Summary
Vi presenterar ett protokoll för byggandet av thioether/vinyl sulfid-uppbundna spiralformade peptider med foto-inducerad thiol-ene/thiol-yne hydrothiolation.
Abstract
Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för beredning av thioether-uppbundna peptider med på-harts intramolekylära/intermolekylära thiol-ene hydrothiolation. Det här protokollet beskriver dessutom utarbetandet av vinyl-sulfid-uppbundna peptider med i-lösning intramolekylära thiol-yne hydrothiolation mellan amino acids som besitter alkene/alkynen sida kedjor och cystein rester vid jag, jag + 4 positioner. Linjär peptider var syntetiseras med en standard Fmoc-baserade fasta fasen peptid syntes (SPPS). Thiol-ene hydrothiolation utförs med hjälp av en intramolekylära thio-ene reaktion eller en intermolekylära thio-ene reaktion, beroende på peptid längden. I denna forskning utförs en intramolekylära thio-ene reaktion när det gäller kortare peptider med på-harts deprotection trityl grupper av cystein rester efter komplett syntesen av den linjära peptiden. Kådan anges då UV-bestrålning med photoinitiator 4-methoxyacetophenone (karta) och 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone (MMP). Intermolekylära thiol-ene reaktionen utförs av upplösning Fmoc-Cys-OH i ett N, N- dimetylformamid (DMF) lösningsmedel. Detta är då reagerade med peptiden med alkene-bärande återstoden på harts. Efter det utförs macrolactamization använda bensotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorofosfat (PyBop), 1-hydroxybenzotriazole (HoBt) och 4-Methylmorpholine (NMM) som aktivering reagens på kådan. Efter macrolactamization, peptidsyntesen är fortsatt använda standard SPPS. När det gäller den thio-yne hydrothiolation, är den linjära peptiden klyvs från kådan, torkat och därefter upplöstes avgasade DMF. Detta är sedan bestrålas med UV-ljus med photoinitiator 2,2-dimetoxi-2-phenylacetophenone (DMPA). Efter reaktionen, DMF indunstas och rå återstoden utfälls och renas med hjälp av högpresterande vätskekromatografi (HPLC). Dessa metoder kan fungera för att förenkla generationen av thioether-uppbundna cykliska peptider på grund av användning av thio-ene/yne Klicka kemi som äger överlägsen funktionell grupp tolerans och god avkastning. Införandet av thioether obligationer i peptider tar fördel av nukleofil naturen av cystein rester och är redox-inert i förhållande till disulfide obligationer.
Introduction
Utvecklingen av ligander till modulera protein-protein interaktioner (PPI) ger en attraktiv metod för moderna läkemedelsutveckling. Således har en stor ansträngning investerats i att studera nya kemiska modaliteter som effektivt kunde modulera protonpumpshämmare1,2,3. Protonpumpshämmare består vanligen av grunt, stora eller avvecklad samverkande ytor och små molekyler normalt anses olämpliga ligander för moduleringen av protonpumpshämmare4,5. Med en lämplig exponerade samverkande yta representerar kort peptider som efterliknar strukturella drag hos protein-gränssnitt perfekta kandidater att ta itu med detta problem6,7. Kort peptider är dock normalt ostrukturerad i vattenlösning. Detta är på grund av att vattenmolekyler som konkurrerar med de intramolekylära väte bindning nätverket av peptid ryggraden och väldefinierade konformationer är entropically unfavorable i vatten8. Dessutom peptiderna låg inneboende stabilitet och permeabilitet Cellegenskaper i hög grad begränsa deras användning i biologiska program9,10. Enligt protein data bank (PDB) analys, > 50% av protonpumpshämmare innebär kort α-helix interaktioner11. Således har olika kemiska metoder utvecklats när det gäller helix stabilisering. Dessa inkluderar disulfid/thioether bond bildandet12,13,14, ringen-stängning metates15, lactam ringen bildandet16, ”klicka” kemi17, tillägg av perfluoroarenes18,19och vinyl-svavelväte bildas20.
Stabiliserad spiralformade peptider är allmänt utnyttjas för olika intracellulära mål, inklusive p53, östrogen receptorer, Ras, BCL-2 familj proteiner, och andra21,22,23,24. ALRN-6924, en all-kolväte häftade peptid dubbla hämmare av MDM2 och MDMX, används för närvarande för klinisk utredning25. I de senaste åren, har vår grupp fokuserat på utvecklingen av romanen peptid stabilisering metoder använder thiol-ene och thiol-yne reaktioner26,27,28. I allmänhet har vi visat att dessa foto-initierade biverkningar är effektiva under milda förhållanden när naturligt rikligt cystein används. Vi har dessutom visat att dessa reaktioner har en utmärkt funktionell grupp tolerans, är bio-ortogonala och har visat sig vara tillämpliga för peptid- och ändringar29. De resulterande thioether/vinyl svavelväte uppbundna peptiderna i hög grad förbättra det kemiska utrymmet tvang peptider, ger ett instabilt på-tether modifiering center och har visat sig vara tillämpligt för bruk i många biologiska applikationer30 ,31,32. Hittills har har endast begränsad rapporter beskrivits angående thiol-ene/thiol-yne peptid ringbildning. I en studie publicerad av Anseth et al. 2009, var en på-harts intramolekylära thiol-ene reaktion för peptid ringbildning mellan aktiverade alkener med cystein visat33. Under 2015 Chou et al. beskrivs en tvåkomponents radikala initierade thiol-ene reaktion för peptid häftning34 och en efterföljande, sekventiell thiol-yne/ene koppling reaktion35. Nyligen har beskrivit vi en rad verk baserat på thioether/vinyl svavelväte uppbundna peptider20,26,27. Det här protokollet beskriver en detaljerad sammanfattning av de ovannämnda thioether/vinyl svavelväte uppbundna peptiderna i förhoppning att det kommer att vara till hjälp för bredare forskarsamhället.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. utrustning förberedelse
- För manuell peptid-syntes apparatur, placera ett vakuum samlingsrör (Tabell för material) i en effektiv spiskåpa. Nästa, placera trevägs Avstängningskranar på vakuum grenröret och ansluta dem till en kväve eller argon gas. Cap alla oanvända vikar med gummi septa.
- Anslut harts fyllda kolumner (0,8 x 4 cm, 10 mL behållare, se Tabell för material) till grenröret med de tre-vägs Avstängningskranar (figur 1). Använda en pump ansluten till ett vakuumsystem som dammsugarfilter eller en gummi pipett glödlampa av strängpressning ta bort lösningsmedlet i kolumnerna.
- Använd en photoreactor (figur 2), utrustad med tio 350 nm lampor (Tabell för material) för UV-bestrålning. Anslut dessa till en argon gastank via luftintaget photoreactor att säkerställa att photoreactor är fyllda med argongas före och under photoreactions.
- Innan du slår på UV-lampan av photoreactor, se till att photoreactor dörren är stängd om det finns bestrålning från UV-ljus.
2. harts förberedelse
Obs: I allmänhet, byggandet av peptid substrat utförs med Fmoc-baserade fasta fasen peptid syntes protokoll. Dessa utförs med rink amide harts som lämnar en C-terminal amide återstående följande peptid klyvning. Detta protokoll används över hela papperet.
Varning: N, N- dimetylformamid (DMF), diklormetan (DCM), 4-methylmorpholine (NMM) och N, N- diisoproylethylamine (DIPEA) är giftigt och farligt vid inandning, förtäring eller hudkontakt. Dietyleter är mycket brandfarlig. Trifluorättiksyra (TFA) är frätande. 1,2-ethanedithiol (EDT) är starkt illaluktande. Därför ska alla organiska lösningsmedel och kemikalier hanteras med lämplig personlig skyddsutrustning (handskar i nitril, laboratorierock och skyddsglasögon) och hanteras inuti kemiska spiskåpa.
- Beräkna mängden harts som krävs med hjälp av följande formel:
skala (mmol) / (kåda lastkapacitet (mmol/g) 1 000 (mg/g)) = massan av harts (mg)
T.ex., mängden rink amide MBHA harts (0,5 mmol/g) för 25 µmol = 0,025 mmol / (0,5 mmol/g 1000 mg/g) = 50 mg. Nästa, väga 50 mg av harts i en kolumn och ställa upp på vakuum grenröret med trevägs Avstängningskranar. - Tillsätt 1-2 mL av DCM till harts i en kolumn (0,8 x 4 cm, 10 mL reservoar). Om du vill svälla kådan, skaka försiktigt den med en kväve eller argon ström för 10 min. Nästa, ta bort lösningsmedlet med dammsugarfilter.
3. N-terminala Fmoc Deprotection och tvätt
- Förbereda den N-terminala Fmoc deprotecting lösning: förbereda en tillräcklig volym (200 mL) av 50% (v/v) morfolin i DMF i en glasflaska.
- Tillsätt 1-2 mL av deprotection lösningen till harts, skaka den försiktigt i 10 min och sedan rinna av lösningen med en dammsugare. Använda DMF (1-2 mL) och DCM (1-2 mL) i den ordningen, tvätta kådan och reaktionskärlet grundligt för sammanlagt 3 x. Nästa, upprepa deprotection och tvätta procedurerna 1 x.
4. Fmoc-skyddade aminosyra koppling
- Med kopplingen av alanin rester som exempel, i fråga om en 25 µmol skala manuell syntes, väger Fmoc-Ala-OH (5 motsv., 41,4 mg), 2-(6-chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium hexafluorofosfat (HCTU; 4,9 motsv., 50,5 mg) i en av polypropen behållare och Lös det i DMF (0,5 mL).
- Lägga till DIPEA (10 motsv., 43,5 µl) för att kunna generera en 0,25-M aktiverat amino syra lösning (tabell 1). Efter en ungefärlig 1 min före aktivering, Lägg lösningen till harts och sedan bubbla det med N2 för cirka 1-2 h.
- Från detta steg på, införliva varje aminosyra i peptid kedjan som en sekvens av steg: först deprotection den N-terminala Fmoc-gruppen, och sedan diska, följt av kopplingen av aminosyran via aktivering med hjälp av HCTU.
Obs: Koppling längre (t.ex., 2 h) rekommenderas om koppling efter en koalisera hindras aminosyra rester [t.ex., Fmoc-Thr (tBu) - OH, Fmoc-Cys (Trt) - OH, Fmoc, hans (Trt) - OH, Fmoc-Arg (Pbf) - OH]. Den alkene/alkynen med un-naturliga aminosyror används i 3 medel istället för 5 och lämnas för att reagera för 3 h. - Övervaka peptid syntes med Kaiser eller kloranil tester som beskrivs av Arora o.a. 36 dessa tester ger kvalitativa bedömningar av närvaro eller frånvaro av gratis primära och sekundära aminer. Alternativt kan cirka 2-3 mg av peptiden klyvs från kådan och analyseras av LC-MS.
5. thiol-ene Hydrothiolation och Thiol-yne ringbildning
- Konstruera thioether linker genom om-harts ringbildning (figur 3).
- Förbereda ca 50 mL av Trt deprotection lösningen (TFA/TIS/DCM 0.03/0.06/1.0). Behandla den Cys- och mS5-lager harts [NH2-R-mS5-A-A-A-Cys (Trt)-R'-harts, 50 mg] med 1-2 mL av Trt deprotection lösningen i en 10 mL-kolumn. Blanda försiktigt lösningen för 10 min använder N2. Slutligen, tvätta det med DCM (1-2 mL) för sammanlagt 3 x.
Obs: MS5 representerar den alkylene räntebärande byggstenen (se struktur avbildas i figur 6) används för peptid koppling och thio-ene ringbildning38. - Upprepa proceduren ovan för sammanlagt cirka 6 x för att ta bort gruppen trityl skydd av cystein, tills lösningen färgen inte längre gul.
- Bubblade med N2, tvätta den R-mS5- en-A-A-Cys(-SH)-R'-harts [cystein med gratis thio (-SH)] med DMF (1-2 mL) och DCM (1-2 mL) i den ordningen. Krympa kådan med metanol (1-2 mL) för 2 min och ta sedan bort vätskan med hjälp av filtrering. Nästa, sekventiellt torr kådan under en ånga N2 gas under cirka 5 minuter i kolumnen.
- Förbereda avgasade DMF i förväg, inom en mun kolv, av bubblande kvävgas för ungefär 1 h genom en lång nål som sträcktes i lösningsmedlet.
- Över massan till en 10 mL-rundbottnad kolv genom väga papper. Avbryta kådan i 2 mL den avgasade DMF följt av tillägg av photoinitiator 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone (MMP; 1 motsv., 5,6 mg), 4-methoxyacetophenone (karta; 1 motsv., 3,8 mg).
- Lägga till en uppståndelse bar (0.3 cm) i kolven och mössa kolven med en lämplig Gummiplugg, då tränga undan luften i kolven med kvävgas som använder oljepump.
Obs: I inert atmosfär är inte absolut nödvändigt för den effektiva thio-ene är på en fast fas. Men är det mycket nödvändigt för den thio-yne är i lösning fas i figur 5. Annars oxiderar svavel under UV bestrålning. - Ställa in reaktionskolven i photoreactor och rör kådan för 1 h under UV-bestrålning vid rumstemperatur (figur 2).
FÖRSIKTIGHET: Innan du växlar photoreactor UV-lampa, se till att photoreactor dörren är stängd om det finns skadlig bestrålning från UV-ljus.
Obs: Ofta provtagning reaktionsblandningen under photoreactions rekommenderas för nya sekvenser, eftersom linjär peptid föregångaren har identiska molekylvikten för produkten. I allmänhet, visar linjär och cykliska peptider signifikant hydrophilicitet. Detta kunde lätt skiljas med HPLC. Alternativt, 5, 5' - dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) reagens kunde också användas för att studera förekomsten av gratis thiol37. - Överföra kådan från kolven i kolumnen och ta bort lösningsmedlet med dammsugarfilter. Tvätta och torka kådan som beskrivs i steg 5.1.3.
- Förbereda ca 10 mL av klyvning cocktail (TFA/TIPS/EDT/H2O 94/1/2.5/2.5) i dragskåp.
- Överför massan till en 2-mL polypropylen behållare, tillsätt 1 mL klyvning cocktail (TFA/TIPS/EDT/H2O 94/1/2.5/2.5) till behållaren och täta behållaren ordentligt med ett skruvlock. Sedan försiktigt skaka behållaren i orbitalskak med en hastighet av 60 rpm i spiskåpa för 1,5-2 h.
Varning: TFA är starkt frätande. Använd skyddskläder och arbetar i en effektiv spiskåpa. EDT är en mycket illaluktande ämne och måste hanteras i en effektiv spiskåpa. - Ta bort transfettsyror cocktail genom avdunstning under en N2 gasström i dragskåp. Nästa, fällningen återstoden använder kall dietyleter (1 mL) för 30 s och isolera den via centrifugering vid 12 000 x g i 2 min. Efter centrifugeringen, försiktigt utgjuta komponenten eter. Upprepa stegen fällningen och centrifugering för 2 x. Avdunsta återstoden till torrhet.
- Slutligen, lös upp restmaterialet i 1 mL H2O/acetonitril (2:1) och rena genom HPLC med en C18 analytic kolonn (4.6 x 250 mm, flödeshastighet 1,0 mL/min). Använd H2O (som innehåller 0,1% TFA) och ren acetonitril som lösningsmedel i en 2%/min linjär gradient från 20% till 70% acetonitril över 25 min. Monitor HPLC spectra med hjälp av UV-280 nm och 220 nm våglängder (tabell 2).
- Förbereda ca 50 mL av Trt deprotection lösningen (TFA/TIS/DCM 0.03/0.06/1.0). Behandla den Cys- och mS5-lager harts [NH2-R-mS5-A-A-A-Cys (Trt)-R'-harts, 50 mg] med 1-2 mL av Trt deprotection lösningen i en 10 mL-kolumn. Blanda försiktigt lösningen för 10 min använder N2. Slutligen, tvätta det med DCM (1-2 mL) för sammanlagt 3 x.
- Konstruera thioether länkaren genom intermolekylära thio-ene reaktion, och sedan cyclize peptiden genom macrolactamization (figur 4).
- Syntetisera alkylene återstoden kullager den linjära peptid H2N-A-A-A-mS5(2-R'')-R'-harts (50 mg) med standard Fmoc-baserade fasta fasen peptidsyntesen (SPPS) som beskrivs i steg 2-4. Nästa, tvätta och torka kådan som beskrivs i steg 5.1.3.
- Avbryta kådan i en 10 mL rundkolv innehållande 2 mL den avgasade DMF som beskrivs i steg 5.1.4.
- Lägg till photoinitiator MMP och karta (MMP: 1 motsv., 5,6 mg; Karta: 1 motsv., 3,8 mg), Fmoc-Cys-OH (3 motsv., 25,7 mg), och uppståndelse bar (0.3 cm) i kolven. Cap kolven med hjälp av en lämplig Gummiplugg och sedan använda oljepumpen att byta ut luften i kolven med kväve.
- Ställa in reaktionskolven i photoreactor. Rör om 1-2 h under UV-bestrålning vid rumstemperatur (figur 2).
- Övervaka reaktionen under en LC-MS-analys: klyva 2-3 mg av kådan med klyvning cocktail. Sedan fällningen återstoden med kall dietyleter (300 µL), isolera återstoden genom centrifugering och avdunsta återstoden till torrhet som beskrivs i steg 5.1.11. Efter det, lös upp restmaterialet i 100 µL av H2O/acetonitril (2:1). Filtratet peptid lösningen med en 0,22 µm mikroporös film och analysera den med LC-MS med föreningen joniserat i elektrospray joniseringen (ESI) och drivs i positivt läge.
- Om nödvändigt, upprepa steg 5.2.2 - utförs 5.2.4 att säkerställa reaktionen till fullbordan.
- Efter slutförandet av foto-reaktionen, överföra kådan från kolven i kolumnen och ta bort lösningsmedlet med dammsugarfilter. Tvätta och torka kådan som beskrivs i steg 5.1.3.
- Tillsätt den DMF lösningen bensotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorofosfat (PyBob; 2,4 motsv., 31,2 mg), 1-hydroxybenzotriazole (HoBt; 2,4 motsv., 8,1 mg), och NMM (4 motsv., 11 µL) till harts i kolumnen för macrolactamization. Bubbla denna lösning med N2 för 2 h.
- Dessutom övervaka denna koppling reaktion med LC-MS enligt beskrivningen i steg 5.2.3. Om nödvändigt, upprepa detta steg för att säkerställa reaktionen utförs till fullbordan.
- Elongate peptiden med standard Fmoc-baserade SPPS som beskrivs i steg 3 och 4.
- Vid montering av alla aminosyra rester, klyva peptiden från kådan som beskrivs i steg 5.1.10 och 5.1.11 och rena det som beskrivs i steg 5.1.12.
- Konstruera vinyl svavelväte länkaren i lösning fas (figur 5).
- Syntetisera alkynen återstoden med linjär peptid med standard Fmoc-baserade SPPS enligt beskrivningen i steg 2-4. Syntetisera de alkynen försedda aminosyra enligt en väletablerad protokoll som beskrivs i en tidigare studie20.
- Klyva peptiden från kådan och fällningen det med kall dietyleter enligt beskrivningen i steg 5.1.9 - 5.1.11. Efter den klyvning och utfällning av kådan, samla peptiden med centrifugering vid 12 000 x g i 2 min.
- Torka resulterande återstoden i ett vakuum. Lös upp restmaterialet i den avgasade DMF (50 mL) i en 100 mL-rundbottnad kolv för att nå en slutlig koncentration av 0,5 mM (baserat på inläsningen av harts, 0,025 mmol (1000 mL/L / 0,5 mmol/L) = 50 mL).
- Lägg till photoinitiator DMPA (0,5 motsv., 3,2 mg) och sedan lufta reaktion lösningen för 10 min med N2 via en lång nål som sträckte sig in i lösningen. Därefter bestråla provet under UV-ljus vid rumstemperatur för 0,5 - 1 h utan agitation.
- Ta bort DMF under en hög vakuum och fällningen rå återstoden genom att lägga till dietyleter för att lösa upp dess ekologiska biprodukter. Sedan isolera återstoden med centrifugering vid 12 000 x g i 2 min. Efter centrifugeringen, försiktigt utgjuta komponenten eter. Avdunsta återstoden till torrhet. Slutligen, lös upp restmaterialet i 1 mL H2O/acetonitril (2:1) och rena det med hjälp av HPLC som beskrivs i steg 5.1.7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De HPLC och MS-spektra av peptiden Ac-Guitar5AAAC-NH2 och dess cyclized produkt Ac - Y-(cyclo-1,5)-[mS5AAAC] - NH2 som genererades med på-harts intramolekylära thiol-ene är skildras i figur 6b. den cykliska peptiden upptäcktes att en identisk molekylvikt i förhållande till dess linjära föregångare. Dess HPLC retentionstiden observerades dock vara cirka 2 min tidigare än sina föregångare på samma separation villkor. Kort peptider med olika sekvenser observerades alla för att ha en bra konvertering, som avbildas i figur 6 c.
Urvalsförfarandet för thio-yne är villkoren avbildas i figur 7Boch isomer omvandling och baserat på fastställdes genom integrering av HPLC med omvänd fas. Endast spårämnesnivåer av peptid 2c observerades efter UV-bestrålning. Detta beror sannolikt på en konfirmerande preferens för en fångst av thiyl radikala vid N-terminalen under upphandlande steg till en 20-membered macrocycle. Både peptider 1a och 1b konstaterades för att generera två isomerer med en 8-medlem vinyl svavelväte crosslink. Peptider 2a-A och 2a-B, som genererades från peptid 1a, uppvisade tydliga retentionstiderna samt olika nyckeltal för olika UV-bestrålning gånger (0 - 30 min) (figur 7 c). Dessa tilldelades som de E/Z isomererna på grund av dubbelbindningen proton signalerna på 1H-NMR-spektroskopi (figur 7 d). När det gäller peptider 2d-2f befanns Z-isomeren vara den dominerande produkten. Detta beror sannolikt på den konfirmerande preferensen under byggandet av en kompakt struktur i förhållande till de 8-medlem vinyl svavelväte crosslink. Som avbildas i figur 7E, enligt cirkulärdichroism (CD) spektrumet, peptider 2a-A/B och 2b-A/B som besitter en 8-medlem vinyl svavelväte crosslink uppvisar en slumpmässig spole, medan peptid 2d som besitter en 7-medlem vinyl svavelväte crosslink uppvisar en spiralformade konformation. I sammanfattning, Z-isomeren av vinyl svavelväte bond befanns bildas prioriterat och visas en bättre helix induktion.
Figur 1: manuell peptid-syntes apparater för fast fas peptidsyntesen. Kolumnerna placerades på vakuum grenröret genom de tre-vägs Avstängningskranar och apparaten var ansluten till en kväve eller argon gas för bubblande. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: den photoreactor anordning som används för photoreactions. Enheten var utrustad med tio 350 nm lampor (Tabell för material) för UV-strålning och en argon gastank att säkerställa att photoreactor var fylld med argongas före och under photoreactions. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: på-harts intramolekylära thiol-ene reaktion när det gäller kortare peptider. Denna reaktion genomfördes med hjälp av en på-harts deprotection trityl grupper av cystein rester efter komplett syntesen av den linjära peptiden och ange sedan kådan till UV bestrålning med hjälp av photoinitiators karta och MMP. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: på-harts intermolekylära thio-ene reaktion. Denna reaktion var utförs av upplösning Fmoc-Cys-OH i DMF lösningsmedlet och sedan bestrålas med alkene-bärande peptid restmaterialet harts, följt av en macrolactamization med PyBop, HoBt och NMM som aktivering reagenser. Sedan peptidsyntesen fortsatte med en standard SPPS. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: intramolekylära thiol-yne reaktion i lösning fas. Denna reaktion genomfördes i lösning fasen efter komplett syntesen av den linjära peptiden, varefter linjär peptiden upplöstes i avgasade DMF och bestrålas med UV-ljus med photoinitiator DMPA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Thioether uppbundna cykliska peptider som genereras med hjälp av en på-harts intramolekylära thiol-ene reaktion. A. denna panel visar systematiken i på-harts intramolekylära thio-ene reaktionen. mS5: ”m” representerar de mono-substituerade olenic aminosyrorna, ”S” representerar S konfigurerad aminosyran och ”5” refererar till antalet side chain atomer38. B. Detta paneler visar de HPLC och MS-spektra av peptiden Ac-Guitar5AAAC-NH2 före och efter dess ringbildning. C. denna panel visar omvandlingen av de cykliska peptiderna med olika sekvenser. Denna siffra har ändrats från Zhao, B. et al.28 vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 7: peptid häftning genom foto-inducerad thiol-yne hydrothiolation. A. Detta är en Schematisk illustration av intramolekylära thiol-yne hydrothiolation. B. i denna panel visas de peptid-sekvenser som utvärderas i denna studie. Initiativtagare: (I) 0,5 eq. DMPA, 1 h; (II) inga initiativtagare, 1 h; (III) 0,5 eq. DMPA, 0,5 eq. karta, 1 h; (IV) 0,5 eq. MMP, 0,5 h. C. Denna panel visar HPLC tracesna av reaktionsblandningen peptid 1a med olika UV bestrålning tider och övervakas på 220 nm. D. i denna panel visas 1H-NMR spectra 1a, 2a-A, och 2a-B (mätt i DMSO-d6 på 400 MHz). Asteriskerna visar bildandet av en vinyl svavelväte dubbelbindning efter UV-bestrålning. E. i denna panel visas cirkulärdichroism spektra av peptider med vinyl svavelväte tvärbindningar. Denna siffra har ändrats från Tian, Y. et al. 44 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Material | MW | N(0.5mmol / g harts × 0. 0 5 g × 5eq.) | M(aminosyra) (mg) |
| (Da) | (mmol) | ||
| Fmoc-Gly-OH | 297 | 0,125 | 37,1 |
| Fmoc-Ala-OH | 331 | 0,125 | 41,4 |
| Fmoc-Val-OH | 339 | 0,125 | 42,4 |
| Fmoc-Leu-OH | 353 | 0,125 | 44,1 |
| Fmoc-Ile-OH | 353 | 0,125 | 44,1 |
| Fmoc-Pro-OH | 337 | 0,125 | 42,1 |
| Fmoc-Phe-OH | 387 | 0,125 | 48,4 |
| Fmoc-Tyr (tBu)-OH | 460 | 0,125 | 57,5 |
| Fmoc-Trp (Boc)-OH | 527 | 0,125 | 65,9 |
| Fmoc-Ser (tBu)-OH | 384 | 0,125 | 48 |
| Fmoc-Thr (tBu)-OH | 398 | 0,125 | 49,8 |
| Fmoc-Cys (Trt)-OH | 586 | 0,125 | 73,3 |
| Fmoc-träffade-OH | 372 | 0,125 | 46,5 |
| Fmoc-Asn (Trt)-OH | 597 | 0,125 | 74,6 |
| Fmoc-Gln (Trt)-OH | 611 | 0,125 | 76,4 |
| Fmoc-Asp (OtBu)-OH | 412 | 0,125 | 51,5 |
| Fmoc-Glu (OtBu)-OH | 426 | 0,125 | 53,3 |
| Fmoc-Lys (Boc)-OH | 469 | 0,125 | 58,6 |
| Fmoc-Arg (Pbf)-OH | 617 | 0,125 | 77,1 |
| Fmoc, hans (Trt)-OH | 620 | 0,125 | 77,5 |
| HCTU | 414 | 0.122 | 50,5 |
| DIPEA | 129 | 0,25 | 43.5(ΜL) |
| DMF | 0,5 mL | ||
Tabell 1: Belopp av koppling villkor.
| Kolumn | Zorbax SB-Aq kolumn, 4,6 × 250 mm (porstorlek 80 Å, partikel storlek 5 μm) |
| Lösningsmedel | A: vatten, 0,1% (vol/vol) TFA; B: acetonitril |
| Flödeshastighet | 1 mL/min |
| Lutning | 20 – 70% (vol/vol) B över 25 min; 70% - 98% över 5 min; 98% över 5min; |
| Injektionsvolym | 30 – 500 ΜL |
| Våglängd (nm) | 280 (för Fmoc-, Trp- eller Tyr-innehållande peptider), eller 494 (FITC-märkt peptider) eller 220 (för andra) |
Tabell 2: Högpresterande vätskekromatografi villkor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I på-harts intramolekylära thio-ene ringbildning beskrivs i figur 3, befanns avlägsnande av gruppen trityl av en cysteinrest vara ett viktigt steg för den efterföljande är. Dessutom avbildas peptid molekylvikten före och efter reaktionen befanns vara identiska som i figur 6B. Därför krävs användning av en HPLC-identifiering eller ett DTNB-test för att övervaka reaktionen. När det gäller intermolekylära thio-ene reaktionen beskrivs i figur 4, är MS övervakning nödvändig. Medan ytterligare ett steg av laktam koppling befanns vara krävs för uppförande av en thioether tjuder, föreslår vi att detta protokoll kommer att användas för långa peptider för att uppnå en övergripande högre effektivitet.
Den vinyl svavelväte bond genereras av den thio-yne är var inte stabil i starkt sur TFA lösningen som används för harts klyvning. Därför, användningen av den thio-yne är i fasen lösning antogs. Denna reaktion var utspätt till en låg koncentration (0,5 mM) för att undvika potentiella intermolekylära av-reaktioner. Det är också lika viktigt att degas lösningsmedlet för att undvika produkten oxidation under photoreactions. Efter reaktionen, vakuum avdunstning av organiska lösningsmedlet DMF bör också noggrant utföras för att förhindra peptid oxidation/nedbrytning eller maskiner avskrivningar. Thio-yne ringbildning reaktionen avbildas i figur 5 ger en mekanism för efter peptidsyntesen ändring35.
Medan de intramolekylära thiol-ene reaktionen genereras framgångsrikt thioether uppbundna peptider med bra konvertering, lyckats en enkel thioether korslänk begränsa peptiderna in önskad spiralformade konformation. Baserat på detta på-tether ändring strategi, en i-tether kirala center inducerad peptid helicity konceptet utvecklades, där γ ersättas med R konfigurationen vid peptiden C-terminal kunde framkalla peptidens spiralformade konformation ( Figur 4)39,40. Begränsningen är associerad med detta tillvägagångssätt är syntesen av enantiomerically ren onaturliga aminosyran med två kirala centra (α (S), γ(R))41,42.
Denna forskning visade att thio-yne reaktionen kan begränsa peptiden till en spiralformade konformation med bra omvandling, som avbildas i figur 7E. När det gäller byggandet av spiralformade peptider rekommenderar vi thio-yne är för byggandet av spiralformade peptider. På-harts intramolekylära thio-ene ringbildning visades vara lämpliga för uppförande av kort thioether tjuder peptider (mindre än 15) om lång peptider är alltför flexibla för att säkerställa effektiv ringbildning. Dessutom rekommenderas på-harts intermolekylära thio-ene ringbildning för lång peptid ringbildning.
Sammanfattningsvis har vi utvecklat en serie kemiska protokoll för byggandet av thioether/vinyl svavelväte uppbundna peptider genom användning av photoinduced thio-ene/thio-yne Klicka på kemi. Reaktionen är effektiv, metall katalysator-gratis, bekvämt för manipulationer, och har visats ha en överlägsen funktionell grupp tolerans och bio-ortogonala. Denna metod utvecklades ytterligare, för att stabilisera andra peptid sekundära strukturer såsom en β-hårnål43,44. Detta papper visar att thioether tjuder ger en traceless modifiering webbplats. Detta utökar till stor del kemiska utrymmet efter peptid syntes modifiering. Dessutom de alifatiska thioether/vinyl svavelväte uppbundna peptider som uppvisade en minskad membran toxicitet i förhållande till kolväte krampa peptiderna tillämpas i olika biologiska tillämpningar med visat bra bioaktivitet och biotillgängligheten45,46.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna erkänner finansiellt stöd från de naturvetenskap Foundation av Kina bidrag (nr 21372023, 21778009 och 81701818); Ministeriet för vetenskap och teknik av folkets republik av Kina (nr. 2015DFA31590); Shenzhen vetenskap och teknik Innovation kommittén (nr. JCYJ20170412150719814, JCYJ20170412150609690, JCYJ20150403101146313, JCYJ20160301111338144, JCYJ20160331115853521, JSGG20160301095829250 och GJHS20170310093122365); och Kina postdoktorala Science Foundation (nr 2017 M 610704).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rink Amide MBHA resin(0.53 mmol/g) | HECHENG | GRM50407 | |
| Standard Fmoc-protected amino acids | GL Biochem (Shanghai) Ltd. | ||
| N-Methyl-2-pyrrolidinone | Shenzhen endi Biotechnology Co.Ltd. | 3230 | skin harmful |
| N,N-Dimethyl formamide | Energy | B020051 | skin harmful |
| Dichloromethane | Energy | W330229 | skin harmful |
| N,N-Diisoproylethylamine | Aldrich | 9578 | irritant |
| Trifluoroacetic acid | J&K | 101398 | corrosive |
| Triisopropylsilane | J&K | 973821 | |
| 1,2-Ethanedithiol | J&K | 248897 | Stench |
| 2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium hexafluorophosphate | GL Biochem (Shanghai) Ltd. | 851012 | |
| Morpholine | Aldrich | M109062 | irritant |
| Diethyl ether | Aldrich | 673811 | flammable |
| Acetonitrile | Aldrich | 9758 | toxicity |
| Methanol | Aldrich | 9758 | toxicity |
| 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone | Energy | A050035 | |
| 4-methoxyacetophenone | Energy | A050098 | |
| 2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone | Energy | D070132 | |
| 5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) | J&K | 281281 | |
| Benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate | Energy | E020172 | |
| 1-Hydroxybenzotriazole | Energy | D050256 | |
| 4-Methylmorpholine | Energy | W320038 | |
| High Performance Liquid Chromatography | SHIMADZU | LC-30AD | |
| Electrospray Ionization Mass | SHIMADZU | LCMS-8030 | |
| Lyophilizer | Labconco | FreeZone | |
| SpeedVac concentration system | Thermo | Savant | |
| vacuum manifold | promega | A7231 | |
| three-way stopcocks | Bio-Rad | 7328107 | |
| poly-prep chromatography columns | Bio-Rad | 7311550 |
References
- Pelay-Gimeno, M., Glas, A., Koch, O., Grossmann, T. N. Structure-based design of inhibitors of protein-protein interactions: mimicking peptide binding epitopes. Angewandte Chemie International Edition. 54 (31), 8896-8927 (2015).
- Passioura, T., Katoh, T., Goto, Y., Suga, H. Selection-based discovery of druglike macrocyclic peptides. Annual Review of Biochemistry. 83, 727-752 (2014).
- Gonzalez, M. W., Kann, M. G.
- Wilson, A. J. Inhibition of protein-protein interactions using designed molecules. Chemical Society Reviews. 38 (12), 3289-3300 (2009).
- Teresa, A. F. C., Alessio, C. Cyclic and macrocyclic peptides as chemical tools to recognise protein surfaces and probe protein-protein interactions. ChemMedChem. 11 (8), 787-794 (2016).
- Craik, D. J., Fairlie, D. P., Liras, S., Price, D.
- Cromm, P. M., Spiegel, J., Grossmann, T. N. Hydrocarbon stapled peptides as modulators of biological function. ACS Chemical Biology. 10 (6), 1362-1375 (2015).
- Zhang, Q. Z., Tian, Y., Lao, Y. Z., Li, Z. G. Peptides-staple method development and its application in cancer therapy. Current Medicinal Chemistry. 21 (21), 2438-2452 (2014).
- Cromm, P. M., Spiegel, J., Grossmann, T. N. Hydrocarbon stapled peptides as modulators of biological function. ACS Chemical Biology. 10 (6), 1362-1375 (2015).
- Wang, D., Liao, W., Arora, P. S. Enhanced metabolic stability and protein-binding properties of artificial alpha helices derived from a hydrogen-bond surrogate: application to Bcl-xL. Angewandte Chemie International Edition. 44 (40), 6525-6529 (2005).
- Bullock, B. N., Jochim, A. L., Arora, P. S. Assessing helical protein interfaces for inhibitor design. Journal of the American Chemical Society. 133, 14220-14223 (2011).
- Jackson, D. Y., King, D. S., Chmielewski, J., Singh, S., Schultz, P. G. General approach to the synthesis of short α-helical peptides. Journal of the American Chemical Society. 113 (24), 9391-9392 (1991).
- Timmerman, P., Beld, J., Puijk, W. C., Meloen, R. H. Rapid and quantitative cyclization of multiple peptide loops onto synthetic scaffolds for structural mimicry of protein surfaces. ChemBioChem. 6 (5), 821-824 (2005).
- Muppidi, A., Wang, Z., Li, X., Chen, J., Lin, Q. Achieving cell penetration with distance-matching cysteine cross-linkers: a facile route to cell-permeable peptide dual inhibitors of Mdm2/Mdmx. Chemical Communications. 47 (33), 9396-9398 (2011).
- Schafmeister, C. E., Po, J., Verdine, G. L. An all-hydrocarbon cross-linking system for enhancing the helicity and metabolic stability of peptides. Journal of the American Chemical Society. 122 (24), 5891-5892 (2000).
- Osapay, G., Taylor, J. W. Multicyclic polypeptide model compounds. 1. synthesis of a tricyclic amphiphilic alpha-helical peptide using an oxime resin, segment-condensation approach. Journal of the American Chemical Society. 112 (16), 6046-6051 (1990).
- Lau, Y. H., Andrade, dP., Wu, Y., Spring, D. R. Peptide stapling techniques based on different macrocyclisation chemistries. Chemical Society Reviews. 44 (1), 91-102 (2015).
- Spokoyny, A. M., Zou, Y., Ling, J. J., Yu, H., Lin, Y. S., Pentelute, B. L. A perfluoroaryl-cysteine S(N)Ar chemistry approach to unprotected peptide stapling. Journal of the American Chemical Society. 135 (16), 5946-5949 (2013).
- Lautrette, G., Touti, F., Lee, H. G., Dai, P., Pentelute, B. L. Nitrogen arylation for macrocyclization of unprotected peptides. Journal of the American Chemical Society. 138 (27), 8340-8343 (2016).
- Tian, Y., et al. Stapling of unprotected helical peptides via photoinduced intramolecular thiol-yne hydrothiolation. Chemical Science. 7 (5), 3325-3330 (2016).
- Chang, Y. S., et al. Stapled α-helical peptide drug development: a potent dual inhibitor of MDM2 and MDMX for p53-dependent cancer therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (36), 3445-3454 (2013).
- Zhao, H., et al. Crosslinked aspartic acids as helix-nucleating templates. Angewandte Chemie International Edition. 55 (39), 12088-12093 (2016).
- Leshchiner, E. S., et al. Direct inhibition of oncogenic KRAS by hydrocarbon-stapled SOS1 helices. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (6), 1761-1766 (2015).
- Wang, D., Qin, X., Zhao, H., Li, Z. N-cap helix nucleation: methods and their applications. Science China Chemistry. 60 (6), 689-700 (2017).
- Zorzi, A., Deyle, K., Heinis, C. Cyclic peptide therapeutics: past, present and future. Current Opinion in Chemical Biology. 38, 24-29 (2017).
- Hu, K., et al. An in-tether chiral center modulates the helicity, cell permeability, and target binding affinity of a peptide. Angewandte Chemie International Edition. 55 (28), 8013-8017 (2016).
- Lin, H., Jiang, Y., Zhang, Q., Hu, K., Li, Z. An in-tether sulfilimine chiral center induces helicity in short peptides. Chemical Communications. 52 (68), 10389-10391 (2016).
- Zhao, B., Zhang, Q., Li, Z. Constructing thioether-tethered cyclic peptides via on-resin intra-molecular thiol-ene reaction. Journal of Peptide Science. 22 (8), 540-544 (2016).
- Dondoni, A., Massi, A., Nanni, P., Roda, A. A new ligation strategy for peptide and protein glycosylation: photoinduced thiol-ene coupling. Chemistry. 15 (43), 11444-11449 (2009).
- Hu, K., Sun, C., Li, Z. Reversible and versatile on-tether modification of chiral-center-induced helical peptides. Bioconjugate Chemistry. 28 (7), 2001-2007 (2017).
- Shi, X., Jiang, Y., Yang, D., Zhao, H., Tian, Y., Li, Z. Reversibly switching the conformation of short peptide through in-tether chiral sulfonium auxiliary. Chinese Chemical Letters. , In Press (2017).
- Jiang, Y., et al. Switching substitution groups on the in-tether chiral centre influences backbone peptides' permeability and target binding affinity. Organic & Biomolecular Chemistry. 15 (3), 541-544 (2017).
- Aimetti, A. A., Shoemaker, R. K., Lin, C. C., Anseth, K. S. On-resin peptide macrocyclization using thiol-ene click chemistry. Chemical Communications. 46 (23), 4061-4063 (2010).
- Wang, Y. X., Chou, D. H. C. A thiol-ene coupling approach to native peptide stapling and macrocyclization. Angewandte Chemie International Edition. 54 (37), 10931-10934 (2015).
- Wang, Y., et al. Application of thiol-yne/thiol-ene reactions for peptide and protein macrocyclizations. Chemistry. 23 (29), 7087-7092 (2017).
- Patgiri, A., Menzenski, M. Z., Mahon, A. B., Arora, P. S. Solid-phase synthesis of short α-helices stabilized by the hydrogen bond surrogate approach. Nature Protocols. 5 (11), 1857-1865 (2010).
- Ozyurek, M., Baki, S., Gungor, N., Celik, S. E., Guclu, K., Apak, R. Determination of biothiols by a novel on-line HPLC-DTNB assay with post-column detection. Analytica Chimica Acta. 750, 173-181 (2012).
- Zhang, Q. Z., et al. Chiral sulfoxide-induced single turn peptide α-helicity. Scientific Reports. 6, 38573 (2016).
- Lin, H., et al. An in-tether sulfilimine chiral center induces beta-turn conformation in short peptides. Organic & Biomolecular Chemistry. 14 (42), 9993-9999 (2016).
- Hu, K., Li, W., Yu, M., Sun, C., Li, Z. Investigation of cellular uptakes of the in-tether chiral-center-induced helical pentapeptides. Bioconjugate Chemistry. 27 (12), 2824-2827 (2016).
- Hu, K., et al. A precisely positioned chiral center in an i, i + 7 tether modulates the helicity of the backbone peptide. Chemical Communications. 53 (50), 6728-6731 (2017).
- Li, J., et al. An in-tether chiral center modulates the proapoptotic activity of the KLA peptide. Chemical Communications. 53 (75), 10452-10455 (2017).
- Zhao, B., et al. A thioether-stabilized-D-proline-L-proline-induced β-hairpin peptide of defensin segment increases its anti-Candida albicans ability. ChemBioChem. 17 (15), 1416-1420 (2016).
- Tian, Y., Yang, D., Ye, X., Li, Z. Thioether-derived macrocycle for peptide secondary structure fixation. The Chemical Record. 17 (9), 874-885 (2017).
- Hu, K., Yin, F., Yu, M., Sun, C., Li, J., Liang, Y., Li, W., Xie, M., Lao, Y., Liang, W., Li, Z. G. In-tether chiral center induced helical peptide modulators target p53-MDM2/MDMX and inhibit tumor growth in stem-like cancer cell. Theranostics. 7 (18), 4566-4576 (2017).
- Tian, Y., Jiang, Y., Li, J., Wang, D., Zhao, H., Li, Z. Effect of stapling architecture on physiochemical properties and cell permeability of stapled α-helical peptides: a comparative study. ChemBioChem. 18 (21), 2087-2093 (2017).
