Summary
Hier beschrijven we een protocol voor de vaststelling en het kweken van mens - en muis-afgeleide 3-dimensionale (3D) maag organoids, en de methode voor de overdracht van 3D organoids naar een 2-dimensionale enkelgelaagde. Het gebruik van de maag epitheliale enkelgelaagde als een roman kras-wond assay voor regeneratie studies wordt ook beschreven.
Abstract
In vitro studies van maag wond reparatie betekent meestal dat het gebruik van maagkanker cellijnen in een kras-wond assay van cellulaire proliferatie en migratie. Een belangrijke beperking van deze gehaltebepalingen, is echter hun homogene assortiment cellulaire soorten. Reparatie is een complex proces dat vraagt om de interactie van verschillende celtypes. Daarom, om te bestuderen van een cultuur verstoken van cellulaire subtypes, is een zorg die moet worden overwonnen als we gaan begrijpen van het herstelproces. Het model van de maag organoid kan dit probleem waarbij de heterogene collectie van celtypes aansluit bij die van de maag epitheel of andere inheemse weefsels in vivoverlichten. Aangetoond hier is een roman, in vitro kras-wond assay, afgeleid van de mens of de 3-dimensionale organoids muis, die vervolgens kunnen worden overgedragen aan een maag epitheliale enkelgelaagde als beide intact organoids of als een enkele celsuspensie van losgekoppeld organoids. Het doel van het protocol is om organoid afkomstige maag epitheliale monolayers die kunnen worden gebruikt in een roman kras-wond assay-systeem om te studeren maag regeneratie.
Introduction
Het gebruik van nul-wond tests is een populaire methode voor het bestuderen van de reparatie en regeneratie1,2,3,4,5,6. De voorgestelde methodologie kan worden gebruikt om specifiek bestuderen maag regeneratie en Helicobacter pylori kolonisatie. In het verleden, maagkanker cellijnen zijn gebruikt als een middel om te studeren van Helicobacter pylori (H. pylori) infectie1,2 en tot onlangs maagkanker cellijnen zoals AGS cellen waren favoriet1 ,2,3,4. Een beperking van de celculturen maagkanker is hun falen om te recapituleren de cellulaire diversiteit van de maag epitheel. Als u wilt proberen om deze beperking, aangetoond dat zij dat hier is de oprichting en overdracht van primaire mens - en muis-afgeleide 3-dimensionale fundic maag organoids (FGOs) een maag epitheliale enkelgelaagde voor wond genezing testen op basis van een gewijzigde methode eerst beschreven door Schlaermann et al. 7 we aantonen dat maag epitheliale monolayers afgeleid van 3D maag FGOs geschoren of FGO-afgeleide enkele cellen behouden een gepolariseerde cellulaire samenstelling die nauw die de maag epitheel vertegenwoordigt in vivo. Gezien het feit dat de cellijnen van maagkanker doen niet aantonen dat de samenstelling van de cel die deze techniek wordt weergegeven, heeft het huidige protocol een voordeel ten opzichte van alternatieve kras-wond controlemethodes. Deze methodologie is geoptimaliseerd waarbij monolayers worden kunnen gevestigd uit hele organoids of uit een enkele celsuspensie van gedissocieerde organoids en vergulde met behulp van een kelder membraan matrix of collageen-coating. Het algemene doel van dit protocol is om dat een organoid afgeleid maag epitheliale enkelgelaagde culturen voor een nieuwe wond genezing assay.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Om besmetting te voorkomen, voeren protocol in zijn geheel binnen een steriele weefselkweek kap. Menselijke fundic weefsel werd verzameld van patiënten die een sleeve Gastrectomie volgens het goedgekeurde protocol van de Universiteit van Cincinnati IRB (IRB protocolnummer: 2015-4869).
Alle muis studies werden goedgekeurd door de Universiteit van Cincinnati institutionele dierenverzorgers en gebruik Comité (IACUC) die een Amerikaanse vereniging van beoordeling en erkenning van Laboratory Animal Care (AAALAC) faciliteit onderhoudt.
1. invoering van mens-afgeleide 3D maag Fundic Organoids
Opmerking: Dit protocol is gebaseerd op onderzoek eerder gepubliceerd in dit lab8.
- 3D organoid media die uit 50% Wnt-geconditioneerd en 20% R-spondin geconditioneerd media bestaat voor te bereiden.
- Bereiden van Wnt geconditioneerd media, cultuur van de L-cellen in Wnt groeimedium (Dulbecco gewijzigd van Eagle Medium (DMEM), 10% foetale runderserum (FBS), 1% penicilline/streptomycine) voor 7 dagen, oogst het medium, en filteren met behulp van een 0,22 µm filter.
- R-spondin geconditioneerd media voor te bereiden. Groeien van een gemodificeerde HEK-293T R-spondin dat cellijn in R-spondin groeimedium (Dulbecco gewijzigd van Eagle Medium (DMEM), 10% foetale runderserum (FBS), 1% penicilline/streptomycine). Op bijlage na 2U, omzetten in het medium van deze cellen OPTIMEM groei medium, 1% penicilline/streptomycine. Cultuur de cellen gedurende 7 dagen. Dan de R-spondin geconditioneerd media oogst en filteren met behulp van een 0,22 µm filter.
Opmerking: Dit protocol is eerder gepubliceerd en voor een meer gedetailleerde protocol verwijzen naar 6,7,8.
- Ontdooi de groeifactor verminderde, fenol red-gratis kelder membraan matrix voor 16u op het ijs bij 4 ° C. Verzamelen van het weefsel in de ijskoude Ca2 +/Mg2 +-gratis DBPS in een grote plastic container. Opslaan op het ijs tot begin stap 1.4.
Opmerking: Weefsel wordt verzameld van patiënten die een sleeve Gastrectomie. - Met behulp van Tang, wassen het weefsel krachtig in een steriele bekerglas van 100 mL Ca2 +/Mg2 +-gratis Dulbecco van fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS). Wassen voor ongeveer 30 s of totdat het puin en het bloed heeft verwijderd. Vervolgens met behulp van steriel gaas, veeg weg de slijmvliezen laag van het epithelium.
- Met behulp van grote pincet, stevig begrijpen de spier laag van het weefsel en met kracht, het epithelium met behulp van de grote gebogen hemostatische verlostang weg te schrapen. De geschraapt epitheliale fragmenten in een petrischaal steriele, polystyreen verzamelen.
- Mince de epitheelweefsel in ongeveer 2.0 x 2.0 mm2 formaat stukjes weefsel vertering optimaliseren met scheermessen. Wassen van de weefsels fragmenten met Ca2 +/Mg2 + -gratis DBPS aangevuld met antibiotica (Ca2 +/Mg2 + -gratis DPBS, 1% penicilline/streptomycine, 0,25 mg/mL amfotericine B 10 mg/mL gentamicine, kanamycine 50 mg/mL), totdat de wash is vrij van bloed. Meerdere wasbeurten uitvoeren indien nodig. Verwijderen uit het wassen met een zorgvuldig het wassen door middel van een steriel gaas filter in een bekerglas van afval.
- Verzamel gewassen fragmenten in een glas 125 mL ronde onderkant kolf met een 25 mm roer bar en voorverwarmde incubatie media (basale media, aangevuld met 2 mM L-glutamine, 1% penicilline/streptomycine, 10 mM HEPES-Buffer, 1 mg/mL Collagenase Type 1, de cultuur van de cel van 2 mg/mL graad van bovien serumalbumine). Het zegel van de kolf met ronde bodem met rubber septa.
- Invoegen van een spinale naald van 20 G in de septa en sluit deze aan op een zuurstoftank met rubber hosing. Als u wilt filteren op eventuele verontreinigingen, kunt u het papieren zakdoekje invoegen door de buis om een filter te maken. Inschakelen van de uitstroom van de zuurstof op laag. 10-15 uitstroom naalden in de septa om te voorkomen dat de breuk van de septa invoegen.
- Beveilig de set up naar een stand van de ring met behulp van klemmen en plaatst u deze in een waterbad gekalibreerd tot 37 ° C met een roer-plaat voor 30-45 min. Nadat het weefsel heeft geweest incubatie gedurende 15 minuten, verwijder 50 µL van incubatie media en Controleer visueel gedissocieerde klieren. Als de klieren niet dicht of niet gescheiden van het weefsel, verlof voor een extra 5-10 min.
- Onmiddellijk na incubatie, voeg 50 mL pre-water verwarmd DMEM/F12 incubatie media met behulp van een steriele serologische pipet of door gieten direct in het incubatie-mengsel.
- Filtreer het mengsel van de klier door middel van een steriel gaas in vier 50 mL conische buizen. Houd het filtraat op ijs gedurende 15 minuten zodat uitgepakte klieren om af te wikkelen naar de onderkant van de conische buis. Wees voorzichtig niet te verstoren de gevestigde klieren, te verwijderen en te verwijderen uit de top 40 mL van het supernatant gebruik een serologische pipet. Resuspendeer de overblijvende 10 mL 10 ml van DPBS aangevuld met antibiotica.
- Het mengsel gelijkmatig verdelen in 5 mL cel cultuur reageerbuizen. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 65 x g bij 4 ° C en verwijder het supernatant zorgvuldig met behulp van een precisiepipet. Resuspendeer de pellet klier in ontdooide kelder membraan matrix met een pipet of een 200 µL breed pipette uiteinde. Meng tot homogene.
Opmerking: Het is van cruciaal belang voor het uitvoeren van deze stap op het ijs en om te voorkomen dat de polymerisatie van kelder membraan matrix tijdens het mixen. Daarnaast is het belangrijk om het visueel inspecteren de dichtheid van de klier door middel van steekproeven voor 50 µL. De optimale dichtheid is ~ 70% confluentie. - Vervolgens plaat de klieren in 50 µL van kelder membraan matrix met behulp van een precisiepipet wide-tipped. Vermijd produceren bubbels terwijl beplating.
- Dat kelder membraan matrix polymeriseren, Incubeer gedurende 10-15 minuten bij 37 ° C. Als plating in een 12-well cultuur bord, voeg 1 mL van hFGO media (Advanced Dulbecco gemodificeerde Eagle medium/F12 medium aangevuld met 2mM L-glutamine, 1% penicilline/streptomycine, 0,25 mg/mL amfotericine B 10 mg/mL gentamicine, 50 mg/mL kanamycine, 10 mM HEPES Buffer, 1 mM n-Acteylcystine, 1 x N2, 1 x B27, 50% Wnt-geconditioneerd medium, 20% R-spondin-geconditioneerd medium aangevuld met 100 ng/mL bot morfogenetische eiwit remmer 1 nM gastrine, 50 ng/mL epidermale groeifactor, 200 ng/mL Fibroblast groeifactor 10, 10 mM Nicotinamide, en 10 µM Y-27632 ROCK remmer) per putje. Als dat niet genoeg media te dompelen de zeepbel van de matrix kelder membraan met behulp van een 12-well cultuur plaat toevoegen.
- Cultuur van de cellen bij 37 ° C in een 5% CO2 bevochtigde cel cultuur incubator. Media elke 4-5 dagen wijzigen.
2. invoering van muis-afgeleide 3D maag Fundic Organoids
Opmerking: Dit protocol is eerder gepubliceerde 6. Kelder membraan matrix op het ijs ontdooien en bereiden alle reagentia voordat u begint.
- Offeren muizen met behulp van een methode goedgekeurd door de onderzoeksinstelling waar onderzoek wordt uitgevoerd. Verwijderen van de maag van de muis en ontleden volgens de eerder gepubliceerde protocollen 6. Wassen in 20 mL ijs koud Ca2 +/Mg2 +-gratis DBPS.
Opmerking: C57BL/6 muizen, leeftijd van 8-10 weken, worden gebruikt voor fundic maag organoid culturen. Muizen werden euthanized inademing van kooldioxide gevolgd door handmatige cervicale dislocatie voordat zij zijn afgehaald van de maag. - Strippen van de laag van de spieren van de maag en zichtbare bloedvaten zoals eerder gepubliceerd 6.
- Scheiden de fundus van het antrum en de voormaag met behulp van een steriele scheermesje. Gesneden fundus met behulp van kleine heelkundige schaar in fragmenten ongeveer 2.0 x 2.0 mm. met pincet, verzamelen de fragmenten in een conische tube van 15 mL EDTA incubatie buffer met (Ca2 +/Mg2 +-gratis DPBS, 5 mM EDTA) en Incubeer bij 4 ° C voor 2 h met zachte agitatie.
- In een steriele kap, laat conische buis en fragmenten op ijs voor ongeveer 5 min. gebruik een pipet om zoveel incubatie buffer mogelijk verlaten fragmenten onaangeroerd. Voeg 5 mL buffer schudden (1 g D-Sorbitol, 1,47 g sacharose in 100 mL Ca2 +/Mg2 +-gratis DPBS) en met de hand schudden met een kracht voor 2 min. laten de grote fragmenten te regelen en te verwijderen met haast, met behulp van een precisiepipet 1000 p, de kleine fragmenten die nog moeten regelen in de bovenste laag.
- Draai de verwijderde fragmenten voor 5 min bij 4 ° C bij 65 x g.
- Terwijl het vermijden van luchtbellen, verwijder het supernatant en resuspendeer in de kelder membraan matrix mix totdat het homogene.
- Een brede tip pipet kunt op plaat van de kelder membraan matrix op 50 µL per putje en vervolgens Incubeer bij 37 ° C gedurende 20 minuten.
- Voeg genoeg mFGO groei media (Advanced Dulbecco bewerkt Eagle medium/F12 medium aangevuld met 2mM L-glutamine, 1% penicilline/streptomycine, 10 mM HEPES-Buffer, 1mM n-Acteylcystine, 1 x N2, 1 x B27, 50% Wnt-geconditioneerd medium, 20% R-spondin-geconditioneerd medium aangevuld met 100 ng/mL bot morfogenetische eiwit remmer, 10 nM gastrine, 50ng/mL epidermale groeifactor, 10 ng/mL Fibroblast groeifactor 10 en 10 µM Y-27632 ROCK remmer) te dompelen de zeepbel.
- Cultuur van de cellen bij 37 ° C, 5% CO2 bevochtigde cel cultuur incubator. De media iedere 4-5 dagen wijzigen.
3. collageen Coating voor 2D overdracht
Opmerking: Voer alle procedures in een steriele weefselkweek kap tenzij anders aangegeven. Begin collageen 24 h vóór de overbrenging van 3D organoids aan de enkelgelaagde coating. Houd de rat staart collageen op het ijs en beschermd tegen licht. Collageen gecoate platen zijn goed voor maximaal 2 weken. Als geen gebruik maakt van de gecoate platen onmiddellijk, wikkel de plaat in parafilm en winkel bij 4 ° C totdat het nodig is.
- Verdun de rat staart collageen met 50 µg Mo/mL met behulp van 20 mM azijnzuur.
- Voldoende dekking van het oppervlak van de put met verdunde collageen. Voor een goed in een standaard 12-well-plate, jas met ongeveer 1 mL van collageen. Laat 's nachts bij kamertemperatuur in een steriele kap.
- Wassen tweemaal met 1 mL Ca2 +/Mg2 +-gratis DPBS per putje en vertrekken vanuit een ongedekte positie gedurende 2 uur bij kamertemperatuur in een steriele kap.
4. kelder membraan Matrix Coating voor 2D overdracht
Opmerking: Voer alle procedures in een steriele weefselkweek kap tenzij anders aangegeven. Kelder membraan matrijs coating 2 h vóór de overbrenging van 3D organoids aan de enkelgelaagde beginnen. Houd de kelder membraan matrix op ijs. Gecoate platen onmiddellijk worden gebruikt en kunnen niet worden opgeslagen voor een langere periode van tijd.
- De kelder membraan matrix in een conische tube van 15 mL met een cel cultuur rang water verdunnen om een 1:10 verhouding. Verdun op ijs.
- Met behulp van een precisiepipet Voeg 100 µL van verdunde kelder membraan matrix aan elk putje van een standaard 12-well-plaat. Met behulp van een cel schraper, verdeel de verdunde kelder membraan matrix in de put voor een zelfs vacht.
- Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur.
- Verwijder het resterende water met behulp van een precisiepipet en drogen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur vóór de overbrenging van 3D organoids.
5. overdracht van 3D m/hFGOs naar 2D maag epitheliale cel Monolayers
- Na 3D muis of mens-afkomstige FGOs hebben zijn gekweekt voor 6-7 dagen, de overdracht van 3D organoids aan de 2D enkelgelaagde begint.
Opmerking: Voor elk putje van een enkelgelaagde vereist het wordt aanbevolen om 300 intact organoids of afzonderlijke cellen afgeleid van 300 organoids te gebruiken. In een robuuste cultuur naar verwachting ongeveer 150 organoid per putje binnen een 12 goed cultuur plaat verkrijgen. - Zorg ervoor dat de platen zijn gecoat vóór de overbrenging.
Opmerking: De kelder membraan matrix gecoate platen hebben een doorzichtig gel laag, collageen gecoate platen zal hebben echter geen enkele duidelijke indicatie van de coating. - Verjagen de zeepbel van de matrix 3D kelder membraan van de plaat door direct pipetteren 1 mL steriele Ca2 +/Mg2 +-gratis DBPS in het midden van de zeepbel.
- De kelder membraan matrix en organoid mengsel in cel cultuur reageerbuisjes met behulp van een precisiepipet, verzamelen. Verzamelen bij een verhouding van 2 kelder membraan matrix bubbels per buis. Centrifugeer gedurende 5 min op 40 x g- en 4 ° C.
- Met behulp van een vacuümsysteem, verwijder het supernatant en zoals veel kelder membraan matrix mogelijk. Resuspendeer in 4 mL Ca2 +/Mg2 +-gratis DBPS, verwijder het supernatant en 2 - 3 keer herhalen. Voor de hele organoid transfer protocol, gaat u verder met stap 5.10. Ga verder met stap 5.7 voor de eencellige schorsing protocol.
- Vooraf warm cell detachement oplossing tot 37 ° C en voeg 1 mL toe aan elke proefbuis. Meng zachtjes door het omkeren van buizen of pipetteren op en neer met een pipet. Incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C.
- Voeg toe 2 mL Ca2 +/Mg2 +-gratis DBPS rechtstreeks naar elke proefbuis.
- Gebruik een 26 G naald en syringe het mengsel 2 - 3 keer. Visueel controleren voor afzonderlijke cellen. Syringe 1-2 vaker als er nog steeds organoids of clusters van cellen.
- Centrifugeer bij 40 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Resuspendeer de pellet in 2D FGO media (2D muis FGO groeimedium: geavanceerde Dulbecco gemodificeerde Eagle medium/F12 medium aangevuld met 2mM L-glutamine, 10 mM penicilline/streptomycine, 10% foetaal kalfsserum, 10 mM HEPES-Buffer, 1 x N2, 1 x B27, aangevuld met 10 nM gastrine, 50 ng/mL epidermale groeifactor, 1 µM TGF-β-remmer en 10 µM Y-27632 ROCK Inhibitor van de omwenteling. 2D menselijke FGO groeimedium: Geavanceerde Dulbecco van gemodificeerde Eagle medium/F12 medium aangevuld met 2mM L-glutamine, 1% penicilline/streptomycine, 10 mM HEPES-Buffer, 10% foetaal kalfsserum, 10 mM Nicotinamide, 1 x N2, 1 x B27, aangevuld met 50 mg/mL kanamycine, 50 ng/mL epidermale groei Factor, en 10 µM Y-27632 ROCK remmer, 1 µM TGF-β-remmer).
- Plaat de resuspensie op gecoate platen. Incubeer de platen bij 37 ° C. Vervang media elke 4 dagen of eerder als media omslaat naar geel. Enkelgelaagde vereist ongeveer 4 dagen naar formulier.
6. Kras wond Assay met behulp van 2D maag epitheliale cel Monolayers
- Met behulp van een scheermesje, krassen de enkelgelaagde wanneer de cultuur heeft bereikt 100% confluentie.
- Fix monolayers met 3,7% formaldehyde gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Permeabilize met 0,5% niet-ionogene wasmiddel/PBS gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
- Volgende blokkeren monolayers met 2% ezel serum gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en incubeer met 1:1000 verdunning van H+, K+-ATPase primair antilichaam 's nachts bij 4 ° C, spoel met 0,1% niet-ionogene wasmiddel/PBS en incubeer met 1:100 verdunning voor donkey anti-muis 488 secundair antilichaam en 10μg/mL Hoechst celkernen vlek gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Vlek ter identificatie van de cellen van de oppervlakte slijm pit in 2D mens afkomstige maag enkelgelaagde culturen, cellen met 20 μg /mL van gaspeldoorn (UEAI) FITC-conjugaat. Afbeelding monolayers op een confocal microscoop.
- Neem beelden van wond elke paar h. kras zal opnieuw epithelialize tussen 24-48 h afhankelijk van de kwaliteit van de enkelgelaagde en variatie tussen patiënten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Organoids waren afgeleid van de corpus/lichaam van de mens of de fundus van de muis maag weefsels (figuur 1A). Na collagenase of EDTA vertering van mens - of muis-afgeleide maag weefsel respectievelijk zijn klieren ingebed in de kelder membraan matrix en gekweekte voor 6-7 dagen (figuur 1A). Figuur 1B toont de vorming van mens-afgeleide maag organoids (huFGOs) die vervolgens aan een maag epitheliale enkelgelaagde (huGEM) op souterrain membraan matrix beklede kamer dia's overgedragen zijn. Na 4 dagen van cultuur, werden confluente huGEMs gebruikt voor kras wond assays (figuur 1B). Foto's verzameld van een time lapse analyse van de huGEM toonde wond sluiting binnen de cultuur over een periode van 24 uur (Figuur 2).
HuGEMs werden gevonden wil de grote cel lineages gevonden in het inheemse maag weefsel. Immunofluorescentie kleuring bleek de expressie van een gepolariseerde E-cadherine-positieve enkelgelaagde die bestond uit de pariëtale (figuur 3B, C) en het oppervlak slijm (figuur 3B, D) cellen. PCR-analyse met behulp van RNA verzameld uit deze monolayers bevestigd de uitdrukking van de pariëtale en oppervlakte slijm cellen, naast de chief en slijm hals cellen (de 3E figuur). Confluente huGEMs uitgedrukt ook paar delende cellen (figuur 3F). Analyse van deze grote cel lineages binnen de kras wond assay gebleken aanhoudende expressie van slijm, pariëtale, hoofd hals oppervlakte slijm cellen over een 24-uurs periode (figuur 4A, B). Collectief, tonen deze gegevens het gebruik van huGEMs als nieuwe cultuur systeem om maag regeneratie in vitrote studeren.
Figuur 1: generatie mens afkomstige maag organoids (huFGO) en primaire maag epitheliale monolayers (huGEM). (A) representatieve beelden van menselijke maag weefsel en muis maag gebruikt voor het genereren van klieren voor organoid cultuur. Overzicht vlak geeft aan fundic regio van de maag van de muis. (B) generatie van mens-afgeleide maag organoids (huFGOs) die worden gebruikt voor de cultuur van mensenrechten afkomstige maag epitheliale monolayers (huGEMs). Representatieve afbeelding van huGEM na kras toont de gewonde gebied. Schaal bar = 500 μm Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Scratch-wond assay. Representatieve beelden verzameld van een time lapse experiment met huGEM 0, 8, 16 en 24 h na kras wond. Schaal bar = 500 μm Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: uitdrukking van grote cel lineages in huGEM culturen. Immunofluorescentie kleuring van huGEM culturen aantonen van de expressie van (A) E-cadherine (Ecad, rood), oppervlakte slijm cellen (UEAI, groen) en kernen (Hoechst, blauw), en (B) E-cadherine (Ecad, rood), pariëtale cellen (HK, groen) en kernen () Hoechst, blauw). Afzonderlijke kanalen worden weergegeven in (C) en (D). (E) rechts-PCR werd uitgevoerd met behulp van RNA gehaald uit huGEMs voor de expressie van H+K+-ATPase (ATP4a), pepsinogen C (PgC), MUC5AC en MUC6. (F) Proliferating cellen binnen de cultuur van de huGEM bepaald door EdU (rood) opname. Schaal bar (A-D) = 50 μm, schaal bar (F) = 100 μm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: wijzigingen in cel lineage expressie in de scratch-wond assay. Immunofluorescentie kleuring van huGEM culturen aantonen van de expressie van E-cadherine (Ecad, rood) of oppervlakte slijm cellen (UEAI, groen) of pariëtale cellen (HK, groen) en kernen (Hoechst, blauw) met behulp van dia's verzameld van huGEM culturen 0, 8, 16 en 24 uur post kras-wond. Bkgrd = achtergrondkleuring van kelder membraan matrix op dia's. XY-as schaal bar van 0 - 400 μm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Muis 3D Media | Stockoplossing | Werken concentratie |
| nAcetylcysteine | Poeder | 1 mM |
| Gastrine | 10 ΜM | 10 nM |
| EFG | 500 µg Mo/mL | 50 ng/mL |
| Bekertje | 100 µg/mL | 100 ng/mL |
| FGF10 | 100 µg/mL | 100 ng/mL |
| YCMD | 10 mM | 10 ΜM |
| B27 | 50 x | 1 x |
| N2 | 100 x | 1 x |
| Pen/Strep | 1 M | 10 mM |
| HEPES | 1 M | 10 mM |
| Glutamax | 200 mM | 2 mM |
| WNT | 50% (v/v): | |
| R-Spondin | 10% (v/v): |
Tabel 1: Muis 3D Media-onderdelen.
| Muis 2D Media | Stockoplossing | Werken concentratie |
| FCS | 100% | 10% |
| YCMPD | 10 mM | 10 ΜM |
| Gastrine | 10 ΜM | 10 nM |
| EFG | 500 µg Mo/mL | 50 ng/mL |
| B27 | 50 x | 1 x |
| N2 | 100 x | 1 x |
| Pen/Strep | 1 M | 10 mM |
| HEPES | 1 M | 10 mM |
| Glutamax | 200 mM | 2 mM |
| TGF-β-remmer | 10 mM | 1 ΜM |
Tabel 2: Muis 2D mediacomponenten.
| Menselijke 3D Media | Stockoplossing | Werken concentratie |
| Nicotinamide | Poeder | 10 mM |
| nAcetylcysteine | Poeder | 1 mM |
| Gastrine | 10 ΜM | 1 nM |
| EFG | 500 µg Mo/mL | 50 ng/mL |
| Bekertje | 100 µg/mL | 100 ng/mL |
| FGF10 | 100 µg/mL | 200 ng/mL |
| YCMD | 10 mM | 10 ΜM |
| B27 | 50 x | 1 x |
| N2 | 100 x | 1 x |
| Pen/Strep | 1 M | 10 mM |
| HEPES | 1 M | 10 mM |
| Glutamax | 200 mM | 2 mM |
| Kanamycine | 1 M | 10 mM |
| Amfotericine B/gentamycine | 125 µg Mo/mL | 1 mM |
| WNT | 50% (v/v): | |
| R-Spondin | 10% (v/v): |
Tabel 3: Menselijke 3D Media-onderdelen.
| Menselijke 2D Media | Stockoplossing | Werken concentratie |
| FCS | 100% | 10% |
| YCMPD | 10 mM | 10 ΜM |
| Gastrine | 10 ΜM | 1 nM |
| EFG | 500 µg Mo/mL | 50 ng/mL |
| B27 | 50 x | 1 x |
| N2 | 100 x | 1 x |
| Pen/Strep | 1 M | 10 mM |
| HEPES | 1 M | 10 mM |
| Glutamax | 200 mM | 2 mM |
| TGF-β-remmer | 10 mM | 1 ΜM |
| Nicotinamide | Poeder | 10 mM |
| Kanamycine | 1 M | 10 mM |
Tabel 4: Menselijke 2D mediacomponenten.
| Experimentele probleem | Troubleshooting Tip |
| Monolayers niet vorm van organoids | 1) optimale kweken voorwaarden voor dit protocol variëren tussen experimentele behoeften. Menselijke en muis monolayers afgeleid van organoids moeten worden gekweekt met behulp van verdunde kelder membraan matrix bij het gebruik van glas of kunststof cultuur gerechten. Echter, rat staart collageen is optimaal voor enkelgelaagde experimenten van muis of menselijke oorsprong waarvoor polyester membraan wordt ingevoegd. 2) optimale kweken omstandigheden variëren afhankelijk van de experimentele set up. Culturen met behulp van één celsuspensie worden idealiter gekweekt met 3D FGO media overwegende dat intact organoids worden gekweekt met 2D FGO media. |
| Monolayers afgeleid van veroudering patiënten (> 55 jaar) of muizen (> 18 maanden) niet groeien en confluentie bereiken | Als met behulp van de maag weefsel verzameld van leeftijd muizen (> 18 maanden) of patiënten (> 55 jaar) de dichtheid van organoids gebruikt voor de generatie van de enkelgelaagde moet worden verdubbeld, gezien het feit dat de efficiëntie van de groei van organoids wordt verlaagd. |
| Organoids niet vorm van klieren | Het is aanbevolen dat verse (indien mogelijk nieuw gekocht) gastrine worden gebruikt. Gebruik vers opnieuw gesuspendeerde gastrine elke 4 maanden. |
| Organoids mislukken om te hechten en vormen monolayers | Ervoor zorgen dat efficiënt afvoeren van kelder membraan matrix is geboekt na de oogst van organoids voor de doorgifte naar cultuur platen voor monolayers. |
| Culturen afgeleid van veroudering patiënten (> 55 jaar) of muizen (> 18 maanden) mislukken | Tijdens de spijsvertering en incubatie, 15-30 min van eerste incubatie gevolgd door 5 minuten intervallen van incubatie zonodig volstaat. Opgemerkt moet worden dat patiënten die groter zijn dan 55 jaar of ouder kunnen hebben klieren die gemakkelijker zijn losgekoppeld en daarom vereisen minder spijsvertering. Evenzo hebben FGOs afgeleid van leeftijd patiënten langzamere groei tijd en verhoogde gevoeligheid voor centrifugeren weergegeven. Voor de beste resultaten, beperken van eventuele overtollige centrifugeren bij het werken met leeftijd weefsel en vervangen van media in een tijdige wijze. |
Tabel 5: bij probleemoplossing. Ondervonden problemen en aanbevolen oplossingen voor optimale inrichting en cultuur van mensenrechten of muis maag monolayers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het huidige protocol detailleert de oprichting van mens - en muis-afgeleide maag epitheliale monolayers die kunnen worden gebruikt voor kras-wond testen. Het protocol is afhankelijk van het concept van de cel van de stam van de resident los van de primaire mens (of muis) weefsels en is een gewijzigd protocol voor het eerst gepubliceerd door Schlaermann et al.7. Wij hebben met name het protocol hier geoptimaliseerd om een heuvels en gepolariseerde maag epitheliale enkelgelaagde welke spreekt de grote cel lineages die kunnen worden gevonden binnen de maag epitheel in vivo. Gastric ulcer reparatie is een complex proces waarbij weefsel opnieuw epithelialization, regeneratie en proliferatie9,10,11. In het bijzonder heeft ons laboratorium gemeld dat de regeneratie van de maag epitheel met de opkomst van spasmolytic polypeptide/klaverblad factor (TFF) 2-uiten metaplasie (SPEM) in de marge van de Ulcus binnen de regeneratie maag klieren samenvalt 12,,13. SPEM wordt gedefinieerd als de transdifferentiatie van de chef cel overdrachtslijn in een slijmvliezen cel metaplasie14 dat naar voren komt met letsel en verdwijnt wanneer de mucosa keert terug naar haar normale cellulaire samenstelling12. Studeren een dergelijk mechanisme in een in vitro -systeem, is het dus essentieel dat de grote cel lineages, zoals de belangrijkste cellen, huidige binnen de cultuur zijn.
Het gebruik van nul-wond tests zijn uitgebreid gebruikt voor de studie van reparatie en regeneratie, en tot voor kort waren maagkanker cellijnen gebruikte1,2,3,4. Hoewel fundamentele mechanismen zijn geopenbaard via maagkanker cellen lijnen, deze culturen worden omgezet en gebrek aan de cellulaire diversiteit van het inheemse maag weefsel. HuGEMs worden weergegeven voor het behouden van een gepolariseerde en diverse cellulaire compositie die nauw de maag epitheel in vivo recapituleert. Bovendien, na het bereiken van confluency huGEM culturen kunnen worden gehandhaafd voor maximaal één maand in optimale omstandigheden. Uitgebreide culturen zorgen voor lange termijn experimenten. Dus, zijn toekomstige toepassingen van de huGEMs die kunnen worden beschouwd enkelgelaagde/immuun co celculturen en lange termijn experimenten voor de studie van Helicobacter pylori pathogenese.
Er zijn belangrijke technische aspecten te merken in het huidige protocol. Het eerste technisch punt is dat de keuze van de kelder membraan component afhankelijk is van het celoppervlak cultuur die moet worden gebruikt voor experimenten. Om ervoor te zorgen dat optimale enkelgelaagde voorwaarden worden bereikt, is het aanbevolen dat collageen wordt gebruikt wanneer de experimenten met monolayers vereisen platen met polyester membraan inzetstukken. Echter, als enkelgelaagde experimenten glas of kunststof cultuur oppervlakken vereisen, verdunde kelder membraan matrix is de optimale keuze van de coating. Ten tweede moet de dichtheid van organoids verplicht te bereiken een confluente enkelgelaagde worden aangepast afhankelijk van de leeftijd van de patiënt waaruit de maag weefsel wordt verzameld. Voor weefsel verzameld van leeftijd muizen (> 18 maanden) of patiënten (> 55 jaar), de dichtheid van de organoid gebruikt moet verhoogde tweeledig individuen overbrengen naar een enkelgelaagde als gevolg van de verminderde groeicapaciteit in leeftijd. Tijdens de spijsvertering en incubatie van menselijk weefsel afgeleid van leeftijd patiënten, klieren kunnen worden meer vatbaar voor dissociatie en centrifugeren en dus: 1) moeten worden gecentrifugeerd zo spaarzaam als mogelijk, 2) media vervangen ijverig, en 3) tijdens de vertering incubations van 15 tot 30 minuten met incrementele spijsvertering van 5 minuten daarna zal verminderen de kans op over de spijsvertering. Tot slot, wanneer vormen monolayers uit organoid afkomstige eencellige schorsingen, 3D FGO media is meest optimale voor goede vorming van monolayers terwijl bij het kweken van intact organoids, 2D FGO media geconstateerd is het hoogste rendement opleveren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de NIH (NIDDK) 5 R01 DK083402-07 verlenen (YZ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced Dulbecco's modified Eagle/F12 medium (basal media) | Life Technologies | 12634-010 | |
| GlutaMAX (L-glutamine) | Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Amphotericin B/Gentamicin | Thermo Scientific | R01510 | |
| Kanamycin | Thermo Fisher | RO1510 | |
| HEPES Buffer | Sigma Aldrich | H0887 | |
| n-Acetylcystine | Sigma Aldrich | A9165 | |
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 | Life Technologies | 12587-010 | |
| BMP Inhibitor (Noggin) | Pepro Tech | 250-38 | |
| Gastrin | Tocris | 3006 | |
| EGF | Pepro Tech | 315-09 | |
| FGF10 | Pepro Tech | 100-26 | |
| Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636 | |
| Y-27632 ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| TGF-β Inhibitor | Tocris | 2939 | |
| Ca2+/Mg2+ -free DPBS | Fisher | 21-031CV | |
| Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 12634-010 | |
| Fetal Bovine Serum | FBS | ||
| OPTIMEM | Invitrogen | ||
| 0.22µM filter | Fisher | 099-720-004 | |
| 37 °C Water Bath | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington | LS004214 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
| Kimwipes (tissue paper) | Fischer Scientific | 06-666C | |
| 125 mL round bottom flask | |||
| 1 in (25 mm) stir bar | |||
| Rubber Septa | |||
| Sterile Gauze | |||
| Stir Plate | |||
| Ring Stand | |||
| Ring Stand Clamps | |||
| Sterile petri dish | |||
| 18 G needles of 1.5 in length | Thermo Fisher | 305196 | |
| 20 G spinal needles of 3.5 in length | Thermo Fisher | 405182 | |
| 12-well cell culture treated plate | Midwest Scientific | 92012 | |
| Growth Factor Reduced, Phenol Red-free MatrigelTM (Basement membrane matrix) | Fisher | CB-40230C | |
| Sterile Razor Blades | |||
| Wide-tip tweezers | |||
| Curved Hemostatic Forceps | |||
| 200 µL wide pipette tips | Thermo Fisher | 02-707-134 | |
| 5 mL cell culture test tubes | Fisher | 14-956-3C | |
| Oxygen Tank with rubber hosing | |||
| 1 g D-Sorbitol | |||
| Sucrose | Fisher | SS-500 | |
| Dissecting microscope | |||
| Dissecting Tray | |||
| Rocking Table | |||
| Rat Tail Collagen Type 1 | Life Technologies | A10483-01 | |
| Cell culture grade glacial acetic acid | Fisher | A38-212 | |
| Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
| 2-well chamber slide | Thermo Fisher | 155380 | |
| 12-well Transwell (polyester membrane inserts) | Corning | 3460 | |
| Cell scraper | Corning | 353086 | |
| Accutase (cell detachment solution) | Stemcell Technologies | 7920 | |
| 263/8 G syringe | Thermo Fisher | 309625 | |
| Razor blade | |||
| L Cells | L cells, a Wnt3a producing cell line, were received as a gift from Dr. Hans Clevers (Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, Netherlands). | N/A | |
| HEK-293T Rspondin secreting cells | A modified HEK-293T R-spondin secreting cell line was obtained from Dr. Jeff Whitsett (Section of Neonatology, Perinatal and Pulmonary Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Centre and The University of Cincinnati College of Medicine, Cincinnati, USA ). | N/A | |
| HK-ATPase Primary Antibody | Invitrogen | SC-374094 | |
| E-Cadherinn | SantaCruz | sc-59778 | |
| UEA1 | Sigma Aldrich | L9006 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 | |
| Alexafluor 488 secondary antibody (Donkey anti-mouse 488 secondary antibody) | ThermoFisher Scientific | R37114 |
References
- Nagy, T. A., et al. Helicobacter pylori regulates cellular migration and apoptosis by activation of phosphatidylinositol 3-kinase signaling. J Infect Dis. 199 (5), 641-651 (2009).
- Mnich, E., et al. Impact of Helicobacter pylori on the healing process of the gastric barrier. World J Gastroenterol. 22 (33), 7536-7558 (2016).
- Zhang, Y., et al. Bm-TFF2, a toad trefoil factor, promotes cell migration, survival and wound healing. Biochem Biophys Res Commun. 398 (3), 559-564 (2010).
- Crabtree, J. Role of cytokines in pathogenesis of Helicobacter pylori-induced mucosal damage. Dig Dis Sci. 43 (Supplement), 46S-53S (1998).
- Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. J Lab Autom. 17 (1), 59-65 (2012).
- Zhang, M., Li, H., Ma, H., Qin, J. A simple microfluidic strategy for cell migration assay in an in vitro wound-healing model. Wound Repair Regen. 21 (6), 897-903 (2013).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Bertaux-Skeirik, N., et al. CD44 plays a functional role in Helicobacter pylori-induced epithelial cell proliferation. PLoS Pathog. 11 (2), e1004663 (2015).
- Tarnawski, A. S. Cellular and molecular mechanisms of gastrointestinal ulcer healing. Dig Dis Sci. 50 (Suppl 1), S24-S33 (2005).
- Wright, N. A., Pike, C., Elia, G. Induction of a novel epidermal growth factor-secreting cell lineage by mucosal ulceration in human gastrointestinal stem cells. Nature. 343, 82-85 (1990).
- Wright, C. L., Riddell, R. H. Histology of the stomach and duodenum in Crohn's disease. Am J Surg Pathol. 22 (4), 383-390 (1998).
- Engevik, A. C., et al. The Development of Spasmolytic Polypeptide/TFF2-Expressing Metaplasia (SPEM) During Gastric Repair Is Absent in the Aged Stomach. CMGH. , In Press (2016).
- Bertaux-Skeirik, N., et al. CD44 variant isoform 9 emerges in response to injury and contributes to the regeneration of the gastric epithelium. Journal of Pathology. 242 (4), 463-475 (2017).
- Nam, K. T., et al. Mature chief cells are cryptic progenitors for metaplasia in the stomach. Gastroenterology. 139 (6), 2028-2037 (2010).
