Summary
Her beskriver vi en protokoll for å etablere og dyrking menneske - og mus-avledet 3-dimensjonale (3D) gastrisk organoids og metoden for overføring av 3D organoids til en 2-dimensjonal monolayer. Bruk av mage epithelial monolayer som en roman scratch-sår analysen for regenerering studier er også beskrevet.
Abstract
In vitro studier av mage såret reparasjon vanligvis innebærer bruk av magekreft cellelinjer i en scratch-sår analysen av mobilnettet spredning og overføring. En kritisk begrensning av slike analyser, er imidlertid deres homogen utvalg av mobilnettet. Reparer er en komplisert prosess som krever samspillet flere celletyper. Derfor, for å studere en kultur uten mobilnettet subtyper, er et problem som må overvinnes hvis vi skal forstå reparasjonsprosessen. Gastrisk organoid modellen kan lindre problemet der heterogene samlingen celletyper tett gjenspeiler mage epitel eller andre innfødte vev i vivo. Vist her er en roman, i vitro scratch-sår analysen avledet fra menneskelige eller musen 3-dimensjonale organoids som kan deretter overføres til en mage epithelial monolayer som enten intakt organoids eller en enkeltcelle suspensjon av avstand organoids. Målet med protokollen er å etablere organoid-avledet mage epithelial monolayers som kan brukes i en roman scratch-sår analysen system for å studere mage gjenfødelse.
Introduction
Bruk av scratch-sår analyser er en populær metode for å studere reparasjon og regeneration1,2,3,4,5,6. Foreslåtte metodikken kan brukes spesielt studere mage regenerasjon og Helicobacter pylori colonization. Tidligere magekreft linjer har blitt brukt som et middel til å studere Helicobacter pylori (H. pylori) infeksjon1,2 og til sist magekreft linjer som AGS celler var favoriserte1 ,2,3,4. En begrensning av magekreft cellekulturer er deres manglende recapitulate mobilnettet mangfoldet av mage epitel. For å prøve å løse denne begrensningen vist her er etablering og overføring av primære menneske - og mus-avledet 3-dimensjonale fundic gastrisk organoids (FGOs) til en mage epithelial monolayer for sår helbredelse analyser basert på en modifisert metode først beskrevet av Schlaermann et al. 7 vi viser at mage epithelial monolayers avledet fra skåret 3D gastrisk FGOs eller FGO-avledet enkeltceller beholde en polarisert mobilnettet sammensetning som tett representerer det av mage epitel i vivo. Gitt at magekreft cellelinjer ikke samordnet celle sammensetningen denne teknikken viser, har gjeldende protokollen en fordel over alternative scratch-sår analysen metoder. Denne metoden har blitt optimalisert der monolayers kan være etablerte fra hele organoids eller en enkeltcelle suspensjon fra avstand organoids og belagt med en kjeller membran matrise eller kollagen belegg. Det overordnede målet med denne protokollen er å etablere en organoid avledet mage epithelial monolayer kulturer for en roman sår helbredelse analysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
For å unngå forurensning, utføre protokollen i sin helhet i sterilt vev kultur hette. Menneskelig fundic vev ble samlet inn fra pasienter som gjennomgår ermet gastrectomy i henhold til godkjente University of Cincinnati IRB-protokollen (IRB Protokollnummer: 2015-4869).
Alle mus studier ble godkjent av University of Cincinnati institusjonelle dyr omsorg og bruk Committee (IACUC) som opprettholder et American Association for vurdering og akkreditering av laboratoriet Animal Care (AAALAC) anlegg.
1. etablere Human-avledet 3D gastrisk Fundic Organoids
Merk: Denne protokollen er basert på forskning tidligere publisert i denne lab8.
- Forberede 3D organoid media som består av 50% Wnt-betinget og 20% R-spondin betinget media.
- Forberede Wnt betinget media, kultur L cellene i Wnt oppblomstringen medium (Dulbecco modifiserte Eagle Medium (DMEM), 10% fosterets bovin serum (FBS), 1% Penicillin/streptomycin) for 7 dager, høste medium, og filtrere bruke filtere 0.22 µm.
- Forberede R-spondin betinget media. Vokse en modifisert HEK-293T R-spondin secreting cellen linje i R-spondin vekst medium (Dulbecco modifiserte Eagle Medium (DMEM), 10% fosterets bovin serum (FBS), 1% Penicillin/streptomycin). På vedlegg etter 2 h, endre mediet fra disse cellene til OPTIMEM vekst medium, 1% Penicillin/Streptomycin. Kultur cellene i 7 dager. Deretter høste R-spondin betinget media og filtrere bruke filtere 0.22 µm.
Merk: Denne protokollen er publisert tidligere, og for en mer detaljert protokoll se 6,7,8.
- Tine vekstfaktor redusert, fenol red-fri kjelleren membran matrix 16 h på isen på 4 ° C. Samle vevet i det iskalde Ca2 +/Mg2 +-gratis DBPS i en stor plastbeholder. Lagre på isen til begynnelsen trinn 1.4.
Merk: Vev samles fra pasienter som gjennomgår ermet gastrectomy. - Ved hjelp av pinsett, vaske vevet kraftig i et sterilt beaker som inneholder 100 mL Ca2 +/Mg2 +-gratis Dulbeccos fosfat bufret saltvann (DPBS). Vask for ca 30 s eller til rusk og blod er fjernet. Deretter bruker sterilt gasbind, tørke bort slimete laget fra epitel.
- Bruker stor tang, fast grep muskel laget av vev og med kraft, skrape bort epitel bruker store buede hemostatic tang. Samle skrapte epithelial fragmenter i et sterilt, polystyren Petriskål.
- Hakke epitel vev i ca 2.0 x 2.0 mm2 størrelse fragmenter bruker barberhøvler for å optimalisere vev fordøyelsen. Vask vev fragmenter med Ca2 +/Mg2 + -gratis DBPS supplert med antibiotika (Ca2 +/Mg2 + -gratis DPBS, 1% Penicillin/Streptomycin, 0,25 mg/mL amfotericin B 10 mg/mL Gentamicin, 50 mg/mL Kanamycin), til vask er blod. Utføre flere vasker hvis nødvendig. Kast av vask ved filtrering nøye vask gjennom sterilt gasbind i et avfall beger.
- Samle vasket fragmenter i et 125 mL glass rundt bunnen kolbe med 25 mm rør bar og forvarmes incubation media (basale media med 2 mM L-glutamin, 1% Penicillin/Streptomycin, 10 mM HEPES Buffer, 1 mg/mL Collagenase Type 1, 2 mg/mL cellekultur karakteren Bovine Serum Albumin). Forsegle runde bunnen flasken gummi septa.
- Sette inn en 20 G spinal nål i septa og koble den til en oksygentank med gummi spyling. Sett inn papir i slangen til å opprette et filter for å filtrere ut eventuelle forurensninger. Slå på oksygen strøm på lav. 10-15 utløp nåler inn septa å unngå brudd på septa.
- Sikre settet opp til en ring stå ved hjelp av klemmer og plasser den i et vannbad kalibrert 37 ° c med en røre plate i 30-45 minutter. Når vevet har vært rugende i 15 min, fjerne 50 µL av inkubasjon media og se visuelt dissosiert kjertler. Hvis kjertler ikke tett eller har ikke skilt fra vevet, la for en ytterligere 5-10 minutter.
- Etter inkubasjon legge 50 mL forvarmet DMEM/F12 inkubasjon medier med en bakteriefri serologisk pipette eller ved å helle direkte i inkubasjon blandingen.
- Filtrere kjertel blandingen gjennom sterilt gasbind i fire 50 mL konisk rør. Holde filtratet på isen i 15 min tillate utdraget kjertler bosette til bunnen av koniske røret. Vær forsiktig med å forstyrre de utlignede kjertlene, fjerne og kaste på toppen 40 mL supernatant bruker en serologisk pipette. Resuspend de resterende 10 mL i 10 mL av DPBS med antibiotika.
- Fordel blandingen jevnt i 5 mL celle kultur reagensglass. Sentrifuge for 5 min 65 x g på 4 ° C og fjerne nedbryting forsiktig med en pipette. Resuspend den kjertel pellet i tinte kjelleren membran matrix en pipette eller et 200 µL bredt pipette tips. Bland til homogen.
Merk: Det er avgjørende å utføre dette trinnet på isen og unngå polymerisering av kjelleren membran matrise mens. I tillegg er det viktig å visuelt inspisere kjertel tettheten av prøvetaking for 50 µL. Optimal tetthet er ~ 70% confluency. - Deretter plate kjertler i 50 µL av kjelleren membran matrise med en bred-tipped pipette. Unngå produserer bobler mens plating.
- Å tillate kjelleren membran matrix danner, ruge i 10-15 minutter på 37 ° C. Hvis kontaktflate i en 12-brønnen plate, legge 1 mL av hFGO media (avansert Dulbecco endret Eagle medium/F12 medium supplert med 2mM L-glutamin, 1% Penicillin/Streptomycin, 0,25 mg/mL amfotericin B 10 mg/mL Gentamicin, 50 mg/mL Kanamycin, 10 mM HEPES Bufferen, 1 mM n-Acteylcystine, 1 x N2, 1 x B27, 50% Wnt-conditioned medium, 20% R-spondin-conditioned medium med 100 ng/mL bein Morfogenetiske proteinet inhibitor, 1 nM gastrin, 50 ng/mL Epidermal vekstfaktor, 200 ng/mL Fibroblast vekstfaktor 10, 10 mM nikotinamid og 10 µM Y-27632 ROCK hemmer) per brønn. Hvis ikke bruker en 12-brønnen plate legger nok media å senke kjelleren membran matrix boblen.
- Kultur cellene på 37 ° C i en 5% CO2 fuktet celle kultur inkubator. Endre media hver 4-5 dager.
2. opprette mus-avledet 3D gastrisk Fundic Organoids
Merk: Denne protokollen har vært publisert tidligere 6. Tine kjelleren membran matrise på isen og forberede reagenser før du begynner.
- Ofre mus med en metode som er godkjent av forskning institusjonen hvor forskning blir utført. Fjern magen fra musen og dissekere ifølge publisert tidligere protokoller 6. Vask i 20 mL isen kalde Ca2 +/Mg2 +-gratis DBPS.
Merk: C57BL/6 mus, alderen 8-10 uker, brukes for fundic gastrisk organoid kulturer. Mus var euthanized ved innånding av karbondioksid etterfulgt av manuell cervical forvridning før magen fjerning. - Stripe muskel laget fra magen og noen synlige blodkar som tidligere publisert 6.
- Skill fundus fra antrum og forestomach bruker et sterilt barberblad. Kutt fundus med små kirurgisk saks i fragmenter ca 2.0 x 2.0 mm. bruke tang, samle fragmenter i et 15 mL konisk rør som inneholder EDTA inkubasjon buffer (Ca2 +/Mg2 +-gratis DPBS, 5 mM EDTA) og Inkuber ved 4 ° C i 2 timer med mild agitasjon.
- I sterilt hette, la konisk rør og fragmenter på is ca 5 min. bruker en pipette for å fjerne så mye inkubasjon buffer som mulig la fragmenter urørt. Legge til 5 mL risting buffer (1 g D-Sorbitol, 1,47 g sukrose i 100 mL Ca2 +/Mg2 +-gratis DPBS) riste for hånd med en kraft for 2 min. tillate store fragmenter å bosette og med hast, bruker en 1000 p pipette, fjerne små fragmenter som har ennå å avgjøre i det øverste laget.
- Spinne fjernet fragmenter i 5 min på 4 ° C 65 x g.
- Mens unngå luftbobler, fjerne nedbryting, resuspend i kjelleren membran matrix og bland til det er homogent.
- Bruk en bred tips pipette plate kjelleren membran matrix på 50 µL per brønn og deretter ruge på 37 ° C for 20 min.
- Legge til nok mFGO vekst medier (avansert Dulbecco endret Eagle medium/F12 medium med 2mM L-glutamin, 1% Penicillin/Streptomycin, 10 mM HEPES Buffer, 1mM n-Acteylcystine, 1 x N2, 1 x B27, 50% Wnt-conditioned medium, 20% R-spondin-conditioned middels supplert med 100 ng/mL bein Morfogenetiske proteinet inhibitor, 10 nM gastrin, 50ng/mL Epidermal vekstfaktor, 10 ng/mL Fibroblast vekstfaktor 10 og 10 µM Y-27632 ROCK hemmer) å senke boblen.
- Kultur cellene på 37 ° C, 5% CO2 fuktet celle kultur inkubator. Endre media hver 4-5 dager.
3. kollagen belegg for 2D overføring
Merk: Utfør alle prosedyrer i sterilt vev kultur hette med mindre annet er angitt. Starte kollagen belegg 24 timer før du overfører 3D organoids til monolayer. Holde rotte hale kollagen på isen og skjermet fra lys. Kollagen belagt platene er bra for opptil 2 uker. Hvis ikke bruker belagt plater umiddelbart, vikle platen i parafilm og store på 4 ° C inntil nødvendig.
- Fortynne rotte hale kollagen å 50 µg/mL med 20 mM eddiksyre.
- Tilstrekkelig dekk overflaten av brønnen med fortynnet kollagen. For en godt i en standard 12-vel plate, pels med ca 1 mL av kollagen. La over natten i romtemperatur i sterilt hette.
- Vask to ganger med 1 mL Ca2 +/Mg2 +-gratis DPBS per brønn og la udekket for 2 timer ved romtemperatur i sterilt hette.
4. kjelleren membran Matrix belegg for 2D overføring
Merk: Utfør alle prosedyrer i sterilt vev kultur hette med mindre annet er angitt. Starte kjelleren membran matrix belegg 2 h før du overfører 3D organoids til monolayer. Holde kjelleren membran matrix på is. Belagt plater skal brukes umiddelbart og kan ikke lagres i lengre tid.
- Fortynne kjelleren membran matrisen i et 15 mL konisk rør med celle kultur klasse vann på en 1:10 forholdet. Fortynne på is.
- Bruke en pipette Tilsett 100 µL av utvannet kjelleren membran matrise hver brønn av en standard 12-vel-plate. Bruker en celle skraper, jevnt distribuere utvannet kjelleren membran matrix gjennom brønnen for en selv strøk.
- Inkuber ved 37 ° C i 1 time.
- Fjerne de gjenværende vannet med en pipette og tørr ved romtemperatur 1t før du overfører 3D organoids.
5. overføring av 3D m/hFGOs til 2D mage Epithelial cellen Monolayers
- Etter 3D musen eller menneske-avledede FGOs har vært kultivert for 6-7 dager, begynner overføringen av 3D organoids til 2D monolayer.
Merk: For hver brønn av en monolayer kreves det anbefales å bruke 300 intakt organoids eller enkeltceller avledet fra 300 organoids. I en robust kultur forventes det å få omtrent 150 organoid/godt innenfor en 12 godt kultur plate. - Pass på at platene er belagt før du overfører.
Merk: Kjelleren membran matrix belagt plater har en gjennomskinnelig gel lag, men kollagen belagt plater vil ikke ha noen tydelig indikasjon på belegget. - Dislodge det 3D kjeller membran matrix boblen fra platen av direkte pipettering 1 mL steril Ca2 +/Mg2 +-gratis DBPS på midten av boble.
- Bruker en pipette, samle kjelleren membran matrise og organoid blandingen i celle kultur reagensglass. Samle i forholdet 2 kjelleren membran matrix bobler per rør. Sentrifuge for 5 min på 40 x g og 4 ° C.
- Bruker et system, fjerne nedbryting og som mye kjelleren membran matrise som mulig. Resuspend i 4 mL av Ca2 +/Mg2 +-gratis DBPS, fjerne nedbryting og Gjenta 2 - 3 ganger. For hele organoid overføringsprotokollen, går du til trinn 5.10. Fortsette til trinn 5.7 for enkeltcelle suspensjon protokollen.
- Forvarm celle avdeling løsning på 37 ° C og legge 1 mL til hver test-rør. Bland forsiktig invertere rør eller pipettering opp og ned med en pipette. Inkuber i 10 min på 37 ° C.
- Legge til 2 mL Ca2 +/Mg2 +-gratis DBPS direkte til hver test-rør.
- Bruk en 26 G nål og sprøyte blandingen 2 - 3 ganger. Visuelt kontrollere enkeltceller. Sprøyte 1-2 ganger hvis det er fortsatt organoids eller klynger av celler.
- Sentrifuger 40 x g i 5 min på 4 ° C. Resuspend pellet i 2D FGO medier (2D musen FGO oppblomstringen medium: avansert Dulbecco endret Eagle medium/F12 medium supplert med 2mM L-glutamin, 10 mM Penicillin/Streptomycin, 10% fosterets kalv Serum, 10 mM HEPES Buffer, 1 x N2, 1 x B27, supplert med 10 nM gastrin, 50 ng/mL Epidermal vekstfaktor, 1 µM TGF-β hemmer og 10 µM Y-27632 ROCK inhibitor. 2D menneskelige FGO oppblomstringen medium: Avansert Dulbecco endret Eagle medium/F12 medium supplert med 2mM L-glutamin, 1% Penicillin/Streptomycin, 10 mM HEPES Buffer, 10% fosterets kalv Serum, 10 mM nikotinamid, 1 x N2, 1 x B27, supplert med 50 mg/mL Kanamycin, 50 ng/mL Epidermal vekst Faktor, og 10 µM Y-27632 ROCK inhibitor, 1 µM TGF-β hemmer).
- Plate rørets på belagt plater. Inkuber plater på 37 ° C. Erstatt media hver 4 dager eller tidligere hvis media gulner etterhvert. Monolayer krever omtrent 4 dager til skjemaet.
6. scratch såret analysen bruker 2D mage Epithelial cellen Monolayers
- Bruker et barberblad, avlyse monolayer når kulturen har nådd 100% confluency.
- Fastsette monolayers med 3,7% formaldehyd i 15 min ved romtemperatur. Permeabilize med 0,5% ikke-ioniske vaskemiddel/PBS for 20 min ved romtemperatur.
- Neste blokkere monolayers med 2% esel serum 1t ved romtemperatur og Inkuber med 1:1000 fortynning av H+, K+-ATPase primære antistoff over natten ved 4 ° C, vask med 0,1% ikke-ioniske vaskemiddel/PBS og ruge med 1: 100 fortynning av esel anti-musen 488 sekundære antistoff og 10μg/mL Hoechst celle kjerner flekken 1t ved romtemperatur.
- Identifisere overflaten slimete grav celler i 2D menneske-avledet gastrisk monolayer kulturer, beis celler med 20 μg /mL i Vest-Agder europaeus (UEAI) FITC konjugert. Bilde monolayers på AC confocal mikroskop.
- Ta bilder av såret hver par h. bunnen vil re epithelialize mellom 24-48 h avhengig av monolayer og variasjon mellom pasienter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Organoids var avledet fra enten corpus/kropp av menneskelige eller fundus av musen mage vev (figur 1A). Etter collagenase eller EDTA fordøyelsen av menneske - eller mus-avledet mage vev, er kjertler innebygd i kjelleren membran matrise og kultivert i 6-7 dager (figur 1A). Figur 1B viser dannelsen av menneske-avledet gastrisk organoids (huFGOs) som er deretter overført til en mage epithelial monolayer (huGEM) på kjeller membran matrix-belagt kammer lysbilder. Etter 4 dager av kultur, ble confluent huGEMs brukt for scratch såret analyser (figur 1B). Bildene samlet fra en tid forfalle analyse av huGEM viste såret nedleggelse innen kultur over en periode på 24 timer (figur 2).
HuGEMs ble funnet å uttrykke store celle linjen funnet i native mage vev. Immunofluorescence flekker avslørt uttrykk for en polarisert E cadherin-positive monolayer som besto av parietal (figur 3B, C) og overflaten slimete (figur 3B, D) celler. PCR analyse ved hjelp av RNA fra disse monolayers bekreftet uttrykk for parietal og overflate slimete celler, i tillegg til sjef og slimete cellene (figur 3E). Confluent huGEMs også uttrykt noen voksende celler (figur 3F). Analyse av disse store celle linjene i scratch såret analysen avdekket vedvarende uttrykk for parietal, sjef, slimete halsen slimete hudceller over en 24 timers periode (figur 4A, B). Samlet viser disse dataene bruk av huGEMs som roman kultur-systemet å studere mage gjenfødelse i vitro.
Figur 1: generasjon av menneske-avledet gastrisk organoids (huFGO) og primære mage epithelial monolayers (huGEM). (A) representant bilder av menneskelige mage vev og mus mage brukes til å generere kjertler for organoid kultur. Disponerte området angir fundic regionen musen magen. (B) generasjon av menneske-avledet gastrisk organoids (huFGOs) som brukes for kulturen i human-avledet mage epithelial monolayers (huGEMs). Representativt bilde av huGEM etter grunnen viser såret området. Skala bar = 500 μm Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Scratch-sår analysen. Representant bilder samlet fra en tid forfalle eksperimentere med huGEM 0, 8, 16 og 24 timer etter grunnen sår. Skala bar = 500 μm Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: uttrykk for store celle linjene i huGEM kulturer. Immunofluorescence farging av huGEM kulturer demonstrere uttrykk for (A) E cadherin (Ecad, rød), overflaten slimete celler (UEAI, grønn) og kjerner (Hoechst, blå), og (B) E cadherin (Ecad, rød), parietal celler (HK, grønn) og kjerner () Hoechst, blå). Separate kanaler vises i (C) og (D). (E) RT PCR ble utført ved hjelp av RNA utvunnet fra huGEMs for uttrykket av H+K+-ATPase (ATP4a), pepsinogen C (PgC), MUC5AC og MUC6. (F) Proliferating celler innenfor huGEM kulturen bestemmes av EdU (rød) opptak. Skalere bar (A-D) = 50 μm, skala bar (F) = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: endringer i celle avstamning uttrykk i bunnen-sår analysen. Immunofluorescence farging av huGEM kulturer demonstrere uttrykk for E cadherin (Ecad, rød) eller slimete hudceller (UEAI, grønn) eller parietal celler (HK, grønn) og kjerner (Hoechst, blå) bruke lysbilder fra huGEM kulturer 0, 8, 16 eller 24 timer innlegg scratch-sår. Bkgrd = bakgrunn farging av kjelleren membran matrise på lysbilder. XY-aksen skala baren fra 0 - 400 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Musen 3D Media | Lagerløsning | Arbeider konsentrasjon |
| nAcetylcysteine | Pulver | 1 mM |
| Gastrin | 10 ΜM | 10 nM |
| EGF | 500 µg/mL | 50 ng/mL |
| Noggin | 100 µg/mL | 100 ng/mL |
| FGF10 | 100 µg/mL | 100 ng/mL |
| YCMD | 10 mM | 10 ΜM |
| B27 | 50 x | 1 x |
| N2 | 100 x | 1 x |
| Penn/Strep | 1 M | 10 mM |
| HEPES | 1 M | 10 mM |
| Glutamax | 200 mM | 2 mM |
| WNT | 50% v/v | |
| R-Spondin | 10% v/v |
Tabell 1: Mus 3D Media komponentene.
| Musen 2D medier | Lagerløsning | Arbeider konsentrasjon |
| FCS | 100% | 10% |
| YCMPD | 10 mM | 10 ΜM |
| Gastrin | 10 ΜM | 10 nM |
| EGF | 500 µg/mL | 50 ng/mL |
| B27 | 50 x | 1 x |
| N2 | 100 x | 1 x |
| Penn/Strep | 1 M | 10 mM |
| HEPES | 1 M | 10 mM |
| Glutamax | 200 mM | 2 mM |
| TGF-β hemmer | 10 mM | 1 ΜM |
Tabell 2: Mus 2D mediekomponenter.
| Menneskelige 3D Media | Lagerløsning | Arbeider konsentrasjon |
| Nikotinamid | Pulver | 10 mM |
| nAcetylcysteine | Pulver | 1 mM |
| Gastrin | 10 ΜM | 1 nM |
| EGF | 500 µg/mL | 50 ng/mL |
| Noggin | 100 µg/mL | 100 ng/mL |
| FGF10 | 100 µg/mL | 200 ng/mL |
| YCMD | 10 mM | 10 ΜM |
| B27 | 50 x | 1 x |
| N2 | 100 x | 1 x |
| Penn/Strep | 1 M | 10 mM |
| HEPES | 1 M | 10 mM |
| Glutamax | 200 mM | 2 mM |
| Kanamycin | 1 M | 10 mM |
| Amfotericin B/Gentamycin | 125 µg/mL | 1 mM |
| WNT | 50% v/v | |
| R-Spondin | 10% v/v |
Tabell 3: Menneskelig 3D mediekomponenter.
| Menneskelige 2D medier | Lagerløsning | Arbeider konsentrasjon |
| FCS | 100% | 10% |
| YCMPD | 10 mM | 10 ΜM |
| Gastrin | 10 ΜM | 1 nM |
| EGF | 500 µg/mL | 50 ng/mL |
| B27 | 50 x | 1 x |
| N2 | 100 x | 1 x |
| Penn/Strep | 1 M | 10 mM |
| HEPES | 1 M | 10 mM |
| Glutamax | 200 mM | 2 mM |
| TGF-β hemmer | 10 mM | 1 ΜM |
| Nikotinamid | Pulver | 10 mM |
| Kanamycin | 1 M | 10 mM |
Tabell 4: Menneskelig 2D mediekomponenter.
| Eksperimentell Problem | Feilsøking tips |
| Monolayers ikke fra organoids | 1) optimale dyrking forhold for denne protokollen varierer fra experimental behov. Menneskelige og mus monolayers avledet fra organoids bør kultivert bruker utvannet kjelleren membran matrix når du bruker glass eller plast kultur retter. Men rotte hale kollagen er optimal for monolayer eksperimenter av mus eller menneskelige opprinnelse som krever polyester membran setter inn. 2) optimale dyrking forhold varierer eksperimentelle settet opp. Kulturer ved hjelp av én celle suspensjon er ideelt kultivert med 3D FGO media mens intakt organoids er kultivert med 2D FGO medier. |
| Monolayers fra alderen pasienter (> 55 år) eller mus (> 18 måneder) mislyktes å vokse og nå confluency | Hvis bruker mage vev samlet fra alderen mus (> 18 måneder) eller pasienter (> 55 år) tettheten av organoids brukt for generering av monolayer bør bli doblet gitt at veksten effektiviteten av organoids er redusert. |
| Organoids ikke fra kjertler | Det anbefales at fersk (nylig kjøpt hvis mulig) gastrin brukes. Bruk ferskt nytt suspendert gastrin 4 måneder. |
| Organoids mislykkes å feste og danner monolayers | Kontroller at effektiv fjerning av kjelleren membran matrise er oppnådd etter høsting organoids for overføring til kultur plater for monolayers. |
| Kulturer stammer fra alderen pasienter (> 55 år) eller mus (> 18 måneder) mislykkes | I fordøyelsen og inkubasjon perioder, 15-30 min første inkubasjon etterfulgt av 5 min intervaller med inkubering nødvendig er tilstrekkelig. Det bør bemerkes at pasienter større enn 55 år har kjertler som er lettere avstand og krever derfor mindre fordøyelsen. Tilsvarende har FGOs avledet fra alderen pasienter vises lavere vekst tid og økt følsomhet for sentrifugering. For å oppnå de beste resultatene, begrense eventuelle overskytende sentrifugering når du arbeider med alderen vev og erstatte medier innenfor tidsrammen. |
Tabell 5: feilsøkingstips. Problemer og anbefalte løsninger for optimal etablering og kultur av menneskelige eller musen gastrisk monolayers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gjeldende protokollen detaljer etableringen av menneske - og mus-avledet mage epithelial monolayers som kan brukes til bunnen-sår analyser. Protokollen avhenger begrepet bosatt stamceller isolert fra primære human (eller mus) vev og er en endret protokoll først utgitt av Schlaermann et al7. Vi har spesielt optimalisert protokollen her for å etablere en confluent og polarisert mage epithelial monolayer som uttrykker store celle linjene som finnes mage epitel i vivo. Magesår reparasjon er en kompleks prosess som involverer vev re epithelialization, fornyelse og spredning9,10,11. Spesielt har vårt laboratorium rapportert at regenerering av mage epitel sammenfaller med fremveksten av spasmolytic polypeptid/trefoil faktor (TFF) 2-uttrykke Metaplasi (SPEM) til sår marg i regenererende gastrisk kjertler 12,13. SPEM er definert som transdifferentiation av den øverste celle-linjen i en slimete celle Metaplasi14 som kommer med skade og forsvinner når mucosa tilbake til sine vanlige mobilnettet komposisjon12. Således, for å studere slik en mekanisme i et i vitro system, er det viktig at store celle linjen, som chief celler, finnes i kulturen.
Bruk av scratch-sår analyser er mye brukt for studiet av reparasjon og gjenfødelse, og inntil nylig, var magekreft cellelinjer brukte1,2,3,4. Mens grunnleggende mekanismer har blitt avslørt med magekreft celler linjer, disse kulturene forvandlet og mangler cellular mangfoldet av innfødte mage vev. HuGEMs er vist å beholde en polarisert og mangfoldig mobilnettet komposisjon som tett viser mage epitel i vivo. I tillegg, nå etter confluency huGEM kulturer kan opprettholdes for opptil én måneds under optimale forhold. Utvidet kulturer tillate langsiktige eksperimenter. Dermed inkluderer fremtidige anvendelser av huGEMs som kan bli vurdert monolayer/immun co cellekulturer og langsiktig eksperimenter for studiet av Helicobacter pylori patogenesen.
Det er viktige tekniske aspekter å merke i gjeldende protokollen. Første tekniske poenget er at valget av kjelleren membran komponent varierer avhengig av celle kultur overflaten som skal brukes for eksperimenter. For å sikre at optimal monolayer forhold er nådd, anbefales det at kollagen brukes når eksperimenter med monolayers krever plater med polyester membran inserts. Men hvis monolayer eksperimenter krever glass eller plast kultur overflater, er utvannet kjelleren membran matrise det optimale valget av belegg. Andre må tettheten av organoids kreves for å nå en confluent monolayer justeres avhengig av alderen av pasienten som samles inn av mage vev. For vev fra alderen mus (> 18 måneder) eller pasienter (> 55 år), til organoid tetthet brukes skal økes todelt når overføring til en monolayer på grunn av redusert vekst kapasiteten i alderen individer. I fordøyelsen og inkubasjonstiden for menneskelig vev fra eldre pasienter, kjertler kan være mer utsatt dissosiasjon og sentrifugering og derfor: 1) bør være sentrifugeres så lite som mulig, 2) media erstattet flittig, og 3) under fordøyelsen incubations på 15 til 30 minutter med trinnvis digestions 5 minutter etterpå vil redusere sannsynligheten for over fordøyelsen. Til slutt, når danner monolayers fra organoid-avledet enkeltcelle suspensjoner, 3D FGO media er mest optimale for riktig dannelsen av monolayers mens når dyrking fra intakt organoids, 2D FGO medier har blitt observert for å gi den høyeste effektiviteten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet ved NIH (NIDDK) 5 R01 DK083402-07 gi (YZ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced Dulbecco's modified Eagle/F12 medium (basal media) | Life Technologies | 12634-010 | |
| GlutaMAX (L-glutamine) | Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Amphotericin B/Gentamicin | Thermo Scientific | R01510 | |
| Kanamycin | Thermo Fisher | RO1510 | |
| HEPES Buffer | Sigma Aldrich | H0887 | |
| n-Acetylcystine | Sigma Aldrich | A9165 | |
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 | Life Technologies | 12587-010 | |
| BMP Inhibitor (Noggin) | Pepro Tech | 250-38 | |
| Gastrin | Tocris | 3006 | |
| EGF | Pepro Tech | 315-09 | |
| FGF10 | Pepro Tech | 100-26 | |
| Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636 | |
| Y-27632 ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| TGF-β Inhibitor | Tocris | 2939 | |
| Ca2+/Mg2+ -free DPBS | Fisher | 21-031CV | |
| Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 12634-010 | |
| Fetal Bovine Serum | FBS | ||
| OPTIMEM | Invitrogen | ||
| 0.22µM filter | Fisher | 099-720-004 | |
| 37 °C Water Bath | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington | LS004214 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
| Kimwipes (tissue paper) | Fischer Scientific | 06-666C | |
| 125 mL round bottom flask | |||
| 1 in (25 mm) stir bar | |||
| Rubber Septa | |||
| Sterile Gauze | |||
| Stir Plate | |||
| Ring Stand | |||
| Ring Stand Clamps | |||
| Sterile petri dish | |||
| 18 G needles of 1.5 in length | Thermo Fisher | 305196 | |
| 20 G spinal needles of 3.5 in length | Thermo Fisher | 405182 | |
| 12-well cell culture treated plate | Midwest Scientific | 92012 | |
| Growth Factor Reduced, Phenol Red-free MatrigelTM (Basement membrane matrix) | Fisher | CB-40230C | |
| Sterile Razor Blades | |||
| Wide-tip tweezers | |||
| Curved Hemostatic Forceps | |||
| 200 µL wide pipette tips | Thermo Fisher | 02-707-134 | |
| 5 mL cell culture test tubes | Fisher | 14-956-3C | |
| Oxygen Tank with rubber hosing | |||
| 1 g D-Sorbitol | |||
| Sucrose | Fisher | SS-500 | |
| Dissecting microscope | |||
| Dissecting Tray | |||
| Rocking Table | |||
| Rat Tail Collagen Type 1 | Life Technologies | A10483-01 | |
| Cell culture grade glacial acetic acid | Fisher | A38-212 | |
| Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
| 2-well chamber slide | Thermo Fisher | 155380 | |
| 12-well Transwell (polyester membrane inserts) | Corning | 3460 | |
| Cell scraper | Corning | 353086 | |
| Accutase (cell detachment solution) | Stemcell Technologies | 7920 | |
| 263/8 G syringe | Thermo Fisher | 309625 | |
| Razor blade | |||
| L Cells | L cells, a Wnt3a producing cell line, were received as a gift from Dr. Hans Clevers (Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, Netherlands). | N/A | |
| HEK-293T Rspondin secreting cells | A modified HEK-293T R-spondin secreting cell line was obtained from Dr. Jeff Whitsett (Section of Neonatology, Perinatal and Pulmonary Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Centre and The University of Cincinnati College of Medicine, Cincinnati, USA ). | N/A | |
| HK-ATPase Primary Antibody | Invitrogen | SC-374094 | |
| E-Cadherinn | SantaCruz | sc-59778 | |
| UEA1 | Sigma Aldrich | L9006 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 | |
| Alexafluor 488 secondary antibody (Donkey anti-mouse 488 secondary antibody) | ThermoFisher Scientific | R37114 |
References
- Nagy, T. A., et al. Helicobacter pylori regulates cellular migration and apoptosis by activation of phosphatidylinositol 3-kinase signaling. J Infect Dis. 199 (5), 641-651 (2009).
- Mnich, E., et al. Impact of Helicobacter pylori on the healing process of the gastric barrier. World J Gastroenterol. 22 (33), 7536-7558 (2016).
- Zhang, Y., et al. Bm-TFF2, a toad trefoil factor, promotes cell migration, survival and wound healing. Biochem Biophys Res Commun. 398 (3), 559-564 (2010).
- Crabtree, J. Role of cytokines in pathogenesis of Helicobacter pylori-induced mucosal damage. Dig Dis Sci. 43 (Supplement), 46S-53S (1998).
- Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. J Lab Autom. 17 (1), 59-65 (2012).
- Zhang, M., Li, H., Ma, H., Qin, J. A simple microfluidic strategy for cell migration assay in an in vitro wound-healing model. Wound Repair Regen. 21 (6), 897-903 (2013).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Bertaux-Skeirik, N., et al. CD44 plays a functional role in Helicobacter pylori-induced epithelial cell proliferation. PLoS Pathog. 11 (2), e1004663 (2015).
- Tarnawski, A. S. Cellular and molecular mechanisms of gastrointestinal ulcer healing. Dig Dis Sci. 50 (Suppl 1), S24-S33 (2005).
- Wright, N. A., Pike, C., Elia, G. Induction of a novel epidermal growth factor-secreting cell lineage by mucosal ulceration in human gastrointestinal stem cells. Nature. 343, 82-85 (1990).
- Wright, C. L., Riddell, R. H. Histology of the stomach and duodenum in Crohn's disease. Am J Surg Pathol. 22 (4), 383-390 (1998).
- Engevik, A. C., et al. The Development of Spasmolytic Polypeptide/TFF2-Expressing Metaplasia (SPEM) During Gastric Repair Is Absent in the Aged Stomach. CMGH. , In Press (2016).
- Bertaux-Skeirik, N., et al. CD44 variant isoform 9 emerges in response to injury and contributes to the regeneration of the gastric epithelium. Journal of Pathology. 242 (4), 463-475 (2017).
- Nam, K. T., et al. Mature chief cells are cryptic progenitors for metaplasia in the stomach. Gastroenterology. 139 (6), 2028-2037 (2010).
