Summary
Qui descriviamo un protocollo per stabilire e coltura umano e del mouse-derivato organoids gastrico 3-dimensionale (3D) e il metodo per il trasferimento di organoids 3D di un monostrato di 2-dimensionale. L'uso del monolayer epiteliale gastrico come un'analisi novella di zero-ferita per studi di rigenerazione è anche descritto.
Abstract
Studi in vitro della riparazione arrotolata gastrico in genere comporta l'uso di linee cellulari di cancro gastrico in un dosaggio zero-ferita di migrazione e proliferazione cellulare. Una limitazione critica di tali dosaggi, tuttavia, è loro assortimento omogeneo di tipi cellulari. Riparazione è un processo complesso che richiede l'interazione di diversi tipi di cellule. Pertanto, studiare una cultura priva di sottotipi cellulari, è una preoccupazione che dovrà essere superata se vogliamo comprendere il processo di riparazione. Il modello organoid gastrico può alleviare questo problema per cui la raccolta eterogenea di tipi di cellule strettamente riflette quella dell'epitelio gastrico o altri tessuti in vivo. Ha dimostrato qui è un romanzo in vitro dosaggio zero-ferita derivato da umani o organoids 3-dimensionale del mouse che possono essere trasferiti a un monostrato epiteliale gastrico come entrambi organoids intatto o come una sospensione unicellulare di dissociato organoids. L'obiettivo del protocollo è quello di stabilire monostrati epiteliali gastrici organoid-derivato che possono essere utilizzati in un sistema di analisi novella zero-ferita per studiare rigenerazione gastrico.
Introduction
L'uso di metodi di zero-ferita è un metodo popolare per lo studio della rigenerazione e riparazione1,2,3,4,5,6. La metodologia proposta può essere usata per studiare specificamente rigenerazione gastrico e Helicobacter pylori colonizzazione. In passato, linee cellulari di cancro gastrico sono stati utilizzati come mezzo per studiare l' Helicobacter pylori (H. pylori) infezione1,2 e fino a cancro gastrico recentemente linee cellulari quali le cellule AGS erano favorito1 ,2,3,4. Una limitazione di colture di cellule di cancro gastrico è loro fallimento di ricapitolare la diversità cellulare dell'epitelio gastrico. Per tentare di risolvere questa limitazione, dimostrato che qui è l'istituzione e il trasferimento dei primari umani - e mouse-derivati 3-dimensionale fundic gastrica organoids (FGOs) di un monostrato epiteliale gastrico per ferita guarigione saggi basati su un metodo modificato prima descritto da Schlaermann et al. 7 dimostriamo che gastrici monostrati epiteliali derivati da Tosato 3D FGOs gastrico o FGO-derivato singole cellule conservano una composizione cellulare polarizzata che strettamente rappresenta che dell'epitelio gastrico in vivo. Dato che le linee cellulari del cancro gastrico non dimostrano la composizione cellulare che questa tecnica consente di visualizzare, l'attuale protocollo ha un vantaggio rispetto ai metodi alternativi dosaggio zero-ferita. Questa metodologia è stata ottimizzata per cui gli strati monomolecolari possono essere stabilita da organoids intero o da una sospensione singola cella da organoids dissociate e placcato utilizzando una matrice della membrana basale o collagene-rivestimento. L'obiettivo generale del presente protocollo è quello di stabilire che un organoid derivato colture monostrato epiteliale gastrica per un'analisi di guarigione della ferita romanzo.
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Protocol
Per evitare contaminazioni, eseguire protocollo nella sua interezza all'interno di una cappa di sterili per coltura. Tessuto umano fundic è stato raccolto da pazienti sottoposti a gastrectomia verticale secondo il protocollo approvato IRB Università di Cincinnati (numero di protocollo IRB: 2015-4869).
Tutti gli studi del topo sono stati approvati dall'Università di Cincinnati istituzionali cura degli animali e uso Committee (IACUC) che gestisce un impianto di associazione americana di valutazione e accreditamento di laboratorio animale cura (AAALAC).
1. istituzione di derivazione umana 3D gastrico fundico Organoids
Nota: Questo protocollo si basa sulla ricerca precedentemente pubblicata in questo laboratorio8.
- Preparare i supporti 3D organoid che consiste di 50% Wnt-condizionate e 20% R-spondin condizionata media.
- Preparare il supporto di Wnt condizionata, coltura le cellule L nel mezzo di crescita Wnt (Dulbecco s modified Eagle Medium (DMEM), 10% siero bovino fetale (FBS), 1% penicillina/streptomicina) per 7 giorni, raccogliere il mezzo e del filtro utilizzando un filtro da 0,22 µm.
- Preparare i supporti R-spondin condizionata. Crescere una linea cellulare che secerne modificata di HEK 293T R-spondin in R-spondin crescita medio (Dulbecco s modified Eagle Medium (DMEM), 10% siero bovino fetale (FBS), 1% penicillina/streptomicina). All'allegato dopo 2 h, modificare il mezzo da queste cellule a crescita OPTIMEM medium, 1% penicillina/streptomicina. Coltura delle cellule per 7 giorni. Poi raccogliere i media di R-spondin condizionata e filtrare usando un filtro da 0,22 µm.
Nota: Questo protocollo è stato pubblicato in precedenza e per un protocollo più dettagliato fare riferimento a 6,7,8.
- Scongelare la matrice della membrana dello scantinato ridotta, privo di rosso fenolo di fattore di crescita per 16 h sul ghiaccio a 4 ° C. Raccogliere il tessuto nel Ca2 +/Mg2 +ghiaccio freddo-gratis DBPS in un grande contenitore di plastica. Memorizzare sul ghiaccio fino al punto di inizio 1.4.
Nota: Il tessuto è raccolto da pazienti sottoposti a gastrectomia. - Usando il forcipe, lavare il tessuto vigorosamente in un becher sterile contenente 100 mL Ca2 +/Mg2 +-libero Phosphate Buffered Saline (DPBS di Dulbecco). Lavare per circa 30 s o fino a quando i detriti e il sangue è stato rimosso. Successivamente, utilizzando garza sterile, spazzare via lo strato di muco dall'epitelio.
- Usando il forcipe grande, saldamente afferrare lo strato muscolare del tessuto e con forza, raschiare via l'epitelio utilizzando il grande curvo pinza emostatica. Raccogliere i frammenti epiteliali raschiati in una capsula di Petri sterile, polistirolo.
- Tritare il tessuto epiteliale in frammenti di2 dimensioni circa 2.0 x 2.0 mm utilizzando rasoi per ottimizzare la digestione del tessuto. Lavare i frammenti di tessuto con Ca2 +/Mg2 + -gratis DBPS completati con antibiotici (Ca2 +/Mg2 + -gratis DPBS, 1% di penicillina/streptomicina, 0,25 mg/mL anfotericina B 10 mg/mL Gentamicina, kanamicina 50 mg/mL), fino a quando il lavaggio è privo di sangue. Se necessario, eseguire diversi lavaggi. Gettare fuori il lavaggio filtrando attentamente il lavaggio attraverso una garza sterile in un becher da rifiuti.
- Lavato raccogliere frammenti in un bicchiere da 125 mL pallone da con un ancoretta di 25 mm e pre-riscaldato incubazione media (media basale completati con 2 mM L-Glutammina, 1% penicillina/streptomicina, 10 mM tampone HEPES, 1 mg/mL 1 tipo collagenosi, coltura cellulare di 2 mg/mL Albumina di siero bovino di grado). Sigillare il pallone a fondo tondo con setti di gomma.
- Inserire un ago spinale 20 G i setti e collegarlo ad una bombola di ossigeno con tubi di gomma. Per filtrare le sostanze contaminanti, inserire il tubo per creare un filtro di carta velina. Accendere il deflusso di ossigeno basso. Inserire gli aghi di deflusso di 10-15 i setti per evitare la rottura dei setti.
- Fissare il kit fino ad un anello utilizzando morsetti e posizionarlo in un bagnomaria calibrato a 37 ° C con un piatto di mescolare per 30-45 min. Dopo che il tessuto è stato incubazione per 15 minuti, rimuovere 50 µ l di incubazione carta e controllare visivamente per ghiandole dissociate. Se le ghiandole non sono dense o non sono separati dal tessuto, lasciare per altri 5-10 min.
- Subito dopo incubazione, aggiungere 50 mL pre-riscaldata DMEM/F12 ai media di incubazione utilizzando una pipetta sterile sierologica o versando direttamente nella miscela di incubazione.
- Filtrare la miscela di ghiandola attraverso una garza sterile in quattro provette coniche da 50 mL. Mantenere il filtrato in ghiaccio per 15 minuti consentire di estratti di ghiandole depositano alla parte inferiore del tubo conico. Fare attenzione a non disturbare le ghiandole si stabilirono, rimuovere ed eliminare la parte superiore 40 mL di surnatante con una pipetta sierologica. Risospendere i rimanenti 10 mL in 10 mL di DPBS completati con antibiotici.
- Distribuire uniformemente la miscela in provette da 5 mL cella cultura. Centrifugare per 5 min a 65 x g a 4 ° C e rimuovere il surnatante con attenzione usando una pipetta. Risospendere il pellet di ghiandola nella matrice della membrana dello scantinato scongelati utilizzando una pipetta o una punta di vasta pipetta 200 µ l. Mescolare fino a quando non è omogenea.
Nota: È fondamentale per eseguire questo passaggio sul ghiaccio e per evitare la polimerizzazione della matrice della membrana basale durante la miscelazione. Inoltre, è importante ispezionare visivamente la densità della ghiandola di campionamento 50 µ l. La densità ottima è confluency di ~ 70%. - Successivamente, piastra le ghiandole in 50 µ l di matrice della membrana basale usando una pipetta a punta larga. Evitare di produrre qualsiasi le bolle mentre placcatura.
- Per consentire la matrice della membrana basale di polimerizzare, incubare per 10-15 min a 37 ° C. Se placcatura in una piastra di coltura 12-pozzetti, aggiungere 1 mL di hFGO media (medium di medie/F12 Eagle modificate di Advanced Dulbecco completati con 2mM L-Glutammina, 1% di penicillina/streptomicina, 0,25 mg/mL anfotericina B 10 mg/mL Gentamicina, 50 mg/mL kanamicina, 10 mM HEPES Buffer, n-Acteylcystine di 1 mM, 1 x N2, 1x B27, 50% medio di Wnt-condizionato, 20% R-spondin-condizionato supplementato con 100 ng/mL dell'osso inibitore della proteina morfogenetica, 1 gastrina nM, 50 ng/mL Epidermal Growth Factor, fattore di crescita fibroblastico 200 ng/mL 10, 10 mM nicotinammide e 10 µM Y-27632 ROCK inibitore) per pozzetto. Se non utilizzando una piastra di coltura 12-pozzetti aggiungere abbastanza media per immergere la bolla di matrice della membrana dello scantinato.
- Coltura le cellule a 37 ° C in un'incubatrice di coltura cellulare umidificata di 5% CO2 . Cambiare supporto ogni 4-5 giorni.
2. stabilire Organoids Fundic gastrica 3D Mouse-derivato
Nota: Questo protocollo è stato in precedenza pubblicato 6. Scongelare la matrice della membrana basale sul ghiaccio e preparare tutti i reagenti prima di iniziare.
- Sacrificio di topi utilizzando un metodo approvato dall'Istituto di ricerca dove si esegue la ricerca. Rimuovere lo stomaco dal mouse e sezionare secondo i protocolli precedentemente pubblicati 6. Lavare in 20ml ghiaccio freddo Ca2 +/Mg2 +-gratis DBPS.
Nota: Topi C57BL/6, età compresa tra 8-10 settimane, sono utilizzati per colture fundic gastrica organoid. Topi sono stati sacrificati per inalazione di anidride carbonica seguita da dislocazione cervicale manuale prima della rimozione dello stomaco. - Striscia lo strato del muscolo dallo stomaco e qualsiasi visibile vasi sanguigni come precedentemente pubblicato 6.
- Separare il fondo dal antrum e prestomaco utilizzando una lama di rasoio sterile. Taglio fondo usando piccole forbici chirurgiche in frammenti circa 2.0 x 2.0 mm. Using forcipe, raccogliere i frammenti in una provetta conica da 15 mL contenente tampone dell'EDTA di incubazione (Ca2 +/Mg2 +-gratis DPBS, 5mm EDTA) e incubare a 4 ° C per 2 h con movimentazione delicata.
- In una cappa sterile, lasciare il tubo conico e frammenti sul ghiaccio per circa 5 min. utilizzano una pipetta per rimuovere quanto più tampone di incubazione possibile lasciando frammenti intatti. Aggiungere 5 mL di buffer di agitazione (1 g D-sorbitolo, saccarosio 1,47 g in 100 mL di Ca2 +/Mg2 +-gratis DPBS) ed agitare a mano con una forza di 2 min permetterà i grandi frammenti di stabilirsi e di fretta, utilizzando una pipetta 1000P, rimuovere i piccoli frammenti che sono ancora da stabilirsi nello strato superiore.
- Girare i frammenti rimossi per 5 min a 4 ° C a 65 x g.
- Evitando bolle d'aria, rimuovere il supernatante, risospendere nella matrice della membrana basale e mescolare fino a quando non è omogenea.
- Utilizzare una pipetta di punta larga per piastra la matrice della membrana basale a 50 µ l per pozzetto e incubare a 37 ° C per 20 min.
- Aggiungi media di crescita abbastanza mFGO (Advanced Dulbecco per volta medium medium/F12 Eagle completate con 2mM L-Glutammina, 1% di penicillina/streptomicina, 10 mM tampone HEPES, 1mM n-Acteylcystine, 1 x N2, 1 x B27, 50% medio di Wnt-condizionato, 20% R-spondin-condizionato supplementato con 100 inibitore della proteina morfogenetica dell'osso ng/mL, 10 nM gastrin, 50ng/mL Epidermal Growth Factor, fattore di crescita fibroblastico 10 ng/mL 10 e inibitore di Y-27632 ROCK 10 µM) per sommergere la bolla.
- Coltura le cellule a 37 ° C, incubatrice di coltura cellulare umidificata di 5% CO2 . Modificare i media ogni 4-5 giorni.
3. rivestimento collagene per trasferimento 2D
Nota: Eseguire tutte le procedure in un cappuccio sterili per coltura, se non diversamente specificato. Begin collagene rivestimento 24 h prima del trasferimento organoids 3D per il monostrato. Mantenere il collagene della coda di ratto sul ghiaccio e protetto da luce. Piastre di collagene rivestito sono buoni per fino a 2 settimane. Se non si utilizza le piastre rivestite in immediatamente, avvolgere la piastra in parafilm e conservare a 4 ° C fino a quando necessario.
- Diluire il collagene della coda di ratto a 50 µ g/mL utilizzando 20 mM di acido acetico.
- Sufficientemente coprire la superficie del pozzo con il collagene diluito. Per un pozzo in una piastra standard 12-pozzetti, cappotto con circa 1 mL di collagene. Lasciar riposare a temperatura ambiente in una cappa sterile.
- Lavare due volte con 1 mL Ca2 +/Mg2 +-gratis DPBS per pozzetto e lasciano scoperti per 2 h a temperatura ambiente in una cappa sterile.
4. membrana basale Matrix rivestimento per trasferimento 2D
Nota: Eseguire tutte le procedure in un cappuccio sterili per coltura, se non diversamente specificato. Iniziare la matrice della membrana basale rivestimento 2 h prima del trasferimento organoids 3D per il monostrato. Tenere la matrice della membrana basale su ghiaccio. Piastre devono essere utilizzati immediatamente e non possono essere memorizzati per un periodo prolungato di tempo.
- Diluire la matrice della membrana dello scantinato in una provetta conica da 15 mL con un acqua di grado di cultura cellulare presso un 01:10 ratio. Diluire il ghiaccio.
- Utilizzando una pipetta aggiungere 100 µ l di matrice della membrana basale diluito in ciascun pozzetto di una piastra 12-pozzetti standard. Utilizzando un raschietto di cella, distribuire uniformemente la matrice della membrana dello scantinato diluito in tutto il bene per uno strato uniforme.
- Incubare a 37 ° C per 1 h.
- Rimuovere l'acqua residua utilizzando una pipetta e asciugare a temperatura ambiente per 1 h prima del trasferimento organoids 3D.
5. trasferimento di m/hFGOs 3D a 2D monostrati di cellule epiteliali gastriche umane
- Dopo 3D mouse-derivati umani o che fgos sono state coltivate per 6-7 giorni, iniziare il trasferimento dei organoids 3D per il 2D monostrato.
Nota: Per ogni pozzetto di un monostrato necessario si consiglia di utilizzare 300 organoids intatto o singole cellule derivate da 300 organoids. In una solida cultura si prevede di ottenere circa 150 organoid/pozzetto all'interno di una piastra di coltura ben 12. - Assicurarsi che le piastre vengono coperte prima del trasferimento.
Nota: Le piastre di matrice rivestito della membrana dello scantinato hanno uno strato di gel traslucido, tuttavia, piastre di collagene rivestito non avrà alcuna indicazione ovvia del rivestimento. - Sloggiare la bolla di matrix 3D della membrana dello scantinato dalla piastra direttamente pipettando 1 mL sterile Ca2 +/Mg2 +-gratis DBPS sul centro della bolla.
- Utilizzando una pipetta, raccogliere l'impasto di matrice e organoid della membrana dello scantinato in provette di coltura delle cellule. Raccogliere con un rapporto di 2 bolle di matrice della membrana dello scantinato per ogni provetta. Centrifugare per 5 min 40 x g e a 4 ° C.
- Utilizzando un sistema di vuoto, rimuovere il supernatante e come molta matrice della membrana basale come possibile. Risospendere in 4 mL di Ca2 +/Mg2 +-priva di DBPS, rimuovere il supernatante e ripetere 2 - 3 volte. Per il protocollo di trasferimento di intero organoid, procedere al passaggio 5.10. Continuare al punto 5.7 per il protocollo di sospensione unicellulare.
- Pre-riscaldare la soluzione di separazione cellulare a 37 ° C e aggiungere 1 mL di ciascuna provetta. Mescolare delicatamente da invertendo i tubi o pipettaggio su e giù con una pipetta. Incubare per 10 min a 37 ° C.
- Aggiungere 2 mL di Ca2 +/Mg2 +-gratis DBPS direttamente da ciascuna provetta.
- Utilizzare un ago da 26 G e la siringa la miscela 2 - 3 volte. Controllare visivamente per singole celle. Siringa 1-2 volte di più se ci sono ancora organoids o aggregati di cellule.
- Centrifuga a 40 x g per 5 min a 4 ° C. Risospendere il pellet in 2D media FGO (del mouse 2D FGO crescita medio: medium di medie/F12 Eagle modificate di Advanced Dulbecco completati con 2mM L-Glutammina, 10mm penicillina/streptomicina, 10% di siero fetale di vitello, 10 mM tampone HEPES, 1 x N2, 1 x B27, completati con 10 nM gastrin, 50 ng/mL Epidermal Growth Factor, inibitore di TGF-β 1 µM e inibitore di Y-27632 ROCK 10 µM. 2D umano FGO crescita medio: Medium di medie/F12 Eagle modificate di Dulbecco avanzati completati con 2mM L-Glutammina, 1% di penicillina/streptomicina, 10 mM tampone HEPES, 10% di siero fetale di vitello, 10 mM nicotinammide, 1 x N2, 1 x B27, addizionata di 50 mg/mL kanamicina, 50 ng/mL sviluppo epidermico Fattore e 10 µM Y-27632 ROCK inibitore, 1 µM TGF-β inibitore).
- Piastra la risospensione su piastre. Incubare le piastre a 37 ° C. Sostituire ogni 4 giorni o prima se media diventa giallo. Monostrato richiede circa 4 giorni al form.
6. analisi della ferita usando monostrati di cellule epiteliali gastriche 2D di scratch
- Utilizzando una lama di rasoio, graffiare il monostrato quando la cultura ha raggiunto confluency di 100%.
- Difficoltà monostrati utilizzando 3,7% formaldeide per 15 min a temperatura ambiente. Permeabilize con detergente non ionico/PBS di 0,5% per 20 min a temperatura ambiente.
- Successiva blocco monostrati con siero di asino 2% per 1 h a temperatura ambiente e incubare con diluizione 1: 1000 di H+, K+-anticorpo primario dell'atpasi durante la notte a 4 ° C, lavare con detergente non ionico/PBS al 0,1% e incubare con diluizione 1: 100 di asino anticorpo secondario anti-topo 488 e 10 μg/mL dei nuclei delle cellule Hoechst macchia per 1 h a temperatura ambiente.
- Per identificare le cellule di superficie mucosa pit in colture monostrato gastrico umano-derivato 2D, macchia di cellule con 20 μg/ml di coniugato FITC Ulex europaeus (UEAI). Monostrati di immagine su un microscopio confocale.
- Prendere le immagini di ferita ogni h. qualche graffio sarà ri-epithelialize tra 24-48 h a seconda della qualità di strato monomolecolare e variazione tra pazienti.
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Representative Results
Organoids sono stati derivati dal corpus/corpo dell'essere umano o del fondo dei tessuti dello stomaco del mouse (Figura 1A). Dopo aver collagenasi o digestione di EDTA del tessuto dello stomaco di derivati umani o del mouse rispettivamente, ghiandole sono incorporati nella matrice della membrana basale e coltivate per 6-7 giorni (Figura 1A). Figura 1B dimostra la formazione dei organoids gastrico umano-derivato (huFGOs) che poi sono stati trasferiti in un monostrato epiteliale gastrico (huGEM) su vetrini camera rivestite con matrice della membrana dello scantinato. Dopo 4 giorni di cultura, huGEMs confluenti sono stati utilizzati per ferita scratch test (Figura 1B). Immagini raccolte da un'analisi del lasso di tempo di huGEM ha mostrato la chiusura della ferita all'interno della cultura in un periodo di 24 ore (Figura 2).
HuGEMs sono stati trovati per esprimere i lignaggi principali delle cellule trovato nel tessuto nativo dello stomaco. Colorazione di immunofluorescenza ha rivelato l'espressione di un monostrato di cadherin-positivo E polarizzato che consisteva di parietale (Figura 3B, C) e la superficie mucosa (Figura 3B, D) cellule. Analisi PCR usando RNA raccolto da questi strati monomolecolari ha confermato l'espressione delle cellule mucose parietale e superficie, oltre alle cellule mucose e capo collo (Figura 3E). HuGEMs confluenti espresse anche alcune cellule proliferanti (Figura 3F). L'analisi di questi lignaggi principali delle cellule all'interno del dosaggio di gratta e Vinci della ferita ha rivelato sostenuta espressione di cellule mucose superficie parietale, capo, mucose collo sopra un periodo di tempo (Figura 4A, B) 24 ore su 24. Collettivamente, questi dati dimostrano l'uso di huGEMs come sistema di romanzo cultura per studiare gastrico rigenerazione in vitro.
Figura 1: generazione di derivazione umana gastrico organoids (huFGO) e monostrati epiteliali gastrici primari (huGEM). (A) immagini rappresentative di stomaco di mouse e tessuto gastrico umano utilizzato per generare le ghiandole per cultura organoid. Apposito spazio indica fundic della regione dello stomaco del mouse. (B) generazione di organoids gastrico umano-derivato (huFGOs) che vengono utilizzati per la coltura di monostrati epiteliali gastrici umano-derivato (huGEMs). Immagine rappresentativa di huGEM dopo zero risultati l'area ferita. Barra della scala = 500 μm Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: dosaggio zero-ferita. Immagini rappresentative raccolti da un esperimento di lasso di tempo utilizzando huGEM 0, 8, 16 e 24 h dopo la ferita di zero. Barra della scala = 500 μm Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: espressione dei lignaggi principali delle cellule nelle colture di huGEM. Colorazione di immunofluorescenza delle culture huGEM dimostrando l'espressione della caderina (A) E (Ecad, rosso), superficie cellule mucose (UEAI, verde) e nuclei (Hoechst, blu) e (B) E caderina (Ecad, rosso), cellule parietali (HK, verde) e i nuclei ( Hoechst, blu). Canali separati sono mostrati in (C) e (D). (E) RT-PCR è stata effettuata usando il RNA Estratto da huGEMs per l'espressione di H+K+-ATPasi (ATP4a), pepsinogeno C (PgC), MUC5AC e MUC6. (F) Proliferating cellule all'interno della cultura di huGEM determinato dall'assorbimento di EdU (rosso). Scala bar (A-D) = 50 μm, scala bar (F) = 100 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: cambiamenti nell'espressione di lineage delle cellule nel dosaggio zero-ferita. Colorazione di immunofluorescenza delle culture huGEM dimostrando l'espressione di E-caderina (Ecad, rosso) o cellule mucose superficiali (UEAI, verde) o cellule parietali (HK, verde) e nuclei (Hoechst, blu) utilizzando diapositive raccolti da huGEM Culture 0, 8, 16 e 24 ore dopo zero-ferita. Bkgrd = colorazione di fondo della matrice della membrana basale su diapositive. Barra della scala asse XY da 0 - 400 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Mouse 3D multimediale | Soluzione di riserva | Concentrazione di lavoro |
| nAcetylcysteine | Polvere | 1 mM |
| Gastrina | 10 ΜM | 10 nM |
| FEG | 500 µ g/mL | 50 ng/mL |
| Zucca | 100 µ g/mL | 100 ng/mL |
| FGF10 | 100 µ g/mL | 100 ng/mL |
| YCMD | 10 mM | 10 ΜM |
| B27 | 50 x | 1 x |
| N2 | 100 x | 1 x |
| Pen/Strep | 1 M | 10 mM |
| HEPES | 1 M | 10 mM |
| Glutamax | 200 mM | 2 mM |
| WNT | 50% v/v | |
| R-Spondin | 10% v/v |
Tabella 1: Mouse 3D Media Components.
| Mouse multimediale 2D | Soluzione di riserva | Concentrazione di lavoro |
| FCS | 100% | 10% |
| YCMPD | 10 mM | 10 ΜM |
| Gastrina | 10 ΜM | 10 nM |
| FEG | 500 µ g/mL | 50 ng/mL |
| B27 | 50 x | 1 x |
| N2 | 100 x | 1 x |
| Pen/Strep | 2. | 10 mM |
| HEPES | 2. | 10 mM |
| Glutamax | 200 mM | 2 mM |
| Inibitore di TGF-β | 10 mM | 1 ΜM |
Tabella 2: Mouse Media 2D componenti.
| Umana Media 3D | Soluzione di riserva | Concentrazione di lavoro |
| Nicotinammide | Polvere | 10 mM |
| nAcetylcysteine | Polvere | 1 mM |
| Gastrina | 10 ΜM | 1 nM |
| FEG | 500 µ g/mL | 50 ng/mL |
| Zucca | 100 µ g/mL | 100 ng/mL |
| FGF10 | 100 µ g/mL | 200 ng/mL |
| YCMD | 10 mM | 10 ΜM |
| B27 | 50 x | 1 x |
| N2 | 100 x | 1 x |
| Pen/Strep | 2. | 10 mM |
| HEPES | 2. | 10 mM |
| Glutamax | 200 mM | 2 mM |
| Kanamicina | 2. | 10 mM |
| Amfotericina B/gentamicina | 125 µ g/mL | 1 mM |
| WNT | 50% v/v | |
| R-Spondin | 10% v/v |
Tabella 3: Componenti di Media 3D umano.
| Umana Media 2D | Soluzione di riserva | Concentrazione di lavoro |
| FCS | 100% | 10% |
| YCMPD | 10 mM | 10 ΜM |
| Gastrina | 10 ΜM | 1 nM |
| FEG | 500 µ g/mL | 50 ng/mL |
| B27 | 50 x | 1 x |
| N2 | 100 x | 1 x |
| Pen/Strep | 2. | 10 mM |
| HEPES | 2. | 10 mM |
| Glutamax | 200 mM | 2 mM |
| Inibitore di TGF-β | 10 mM | 1 ΜM |
| Nicotinammide | Polvere | 10 mM |
| Kanamicina | 2. | 10 mM |
Tabella 4: Componenti umana Media 2D.
| Problema sperimentale | Risoluzione dei problemi di suggerimento |
| Monostrati non riescono a forma da organoids | 1) le condizioni di coltura ottimali per questo protocollo variano tra esigenze sperimentali. Umano e strati monomolecolari del mouse derivati da organoids dovrebbero essere coltivati utilizzando la matrice della membrana basale diluito quando si utilizza il vetro o plastica Petri. Tuttavia, collagene della coda di ratto sono ottimale per gli esperimenti di monostrato di mouse o inserti di origine umana che richiedono membrana in poliestere. 2) condizioni di coltura ottimali variano a seconda il set sperimentale fino. Lingue mediante sospensione unicellulare idealmente sono coltivate con supporti 3D FGO considerando che organoids intatta sono coltivate con media FGO 2D. |
| Monostrati derivati da pazienti invecchiati (> 55 anni) o topi (> 18 mesi) non è riuscito a crescere e raggiungere la confluenza | Se utilizzando il tessuto dello stomaco raccolti da topi invecchiati (> 18 mesi) o pazienti (> 55 anni) la densità dei organoids utilizzato per la generazione di strato monomolecolare dovrebbe essere raddoppiata dato che l'efficienza di crescita dei organoids è diminuito. |
| Organoids non riescono a forma dalle ghiandole | È consigliabile che fresco (appena acquistato se possibile) essere utilizzato gastrina. Utilizzare appena ri-sospensione gastrina ogni 4 mesi. |
| Organoids non riescono a collegare e formano monostrati | Assicurare che un'efficiente rimozione di matrice della membrana basale è stato raggiunto dopo la raccolta organoids per il trasferimento a piastre di coltura per gli strati monomolecolari. |
| Colture ottenute da pazienti invecchiati (> 55 anni) o topi (> 18 mesi) non riescono | Durante i periodi di digestione e incubazione, 15-30 min di incubazione iniziale seguito da intervalli di 5 min di incubazione come necessaria è sufficiente. Dovrebbe essere notato che i pazienti maggiori di 55 anni di età possono avere ghiandole che più facilmente sono dissociate e quindi richiedono meno digestione. Analogamente, FGOs derivati da pazienti invecchiati hanno visualizzato tempi di crescita e aumento della sensibilità alla centrifugazione. Per ottenere i migliori risultati, è necessario limitare qualsiasi centrifugazione in eccesso quando si lavora con tessuto invecchiato e sostituire il supporto in modo tempestivo. |
Tabella 5: risoluzione dei problemi suggerimenti. Problemi riscontrati e risoluzioni consigliate per istituzione ottimale e la cultura dell'essere umano o monostrati gastrico del mouse.
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Discussion
L'attuale protocollo dettagli l'istituzione di monostrati epiteliali gastrico umano e del mouse-derivato che può essere utilizzato per le analisi di zero-ferita. Il protocollo dipende il concetto dei tessuti di isolamento da primari umani (o mouse) di cellule staminali residenti e un protocollo modificato è pubblicato da Schlaermann et al.7. In particolare, abbiamo ottimizzato il protocollo qui per stabilire un confluenti e polarizzati monostrato epiteliale gastrica che esprime i principali cellulari lignaggi che possono essere trovati all'interno dell'epitelio gastrico in vivo. Riparazione di ulcera gastrica è un processo complesso che coinvolge il tessuto riepitelizzazione, rigenerazione e proliferazione9,10,11. In particolare, il nostro laboratorio ha segnalato che la rigenerazione dell'epitelio gastrico coincide con l'emersione del polipeptide spasmolitico/trefoil fattore (TFF) 2-esprimendo il metaplasia (SPEM) al margine dell'ulcera all'interno delle ghiandole gastriche rigenerante 12,13. SPEM è definito come la transdifferenziazione del lignaggio capo cella in una mucosa delle cellule metaplasia14 che emerge con la ferita e scompare quando la mucosa ritorna al suo normale composizione cellulare12. Quindi, per studiare tale meccanismo in un sistema in vitro , è essenziale che i lignaggi principali delle cellule, quali cellule principali, sono presenti all'interno della cultura.
L'uso di zero-ferita saggi sono stati ampiamente utilizzati per lo studio della riparazione e rigenerazione, e fino a poco tempo, linee cellulari di cancro gastrico sono stati usati1,2,3,4. Mentre meccanismi fondamentali sono state rivelate utilizzando linee di cellule di cancro gastrico, queste culture sono trasformate e mancano la diversità cellulare del tessuto nativo dello stomaco. HuGEMs sono indicati per mantenere una composizione cellulare polarizzata e diversificata che strettamente ricapitola l' epitelio gastrico in vivo. Inoltre, dopo raggiungendo confluenza huGEM culture possono essere mantenute fino a un mese in condizioni ottimali. Estese culture consentono esperimenti a lungo termine. Pertanto, le applicazioni future di huGEMs che possono essere considerati includono monostrato/immunitario delle cellule co-colture ed esperimenti a lungo termine per lo studio della patogenesi di Helicobacter pylori .
Ci sono aspetti tecnici importanti da notare nel protocollo corrente. Il primo punto tecnico è che la scelta dei componenti della membrana dello scantinato varia a seconda della superficie di coltura cellulare che deve essere utilizzato per gli esperimenti. Per garantire che sono raggiunte le condizioni ottimali monostrato, è consigliabile che il collagene viene utilizzato quando gli esperimenti con gli strati monomolecolari richiedono con membrana in poliestere inserti. Tuttavia, se gli esperimenti dello strato monomolecolare richiedono superfici cultura plastica o vetro, matrice della membrana basale diluito è la scelta ottima del rivestimento. In secondo luogo, la densità dei organoids necessaria per raggiungere un monostrato confluente deve essere regolata a seconda dell'età del paziente da cui è raccolto il tessuto gastrico. Per il tessuto raccolto da topi invecchiati (> 18 mesi) o pazienti (> 55 anni), la densità di organoid utilizzata dovrebbe essere duplice aumentato quando il trasferimento di un monostrato a causa della capacità di crescita è diminuito in individui di età compresa tra. Durante la digestione e l'incubazione del tessuto umano derivato da pazienti invecchiati, ghiandole possono essere più suscettibili di centrifugazione e di dissociazione e di conseguenza: 1) devono essere centrifugati come con parsimonia come possibili, 2) media sostituiti diligentemente e 3) durante la digestione le incubazioni di 15-30 minuti con digestioni incrementale di 5 minuti in seguito farà diminuire la probabilità di sopra digestione. Infine, quando si formano monostrati dalle sospensioni derivate organoid singola cella, 3D FGO media è più ottima per la corretta formazione di monostrati considerando che quando la coltura da organoids intatto, media FGO 2D è stato osservato per produrre la massima efficienza.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da NIH (NIDDK) 5 DK083402 R01-07 concedere (YZ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced Dulbecco's modified Eagle/F12 medium (basal media) | Life Technologies | 12634-010 | |
| GlutaMAX (L-glutamine) | Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Amphotericin B/Gentamicin | Thermo Scientific | R01510 | |
| Kanamycin | Thermo Fisher | RO1510 | |
| HEPES Buffer | Sigma Aldrich | H0887 | |
| n-Acetylcystine | Sigma Aldrich | A9165 | |
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 | Life Technologies | 12587-010 | |
| BMP Inhibitor (Noggin) | Pepro Tech | 250-38 | |
| Gastrin | Tocris | 3006 | |
| EGF | Pepro Tech | 315-09 | |
| FGF10 | Pepro Tech | 100-26 | |
| Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636 | |
| Y-27632 ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| TGF-β Inhibitor | Tocris | 2939 | |
| Ca2+/Mg2+ -free DPBS | Fisher | 21-031CV | |
| Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 12634-010 | |
| Fetal Bovine Serum | FBS | ||
| OPTIMEM | Invitrogen | ||
| 0.22µM filter | Fisher | 099-720-004 | |
| 37 °C Water Bath | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington | LS004214 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
| Kimwipes (tissue paper) | Fischer Scientific | 06-666C | |
| 125 mL round bottom flask | |||
| 1 in (25 mm) stir bar | |||
| Rubber Septa | |||
| Sterile Gauze | |||
| Stir Plate | |||
| Ring Stand | |||
| Ring Stand Clamps | |||
| Sterile petri dish | |||
| 18 G needles of 1.5 in length | Thermo Fisher | 305196 | |
| 20 G spinal needles of 3.5 in length | Thermo Fisher | 405182 | |
| 12-well cell culture treated plate | Midwest Scientific | 92012 | |
| Growth Factor Reduced, Phenol Red-free MatrigelTM (Basement membrane matrix) | Fisher | CB-40230C | |
| Sterile Razor Blades | |||
| Wide-tip tweezers | |||
| Curved Hemostatic Forceps | |||
| 200 µL wide pipette tips | Thermo Fisher | 02-707-134 | |
| 5 mL cell culture test tubes | Fisher | 14-956-3C | |
| Oxygen Tank with rubber hosing | |||
| 1 g D-Sorbitol | |||
| Sucrose | Fisher | SS-500 | |
| Dissecting microscope | |||
| Dissecting Tray | |||
| Rocking Table | |||
| Rat Tail Collagen Type 1 | Life Technologies | A10483-01 | |
| Cell culture grade glacial acetic acid | Fisher | A38-212 | |
| Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
| 2-well chamber slide | Thermo Fisher | 155380 | |
| 12-well Transwell (polyester membrane inserts) | Corning | 3460 | |
| Cell scraper | Corning | 353086 | |
| Accutase (cell detachment solution) | Stemcell Technologies | 7920 | |
| 263/8 G syringe | Thermo Fisher | 309625 | |
| Razor blade | |||
| L Cells | L cells, a Wnt3a producing cell line, were received as a gift from Dr. Hans Clevers (Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, Netherlands). | N/A | |
| HEK-293T Rspondin secreting cells | A modified HEK-293T R-spondin secreting cell line was obtained from Dr. Jeff Whitsett (Section of Neonatology, Perinatal and Pulmonary Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Centre and The University of Cincinnati College of Medicine, Cincinnati, USA ). | N/A | |
| HK-ATPase Primary Antibody | Invitrogen | SC-374094 | |
| E-Cadherinn | SantaCruz | sc-59778 | |
| UEA1 | Sigma Aldrich | L9006 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 | |
| Alexafluor 488 secondary antibody (Donkey anti-mouse 488 secondary antibody) | ThermoFisher Scientific | R37114 |
References
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