Summary
Burada biz kurmak ve 3 boyutlu (3D) Gastrik organoids insan ve fare türetilen ve yöntemi 3D organoids aktarmak için bir 2-boyutlu monolayer kültür bir protokol tanımlamak. Yenilenme çalışmaları bir roman çizik-yara tahlil olarak Gastrik epitel monolayer kullanımı da açıklanmıştır.
Abstract
Vitro çalışmalar, mide yarası onarma genelde mide kanseri hücre hatlarında bir çizik-yara tahlil hücresel proliferasyonu ve göç kullanımını içerir. Bir kritik böyle deneyleri, ancak, onların homojen karışım-in hücresel türleri kısıtlamasıdır. Onarım birkaç hücre tipleri arasındaki etkileşimin talepleri karmaşık bir süreçtir. Bu nedenle, bir kültür hücresel alt türlerinden yoksun çalışmaya Eğer biz onarım süreci anlamak için aşılması gereken bir sorundur. Mide organoid modeli mademki türdeş olmayan hücre türleri topluluğu benzer biçimde, Gastrik epitel veya diğer yerel doku içinde vivoyansıtan bu sorunu hafifletmek. İşte bir roman, insan türetilmiş vitro çizik-yara tahlil gösterdi veya sonra bir Gastrik epitel monolayer sağlam ya organoids ya da bir tek hücre süspansiyon olarak transfer edilebilir fare 3 boyutlu organoids ayrışmış organoids. Gastrik yenilenme eğitim için bir roman çizik-yara tahlil sisteminde kullanılan organoid kaynaklı Gastrik epitel monolayers kurmak için protokol hedefidir.
Introduction
Çizik-yara deneyleri kullanımı onarım ve rejenerasyon1,2,3,4,5,6eğitim için popüler bir yöntemdir. Önerilen metodoloji özellikle mide yenilenme ve Helicobacter pylori kolonizasyon eğitim için kullanılabilir. Geçmişte, mide kanseri hücre hatları Helicobacter pylori (H. pylori) enfeksiyon1,2 çalışma için bir araç olarak kullanılmış olan ve ana kadar son zamanlarda mide kanseri hücre hatları AGS hücreleri gibi tercih1 vardı. ,2,3,4. Bir mide kanseri hücre kültürleri Gastrik epitel hücre çeşitliliği özetlemek için onların başarısızlığı kısıtlamasıdır. Bu sınırlama, adres deneyin için işte kuruluş ve birincil insan ve fare-kaynaklı 3 boyutlu fundic mide organoids (FGOs) transferi için değiştirilmiş bir yöntemiyle ilk alan yara iyileşme deneyleri için Gastrik epitel monolayer gösterdi Schlaermann ve arktarafından açıklanan. 7 biz Gastrik epitel monolayers türetilen güdülmesini 3D Gastrik FGOs veya tek hücre FGO elde tutmak yakından bu Gastrik epitel temsil eden bir polarize hücresel kompozisyon göstermek içinde vivo. Mide kanseri hücre hatları bu teknik görüntüler hücre kompozisyon göstermek değil ki, geçerli protokol alternatif çizik-yara tahlil yöntemleri üzerinde bir avantaj sahiptir. Monolayers bütün organoids veya tek hücre süspansiyon Disosiye organoids üzerinden kurulan ve kaplama bir membran matrisi kullanarak veya kollajen-kaplama olabilir mademki bu metodoloji optimize edilmiştir. Bu iletişim kuralı genel amacı bir organoid Gastrik epitel monolayer kültürler bir roman yara iyileşme tahlil için türetilmiş kurmaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Kirlenmesini önlemek için iletişim kuralı bütünüyle bir steril doku kültürü başlık içinde gerçekleştirin. İnsan fundic doku kol gastrektomi onaylı Cincinnati Üniversitesi IRB protokolüne göre geçiren hastaların toplanan (IRB protokol numarası: 2015-4869).
Tüm fare çalışmaları Cincinnati Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı Komitesi (IACUC) bir Amerikan Derneği değerlendirme ve Akreditasyon, laboratuvar hayvan bakım (AAALAC) tesis tutar tarafından kabul edildi.
1. insan kaynaklı 3D mide Fundic Organoids kurulması
Not: Bu protokol araştırma daha önce yayınlanan bu laboratuvar8' üzerine kuruludur.
- % 50 Wnt klimalı ve %20 R-spondin şartına medya oluşan 3D organoid ortam hazırlamak.
- Wnt klimalı ortam hazırlamak, Wnt büyüme orta L hücrelerde kültür (Dulbecco kartal orta (DMEM), % 10 fetal sığır serum (FBS), % 1'değişiklik ' ın penisilin/streptomisin) 7 gün boyunca orta hasat ve 0,22 µm filtre kullanarak filtre uygulama.
- R-spondin klimalı ortam hazırlamak. Değiştirilmiş HEK-293T R-spondin secreting hücre R-spondin büyüme orta hattı büyümek (Dulbecco kartal orta (DMEM), % 10 fetal sığır serum (FBS), % 1'değişiklik ' ın penisilin/streptomisin). 2 h sonra eki orta bu hücrelerden OPTIMEM büyüme için orta, % 1 değiştirin penisilin/streptomisin. Hücreleri 7 gün boyunca kültür. O zaman R-spondin klimalı ortam hasat ve 0,22 µm filtre kullanarak filtre uygulama.
Not: Bu protokol daha önce yayımlanmış ve daha ayrıntılı bir iletişim kuralı için 6,7,8' e bakın.
- Büyüme faktörü azaltılmış, fenol red ücretsiz membran matris için 16 h 4 ° C'de buz çözme Buz gibi Ca2 +/Mg2 +dokusunda toplamak-DBPS büyük bir plastik kap içinde ücretsiz. Buz üzerinde başlangıç adım 1.4 kadar saklayın.
Not: Doku kol gastrektomi geçiren hastaların toplanır. - Forseps kullanarak, 100 mL Ca2 +/Mg2 +içeren steril bir ölçek şiddetle doku yıkama-Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz (DPBS) ücretsiz. Yıkama için yaklaşık 30 s veya enkaz ve kan kaldırıldı kadar. Daha sonra steril gazlı bez kullanarak, uzak epitel müköz katmandan silin.
- Büyük forseps kullanarak, sıkıca kas katmanı doku ve gücü ile kavramak, uzakta büyük eğri Kan durdurucu sargı forseps kullanarak epitel kazımak. Steril, polistren petri kabına alıntı epitel parçaları toplamak.
- Epitel doku doku sindirim optimize etmek için jilet kullanarak yaklaşık 2.0 x 2.0 mm2 boyutlu parçaları kıyma. Doku parçaları ile Ca2 +/Mg2 + yıkama-antibiyotik ile desteklenmiş DBPS ücretsiz (Ca2 +/Mg2 + -DPBS, %1 penisilin/streptomisin, 0.25 mg/mL Amfoterisin B ücretsiz 10 mg/mL gentamisin, 50 mg/mL sefaloridin), kadar yıkama kan ücretsizdir. Birden fazla yıkamak gerekiyorsa gerçekleştirin. Yıkama yıkama steril bir gazlı bez ile atık kabı dikkatle süzerek atmak.
- Toplamak bir 125 mL cam alt şişe ile 25 mm heyecan bar ve Önceden ısıtılmış kuluçka medya yuvarlak içine parçaları yıkanmış (2 mM L-glutamin, % 1 ile desteklenmiş Bazal medya penisilin/streptomisin, 10 mM HEPES tampon, 1 mg/mL Collagenase Type 1, 2 mg/mL hücre kültürü «««sınıf) sığır Serum albümin. Yuvarlak alt balon lastik septa ile kapatın.
- 20 G spinal iğne septa yerleştirin ve bir oksijen tankı kauçuk hosing ile bağlayın. Herhangi bir kirletici maddeleri filtre uygulamak için filtre oluşturmak için tüp içine doku kağıt yerleştirin. Düşük oksijen çıkım açın. 10-15 çıkış iğneler septa rüptürü önlemek için septa yerleştirin.
- Set kelepçeler kullanılarak bir yüzük standına güvenli ve 37 ° C 30-45 dk için bir heyecan plaka için kalibre bir su banyosu yerleştirebilirsiniz. Sonra doku 15dk için kuluçka kuluçka medya ve görsel olarak Disosiye bezleri için onay 50 µL kaldırın. Bezleri yoğun değildir ya da dokudan ayrılmış değil, bir ek 5-10dk için bırakın.
- Hemen kuluçka, ekleyin 50 mL Önceden ısıtılmış DMEM/F12 kuluçka ortamına steril serolojik pipet kullanarak veya doğrudan kuluçka karışım içine dökme tarafından.
- Bezi karışımı steril bir gazlı bez ile dört 50 mL konik tüpler içine filtre. Filtrate buz ayıklanan bezleri konik tüp altına yerleşmek izin vermek 15 dakika tutun. Değil kapatılan bezleri rahatsız kaldırmak ve üstlerden süpernatant serolojik pipet kullanarak 40 mL atmak dikkatli olun. Kalan 10 mL antibiyotiklerle takıma DPBS 10 ml resuspend.
- Karışım 5 mL hücre kültür testi tüpler içine eşit dağıt. 65 x g 4 ° c de 5 dk santrifüj kapasitesi ve dikkatli bir pipet kullanarak süpernatant kaldırın. Bezi Pelet çözdürülen membran matris bir pipet ya da 200 µL geniş pipet ucu kullanarak resuspend. Mix kadar homojen.
Not: Buz üzerinde bu adımı gerçekleştirmek için ve karıştırma sırasında polimerizasyon membran matris önlemek için önemlidir. Ayrıca, bezi yoğunluğu 50 µL için örnekleme tarafından kontrol edin önemlidir. ~ %70 confluency en uygun yoğunluğudur. - Daha sonra geniş uçlu pipet kullanarak membran matrisinin 50 µL bezlerinde plaka. Kaplama sırasında herhangi bir kabarcıklar üreten kaçının.
- Membran matris polimerize, 10-15 dk 37 ° C'de için kuluçkaya izin vermek için Bir 12-şey kültür tabağına kaplama, 1 mL hFGO medya ekleyerek (Gelişmiş Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal orta/F12 orta takıma 2 mM L-glutamin, %1 penisilin/streptomisin, 0.25 mg/mL Amfoterisin B ile 10 mg/mL gentamisin, 50 mg/mL sefaloridin, 10 mM HEPES Tampon, 1 mM n-Acteylcystine, 1 x N2, 1 x B27, % 50 Wnt şartına orta, % 20'r-spondin-şartına orta 100 ng/mL ile desteklenmiş kemik morfogenetik protein inhibitörü, 1 nM gastrin, 50 ng/mL Epidermal büyüme faktörü, 200 ng/mL Fibroblast büyüme faktörü 10, 10 mM Nikotinamid ve 10 µM Y-27632 ROCK inhibitörü) iyi başına. Yoksa bir 12-şey kültür plaka kullanarak eklemek yeterli medya membran matris kabarcık daldırın.
- Bir % 5 CO2 oksijen hücre kültür kuluçka 37 ° C'de hücreler kültür. Medya her 4-5 gün değiştirin.
2. fare kaynaklı 3D mide Fundic Organoids kurulması
Not: Bu protokol önceden yayınlanmış 6oldu. Membran matris buz çözme ve tüm reaktifler başlamadan hazır olun.
- Araştırma kuruluşu tarafından onaylanmış bir araştırma gerçekleştirildiği yöntemiyle fareler kurban. Mide fare kaldırmak ve göre daha önce yayımlanmış protokolleri 6incelemek. 20 mL buz soğuk Ca2 +/Mg2 +yıkama-DBPS ücretsiz.
Not: C57BL/6 fare, 8-10 hafta, yaşlı fundic mide organoid kültürler için kullanılır. Fareler karbondioksit mide kaldırma önce el ile servikal çıkığı ardından Solunduğunda euthanized. - Mide kas katmandan şerit ve görünür herhangi bir kan damarları daha önce 6yayınlandı.
- Fundus test ve steril bir jilet kullanarak forestomach ayrı. Kesme fundus parçalara yaklaşık 2.0 x 2.0 mm. kullanma forseps, küçük Cerrahi makas kullanarak bir 15 mL konik tüp EDTA kuluçka arabellek içeren parçaları toplamak (Ca2 +/Mg2 +-DPBS, 5 mM EDTA ücretsiz) ve 4 ° c 2 h ile için kuluçkaya nazik ajitasyon.
- Steril bir Hood, konik tüp bırakın ve yaklaşık 5 dakika süreyle buz parçaları bir pipet parçaları el değmemiş bırakarak mümkün olduğu kadar kuluçka arabellek kaldırmak için kullanın. 5 mL arabellek sallayarak ekleyin (D-Sorbitol, 1,47 g Sükroz 100 ml Ca2 +/Mg2 +1 g-DPBS ücretsiz) ve 2 dk. izin yönelik büyük parçaları yerleşmek ve 1000 p pipet kullanarak acele ile yerleşmek için henüz küçük parçaları kaldırmak el ile bir güçle sallamak en üst katmanda.
- 65 x g de 4 ° C'de 5 min için kaldırılan parçaları spin.
- Hava kabarcıkları kaçınırken süpernatant kaldırmak, membran matrisinde resuspend ve homojen gelene kadar karıştırın.
- Membran matris şey başına 50 µL at plaka ve sonra 20 dakika 37 ° C'de kuluçkaya için geniş uç pipet kullanın.
- Yeterli mFGO büyüme ortamı ekleyin (Gelişmiş Dulbecco'nın modifiye kartal orta/F12 orta takıma 2 mM L-glutamin, %1 penisilin/streptomisin, 10 mM ile HEPES tampon, 1mM n-Acteylcystine, 1 x N2, 1 x B27, % 50 orta, Wnt şartına % 20 R-spondin-klimalı 100 ng/mL kemik morfogenetik protein inhibitörü, 10 nM gastrin, 50ng/mL Epidermal büyüme faktörü, 10 ng/mL Fibroblast büyüme faktörü 10 ve 10 µM Y-27632 ROCK inhibitörü ile desteklenmiş orta) kabarcık daldırın için.
- 37 ° c, % 5 CO2 oksijen hücre kültür kuluçka hücreler kültür. Medya her 4-5 gün değiştirin.
3. kollajen kaplama 2D Transfer için
Not: aksi belirtilmedikçe steril doku kültürü mahallede tüm yordamları gerçekleştirin. 3D organoids için monolayer aktarmadan önce 24 h kaplama kollajen başlar. Sıçan kuyruğu kollajen buz üzerinde tutun ve ışıktan korumalı. Kolajen kaplı levha 2 hafta kadar iyidir. Kaplamalı plakalar hemen kullanmıyorsanız, parafilm ve store gerekinceye kadar 4 ° C'de plaka sarın.
- Sıçan kuyruğu kollajen 50 µg/ML 20 mM Asetik asit kullanarak sulandırmak.
- Yeterince seyreltilmiş kollajen ile pınarı yüzeyini kapsar. Standart bir 12-şey plaka bir kuyuda kollajen yaklaşık 1 mL ile kat. Gece, oda sıcaklığında bir steril başlıklı bırakın.
- İki kez ile 1 mL Ca2 +/Mg2 +yıkama-DPBS iyi ücretsiz ve steril başlıklı oda sıcaklığında 2 h için açığa bırakın.
4. membran matris kaplama 2D Transfer için
Not: aksi belirtilmedikçe steril doku kültürü mahallede tüm yordamları gerçekleştirin. 3D organoids için monolayer aktarmadan önce 2 h kaplama membran matris başlar. Membran matris buz üzerinde tutun. Kaplamalı plakalar hemen kullanılacak olan ve uzun süre saklanamaz.
- 1:10, 15 mL konik tüp bir hücre kültür sınıf su ile membran matrisinde seyreltik oranı. Buzda sulandırmak.
- Bir pipet kullanarak standart bir 12-şey plaka her şey için 100 µL seyreltilmiş membran matris ekleyin. Bir hücre kazıyıcı kullanarak, hatta bir kat için kuyu boyunca seyreltilmiş membran matris eşit dağıt.
- 1s için 37 ° C'de kuluçkaya.
- Bir pipet kullanarak kalan su kaldırmak ve 3D organoids aktarmadan önce oda sıcaklığında 1 h için kuru.
5. 2D Gastrik epitel hücre Monolayers 3D m/hFGOs ve aktarımı
- 3D fare veya insan-FGOs 6-7 gün boyunca kültürlü kaynaklı sonra 3D organoids aktarımı için 2D monolayer başlar.
Not: gerekli bir monolayer her şey için 300 olduğu gibi organoids veya tek hücre 300 organoids türetilmiş kullanmak için önerilir. Sağlam bir kültürde bu 150 organoid/iyi bir 12 iyi kültür tabak içinde yaklaşık almak için bekleniyor. - Tabak aktarmadan önce kaplanır emin olun.
Not: Membran kaplı matris plakaları bir yarı saydam jel katman var, ancak, kolajen kaplı levha kaplama açık belirtisi yoktur. - Doğrudan 1 mL steril Ca2 +/Mg2 +pipetting tarafından 3D membran matris kabarcık plaka çıkarmak-DBPS ücretsiz kabarcık Merkezi.
- Bir pipet kullanarak, membran matris ve organoid karışımı hücre kültür testi tüpler içine toplamak. 2 membran matris baloncuklar tüp başına oranında toplamak. 40 g ve 4 ° c x 5 dk santrifüj
- Vakum sistemiyle süpernatant kaldırmak ve mümkün olduğunca fazla membran matris. Ca2 +/Mg2 +4 mL resuspend-DBPS ücretsiz, süpernatant kaldırmak ve 2 - 3 kez tekrarlayın. Bütün organoid Aktarım Protokolü için 5.10 adıma geçin. Adım 5,7 tek hücre süspansiyon protokolü için devam ediyor.
- Hücre dekolmanı çözümü 37 ° c önceden sıcak ve her test tüpü 1 mL ekleyin. Tüpler ters çevirme ya da yukarı ve aşağı bir pipet ile pipetting karışımı yavaşça. 37 ° C'de 10 dakika için kuluçkaya
- Ca2 +/Mg2 +2 mL ekleyin-DBPS doğrudan her tüp için ücretsiz.
- 26 G iğne kullanın ve karışım 2 - 3 kez şırınga. Görsel için tek hücreleri denetleyin. Hala varsa organoids veya hücre kümeleri 1-2 kez daha şırınga.
- 4 ° C'de 5 min için 40 x g, santrifüj Pelet 2D FGO medyada resuspend (2D fare FGO büyüme orta: gelişmiş Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal orta/F12 orta Fetal buzağı Serum, 10 mM 2 mM L-glutamin, 10 mM penisilin/streptomisin, % 10 takıma HEPES tampon, 1 x N2, 1 x B27, 10 nM gastrin, 50 ng/mL Epidermal büyüme faktörü, 1 µM TGF-β inhibitörü ve 10 µM Y-27632 ROCK inhibitörü ile desteklenmiştir. 2D insan FGO büyüme orta: Gelişmiş Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal orta/F12 orta 2 mM L-glutamin, %1 penisilin/streptomisin, 10 mM ile % 10 HEPES tampon, takıma Fetal buzağı Serum, 10 mM Nikotinamid, 1 x N2, 1 x B27, sefaloridin, 50 ng/mL Epidermal büyüme 50 mg/mL ile desteklenmiş 1 µM TGF-β önleyici) faktör ve 10 µM Y-27632 ROCK inhibitörü.
- Levha kaplamalı plakalar üzerinde resuspension. Tabak 37 ° C'de kuluçkaya Medya sarı dönüşürse ortamı her 4 gün veya daha önce değiştirin. Monolayer yaklaşık 4 gün form olarak gerektirir.
6. yara tahlil 2D Gastrik epitel hücre Monolayers kullanarak sıfırdan
- Kültür % 100 confluency ulaşmıştır jilet kullanarak, monolayer kaşı.
- 15 dakika oda sıcaklığında % 3.7 formaldehit kullanarak monolayers saptamak. %0,5 non-iyonik deterjan/PBS için oda sıcaklığında 20 dk ile permeabilize.
- Sonraki monolayers oda sıcaklığında 1 h için % 2 eşek serum ile blok ve 1: 1000 seyreltme h+, K+ile kuluçkaya-ATPaz birincil antikor gecede 4 ° C'de yıkama %0,1 non-iyonik deterjan/PBS ile ve eşek 1: 100 seyreltme ile kuluçkaya Anti-fare 488 ikincil antikor ve 10μg/mL Höchst hücre çekirdeği, oda sıcaklığında 1 h için leke.
- 2D insan kaynaklı mide monolayer kültürlerde yüzey müköz çukur hücreleri tanımlamak için 20 μg /mL Ulex europaeus (UEAI) FITC eşleniği olan hücreleri leke. Confocal mikroskop üzerinde görüntü monolayers.
- Her kaç h. çizik monolayer kalitesine bağlı olarak 24-48 h ve hastalar arasında varyasyon arasında yeniden epithelialize yara görüntülerini almak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Organoids ya corpus/vücut insan ya da fundus fare mide dokuların (şekil 1A) elde edilmiştir. Ya collagenase ya da EDTA sindirim mide dokusunun insan veya fare türetilmiş sonra sırasıyla, bezleri membran matris gömülü ve 6-7 gün (şekil 1A) kültürlü. Şekil 1B sonra Gastrik epitel monolayer (huGEM) için membran matris kaplı odası slaytlarda transfer edilmiş insan kaynaklı mide organoids (huFGOs) oluşumunu gösterir. Kültür 4 gün sonra Konfluent huGEMs sıfırdan yara deneyleri (şekil 1B) kullanılmıştır. Görüntüleri bir zaman atlamalı analizini yara kapatma kültür içinde 24 saat (Şekil 2) bir süre içinde gösterdi huGEM toplanan.
HuGEMs büyük hücre soy ifade etmek için yerel mide dokusu içinde bulduk bulundu. Ayirt boyama saptandı (şekil 3B, C) Paryetal ve yüzeyi mukoza (şekil 3B, D) oluşuyordu polarize E cadherin pozitif monolayer ifade hücreleri. Bu monolayers toplanan RNA PCR analizi parietal ve yüzey mukoza hücreleri, Şef ve müköz boyun hücreleri (şekil 3E) ek olarak ifade doğruladı. Konfluent huGEMs de kaç Proliferasyona hücre (şekil 3F) ifade. Bu büyük hücre soy içinde sıfırdan yara tahlil analiz çeper, Şef, müköz boyun yüzey mukoza hücreleri sürekli ifade üzerinde 24 saatlik zaman dilimi (şekil 4A, B) saptandı. Toplu olarak, bu veri Gastrik rejenerasyon vitroçalışma roman kültür sistemi olarak huGEMs kullanımı göstermektedir.
Şekil 1: üretimi birincil Gastrik epitel monolayers (huGEM) ve mide organoids (huFGO) insan kaynaklı. (A) insan Gastrik doku ve fare mide temsilcisi görüntülerini kullanılan bezleri organoid kültür için oluşturmak için. Anahatları belirlenmiş alan fare mide fundic bölge gösterir. (B) nesil insan kaynaklı Gastrik epitel monolayers (huGEMs) kültürü için kullanılan insan kaynaklı mide organoids (huFGOs). HuGEM yaralı alan gösterilen sıfırdan sonra temsilcisi görüntüsü. Ölçek çubuğu = 500 mikron Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: Scratch-yara tahlil. Temsili resim huGEM kullanarak bir zaman atlamalı deneme 0, 8, 16 ve 24 h yara sıfırdan sonra toplanan. Ölçek çubuğu = 500 mikron Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: büyük hücre soy huGEM kültürlerde ifadesidir. (A) E cadherin (Ecad, kırmızı), ifade gösteren huGEM kültürleri ayirt boyama yüzey mukoza hücreleri (UEAI, yeşil) ve çekirdek (Höchst, mavi) ve (B) E cadherin (Ecad, kırmızı), Paryetal hücreler (HK, yeşil) ve hücre çekirdeği () Höchst, mavi). Ayrı kanallar (C) ve (D)görüntülenir. (E) huGEMs H+K bir ifade için+çıkarılan RNA kullanarak RT-PCR gerçekleştirildi-ATPaz (ATP4a), pepsinogen C (PgC), MUC5AC ve MUC6. (F) Proliferating hücreleri EdU (kırmızı) alımı tarafından belirlenen huGEM kültür içinde. Ölçek (bar A-D) 50 mikron, ölçek = 100 mikron (F) =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: hücre lineage ifade sıfırdan-yara tahlil değişimler. Ayirt E cadherin (Ecad, kırmızı) ifade gösteren huGEM kültürleri boyama veya yüzey mukoza hücreleri (UEAI, yeşil) veya Paryetal hücreler (HK, yeşil) ve çekirdek (Höchst, mavi) kullanarak huGEM kültürler 0, 8, 16 ve 24 gönderilen görevinden toplanan slaytlar çizik-yara. Bkgrd membran matris slaytlara arka plan boyama =. XY-ekseni ölçek çubuğu 0 - 400 mikron. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Fare 3D Medya | Hisse senedi çözüm | Çalışma konsantrasyonu |
| nAcetylcysteine | Toz | 1 mM |
| Gastrin | 10 ΜM | 10 nM |
| EGF | 500 µg/mL | 50 ng/mL |
| Kafa | 100 µg/mL | 100 ng/mL |
| FGF10 | 100 µg/mL | 100 ng/mL |
| YCMD | 10 mM | 10 ΜM |
| B27 | 50 x | 1 x |
| N2 | 100 x | 1 x |
| Kalem/Strep | 1 M | 10 mM |
| HEPES | 1 M | 10 mM |
| Glutamax | 200 mM | 2 mM |
| WNT | % 50 v/v | |
| R-Spondin | % 10 v/v |
Tablo 1: Fare 3D ortam bileşenleri.
| Fare 2D medya | Hisse senedi çözüm | Çalışma konsantrasyonu |
| FCS | % 100 | % 10 |
| YCMPD | 10 mM | 10 ΜM |
| Gastrin | 10 ΜM | 10 nM |
| EGF | 500 µg/mL | 50 ng/mL |
| B27 | 50 x | 1 x |
| N2 | 100 x | 1 x |
| Kalem/Strep | 1 M | 10 mM |
| HEPES | 1 M | 10 mM |
| Glutamax | 200 mM | 2 mM |
| TGF-β inhibitörü | 10 mM | 1 ΜM |
Tablo 2: Fare 2D ortam bileşenleri.
| İnsan 3D Medya | Hisse senedi çözüm | Çalışma konsantrasyonu |
| Nikotinamid | Toz | 10 mM |
| nAcetylcysteine | Toz | 1 mM |
| Gastrin | 10 ΜM | 1 nM |
| EGF | 500 µg/mL | 50 ng/mL |
| Kafa | 100 µg/mL | 100 ng/mL |
| FGF10 | 100 µg/mL | 200 ng/mL |
| YCMD | 10 mM | 10 ΜM |
| B27 | 50 x | 1 x |
| N2 | 100 x | 1 x |
| Kalem/Strep | 1 M | 10 mM |
| HEPES | 1 M | 10 mM |
| Glutamax | 200 mM | 2 mM |
| Sefaloridin | 1 M | 10 mM |
| Amfoterisin B/viomisin | 125 µg/mL | 1 mM |
| WNT | % 50 v/v | |
| R-Spondin | % 10 v/v |
Tablo 3: İnsan 3D ortam bileşenleri.
| İnsan 2D medya | Hisse senedi çözüm | Çalışma konsantrasyonu |
| FCS | % 100 | % 10 |
| YCMPD | 10 mM | 10 ΜM |
| Gastrin | 10 ΜM | 1 nM |
| EGF | 500 µg/mL | 50 ng/mL |
| B27 | 50 x | 1 x |
| N2 | 100 x | 1 x |
| Kalem/Strep | 1 M | 10 mM |
| HEPES | 1 M | 10 mM |
| Glutamax | 200 mM | 2 mM |
| TGF-β inhibitörü | 10 mM | 1 ΜM |
| Nikotinamid | Toz | 10 mM |
| Sefaloridin | 1 M | 10 mM |
Tablo 4: İnsan 2D ortam bileşenleri.
| Deneysel sorun | İpucu sorun giderme |
| Monolayers forma organoids başarısız. | 1) bu iletişim kuralı için optimal kodlamayla koşullar deneysel ihtiyaçları arasında değişir. İnsan ve fare monolayers organoids türetilmiş-var kültürlü cam veya plastik kültür yemekleri kullanırken seyreltilmiş membran matrisi kullanarak. Ancak, sıçan kuyruk kollajen fare monolayer deneyler için en iyi yöntemdir veya polyester zar gerektiren insan kaynaklı ekler. 2) optimal kodlamayla koşullar kadar deneysel küme bağlı olarak değişir. Tek hücre süspansiyon kullanarak kültürler sağlam organoids 2D FGO medya ile kültürlü ise, 3D FGO medya ile ideal kültürlü. |
| Türetilen monolayers yaş arası hastalar (> 55 yaş) veya fare (> 18 ay) büyümek ve confluency ulaşmak için başarısız oldu | Eğer mide doku kullanarak toplanan yaşlı fareler (> 18 ay) veya hasta (> 55 yaş) verilen bu organoids büyüme verimliliğini azalmış monolayer oluşturulmasında kullanılan organoids yoğunluğu iki katına. |
| Organoids forma bezleri başarısız. | O taze (mümkünse yeni satın) önerilir gastrin kullanılabilir. Taze yeniden askıya alınmış gastrin her 4 ay kullanın. |
| Takın ve monolayers oluşturmak için Organoids başarısız | Kültür plakaları monolayers için aktarmak için organoids hasat sonrası membran matris verimli kaldırılması elde emin olun. |
| Türetilen kültürler yaşlı hastalar (> 55 yaş) veya fare (> 18 ay) başarısız | Sindirim ve kuluçka dönemleri sırasında ilk kuluçka kuluçka gerektiği gibi 5 dk aralıklarla ardından 15-30 dakika yeterli olur. Bu hastaların yaş 55 yaş büyük daha kolay ayrışmış ve bu nedenle gerektiren daha az sindirim bezlerinin olabilir unutulmamalıdır. Benzer şekilde, yaşlı hastalardan elde edilen FGOs daha yavaş büyüme zaman ve artan duyarlılık için Santrifüjü görüntülemiş. En iyi sonuçları elde etmek için herhangi bir aşırı Santrifüjü yaşlı doku ile çalışırken sınırlamak ve zamanında ortamı değiştirin. |
Tablo 5: sorun giderme ipuçları. Sorunları ve önerilen çözümleri için en uygun kuruluş ve insan kültürünü veya fare Gastrik monolayers karşılaştı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Geçerli protokol çizik-yara deneyleri için kullanılan insan ve fare türetilmiş Gastrik epitel monolayers kurulması ayrıntıları. Değiştirilmiş bir protokol ilk Schlaermann ve ark7tarafından yayınlanan ve protokol ikamet kök hücre izolasyon birincil insan (veya fare) doku kavramı üzerinde bağlıdır. Özellikle, biz burada protokolü bir birleşmesi kurmak için optimize edilmiş ve hangi ifade eder ve ana hücre içinde Gastrik epitel vivo içindebulunan soy Gastrik epitel monolayer polarize. Gastrik ülser onarım doku yeniden epithelialization, yenilenme ve nükleer silahların yayılmasına karşı9,10,11içeren karmaşık bir işlemdir. Özellikle, bizim laboratuvar Gastrik epitel rejenerasyon spasmolytic polipeptid/trefoil faktörünü (TFF) 2 ifade metaplazi (SPEM) ortaya çıkması ile Yenileyici mide bezlerinin içinde ülser kenar boşluğuna denk geliyor bildirdi 12,13. SPEM yaralanma ile ortaya çıkıyor ve Mukoza onun normal hücresel kompozisyon12' ye döndüğünde kaybolur bir müköz hücre metaplazi14 içine Şef hücre soy transdifferentiation tanımlanır. Böylece, bir vitro sistemde böyle bir mekanizma çalışmaya bu Şef hücreleri gibi büyük hücre soy kültürü içinde bulunması esastır.
Çizik-yara deneyleri kullanımı yoğun onarım ve yenileme çalışması için hem de son zamanlarda kadar kullanılan1,2,3,4mide kanseri hücre hatları vardı. Mide kanseri hücreleri satırları'nı kullanarak temel mekanizmaları ortaya koydu iken, bu kültürler dönüştürülür ve yerel mide dokusunun hücresel çeşitlilik eksikliği. HuGEMs yakından Gastrik epitel içinde vivobeyannamedir bir polarize ve çeşitli hücresel kompozisyon korumak için gösterilir. Ayrıca, sonra ulaşan confluency huGEM kültürler için en fazla bir ay optimal koşullar içinde muhafaza edilebilir. Genişletilmiş kültürler uzun süreli deneyler için izin. Böylece, gelecekteki uygulamaları kabul edilebilir huGEMs monolayer/bağışıklık hücre ortak kültürleri ve uzun süreli deneyler Helicobacter pylori Patogenez incelenmesi için içerir.
Geçerli protokol dikkat edilmesi gereken önemli teknik yönleri vardır. İlk teknik asıl olay membran bileşen seçimi deneylerde kullanılmak üzere hücre kültür yüzeye bağlı olarak değişir. Optimum monolayer koşulları ulaştığını emin olmak için monolayers ile deneyler polyester membran ekler ile plakalar gerektiğinde bu kollajen kullanılır önerilir. Monolayer deneyler cam veya plastik kültür yüzeyler gerekiyorsa, ancak, seyreltilmiş membran matris en uygun kaplama seçimdir. İkinci olarak, bir Konfluent monolayer ulaşmak için gerekli organoids yoğunluğu hastanın mide doku toplanan yaş bağlı olarak ayarlanması gerekir. Yaşlı fareler toplanan doku için (> 18 ay) veya hasta (> 55 yaş), düşük büyüme kapasitesi nedeniyle monolayer aktarılması bireyler arası kullanılan organoid yoğunluğu artan iki kat olması gerekir. Sindirim ve yaşlı hastalardan elde edilen insan dokusunun kuluçka sırasında bezleri ayrılma ve Santrifüjü daha duyarlı olabilir ve bu nedenle: mümkün, 2) medya özenle yerine olarak idareli ve 3) sırasında sindirim centrifuged 1) 15-30 dakika incubations 5 dakika sonra artımlı kesimi ile sindirim üzerinde olasılığını azaltır. Ne zaman sağlam organoids kültür, 2D FGO medya en yüksek verimliliği vermeye gözlenmiştir ise son olarak, tek hücre organoid kaynaklı kullanılamaz hale gelen monolayers oluşturan, 3D FGO medya monolayers uygun oluşumu için en uygun olur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser NIH (NIDDK) 5 desteklenmiştir R01 DK083402-07 (YZ) verin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced Dulbecco's modified Eagle/F12 medium (basal media) | Life Technologies | 12634-010 | |
| GlutaMAX (L-glutamine) | Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Amphotericin B/Gentamicin | Thermo Scientific | R01510 | |
| Kanamycin | Thermo Fisher | RO1510 | |
| HEPES Buffer | Sigma Aldrich | H0887 | |
| n-Acetylcystine | Sigma Aldrich | A9165 | |
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 | Life Technologies | 12587-010 | |
| BMP Inhibitor (Noggin) | Pepro Tech | 250-38 | |
| Gastrin | Tocris | 3006 | |
| EGF | Pepro Tech | 315-09 | |
| FGF10 | Pepro Tech | 100-26 | |
| Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636 | |
| Y-27632 ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| TGF-β Inhibitor | Tocris | 2939 | |
| Ca2+/Mg2+ -free DPBS | Fisher | 21-031CV | |
| Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 12634-010 | |
| Fetal Bovine Serum | FBS | ||
| OPTIMEM | Invitrogen | ||
| 0.22µM filter | Fisher | 099-720-004 | |
| 37 °C Water Bath | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington | LS004214 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
| Kimwipes (tissue paper) | Fischer Scientific | 06-666C | |
| 125 mL round bottom flask | |||
| 1 in (25 mm) stir bar | |||
| Rubber Septa | |||
| Sterile Gauze | |||
| Stir Plate | |||
| Ring Stand | |||
| Ring Stand Clamps | |||
| Sterile petri dish | |||
| 18 G needles of 1.5 in length | Thermo Fisher | 305196 | |
| 20 G spinal needles of 3.5 in length | Thermo Fisher | 405182 | |
| 12-well cell culture treated plate | Midwest Scientific | 92012 | |
| Growth Factor Reduced, Phenol Red-free MatrigelTM (Basement membrane matrix) | Fisher | CB-40230C | |
| Sterile Razor Blades | |||
| Wide-tip tweezers | |||
| Curved Hemostatic Forceps | |||
| 200 µL wide pipette tips | Thermo Fisher | 02-707-134 | |
| 5 mL cell culture test tubes | Fisher | 14-956-3C | |
| Oxygen Tank with rubber hosing | |||
| 1 g D-Sorbitol | |||
| Sucrose | Fisher | SS-500 | |
| Dissecting microscope | |||
| Dissecting Tray | |||
| Rocking Table | |||
| Rat Tail Collagen Type 1 | Life Technologies | A10483-01 | |
| Cell culture grade glacial acetic acid | Fisher | A38-212 | |
| Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
| 2-well chamber slide | Thermo Fisher | 155380 | |
| 12-well Transwell (polyester membrane inserts) | Corning | 3460 | |
| Cell scraper | Corning | 353086 | |
| Accutase (cell detachment solution) | Stemcell Technologies | 7920 | |
| 263/8 G syringe | Thermo Fisher | 309625 | |
| Razor blade | |||
| L Cells | L cells, a Wnt3a producing cell line, were received as a gift from Dr. Hans Clevers (Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, Netherlands). | N/A | |
| HEK-293T Rspondin secreting cells | A modified HEK-293T R-spondin secreting cell line was obtained from Dr. Jeff Whitsett (Section of Neonatology, Perinatal and Pulmonary Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Centre and The University of Cincinnati College of Medicine, Cincinnati, USA ). | N/A | |
| HK-ATPase Primary Antibody | Invitrogen | SC-374094 | |
| E-Cadherinn | SantaCruz | sc-59778 | |
| UEA1 | Sigma Aldrich | L9006 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 | |
| Alexafluor 488 secondary antibody (Donkey anti-mouse 488 secondary antibody) | ThermoFisher Scientific | R37114 |
References
- Nagy, T. A., et al. Helicobacter pylori regulates cellular migration and apoptosis by activation of phosphatidylinositol 3-kinase signaling. J Infect Dis. 199 (5), 641-651 (2009).
- Mnich, E., et al. Impact of Helicobacter pylori on the healing process of the gastric barrier. World J Gastroenterol. 22 (33), 7536-7558 (2016).
- Zhang, Y., et al. Bm-TFF2, a toad trefoil factor, promotes cell migration, survival and wound healing. Biochem Biophys Res Commun. 398 (3), 559-564 (2010).
- Crabtree, J. Role of cytokines in pathogenesis of Helicobacter pylori-induced mucosal damage. Dig Dis Sci. 43 (Supplement), 46S-53S (1998).
- Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. J Lab Autom. 17 (1), 59-65 (2012).
- Zhang, M., Li, H., Ma, H., Qin, J. A simple microfluidic strategy for cell migration assay in an in vitro wound-healing model. Wound Repair Regen. 21 (6), 897-903 (2013).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Bertaux-Skeirik, N., et al. CD44 plays a functional role in Helicobacter pylori-induced epithelial cell proliferation. PLoS Pathog. 11 (2), e1004663 (2015).
- Tarnawski, A. S. Cellular and molecular mechanisms of gastrointestinal ulcer healing. Dig Dis Sci. 50 (Suppl 1), S24-S33 (2005).
- Wright, N. A., Pike, C., Elia, G. Induction of a novel epidermal growth factor-secreting cell lineage by mucosal ulceration in human gastrointestinal stem cells. Nature. 343, 82-85 (1990).
- Wright, C. L., Riddell, R. H. Histology of the stomach and duodenum in Crohn's disease. Am J Surg Pathol. 22 (4), 383-390 (1998).
- Engevik, A. C., et al. The Development of Spasmolytic Polypeptide/TFF2-Expressing Metaplasia (SPEM) During Gastric Repair Is Absent in the Aged Stomach. CMGH. , In Press (2016).
- Bertaux-Skeirik, N., et al. CD44 variant isoform 9 emerges in response to injury and contributes to the regeneration of the gastric epithelium. Journal of Pathology. 242 (4), 463-475 (2017).
- Nam, K. T., et al. Mature chief cells are cryptic progenitors for metaplasia in the stomach. Gastroenterology. 139 (6), 2028-2037 (2010).
