554	Any equivalent hardware is acceptable
Branson CPX series ultrasonic bath	Sigma Aldrich	Z769363	Any equivalent hardware is acceptable
Empty Gel Cassettes, mini, 1.0 mm	ThermoFisher Scientific	NC2010	Any equivalent hardware is acceptable
Mesh Filter Plate - Corning HTS Transwell 96 well permeable supports - 8.0 µm pore size	Sigma Aldrich	CLS3374	Referred to in the text as 8 um mesh filter plate
PowerPac HC Power Supply	Bio-Rad	1645052	Any equivalent hardware is acceptable
Qubit Fluorometer	ThermoFisher Scientific	Q33216	Any equivalent hardware is acceptable
Vacufuge Concentrator	Eppendorf	22822993	Any equivalent hardware is acceptable
XCell SureLock Mini-Cell system	ThermoFisher Scientific	EI0001	Any equivalent hardware is acceptable
Bio-Rad CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad	1855195	Any equivalent hardware is acceptable
Amersham UVC 500 Ultraviolet Crosslinker	GE Healthcare Life Sciences	UVC500-115V	Discontinued, any equivalent hardware is acceptable
Gel Doc XR+ Gel Documentation System	Bio-Rad	1708195	Referred to in the text as gel imager
Dark Reader Transilluminator	Clare Chemical Research	DR89	Referred to in the text as UV transilluminator
Ultrasonic Bath	Bransonic	1207K35	Any equivalent ultrasonic bath is acceptable.