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Bioengineering

Gel-seq: एक साथ अनुक्रमण पुस्तकालय के लिए एक विधि डीएनए और आरएनए का उपयोग Hydrogel मैट्रिक्स की तैयारी

Published: March 26, 2018 doi: 10.3791/57315
Automatic Translation
*1, *2, 2, 3, 2
1Department of Engineering, University of San Diego, 2Department of Bioengineering, University of California, San Diego, 3Department of Mechanical and Aerospace Engineering, University of California, San Diego
* These authors contributed equally

Summary

जेल-seq एक सरल hydrogel डिवाइस का उपयोग कर 100-1000 कोशिकाओं से शुरू नगण्य जोड़ा लागत पर दोनों डीएनए और आरएनए-seq के लिए एक साथ पुस्तकालयों को तैयार करने के लिए शोधकर्ताओं को सक्षम बनाता है. यह कागज डिवाइस के निर्माण के लिए एक विस्तृत दृष्टिकोण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जैविक प्रोटोकॉल युग्मित पुस्तकालयों उत्पंन करने के लिए प्रस्तुत करता है ।

Abstract

छोटे से प्रारंभिक नमूनों से या तो डीएनए या आरएनए को बढ़ाना और अनुक्रम की क्षमता केवल पिछले पांच वर्षों में प्राप्त की गई है. दुर्भाग्य से, जीनोमिक या transcriptomic पुस्तकालयों पैदा करने के लिए मानक प्रोटोकॉल असंगत हैं और शोधकर्ताओं को एक विशेष नमूने के लिए डीएनए या आरएनए अनुक्रम करने के लिए कि क्या चुनना होगा. जेल-seq एक सरल hydrogel डिवाइस का उपयोग कर 100-1000 कोशिकाओं के साथ शुरू डीएनए और आरएनए दोनों के लिए पुस्तकालयों को एक साथ तैयार करने के लिए शोधकर्ताओं को सक्षम करने से इस समस्या का हल. यह कागज डिवाइस के निर्माण के लिए एक विस्तृत दृष्टिकोण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जैविक प्रोटोकॉल युग्मित पुस्तकालयों उत्पंन करने के लिए प्रस्तुत करता है । हम जेल-seq बनाया है ताकि यह आसानी से अंय शोधकर्ताओं द्वारा कार्यांवित किया जा सकता है; कई आनुवंशिकी प्रयोगशालाओं पहले से ही आवश्यक उपकरण जेल-seq डिवाइस निर्माण पुन: पेश करने के लिए है । हमारे प्रोटोकॉल आमतौर पर दोनों पूरी-प्रतिलिपि प्रवर्धन (डब्ल्यूटीए) और पुस्तकालय की तैयारी है, जो भी पहले से ही जीनोमिक और transcriptomic पुस्तकालयों पैदा करने में निपुण शोधकर्ताओं को परिचित होने की संभावना है के लिए इस्तेमाल किया किट कार्यरत हैं । हमारे दृष्टिकोण शोधकर्ताओं ने बंटवारे के बिना और नगण्य जोड़ा लागत के साथ एक एकल नमूना पर दोनों डीएनए और आरएनए अनुक्रमण की शक्ति को सहन करने के लिए लाने के लिए अनुमति देता है.

Introduction

अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (NGS) जिस तरह से आनुवंशिकी अनुसंधान आयोजित किया जाता है पर एक गहरा प्रभाव पड़ा है । शोधकर्ताओं ने एक बार एक पूरी प्रजाति के जीनोम sequencing पर ध्यान केंद्रित किया, जहां यह अब एक प्रयोग में एक ही ट्यूमर या यहां तक कि एक सेल के जीनोम अनुक्रम करने के लिए संभव है । 1 NGS भी एक सेल, transcriptome के रूप में जाना जाता डेटा का एक संग्रह के भीतर पाया आरएनए टेप अनुक्रम के लिए यह लागत प्रभावी बना दिया है । छोटे से प्रारंभिक नमूनों से या तो डीएनए या आरएनए को बढ़ाना और अनुक्रम की क्षमता केवल पिछले पांच वर्षों में प्राप्त की गई है. 2 , 3 , 4 दुर्भाग्यवश, मानक प्रोटोकॉल असंगत है और शोधकर्ताओं को यह चुनना होगा कि किसी दिए गए नमूने के लिए डीएनए या आरएनए अनुक्रम करना है या नहीं । जब एक प्रारंभिक नमूना काफी बड़ा है, यह आधा में विभाजित किया जा सकता है । छोटे तराजू पर, हालांकि, बंटवारे के नमूनों के कारण सामग्री की हानि पुस्तकालय की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते हैं, और नमूनों की पूलिंग कोशिकाओं के बीच दिलचस्प भिन्नता बाहर औसत कर सकते हैं. 5 इसके अलावा, शोधकर्ताओं ने तेजी से ऐसे एकल कोशिकाओं या छोटे विषम ट्यूमर बायोप्सी के रूप में, विभाजित नहीं किया जा सकता है कि नमूनों की जांच में रुचि रखते हैं । ६

इस समस्या को हल करने के लिए, तीन प्रोटोकॉल हाल ही में एक ही शुरू नमूना से डीएनए और आरएनए दोनों अनुक्रम के लिए विकसित किया गया है: जेल-seq7, जी एंड टी-seq8, और डॉ-seq9. यह लेख जेल-seq के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है, जो एक साथ के रूप में नगण्य जोड़ा लागत पर 100 कोशिकाओं के रूप में कुछ से डीएनए और आरएनए पुस्तकालयों उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । जेल-seq के उपंयास पहलू कम लागत hydrogel मैट्रिक्स का उपयोग कर आकार पर विशेष रूप से आधारित डीएनए और आरएनए अलग करने की क्षमता है । जेल-Seq प्रोटोकॉल के मुख्य नवाचार आरएनए से डीएनए की शारीरिक जुदाई है । इस जुदाई polyacrylamide झिल्ली का एक संयोजन है कि इन अणुओं के बीच आकार मतभेदों का लाभ लेने का उपयोग कर electrophoretically हासिल की है । संदर्भ में इन आकार मतभेद डाल करने के लिए, कैसे डीएनए और आरएनए imaged कर रहे हैं पर विचार करें: जबकि डीएनए माइक्रोन पर मौजूद है पैमाने पर और पारंपरिक सूक्ष्मदर्शी का उपयोग करते हुए देखा जा सकता है, आरएनए नैनोमीटर पैमाने पर मौजूद है और इस तरह के क्रायो के रूप में जटिल तकनीकों का उपयोग imaged होना चाहिए-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी. 10

इस प्रोटोकॉल में डीएनए और आरएनए को अलग करने का दृष्टिकोण चित्रा 1में दिखाया गया है । बाएँ पैनल डीएनए और आरएनए मुक्त एक झिल्ली के पास समाधान में तैर से पता चलता है. एक बिजली के क्षेत्र में लागू किया जाता है, के रूप में सही पैनल में दिखाया गया है, डीएनए और आरएनए झिल्ली के माध्यम से पलायन लाती है कि एक electrophoretic बल का अनुभव । झिल्ली गुणों ट्यूनिंग द्वारा, हम एक अर्द्ध पारगंय झिल्ली है कि आरएनए से डीएनए अलग बनाया है । डीएनए अणु झिल्ली के खिलाफ धक्का दिया, लेकिन उनके बड़े आकार की वजह से किनारे पर उलझ जाते हैं । दूसरी ओर छोटी आरएनए अणु, पुनः विन्यस्त और झिल्ली के माध्यम से अपने तरीके से बुनाई कर सकते हैं । इस प्रक्रिया, reptation के रूप में जाना जाता है, जिस तरह से एक सांप घास के माध्यम से चलता है के समान है । अंततः इन आरएनए अणुओं के माध्यम से wriggle करने के लिए भी छोटे पॉलिमर (> 200 आधार जोड़े) के लिए भी मुश्किल है कि एक दूसरे, उच्च घनत्व झिल्ली द्वारा बंद कर रहे हैं । एक बार शारीरिक रूप से अलग, डीएनए और आरएनए बरामद किया जा सकता है और दोनों जीनोम और transcriptome के बारे में जानकारी उत्पंन करने के लिए संसाधित । जब तक हम डीएनए और शाही सेना अलग कर सकते हैं, हमने पाया है बेहतर परिणाम प्राप्त कर रहे है अगर आरएनए रिवर्स है जुदाई से पहले सीडीएनए को लिखित । सीडीएनए/आरएनए संकर अकेले आरएनए से अधिक स्थिर हैं और अभी भी कम घनत्व झिल्ली के माध्यम से पारित कर सकते हैं ।

Figure 1
चित्र 1 . जेल-seq ऑपरेटिंग सिद्धांत । अंतर्निहित सिद्धांत शारीरिक रूप से अलग डीएनए और आरएनए के लिए इस्तेमाल किया । एक एप्लाइड इलेक्ट्रिक क्षेत्र में, छोटे आरएनए अणु कम घनत्व झिल्ली के माध्यम से स्थानांतरित लेकिन बड़े डीएनए अणु सतह पर फंस रहे हैं । यह आंकड़ा Ref. 7 से रसायन विज्ञान के रॉयल सोसायटी से अनुमति के साथ reproduced था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

इस पत्र में विस्तार से दोनों जेल-seq डिवाइस और जैविक प्रोटोकॉल युग्मित डीएनए और आरएनए पुस्तकालयों उत्पन्न करने के लिए का वर्णन करता है । दोनों का ओवरव्यू आरेख 2में दिखाया गया है । डिवाइस मानक स्टैकिंग जैल बनाने के लिए इसी तरह की एक प्रक्रिया में एक दूसरे के शीर्ष पर तीन अलग घनत्व polyacrylamide जैल लेयरिंग द्वारा गढ़े है । 11 जैव प्रोटोकॉल 100 के साथ शुरू होता है-1000 पंजाब में निलंबित कोशिकाओं । कोशिकाएं लीजड ड हैं और आरएनए को सीडीएनए/आरएनए संकर से जीनोमिक डीएनए को अलग करने के लिए डिवाइस का इस्तेमाल करने से पहले सीडीएनए में बदल दिया जाता है । जुदाई और वसूली के बाद, जीनोमिक और transcriptomic पुस्तकालयों एक प्रक्रिया है कि बारीकी से मानक पूरे जीनोम पुस्तकालय तैयारी किट प्रोटोकॉल इस प्रकार का उपयोग कर तैयार कर रहे हैं । विकास और जेल के सत्यापन के बारे में और अधिक विस्तार-seq एक चिप प्रकाशन "जेल-seq: अर्द्ध पारगंय hydrogel बाधाओं का उपयोग कर एक साथ कम इनपुट डीएनए और आरएनए पुस्तकालय तैयारी द्वारा पूरे जीनोम और transcriptome अनुक्रमण पर प्रयोगशाला में पढ़ा जा सकता है ." 7

Figure 2
चित्र 2 . जेल-seq प्रोटोकॉल । कदम के एक सिंहावलोकन जेल-seq उपकरण और उत्पंन युग्मित डीएनए और आरएनए पुस्तकालयों के लिए प्रोटोकॉल बनाना । इस आंकड़े के अंश को Ref. 7 से रसायन विज्ञान के रॉयल सोसायटी से अनुमति के साथ reproduced थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

एकल कोशिकाओं से डीएनए और आरएनए पुस्तकालयों उत्पन्न करने के लिए, शोधकर्ताओं को या तो जी एंड टी-seq या डॉ-seq. जी एंड टी-seq, जेल-seq की तरह, जीनोमिक डीएनए से आरएनए के एक भौतिक जुदाई पर निर्भर करता है का उपयोग करने पर विचार करना चाहिए. इस दृष्टिकोण दूत है आरएनए (mRNA) पर निर्भर करता है 3 ' एक पुल नीचे लक्ष्य के रूप में polyadenylated पूंछ । mRNA एक biotinylated oligo-डीटी प्राइमर का उपयोग कर एक चुंबकीय मनका पर कब्जा कर लिया है । एक बार mRNA पर कब्जा कर लिया गया है एक चुंबक और जीनोमिक डीएनए युक्त supernatant के साथ जगह में आयोजित कर रहे है और हटाया जा सकता है एक और ट्यूब को हस्तांतरित । इस शारीरिक जुदाई के पूरा होने के बाद, mRNA और डीएनए से अलग पुस्तकालयों उत्पन्न किया जा सकता है । 8 यह दृष्टिकोण अच्छी तरह से काम करता है अगर ब्याज की आरएनए polyadenylated है, लेकिन यह गैर polyadenylated टेप, जैसे राइबोसोमल आरएनए, tRNA, या prokaryotes से आरएनए का अध्ययन करने के लिए उपयोग नहीं किया जा सकता ।

DR-seq एक पूर्व प्रवर्धन कदम पर निर्भर करता है, जहां दोनों डीएनए और सीडीएनए आरएनए से व्युत्पंन एक ही ट्यूब में परिलक्षित कर रहे हैं । नमूना तो दो में विभाजित है और समानांतर में संसाधित करने के लिए डीएनए और आरएनए-seq पुस्तकालयों तैयार. जीनोमिक डीएनए और आरएनए से व्युत्पंन सीडीएनए के बीच अंतर करने के लिए, डॉ-seq एक गणना दृष्टिकोण लेता है. जुगाड़ जहां केवल exons है गणना जीनोमिक डीएनए डेटा में दबा रहे हैं, के रूप में उन या तो डीएनए या आरएनए से उत्पंन किया जा सकता है । 9 इस दृष्टिकोण का एक लाभ यह है कि डीएनए और सीडीएनए/आरएनए को शारीरिक रूप से अलग नहीं किया जाना चाहिए जैसा कि जेल-seq और जी एंड टी-seq में किया जाता है । दोष, तथापि, यह है कि डॉ seq जीनोम और transcriptome (यानी, exons बनाम introns) के एक प्राथमिकताओं ज्ञान की आवश्यकता है, और ऐसे नाभिक के अनुक्रमण के रूप में अनुप्रयोगों के लिए आदर्श नहीं हो सकता है, जिसमें कई टेप अभी तक पूरी तरह से नहीं कर रहे है ब्याह और अभी भी introns होते हैं । 12

जेल-seq के उपंयास पहलू आकार पर विशेष रूप से आधारित कोशिकाओं के सैकड़ों में डीएनए और आरएनए अलग करने की क्षमता है । इस विधि के जीनोम या transcriptome का कोई प्राथमिकताओं ज्ञान की आवश्यकता है, अधूरा ब्याह के खिलाफ मजबूत है, और पाली-adenylated टेप तक ही सीमित नहीं है । अनुप्रयोगों के लिए जहां एक शोधकर्ता के साथ शुरू कर सकते है कम से 100 कोशिकाओं, जेल-seq सस्ते और व्यापक रूप से उपलब्ध सामग्री का उपयोग कर एक सीधा दृष्टिकोण प्रदान करता है ।

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Protocol

1. रासायनिक समाधान की तैयारी

नोट: बाद के चरणों में आवश्यक रासायनिक समाधान तैयार करने के लिए निम्न चरण हैं । इन थोक में बनाया जा सकता है और कई महीनों के लिए संग्रहीत ।

  1. शुरू करने के लिए, 15 मिनट के लिए एक 254 एनएम यूवी crosslinking ओवन में निष्फल द्वारा शुद्ध, जल के 50 मिलीलीटर तैयार (15 माइकल/cm2 कुल एक्सपोजर) किसी भी दूषित डीएनए को बेअसर । निंनलिखित चरणों में उपयोग के लिए 37 डिग्री सेल्सियस के लिए हीट ।
  2. एक 40% कुल (टी) और 3.3% crosslinker (ग) (29:1) polyacrylamide प्रणेता समाधान के 10 मिलीलीटर बनाओ । acrylamide मोनोमर और बीआईएस के ०.१३३ g-acrylamide मोनोमर का वजन ३.८६७ माम है । गठबंधन और भंग जब तक गर्म शुद्ध पानी और भंवर के साथ 10 मिलीलीटर तक की मात्रा ले आओ । स्टोर कमरे के तापमान पर प्रकाश से संरक्षित ।
    नोट: मिश्रित 40% T, 3.3% C (29:1) polyacrylamide समाधानों को व्यावसायिक रूप से खरीदा जा सकता है ।
  3. 50% टी, 5% सी जेल समाधान के 10mL बनाओ । acrylamide मोनोमर और बीआईएस के ०.२५० g-acrylamide मोनोमर का वजन ४.७५० माम है । गठबंधन और 10 मिलीलीटर को भंग जब तक गर्म शुद्ध पानी और भंवर का उपयोग कर मात्रा ले आओ । स्टोर कमरे के तापमान पर प्रकाश से संरक्षित ।
  4. एक 50% (डब्ल्यू/वी) सुक्रोज समाधान के 10 मिलीलीटर बनाओ । एक एेसे सिलेंडर के लिए 5 ग्राम सुक्रोज जोड़ें और 10 मिलीलीटर की कुल मात्रा तक गर्म शुद्ध पानी जोड़ें । भंवर जब तक भंग और कमरे के तापमान पर दुकान ।
  5. 10% एपीएस (डब्ल्यू/वी) के 10 मिलीलीटर बनाओ । एक एेसे सिलेंडर के लिए अमोनियम persulfate (एपीएस) का 1 ग्राम जोड़ें । ठंड जोड़ें (~ 4 डिग्री सेल्सियस) भंग जब तक 10 मिलीलीटर और भंवर की कुल मात्रा तक शुद्ध पानी । तुरंत 200 µ एल के aliquots में फ्रीज ।

2. जेल-seq कैसेट निर्माण

नोट: जेल-seq मूल रूप से ईमानदार कैसेट के साथ विकसित किया गया था (अधिक जानकारी के लिए सामग्री की तालिका देखें); हालांकि, इस प्रोटोकॉल के लिए किसी भी मानक जेल ट्रो कैसेट के साथ काम अनुकूलित किया जा सकता है ।

  1. तीन अलग प्लास्टिक ट्यूबों में जेल के अग्रदूतों के रूप में नीचे दिखाए गए एजेंट जोड़कर तैयार करें तालिका 1. निंन चरणों में निर्देशित होने तक या तो एपीएस या Tetramethylethylenediamine (TEMED) को न जोड़ें । भंवर सामग्री अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए ।
भरावन जेल के प्रणेता उच्च घनत्व जेल प्रणेता कम घनत्व जेल प्रणेता
40% T, 3.3% C Acrylamide Bisacrylamide हल 1.6 mL 50% T, 5% ग Acrylamide Bisacrylamide हल 2.4 mL 40% T, 3.3% C Acrylamide Bisacrylamide हल 0.6 एमएल
जल 10.2 मिलीलीटर जल 1.0 mL जल 4.8 मिलीलीटर
सुक्रोज समाधान (50% w/ 2.6 मिलीलीटर सुक्रोज समाधान (50% w/ 0.6 एमएल
10x Tris-बोराटे-EDTA 1.6 mL 10x Tris-बोराटे-EDTA 0.6 एमएल
अमोनियम persulfate (10% डब्ल्यू/ १०४.० µ l अमोनियम persulfate (10% डब्ल्यू/ ५०.० µ l अमोनियम persulfate (10% डब्ल्यू/ ३९.० µ l
TEMED 6.0 µ l TEMED 1.0 µ l TEMED 2.2 µ एल
कुल मात्रा 16.1 mL कुल मात्रा 4.1 मिलीलीटर कुल मात्रा 6.0 मिलीलीटर

तालिका 1. जेल संश्लेषण रिएजेंट. Polyacrylamide जेल के प्रणेता रिएजेंट 2 कैसेट के निर्माण के लिए पर्याप्त है ।

  1. De-गैस जेल ट्यूब की टोपी के माध्यम से एक सुई डालने और एक घर वैक्यूम लाइन के लिए इस सुई जोड़ने के द्वारा मोनोमर समाधान । इस असेंबली में एक अल्ट्रासोनिक स्नान उच्च करने के लिए सेट करें और जब तक बुलबुले अगले चरण (~ 60 सेकंड/ट्यूब) करने के लिए जाने से पहले तरल से उभर बंद में डूब ।
    नोट: वैक्यूम और अल्ट्रासोनिक स्नान की शक्ति की गुणवत्ता इतने लंबे समय के रूप में बुलबुले समाधान से उभर देखा जा सकता है महत्वपूर्ण नहीं है ।
  2. भराव जेल अग्रदूत और भंवर संक्षेप में TEMED और ए पी एस जोड़ें । तुरंत कैसेट के शीर्ष में समाधान pipetting द्वारा प्रत्येक जेल कैसेट के लिए भराव जेल अग्रदूत के 6 मिलीलीटर जोड़ें । एक 1 मिलीलीटर micropipette का उपयोग करने के लिए छह वृद्धि में अग्रदूत साबित फैल से बचने के लिए । इस चरण के लिए कुल समय 3 मिनट से कम होना चाहिए ।
  3. सुनिश्चित करें कि द्रव एक स्तर की मेज पर कैसेट ईमानदार स्थिति से स्तर है । , degassed पानी के साथ कैसेट के शेष भरें । पिपेट पानी, फिर से 1 मिलीलीटर वेतन वृद्धि का उपयोग कर, धीरे कैसेट के केंद्र में मिश्रण को कम करने के लिए । बहुलक की अनुमति दें करने के लिए एक घंटे के लिए इलाज के लिए कम से रात ।
  4. बहुलक ठीक हो गया है के बाद, एक सिंक पर जेल कैसेट्स पलटना पानी ओवरले को दूर करने के लिए । एक संपीड़ित एयर गन को धीरे से 6 इंच की दूरी से कैसेट के शीर्ष खोलने के माध्यम से हवा उड़ाने से अंतरफलक शुष्क किया जा सकता है ।
  5. उच्च घनत्व जेल अग्रदूत और भंवर संक्षेप में TEMED और ए पी एस जोड़ें । तुरंत कैसेट के लिए उच्च घनत्व अग्रदूत के 320 µ एल जोड़ने के लिए, फिर से एक 1 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग कर । सुनिश्चित द्रव समान रूप से कैसेट पीछे और आगे पीछे 3 बार कमाल द्वारा भराव जेल परत कोट । इस चरण में तीन मिनट से कम समय लेना चाहिए ।
  6. , degassed पानी के साथ कैसेट के शेष भरें । पिपेट धीरे कैसेट के केंद्र में एक 1 मिलीलीटर पिपेट के साथ मिश्रण को कम करने के लिए । की अनुमति दें बहुलक के लिए इलाज के लिए ंयूनतम पंद्रह मिनट, अधिमानतः एक घंटे ।
  7. फिर, पानी ओवरले को दूर करने के लिए जेल कैसेट्स पलटना. संपीड़ित हवा धीरे अंतरफलक सूखी इस्तेमाल किया जा सकता है । कम घनत्व जेल अग्रदूत और भंवर संक्षेप में TEMED और ए पी एस जोड़ें । तुरंत कैसेट के शेष भरें (~ 1.65 मिलि) कम घनत्व जेल अग्रदूत के साथ और जेल कंघी डालें ।
  8. पिपेट कंघी के शीर्ष पर रिजर्व अग्रदूत के एक अतिरिक्त के रूप में यह बहुलकीकरण के दौरान अवशोषित हो जाएगा । की अनुमति दें बहुलक का इलाज करने के लिए ंयूनतम 4 घंटे, अधिमानतः रातोंरात । जैल Tris-बोराटे-Ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) (TBE बफर) के एक बफर में एक सप्ताह या अधिक के लिए संग्रहीत किया जा सकता है ।

3. नमूना तैयारी और रिवर्स प्रतिलेखन

  1. ब्याज की कोशिकाओं के निलंबन के साथ शुरू, और एक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर) लामिना प्रवाह हूड में काम कर रहे, एक hemocytometer या एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करने के लिए सेल एकाग्रता की गणना । कोशिकाओं को पतला करने के लिए एक एकाग्रता के लिए 100 µ एल प्रति 1000 कोशिकाओं में फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब).
    नोट: इस प्रोटोकॉल PC3, हेला, और माउस जिगर की कोशिकाओं सहित कक्षों की एक श्रेणी पर मांय किया गया है ।
  2. डब्ल्यूटीए किट में दिए गए रिएजेंट का प्रयोग ( सामग्री की तालिकादेखें), lysis बफर के 19 µ एल मिश्रण और RNase अवरोधक के 1 µ एल प्रतिक्रिया बफर के एक 10x स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए । प्रतिक्रिया बफर के 0.5 µ l युक्त पर्याप्त मात्रा का एक lysis मास्टर मिश्रण बनाएँ और प्रत्येक नमूने के लिए nuclease मुफ्त पानी की 2.75 µ l.
  3. पिपेट सेल निलंबन ऊपर और नीचे 5 बार फिर से तय की कोशिकाओं को निलंबित और फिर एक 200 µ एल nuclease में नमूना के 1 µ एल पिपेट नि: शुल्क पट्टी ट्यूब यूवी द्वारा निष्फल । नमूनों की संख्या के आधार पर आवश्यक के रूप में दोहराएँ. एक प्रतिक्रिया के लिए कोशिकाओं के बजाय nuclease मुक्त पानी की pipetting 1 µ एल द्वारा एक नकारात्मक नियंत्रण शामिल करने के लिए सुनिश्चित करें । अगले, प्रत्येक नमूने को lysis मास्टर मिश्रण के 3.25 µ एल जोड़ें और धीरे से ऊपर और नीचे 5 बार pipetting द्वारा मिश्रण ।
  4. 72 डिग्री सेल्सियस के लिए एक थर्मल साइकिल चालक (गरम ढक्कन के साथ) कचौरी । 1 µ एल आरटी प्राइमर और 1 µ एल के 20 µ एम यादृच्छिक hexamer के साथ डब्ल्यूटीए अनुकूलक (5 ′-AAGCAGTGGTAT-CAACGCAGAGTAC-NNNNNN-3 ′) के प्रत्येक नमूने के लिए जोड़ें । gDNA पुस्तकालय की तैयारी के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कम एक ट्यूब आरक्षित और पानी की बजाय प्राइमरों के 2 µ एल जोड़ें ।
    नोट: डब्ल्यूटीए एडाप्टर के साथ यादृच्छिक hexamer वैकल्पिक है और अनुक्रमण परिणामों पर न्यूनतम प्रभाव पड़ता है ।
  5. कोशिकाओं लाइसे करने के लिए 3 मिनट के लिए पहले से गरम थर्मल साइकिल चालक में 72 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की मशीन । थर्मल साइकिल चालक से कोशिकाओं को निकालें और 2 मिनट के लिए बर्फ पर जगह है । 4 ° c चरण 5 तक पर सकारात्मक नियंत्रण संग्रहीत ।
  6. जबकि कोशिकाओं lysing कर रहे हैं, सभी शाही सेना के नमूनों के लिए रिवर्स प्रतिलेखन मास्टर मिश्रण की एक पर्याप्त मात्रा बनाने के निम्नलिखित रिएजेंट अनुपात युक्त: पहला किनारा बफर के 2 µ l, 0.5 µ एल ऑफ टेम्पलेट स्विच oligonucleotide (त्सो), 0.25 µ एल के RNase अवरोधक, और 1 µ l के रिवर्स transcriptase (100 यू/µ एल) ।
  7. कचौरी थर्मल साइकिल चालक 42 ° c. शेष नमूनों को रिवर्स प्रतिलेखन मास्टर मिश्रण के 3.75 µ एल जोड़ें, 10 µ एल मिश्रण करने के लिए कुल नमूना मात्रा लाने के ऊपर और नीचे 5 बार pipetting द्वारा ।
  8. तुरंत एक गरम थर्मल साइकिल चालक में नमूने रखने के द्वारा प्रतिलिपि रिवर्स प्रदर्शन करते हैं । निम्न प्रोग्राम चलाएँ: 42 ° c के लिए 90 मिनट, 70 ° c के लिए 10 मिनट, 4 ° c हमेशा के लिए. यह एक सुरक्षित रोक बिंदु है ।

4. जेल जुदाई और नमूना वसूली

  1. सावधानी से एक जेल ट्रो चैंबर एक डीएनए हटाने के उत्पाद का उपयोग कर साफ । लागू तरल सफाई एजेंट के कई मिलीलीटर एक डिस्पोजेबल एक प्रकार का वृक्ष मुक्त पोंछें और सभी कक्ष की सतहों में पोंछ, और फिर साफ 0.5 x TBE के साथ चैंबर भरें । इष्टतम परिणामों के लिए, एक 254 एनएम यूवी crosslinking ओवन में पूरे तंत्र जगह और 15 मिनट के लिए बंध्याकरण (15 माइकल/
  2. जेल ट्रो चैंबर में seq कैसेट डालें और जगह में ताला । धीरे से सीधे ऊपर खींच कर जेल कंघी हटा दें । जेल फाड़ने या बाहों के किसी भी तेजस्वी से बचने के लिए धीरे से ले जाएं ।
  3. बर्फ पर कदम 3 से नमूने रखते हुए, सीडीएनए पुस्तकालय पीढ़ी के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कम से एक नमूना आरक्षित । 4 ° c चरण 6 तक इस नियंत्रण को संग्रहीत । शेष नमूनों के लिए 6X लोडिंग डाई के 2 µ एल जोड़ें, कुल मात्रा लाने के लिए ~ 12 µ l अच्छी तरह से pipetting द्वारा नमूनों मिश्रण ऊपर और नीचे 5 बार.
  4. 6x लोडिंग डाई के 2 µ l के साथ एक डीएनए सीढ़ी के 1 µ l का मिश्रण और पानी के 7 µ l. जेल के लेन 1 में इस मिश्रण पिपेट-एक ट्रो नियंत्रण के रूप में seq कैसेट । पिछले कदम से नमूनों को जेल-seq कैसेट की पृथक गलियों में पिपेट. पिपेट को पूरी तरह से प्रत्येक कुआं में डालने और इसे केवल एक ऊर्ध्वाधर गति का उपयोग कर हटाने से कुओं के बीच संदूषण को रोकने के लिए सावधान रहें ।
  5. एक मानक जेल ट्रो बिजली की आपूर्ति का उपयोग करना, जेल में 250 वी के एक बिजली के क्षेत्र लागू-seq कैसेट 30 मिनट के लिए सीडीएनए/ एक बार अलग, जेल ट्रो चैंबर से seq कैसेट को हटाने और एक scraping उपकरण के साथ आँखों से कैसेट के दो हिस्सों को खोलने ।
  6. एक स्केलपेल का प्रयोग, बस उच्च घनत्व परत के नीचे आधे में जेल काट । आधा है कि यह अपने दस्ताने हाथ से उठा द्वारा भराव जेल शामिल है त्यागें । धीरे से यह एक पेंट खुरचनी या अंय इसी तरह के उपकरण के साथ परिमार्जन द्वारा कैसेट के बंद शेष जेल छील । जेल के इस खंड प्लेस एक युक्त पकवान में ~ 0.5 एक्स TBE के 3 जेल दाग के µ एल के साथ 30 मिलीलीटर ।
  7. कंटेनर को कवर करने के लिए photobleaching को कम करने और जेल सोख जबकि धीरे 5 मिनट के लिए कंटेनर मिलाते हुए । प्लास्टिक लपेटो पर जेल प्लेस और एक यूवी जेल प्रलेखन प्रणाली का उपयोग कर छवि ले (और अधिक विस्तार के लिए देखें रेफरी .13) । एक 30 दूसरा जोखिम आम तौर पर स्पष्ट छवियों का उत्पादन । सत्यापित करें कि जुदाई हुई है ।
  8. न्यूक्लिक एसिड के दृश्य की सुविधा के लिए एक यूवी transilluminator के लिए जेल ले जाएँ । उपयुक्त यूवी चश्मा पहने हुए, जेल प्रलेखन प्रणाली से परिणाम की पुष्टि करें । gDNA कम घनत्व और उच्च घनत्व वाले क्षेत्रों के इंटरफेस पर सीडीएनए के शुरू में स्थित हो जाना चाहिए.....
  9. एक स्केलपेल का प्रयोग करें, बाहर gDNA और सीडीएनए युक्त जेल के क्षेत्रों में कटौती । नमूने सबसे अच्छा जेल के 10 मिमी आयताकार अनुभाग द्वारा एक 4 मिमी काटने से बरामद कर रहे हैं; हालांकि, सटीक ज्यामिति जेल ट्रो प्रणाली इस्तेमाल पर निर्भर करेगा । भी नकारात्मक नियंत्रण के साथ भरी हुई लेन में कटौती करने के लिए याद रखें ।
  10. एक पट्टी ट्यूब में कुंद अंत चिमटी की एक जोड़ी का उपयोग करके जेल के प्रत्येक आबकारी अनुभाग प्लेस । सावधान रहना बहुत अधिक बल लागू नहीं है या जेल कई टुकड़ों में विभाजित होगा । ऐसा होना चाहिए, बस प्रत्येक टुकड़ा लेने और यह ट्यूब को जोड़ने ।
  11. ट्यूब के नीचे के खिलाफ एक परिपत्र फैशन में पिपेट टिप चलती द्वारा एक पिपेट (200 µ एल पिपेट युक्तियाँ अच्छी तरह से काम) की नोक का उपयोग कर प्रत्येक ट्यूब में जेल पीस. nuclease मुक्त पानी जोड़ें (gDNA नमूनों में 40 µ एल और सीडीएनए नमूनों में 80 µ एल) पिपेट टिप को हटाने के लिए नमूना नुकसान को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जेल पीसने से पहले प्रत्येक ट्यूब के लिए ।
  12. एक भंवर मिक्सर को एक 37 डिग्री सेल्सियस के अंदर पट्टी ट्यूबों प्लेस और 8-12 घंटे के लिए शेक । यह न्यूक्लिक एसिड जेल से बाहर फैलाना करने के लिए अनुमति देता है और इस बहु दिवस प्रोटोकॉल के लिए एक प्राकृतिक रोक बिंदु है ।
  13. एक 8 µm मेष फिल्टर प्लेट में नमूनों पिपेट और 5 मिनट के लिए 2600 x g पर थाली स्पिन जेल टुकड़े बाहर तनाव के लिए । आवास की थाली से दूर मेष फिल्टर प्लेट लिफ्ट और एक नया 200 µ एल पट्टी ट्यूब में जेल मुक्त पानी के नमूनों पिपेट ।
  14. 1 µ l को छेड़ने की (0.9 AU/mL) gDNA युक्त प्रत्येक नमूने के लिए, ऊपर और नीचे pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण, और 15 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्मी निष्क्रियता के बाद 15 मिन के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर मशीन । यह कदम घट nucleosomes के लिए महत्वपूर्ण है और बाद में प्रतिक्रिया चरणों के लिए gDNA सुलभ बनाता है ।
  15. एक 18 गेज सुई का उपयोग करना, सभी नमूना ट्यूबों की टोपियां में छेद प्रहार. तरल मात्रा को कम करने के लिए एक vacufuge में नमूने प्लेस । gDNA नमूनों को घटाकर 5 µ l और सीडीएनए नमूनों को घटाकर 10 µ l किया जाना चाहिए.
  16. vacufuge और नमूनों की संख्या के आधार पर, कुल वाष्पीकरण का समय 30 और 60 मिनट के बीच भिन्न होगा. नमूना मात्रा लक्ष्य मात्रा से नीचे गिर जाता है, तो बस नमूना मात्रा को बढ़ाने के लिए nuclease मुक्त पानी जोड़.

5. gDNA पुस्तकालय की तैयारी

  1. एक fluorometer या इसी तरह की तकनीक का उपयोग कर, चरण 4 से प्रत्येक gDNA नमूना में डीएनए एकाग्रता के रूप में अच्छी तरह से चरण 3 से सकारात्मक नियंत्रण यों तो । एक विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए fluorometer संदर्भ मैनुअल देखें । 14
  2. डीएनए के 0.2 एनजी/µ एल के नमूनों को पतला । प्रारंभिक सेल प्रकार और आवश्यक परिणामों की गुणवत्ता के आधार पर, कम सांद्रता अभी भी व्यवहार्य पुस्तकालयों का उत्पादन हो सकता है । कुछ प्रयोग की आवश्यकता होगी; हालांकि, लेखकों के रूप में कम के रूप में पुस्तकालयों के साथ सफलता थी 0.1 एनजी/µ एल
  3. पूरा gDNA पुस्तकालय तैयारी का पालन करके पुस्तकालय की तैयारी आधा प्रतिक्रिया मात्रा प्रोटोकॉल चरण 7 में ।

6. सीडीएनए पुस्तकालय की तैयारी

  1. 10 µ एल सीडीएनए नमूनों और चरण 4 से सकारात्मक नियंत्रण के साथ शुरू, 2x qPCR मिश्रण के 12.5 µ एल जोड़ने, 0.5 µ एल सीडीएनए पीसीआर प्राइमर, और 2 µ एल nuclease-मुक्त पानी.
  2. निंनलिखित प्रोटोकॉल का उपयोग कर एक वास्तविक समय thermocycler में पीसीआर प्रदर्शन: 3 मिनट के लिए 95 ° c पर गर्म शुरू, के लिए 98 ° c के 20-30 चक्र के बाद 10 s, 65 ° c के लिए 30 s, और 72 ° c 3 मिनट के लिए. कुल नमूना मात्रा 25 µ l मॉनिटर प्रतिक्रिया घटता है और वें से पहले प्रवर्धन बंद करो प्रतिवर्धन के कारण पीसीआर कलाकृतियों से बचने के क्रम में घातीय चरण (रैखिक संकेत वृद्धि बनाम चक्र संख्या) ई प्रतिक्रियाओं छोड़ दें । अधिक से अधिक वर्धन से बचने पर के लिए, इस पेपर के चर्चा अनुभाग के रूप में के रूप में अच्छी तरह से रेफरी .15 देखें ।
  3. प्रवर्धन के बाद, चरण 8 में प्रोटोकॉल के बाद ठोस चरण प्रतिवर्ती स्थिरीकरण (SPRI) मोतियों का उपयोग उत्पाद साफ । एक बार पूरा, अगले कदम के लिए आगे बढ़ें ।
  4. एक fluorometer या इसी तरह की तकनीक का प्रयोग, प्रत्येक सीडीएनए नमूना के रूप में अच्छी तरह से चरण 4 से सकारात्मक नियंत्रण में डीएनए एकाग्रता मात्रा । यदि आवश्यक हो तो नमूने पतला डीएनए के लगभग 0.2 एनजी/µ l को शामिल करने के लिए । थोड़ा कम सांद्रता अभी भी व्यवहार्य पुस्तकालयों का उत्पादन । कुछ प्रयोग की आवश्यकता होगी, लेकिन लेखकों के रूप में कम के रूप में पुस्तकालयों के साथ सफलता के रूप में 0.1 एनजी/µ एल
  5. वैकल्पिक चरण: प्रत्येक qPCR उत्पाद के 1-2 µ l पर एक मानक polyacrylamide जेल ट्रो जुदाई करने के लिए पुस्तकालय पीढ़ी की प्रतिक्रिया को मान्य करने के लिए कार्य किया. सफल परिणाम का एक नमूना छवि चित्रा 4में दिखाया गया है । कैसे polyacrylamide जेल ट्रो आचरण करने के लिए पर एक विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए, देखें Ref. 16.
  6. लाइब्रेरी तैयारी किट का पालन करते हुए पूरा सीडीएनए लाइब्रेरी तैयारी चरण 7 में आधा वॉल्यूम रिएक्शन प्रोटोकॉल ।

7. आधा मात्रा प्रतिक्रियाओं के साथ पुस्तकालय की तैयारी

  1. पुस्तकालय तैयारी आधा मात्रा प्रतिक्रियाओं का उपयोग कर पुस्तकालय तैयारी किट प्रोटोकॉल निंनानुसार है । 17 प्रोटोकॉल के इस खंड में संदर्भित सभी एजेंट पुस्तकालय तैयारी किट ( सामग्री की तालिकादेखें) से कर रहे हैं । यूवी द्वारा शुरू नमूनों की संख्या के लिए पट्टी ट्यूबों की एक पर्याप्त संख्या निष्फल संसाधित किया जा करने के लिए ।
  2. प्रत्येक पट्टी ट्यूब करने के लिए 5 µ l transposase बफर जोड़कर transposase प्रतिक्रिया प्रदर्शन परख में इस्तेमाल किया जाएगा । फिर जोड़ें 2.5 µ एल इनपुट डीएनए में 0.2 एनजी/µ एल (0.5 कुल एनजी) 2.5 µ l transposase द्वारा पीछा किया । ऊपर और नीचे 5 बार pipetting करके मिलाएं ।
  3. 5 मिनट के लिए 55 ° c पर मशीन, तो 10 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ । नमूना 10 डिग्री सेल्सियस तक पहुँच जाता है के बाद, इसे thermocycler से निकालें और तुरंत प्रत्येक नमूने के लिए 2.5 µ l transposase रोकें बफ़र जोड़ें । नमूनों को 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर रखें ।
  4. के लिए पीसीआर की प्रतिक्रिया तैयार करें स्थानांतरित 7.5 µ एल पुस्तकालय तैयारी पीसीआर मिक्स, 2.5 µ एल जोड़ने के द्वारा उपचारित नमूना एक सूचकांक 1 प्राइमर, और 2.5 µ एक सूचकांक 2 प्राइमर के एल । इन प्राइमरों स्वामित्व और पुस्तकालय तैयारी किट के निर्माता द्वारा आपूर्ति की जाती हैं । ऊपर और नीचे 5 बार pipetting करके अच्छी तरह मिलाएं ।
    नोट: सुनिश्चित करें कि अद्वितीय प्राइमर संयोजन प्रत्येक नमूने के लिए उपयोग किया जाता है । वहां 12 अलग सूचकांक 1 प्राइमरों और 8 अलग सूचकांक 2 प्राइमरों, यह विशिष्ट 96 विभिंन नमूनों को लेबल करने के लिए संभव बना रहे हैं । प्रत्येक नमूने के लिए प्राइमरों का एक अनूठा संयोजन चुनें ।
  5. एक thermocycler पर निंनलिखित कार्यक्रम का उपयोग कर पीसीआर प्रदर्शन । नमूना मात्रा 25 µ l है ।
    72 ° c 3 मिनट के लिए
    30 सेकंड के लिए 95 ° c
    के 12 चक्र:
    10 सेकंड के लिए 95 ° c
    30 सेकंड के लिए 72 ° c
    55 ° c 30 सेकंड के लिए
    72 ° c 5 मिनट के लिए
    10 डिग्री सेल्सियस पर होल्ड करें
  6. 8 कदम में प्रोटोकॉल के बाद SPRI मोतियों का उपयोग कर तैयार पुस्तकालयों को साफ करें । पुस्तकालयों जेल ट्रो या एक ऐसी ही परख का उपयोग कर मांय किया जाना चाहिए । पुस्तकालयों को मान्य करने के लिए कैसे पर विवरण के लिए पुस्तकालय तैयारी किट मैनुअल का संदर्भ लें । 17

8. ठोस चरण प्रतिवर्ती स्थिरीकरण मनका पुस्तकालय की सफाई

  1. ठोस चरण प्रतिवर्ती स्थिरीकरण (SPRI) मोती 1.5 मिलीलीटर aliquots में संग्रहीत किया जाना चाहिए और प्रत्येक उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान के लिए लाया जाना चाहिए । यह भी प्रत्येक प्रयोग के लिए ताजा 80% इथेनॉल तैयार करने की सिफारिश की है । निम्नलिखित कदम डब्ल्यूटीए किट मैनुअल में SPRI मनका प्रोटोकॉल आधारित हैं । 18
  2. प्रत्येक पीसीआर उत्पाद के लिए डब्ल्यूटीए किट lysis बफर के 1 µ एल जोड़ें । भंवर SPRI मोती समान रूप से मिश्रित जब तक, तो प्रत्येक नमूने के लिए SPRI मोतियों की 50 µ एल जोड़ें । मिश्रण pipetting नमूना ऊपर और नीचे 10 बार और फिर 8 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर नमूनों की मशीन ।
  3. संक्षेप में नमूने ट्यूबों के पक्ष से तरल इकट्ठा करने के लिए स्पिन । के लिए एक चुंबकीय जुदाई डिवाइस पर नमूने प्लेस ~ 5 मिनट तक तरल पूरी तरह से स्पष्ट प्रतीत होता है ।
  4. नमूने चुंबकीय जुदाई डिवाइस पर कर रहे हैं, जबकि धीरे supernatant बंद पिपेट और त्यागना-ट्यूब पर मोतियों की अंगूठी को परेशान करने के लिए नहीं सावधान रहना । अगले मोती परेशान बिना प्रत्येक नमूने के लिए 80% इथेनॉल के 200 µ एल जोड़ें । 30 सेकंड के लिए रुको और फिर ध्यान से supernatant बंद पिपेट । इस कदम (इथेनॉल धोने) एक बार दोहराएं ।
  5. नमूने 30 एस-1 मिनट के लिए शुष्क करने की अनुमति दें । बड़े टुकड़े के रूप में अधिक सूखे के नमूनों को स्थाई रूप से मोतियों के लिए बाध्य हो जाएगा मत करो ।
    नोट: एक संक्षिप्त शुष्क समय इथेनॉल के सभी निशान को दूर कर रहे है सुनिश्चित करने के लिए सिफारिश की है । इथेनॉल की मात्रा का पता लगाने के पीछे रहना चाहिए वे थोड़ा बहाव प्रतिक्रियाओं को बाधित कर सकते हैं ।
  6. चुंबकीय जुदाई डिवाइस से नमूने निकालें और मोतियों से डीएनए elute करने के लिए प्रत्येक नमूने के लिए पानी की 15 µ एल जोड़ें । पिपेट ऊपर और नीचे और सुनिश्चित करें कि मोती ट्यूबों के किनारों से हटा रहे हैं । 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन । संक्षेप में नमूनों स्पिन और फिर उंहें चुंबकीय जुदाई डिवाइस पर ~ 1 मिनट के लिए जब तक समाधान स्पष्ट प्रतीत होता है ।
  7. नमूने चुंबकीय जुदाई डिवाइस पर कर रहे हैं, जबकि धीरे supernatant ऊपर पिपेट और यह साफ ट्यूबों के लिए स्थानांतरण । ट्यूब पर मोतियों की अंगूठी को परेशान नहीं करने के लिए सावधान रहें । मोतियों के साथ ट्यूबों त्यागें ।

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Representative Results

जेल-seq डिवाइस में gDNA और सीडीएनए/आरएनए संकर की शारीरिक जुदाई फ्लोरोसेंट जेल इमेजिंग के माध्यम से visualized किया जा सकता है; एक प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 3में दिखाया गया है । पैनल एक गढ़े जेल-seq डिवाइस से पता चलता है; झूठी रंग अलग जेल क्षेत्रों भेद करने के लिए जोड़ा गया है । पैनल बी एक करीब चार विभिंन विभाजन सत्यापन के लिए इस्तेमाल से पता चलता है । तीसरी लेन, एक नकारात्मक नियंत्रण, पृष्ठभूमि का प्रतिनिधित्व करता है और पता चलता है कि इंटरफेस पर जेल की कोई autoflourescence है । हम डीएनए सीढ़ी के साथ पहली और दूसरी गलियों भरी हुई है । इन गलियों कम और उच्च घनत्व झिल्ली के बीच इंटरफेस पर केवल एक अंधेरे बैंड दिखाने के लिए, खुलासा है कि छोटे टुकड़े कम घनत्व जेल के माध्यम से पारित कर सकते हैं । चौथे लेन ब्याज की एक जैविक नमूना के व्यवहार से पता चलता है: 500 PC3 कोशिकाओं । हम लेन चार लोड के रूप में प्रोटोकॉल के चरण 3 में वर्णित है । छवि जीनोमिक डीएनए और सीडीएनए/आरएनए संकर की जुदाई से पता चलता है । कम घनत्व झिल्ली के शीर्ष पर एक अंधेरे बैंड megabase पैमाने जीनोमिक डीएनए है, जबकि सीडीएनए/आरएनए संकर कम और उच्च घनत्व वाले क्षेत्रों के इंटरफेस पर खड़ी कर रहे हैं । सीढ़ी के साथ भरी हुई गलियों के विपरीत, वहां भी कई जेल के घनत्व उच्च क्षेत्र के भीतर मौजूद बैंड हैं । इन टुकड़ों, से छोटे 100 बीपी, बंद लक्ष्य है रिवर्स प्रतिलेखन के दौरान प्राइमर oligonucleotides से उत्पंन उत्पादों । पैनल सी एक सफल प्रयोग से पूरे जेल-seq डिवाइस की एक प्रतिनिधि छवि से पता चलता है । गलियों लेबल आरएनए/सीडीएनए जेल-seq प्रोटोकॉल के साथ कार्रवाई की गई, जबकि गलियों लेबल आरएनए सिर्फ gDNA और आरएनए की एक जुदाई दिखाते हैं । पैनल डी कम घनत्व झिल्ली के हर लेन के शीर्ष पर काले बैंड के साथ एक असफल प्रयोग से पता चलता है । यह खंडित डीएनए के साथ प्रदूषित ट्रो बफर के कारण होता था । इस कदम पर, शोधकर्ताओं दोनों साफ नकारात्मक नियंत्रण और दो अलग काले अलग gDNA और आरएनए की उपस्थिति का संकेत बैंड/सीडीएनए संकर के लिए लग जाना चाहिए ।

Figure 3
चित्र 3 . जेल-Seq पृथक् परिणाम । जेल-seq डिवाइस (ए) और डीएनए और आरएनए के जुदाई दिखा एक फ्लोरोसेंट छवि/सीडीएनए संकर (बी) । झूठा रंग और अधिक आसानी से जेल के भीतर घनत्व के विभिंन क्षेत्रों के बीच भेद करने के लिए जोड़ दिया गया है । (सी और डी) एक सफल (ग) और असफल (डी) प्रयोग से पूरे जेल-seq डिवाइस के प्रतिनिधि फ्लोरोसेंट छवियां । एनटीसी = कोई टेम्पलेट नियंत्रण नहीं है । इस आंकड़े के अंश को Ref. 7 से रसायन विज्ञान के रॉयल सोसायटी से अनुमति के साथ reproduced थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

डीएनए और आरएनए/सीडीएनए संकर अलग किया गया है और जेल-seq प्रोटोकॉल के शेष पूरा हो गया है, एक बार sequencing पुस्तकालयों उत्पन्न करने के लिए संभव है. तैयार पुस्तकालयों को मान्य करने के लिए, हम या तो एक मानक जेल ट्रो प्रयोग (चित्रा 4) या एक विश्लेषक चलाते हैं । 500 PC3 कोशिकाओं और 750 हेला कोशिकाओं से उत्पन्न चित्रा 4 शो पुस्तकालयों में परिणाम. यह आंकड़ा मानक प्रोटोकॉल (लेबल ' ट्यूब ') के साथ उत्पन्न बेजोड़ नमूनों की तुलना में जेल-seq से उत्पन्न मिलान पुस्तकालयों के लिए टुकड़ा वितरण दिखाता है (लेबल ' जेल '). जेल-seq के लिए टुकड़ा आकार 200 और 800 basepairs के बीच जब मानक पूरे जीनोम पुस्तकालय तैयारी किट का उपयोग कर पुस्तकालयों की तैयारी की उंमीद के रूप में दिखाई देते हैं । यदि लायब्रेरी अंश इस चरण में सही आकार श्रेणी में नहीं दिखते हैं, तो लायब्रेरी की तैयारी विफल हो गई है ।

Figure 4
चित्र 4 . लायब्रेरी अंश आकार तुलना । एक फ्लोरोसेंट जेल ट्रो जेल-seq (जेल) और मानक नियंत्रण (ट्यूब) के बीच पुस्तकालय आकार वितरण की तुलना छवि । बाएं लेन टुकड़ा आकार 100, 200, 400, 800, 1200, और 2000 basepairs के साथ एक कम सामूहिक डीएनए सीढ़ी शामिल हैं । सभी पुस्तकालयों के लिए टुकड़ा आकार 200 और 800 basepairs के बीच गिरावट, के रूप में इस किट के साथ तैयार पुस्तकालयों के लिए उंमीद है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

जेल-seq प्रोटोकॉल का अंतिम सत्यापन sequencing परिणामों के विश्लेषण पर आधारित है । हमने अपने मांयता प्रयोगों के लिए PC3 कक्षों का चयन किया है, क्योंकि इन कक्षों में समरूप व्यंजक प्रोफ़ाइल हैं, जो जेल-seq और पारंपरिक विधियों का उपयोग करके नमूनों को विभक्त और संसाधित करने की अनुमति देते हैं; चित्र 5देखें । PC3 कोशिकाओं के लिए जीनोमिक डीएनए के बीच एक तुलना आंकड़े 5ए और 5Bमें दिखाया गया है । चित्र 5 एक से पता चलता है जीनोम की तुलना व्यापक प्रतिलिपि संख्या भिंनता (CNV) या तो जेल-seq या एक मानक पूरे जीनोम पुस्तकालय तैयारी प्रतिक्रिया (ट्यूब नियंत्रण) का उपयोग PC3 से उत्पंन प्रोफाइल । प्रत्येक बिंदु एक मतलब सामान्यीकृत बिन गिनती है; डिब्बे संदर्भ जीनोम डेटा से परिभाषित कर रहे है कि प्रत्येक बिन एक स्वस्थ द्विगुणित सेल में बराबर की उंमीद की गिनती है, यानी, एक फ्लैट लाइन, सभी autosomal के प्रत्येक क्षेत्र के लिए बराबर प्रतियां का प्रतिनिधित्व (एक्स और वाई को छोड़कर) गुणसूत्रों । PC3 एक ही क्षेत्र है जो दो की एक पृष्ठभूमि प्रति संख्या के ऊपर spikes के रूप में दिखाने के कई प्रतियां शामिल हैं । जेल-seq मानक ट्यूब प्रतिक्रिया के रूप में एक गुणात्मक समान CNV प्रोफ़ाइल पैदावार । दो भूखंडों के बीच समझौते रैखिक प्रतीपगमन द्वारा मात्रात्मक मूल्यांकन किया जा सकता है, के रूप में पैनल B में दिखाया गया है R = ०.९० के एक पियरसन सहसंबंध इंगित करता है कि जीनोमिक डेटा या तो विधि से एकत्रित कार्यात्मक रूप से समकक्ष है ।

Figure 5
चित्र 5 . लायब्रेरी मांयता । जेल-seq जीनोमिक (ए और बी) और transcriptomic (सी, डी, और ई) डेटा PC3 और हेला कोशिकाओं से उत्पंन के लिए मांयता । पैनल एक जीनोम चौड़ा CNV या तो जेल-seq (जेल-seq) या एक मानक प्रतिक्रिया (ट्यूब) का उपयोग PC3 से उत्पंन प्रोफाइल की तुलना से पता चलता है । MAPD = माध्य निरपेक्ष Pairwise अंतर. पैनल बी एक पैनल में दो नमूनों के बीच एक रैखिक प्रतिगमन है, आर के साथ = ०.९० जीनोमिक डेटा का संकेत कार्यात्मक समकक्ष हैं । अक्षों log2 सामान्यीकृत बिन गिनती दिखाता है । पैनलों सी और डी PC3 कोशिकाओं से transcriptomic डेटा की तुलना करें, प्रत्येक kilobase प्रति लाख (TPM) प्रति टेप में एक गिनती दिखा बिंदु के साथ । अक्षों log2 सामान्यीकृत प्रतिलिपि गणना के रूप में दो नमूनों के बीच तुलना दिखाते हैं । पैनल सी तकनीकी जेल-seq का उपयोग कर उत्पंन प्रतिकृति की तुलना से पता चलता है, और पैनल डी जेल के बीच एक तुलना से पता चलता है-seq और पारंपरिक आरएनए-seq. पैनल ई दिखाता है कि जेल-seq एक प्रमुख घटक विश्लेषण का उपयोग कर आरएनए अभिव्यक्ति के आधार पर कोशिका प्रकार को हल कर सकते हैं । x अक्ष दिखाता है कि पहले मुख्य घटक खातों के बीच भिंनता के ९१.६% के लिए जब y अक्ष दिखाता है कि दूसरे प्रमुख घटक केवल 6.5% प्रसरण के लिए खाते । इस आंकड़े के अंश को Ref. 7 से रसायन विज्ञान के रॉयल सोसायटी से अनुमति के साथ reproduced थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

इसी तरह, हम transcriptomic डेटा हमारे जेल-seq प्रोटोकॉल से मानक में ट्यूब स्मार्ट-seq प्रोटोकॉल की तुलना में । चित्रा 5 दोनों जेल-seq तकनीकी प्रतिकृति (चित्रा 5सी) के बीच और जेल-seq और मानक विधि (चित्रा 5डी) के बीच सहसंबंध दिखाता है । प्रत्येक बिंदु टेप में एक प्रति kilobase प्रति मिलियन (tpm) प्रत्येक जीन में पाया के लिए एक गणना है tpm > 5 दोनों डेटासेट में । रेखीय प्रतीपगमन लाल रेखाओं के रूप में दिखाए जाते हैं, और ऊपरी बाएँ कोने में पियरसन सहसंबंध गुणांक दिखाया गया है । तकनीकी जेल से प्रतिकृति-seq (r ∼ 0.8) सहमत हैं, लेकिन मानक विधि (r < 0.7) के साथ कम अच्छी तरह से सहसंबंधी । यह पता चलता है कि जेल-seq जीन गिनती में एक पूर्वाग्रह का परिचय । सौभाग्य से, इस पूर्वाग्रह और व्यवस्थित है, के रूप में चित्रा 5ईमें प्रमुख घटक विश्लेषण से देखा जा सकता है, सार्थक निष्कर्ष अभी भी विभिंन जैविक नमूनों के बीच तैयार किया जा सकता है ।

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Discussion

जेल-seq डिवाइस निर्माण के साथ ही प्रोटोकॉल के साथ जुड़े कई महत्वपूर्ण कदम हैं । निर्माण के दौरान, हम जेल के विभिन्न क्षेत्रों के लिए निर्धारित परत मोटाई के साथ शुरू करने की सलाह देते हैं । हम महत्वपूर्ण समय बिताया विभिंन निर्माण विकल्प परीक्षण और प्रोटोकॉल यहां वर्णित सामग्री और रिएजेंट की तालिकामें सूचीबद्ध कैसेट के लिए सबसे अच्छा उपकरणों का उत्पादन । यदि शोधकर्ताओं ने एक वैकल्पिक कैसेट प्रणाली का उपयोग करें, वे यह आवश्यक है जब उपकरण बनाने के लिए इस्तेमाल किया संस्करणों tweak करने के लिए मिल सकता है । निर्माण में प्रमुख चुनौती यह है कि अगर उच्च घनत्व जेल क्षेत्र बहुत बड़ा है यह कैसेट के किनारों से फाड़ना और कैसेट है कि ट्रो बाधित होगा के इंटीरियर पर हवा जेब बना सकते है । कई विभिंन स्तर की मात्रा के साथ कई कैसेट कास्टिंग द्वारा, शोधकर्ताओं को जल्दी से अपने विशिष्ट हार्डवेयर के लिए इष्टतम विंयास निर्धारित करने में सक्षम होना चाहिए ।

जेल-seq प्रोटोकॉल भी कई महत्वपूर्ण कदम है कि प्रोटोकॉल के पूरा होने से पहले मांय किया जा सकता है । एक संभावित विफलता बिंदु gDNA और आरएनए के पृथक्करण/सीडीएनए संकर है । इस इमेजिंग द्वारा मांय किया जा सकता है जेल-seq डिवाइस जुदाई के बाद ( चित्रा 3बीदेखें) । प्रयोगों के एक सेट में, हमने पाया कि हमारे बफर की प्रयोगशाला की आपूर्ति डीएनए के साथ दूषित हो गया था और हमारे डिवाइस में पर्याप्त autoflourescence पैदा कर रहा था ( चित्रा 3डीदेखें). यह यह मुश्किल अगर जुदाई जगह ले लिया था निर्धारित करने के लिए बनाया है । फ्लोरोसेंट इमेजिंग हमें पहचानने में मदद की और किसी भी महंगा एजेंट का उपयोग करने के लिए अनुक्रमण पुस्तकालयों उत्पंन करने से पहले इस समस्या को सही ।

एक अंय महत्वपूर्ण बिंदु 6.2 कदम है, जुदाई के बाद सीडीएनए के qPCR प्रवर्धन । शोधकर्ताओं सावधान ध्यान देना इस कदम में बढ़ाना नहीं है क्योंकि यह आरएनए-seq डेटा की गुणवत्ता को कम करेगा चाहिए । यह विचार जेल-seq के लिए अद्वितीय नहीं है, लेकिन कम इनपुट आरएनए-seq पुस्तकालय की तैयारी का एक आम पहलू है । sequencing पुस्तकालय की तैयारी के दौरान पीसीआर प्रवर्धन अक्सर आवश्यक है, लेकिन यह अनुक्रम त्रुटियों और पूर्वाग्रहों परिचय कर सकते हैं । पीसीआर के लिए चक्र की अपेक्षित संख्या नमूना मात्रा और जटिलता पर निर्भर करता है । यह आम तौर पर उचित है जब पुस्तकालयों अनुक्रम रहे है पर्याप्त clustering उपज के लिए आवश्यक नंगे ंयूनतम करने के लिए पीसीआर चक्र संख्या सीमा । सिद्धांत रूप में, एक प्रोटोकॉल के लिए सटीक चक्र संख्या है कि अत्यधिक कलाकृतियों को शुरू करने के बिना पर्याप्त प्रतिलिपि संख्या पैदावार निर्धारित करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । व्यवहार में, तथापि, नमूना गुणवत्ता में विसंगतियां, लोड हो रहा है, या प्रोटोकॉल में जल्दी हैंडलिंग नाटकीय रूप से जो बारी में इष्टतम पीसीआर चक्र संख्या को प्रभावित करता है पुस्तकालय तैयारी पीसीआर, के लिए उपलब्ध आणविक टेम्पलेट्स के वितरण को प्रभावित कर सकते हैं. सबसे सामांय समाधान हम प्रवर्धन प्रतिक्रियाओं की प्रगति पर नजर रखने के लिए एक फ्लोरोसेंट डाई का उपयोग कर पाया है, एक वास्तविक समय पीसीआर thermocycler पर प्रतिक्रियाओं चलाने के लिए, और घातीय (रैखिक बनाम चक्र संख्या) चरण में प्रतिक्रियाओं को रोकने के । हमारे अनुभव में, वास्तविक समय निगरानी विशेष रूप से प्रासंगिक है जब विकासशील, अनुकूल, या एक नया प्रोटोकॉल अपनाने ।

अंतिम महत्वपूर्ण चरण जीनोमिक और transcriptomic लायब्रेरीज़ जनरेट कर रहा है । इस कदम के लिए महत्वपूर्ण के रूप में संभव के रूप में 0.2 एनजी/µ l (0.5 एनजी कुल) के लिए डीएनए पुस्तकालय तैयारी प्रतिक्रिया के लिए शुरू नमूना एकाग्रता स्थापित करने के लिए है । इस qPCR परिवर्धित सीडीएनए के लिए अपेक्षाकृत सरल है के रूप में वहां आम तौर पर सीडीएनए की एक अतिरिक्त है, लेकिन यह gDNA नमूनों के लिए और अधिक चुनौतीपूर्ण हो सकता है । हम vacufuge कदम के लिए सावधान ध्यान पाया आवश्यक था, जबकि नमूनों केंद्रित किया जा रहा था । के रूप में उंमीद के अनुसार, 1000 कोशिकाओं के साथ प्रयोगों में, vacufuge कदम बहुत जल्दी 100 कोशिकाओं के साथ प्रयोगों से रोका जा सकता है । vacufuge में नमूनों की संख्या में भी हमारे प्रयोगों में वाष्पीकरण दर पर असर पड़ा. हमने पाया है कि एक flourometer का उपयोग करने के लिए एकाग्रता कदम के माध्यम से बीच डीएनए सामग्री मांय जब अपरिचित नमूनों के साथ प्रोटोकॉल प्रदर्शन उपयोगी हो सकता है । सौभाग्य से, अगर शोधकर्ताओं ने एक नमूना ध्यान केंद्रित, nuclease मुक्त पानी के लिए नमूना पतला जोड़ा जा सकता है । सैद्धांतिक रूप से, यह vacufuge का उपयोग करने के लिए डीएनए शुष्क और फिर इसे वांछित मात्रा में reसस्पैंड संभव है; हालांकि, हम पूरा वाष्पीकरण से बचने का सुझाव देते हैं ।

हम एक साथ डीएनए और आरएनए पुस्तकालयों, जेल-seq7, जी एंड टी-seq8, और डॉ-seq9, के रूप में मानार्थ पैदा करने के लिए तीन मौजूदा तरीकों को देखते हैं । जेल-seq 100-1000 सेल रेंज में नमूनों के लिए आदर्श है और कोई पुल नीचे लक्ष्य या जीनोम के एक प्राथमिकताओं ज्ञान की आवश्यकता है । अंय दो तरीकों बेहतर एकल सेल अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त हैं । जेल के विकास में हमारे लक्ष्यों में से एक-seq के लिए एक प्रोटोकॉल है कि आसानी से अंय शोधकर्ताओं द्वारा कार्यांवित किया जा सकता है बना था । इसलिए हम एक polyacrylamide जेल कैसेट के मानक फार्म का कारक के भीतर उपकरणों बनाना का फैसला किया । जबकि तकनीक हम हमारे अलग झिल्ली को परिभाषित करते थे उपंयास है, सबसे आनुवंशिकी प्रयोगशालाओं पहले से ही सभी आवश्यक उपकरण के लिए जेल-seq उपकरण बनाना है । इसके अलावा, डिवाइस की लागत तुच्छ है-सिर्फ एक डिवाइस है कि 12 नमूनों की प्रक्रिया कर सकते हैं के लिए $५.२५. उस ने कहा, के रूप में किसी भी पुस्तकालय तैयारी प्रोटोकॉल वाणिज्यिक रिएजेंट का उपयोग कर के साथ, पुस्तकालयों पैदा करने के लिए कुल लागत अधिक रहता है । हमारे नमूने के प्रति एजेंट लागत पूरे के लिए $50-प्रतिलिपि प्रवर्धन और दोनों डीएनए और आरएनए के लिए पुस्तकालय तैयारी के लिए $२८ था । सौभाग्य से, जेल-seq डिवाइस ही नास्तिक प्रोटोकॉल है । उदाहरण के लिए, हम सफलतापूर्वक इस उपकरण का परीक्षण संस्कृति और एक पुराने आरएनए पुस्तकालय प्रवर्धन प्रोटोकॉल19से कोशिकाओं का उपयोग कर, हालांकि हम यह चूहों से ऊतक के नमूनों के लिए उपयुक्त नहीं था पाया. भविष्य की ओर देख रहे हैं, के रूप में पुस्तकालय की तैयारी के लिए सस्ता विकल्प विकसित कर रहे हैं, हमारे प्रोटोकॉल इन नई तकनीकों के साथ काम अनुकूलित किया जा सकता है । हमारा मानना है कि शोधकर्ताओं को यह अपने स्वयं के प्रयोगशालाओं में जेल seq लागू करने के लिए सीधा मिल जाएगा । हमें उंमीद है कि इस प्रौद्योगिकी के तेजी से गोद लेने की सुविधा होगी ।

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Disclosures

KZ के सह संस्थापक और Singlera जीनोमिक्स इंक के वैज्ञानिक सलाहकार है

Acknowledgments

इस काम के लिए धन सैन डिएगो, राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन स्नातक अनुसंधान फैलोशिप कार्यक्रम, NIH अनुदान R01-HG007836, और कोरियाई विज्ञान मंत्रालय, आईसीटी और भविष्य की योजना के द्वारा विश्वविद्यालय द्वारा प्रदान की गई थी ।

कई आंकड़ों के पहले के संस्करणों "Hoople, जी. डी. एट अल में प्रकाशित किया गया । जेल-seq: अर्द्ध पारगंय hydrogel बाधाओं का उपयोग कर एक साथ कम इनपुट डीएनए और आरएनए पुस्तकालय तैयारी द्वारा पूरे जीनोम और transcriptome अनुक्रमण । एक चिप पर लैब 17, 2619-2630, दोी: 10.1039/c7lc00430c (2017). " एक चिप पर लैब इस प्रकाशन में आंकड़ों के पुनः प्रयोग को मंजूरी दी है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Acrylamide Monomer Sigma Aldrich A8887-100G
Ammonium Persulfate Sigma Aldrich A3678-25G
Ampure XP Beads Beckman Coulter A63880 Referred to in the text as solid phase reversible immobilization (SPRI) beads
DNA Gel Loading Dye (6x) ThermoFisher Scientific R0611 Referred to in the text as 6X loading dye
Ethyl alcohol Sigma Aldrich E7023-500ML
KAPA SYBR FAST One-Step qRT-PCR Kits Kapa BioSystems 7959613001 Referred to in the text as 2X qPCR mix
N,N′-Methylenebis(acrylamide)  Sigma Aldrich 146072-100G Also known as bis-acrylamide
NexteraXT DNA Library Preparation Kit (referred to in the text as library preparation kit) Illumina FC-131-1024 Includes: TD (referred to in the text as transposase buffer), ATM (referred to in the text as transposase), NT (referred to in the text as transposase stop buffer), and NPM (Referred to in the text as library prep PCR mix)
Nuclease Free Water Millipore 3098
Protease Qiagen 19155
SMART-Seq v4 Kit (referred to in the text as whole-transcript amplification (WTA) kit) Takara/Clontech 634888 Includes: Lysis buffer, RNase inhibitor, 3’ SMART-Seq CDS Primer II A (referred to in the text as RT primer), 5X Ultra Low First Strand Buffer (referred to in the text as first strand buffer), SMART-Seq v4 Oligonucleotide (referred to in the text as template switch oligonucleotide (TSO)), SMART-Scribe Reverse Transcriptase (referred to in the text as reverse transcriptase), and PCR Primer II A (referred to in the text as cDNA PCR primer)
Random hexamer with WTA adapter  IDT n/a 5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC-NNNNNN-3′
Sucrose Sigma Aldrich S0389-500G
TEMED Sigma Aldrich T9281-25ML
DNA AWAY Surface Decontaminant ThermoFisher Scientific 7010PK   Referred to in the text as DNA removal product
Tris-Borate-EDTA buffer (10X concentration) Sigma Aldrich T4415-1L
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000X Concentrate in DMSO) ThermoFisher Scientific S11494 Referred to in the text as gel stain
Equipment
BD Precisionglide syringe needles, gauge 18 Sigma Aldrich Z192554 Any equivalent hardware is acceptable
Branson CPX series ultrasonic bath Sigma Aldrich Z769363 Any equivalent hardware is acceptable
Empty Gel Cassettes, mini, 1.0 mm ThermoFisher Scientific NC2010 Any equivalent hardware is acceptable
Mesh Filter Plate - Corning HTS Transwell 96 well permeable supports - 8.0 µm pore size Sigma Aldrich CLS3374 Referred to in the text as 8 um mesh filter plate
PowerPac HC Power Supply Bio-Rad 1645052 Any equivalent hardware is acceptable
Qubit Fluorometer ThermoFisher Scientific Q33216 Any equivalent hardware is acceptable
Vacufuge Concentrator Eppendorf 22822993 Any equivalent hardware is acceptable
XCell SureLock Mini-Cell system ThermoFisher Scientific EI0001 Any equivalent hardware is acceptable
Bio-Rad CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System Bio-Rad 1855195  Any equivalent hardware is acceptable
Amersham UVC 500 Ultraviolet Crosslinker GE Healthcare Life Sciences UVC500-115V Discontinued, any equivalent hardware is acceptable
Gel Doc XR+ Gel Documentation System Bio-Rad 1708195 Referred to in the text as gel imager
Dark Reader Transilluminator Clare Chemical Research DR89 Referred to in the text as UV transilluminator
 Ultrasonic Bath Bransonic 1207K35 Any equivalent ultrasonic bath is acceptable.

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References

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Hoople, G. D., Richards, A., Wu, Y., Pisano, A. P., Zhang, K. Gel-seq: A Method for Simultaneous Sequencing Library Preparation of DNA and RNA Using Hydrogel Matrices. J. Vis. Exp. (133), e57315, doi:10.3791/57315 (2018).

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