Summary
このプロトコルは、アプリケーション (すなわち免疫細胞化学、フローサイトメトリー、等) の様々 な使用することができます長期胎盤の胎児膜から収集した主のひと脱落膜細胞の分離方法を示しますを目指して妊娠合併症の異なる細胞集団の役割を研究。
Abstract
脱落膜、妊娠子宮内膜として知られている、非常に重要な生殖組織であります。脱落膜細胞は、主に decidualized の間質細胞と免疫細胞の構成は成功した胚盤胞移植、胎盤発育に欠かせないし、の役割を果たすホルモンや炎症性因子の分泌を担当されて、用語と早産で労働の開始。脱落膜を構成する異なる細胞集団の微妙なバランスの摂動から多くの妊娠合併症が生じる。脱落膜細胞の特定の種類の割合に変化がこれらの重要なプロセスを中断、妊娠、妊娠中毒症、子宮内胎児発育制限胚着床障害などの重篤な合併症の発症リスクを高めると早産。ここで説明されているプロトコルは、コストと時間的胎盤の胎児膜から収集した主のひと脱落膜細胞の隔離のための効果的な方法を示しています。酵素消化と脱落膜組織の穏やかな機械的破壊を組み合わせて、絨毛膜の汚染の事実上なしで脱落膜細胞の高収率が得られました。重要なは、孤立した脱落膜細胞が特徴付けられた (間質細胞 (55-60%)、白血球 (35%)、上皮 (1%) または (0.01%) 栄養膜細胞) マルチカラー イメージング流れ cytometry の試金によって確認された高い生存率 (80%) を維持。このプロトコルは脱落膜の parietalis に固有、最初と 2 番目の妊娠の胎盤に適応することができます。一度分離、脱落膜細胞は多数の妊娠合併症で別の脱落膜細胞集団の役割を理解することを目指して実験的アプリケーションを使用できます。
Introduction
子宮内膜、最も活発な大人女性組織の 1 つは、劇的改造卵巣ホルモン、エストロゲン (E2) とプロゲステロン (P4) によって刺激への応答の各月経周期を経る。脱落膜、妊娠子宮内膜として知られているは、E2 支配的な増殖期に続く P4 駆動型分化の結果として postovulatory のフェーズの終了によって形成される非常に重要な生殖組織です。脱落膜細胞が分泌ホルモンの要因成功した胚盤胞の着床、胎児移植する母体を維持するため子宮胎盤インタ フェースの開発を担当。
エストロージェンは、注入と脱落膜らせん動脈のそれに続く改造に必要です。子宮内膜間質細胞は、月経周期1の後半の黄体期における P4 とキャンプの制御の下でエストロージェンを受けます。このプロセスは、血管と血管リモデリングと規制を人身売買白血球におけるその役割を示唆している間質全体に広がる周り開始です。この携帯の変換は、円形の形態、核サイズの増加と粗面小胞体とゴルジ装置2の拡大が特徴です。Decidualized 間質細胞は胚盤胞移植を支援パラクライン因子を作り出すことができる、多数のホルモン (プロラクチンすなわち)、血管新生因子、インスリン成長因子結合蛋白質 1 の分泌によって特徴づけられる(IGFBP 1), プロスタグランジン (PG) E (細胞内 cAMP の刺激)、サイトカイン、細胞外マトリックス成分と胎盤注入と開発3,4,5,6 に不可欠な栄養素.
脱落膜細胞の人口が decidualized の間質細胞のみで構成されていないも大きく、妊娠特有の脱落膜白血球ポピュレーションが含まれています。エストロージェンには、ローカライズされた一過性の浮腫とナチュラル キラー (NK) 細胞、T 細胞、樹状細胞、大食細胞の流入が含まれます。最大白血球サブポピュレーションが子宮 NK 細胞は、サイトカインの源である脱落膜・血管新生因子エストロージェン プロセスの援助し、の増加可能性のある浸潤母体のすべての白血球の約 50-70% を構成します。妊娠7全体の数です。大食細胞、免疫細胞の二番目に大きい集団をされて、移植部位周辺、妊娠8の間に増加します。彼らはサイトカインの源であり、成長因子などコロニー刺激要因 (CSF-1)9、腫瘍壊死因子 (tnf α) α10とプロスタグランジン (PG) E11。
妊娠中、長期的な労働者の前に、両名はサイトカインやケモカイン母体末梢血白血球の活性化と労働を開始する子宮の組織への移行のための責任の主要なソースです。動物研究ことを示した多数のプロ炎症性サイトカイン マウス脱落膜の調整、労働中によう TNF は、IL-6、イリノイ-12 と IL-1 b12。ひと脱落膜における炎症性サイトカイン IL-1 b、IL-6 と IL-8 (主要な好中球走化性因子) は労働労働13ではなくに比べて高い発現を展示します。これら分泌されるサイトカインの活性化、白血球の流入の結果脱落膜組織14;脱落膜浸潤子宮 4 倍大きく、この 2 つが隣接して子宮組織の活性化のカスケードを示すの前で長期的な労働者中、見ると脱落膜マクロファージと両方人間の好中球浸潤およびラットの増加15. PGs16子宮筋の収縮を同期をアクティブ化することを作り出すこれら白血球の浸潤、マトリックスメタロプロテアーゼ (Mmp) 膜を開始する破裂17,18, と同様子宮アクティベーション プロセス (「サイトカイン ストーム」) を増幅する炎症性サイトカイン。
初期妊娠期では、労働力の活性化に参加することで母体・胎児の公差を維持注入プロセスで重要な役割を再生などの脱落膜細胞の多くの重要な機能のため異なることができます中に発生します。妊娠。脱落膜の成熟の障害から再発着床障害再発妊娠の損失の原因 (1) 不妊につながる例えば、(2) 子宮内の成長の制限 (IUGR) と不適切な開発と脱落膜・胎盤や子宮脱落膜ジャンクション; 妥協血管変形の機能不全による妊娠中毒症(3) 早産、早期脱落膜活性化起因することができます。
研究生体内で人間の倫理的、実用的な制限と相まって、これらの主要な疾患に照らして体外より良い理解を目的とした分析のため不可欠です主のひと脱落膜細胞株を確立して妊娠合併症の臨床管理を改善します。したがって、我々 の研究の目的細胞の高と生存期間胎盤の胎児膜から収集したひと脱落膜細胞の分離を可能にするプロトコルを開発することでした。現在このプロトコルを細胞の脱落膜の特定のサブタイプの分離の明確に時間と費用の有効な方法について説明します様々 な体外分析に使用します。豊かさの特性と用語と最初または 2 番目の妊娠との比較で脱落のサブ集団の表現型人間の妊娠の中で自分の役割を定義することが重要です。
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Protocol
胎盤は、選択科目の帝王を受ける労働女性ではなく、健康的な用語から収集されます。収集、処理、およびひと試料の使い捨ては、マウント シナイ病院倫理委員会のガイドラインに従います。各患者からの書面による同意を得た本研究は、マウント シナイ病院研究倫理委員会で承認されています。
1. 準備
注: すべての手順は、ヒューム フードの下で行われなければならないし、すべての手術用機器は発煙のフードで配置する前にオートクレーブで滅菌する必要があります。(ボトル、50 mL の管、等) 他のすべての材料は、70% エタノールで消毒する必要があります。常に摩耗保護具は、バイオハザード廃棄物 (白衣、手袋、長い髪を後ろで結ぶ、等) を使用する場合すべての回します。
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酵素消化ソリューション (最終的な解決: 200 mL)
- HBSS の 180 mL のピペット/- 500 mL ビーカーに滅菌攪拌磁石を追加し、室温で感動のプレートを配置。
- 重量を量り、ゆっくりと順番に次の HBSS/ソリューションに追加: FBS、20 mL、400 mg コラゲナーゼ 2 ([final] = 2 mg/mL)、20 mg 大豆豆トリプシンインヒビター ([final] = 0.1 mg/mL)、30 mg DNase 1 ([final] = 0.15 mg/mL)、および 200 mg BSA ([final] = 1 mg/mL)
- 中速に攪拌を設定し、10 ~ 20 分 (攪拌しながらスズ箔またはパラフィン フィルムでカバー) 攪拌混合物を許可します。
- プラスチックの漏斗を使用して 250 mL ガラス瓶の中に混合液を注ぎ、ヒューム フードに置きます。
- 50 mL チューブ (合計 10 管) と使用するまで-20 ° C でストアに分注 20 mL プラスチック トップろ過ユニット (0.22 μ m メンブラン フィルター、500 mL)、ソリューションを渡します。
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RPMI 1640 メディア (2% 洗濯ソリューションと完全な成長媒体の 10%)
- RPMI 1640 とヒューム フードのガラス瓶の FBS を組み合わせます。
- FBS 溶液の 2%、490 mL RPMI 1640、10 mL FBS を組み合わせます。
- FBS 溶液の 10%、450 mL RPMI 1640 と 50 mL FBS を組み合わせます。
- RPMI メディアと FBS (50 mg/mL 在庫、0.05 mg/mL 作業濃度) を含む前の手順から 500 mL ガラス瓶の中に normocin の 500 μ L をピペットします。
- 使用するまで 4 ° C で 500 mL の瓶で 0.22 μ m のメンブラン フィルターとストアを介してメディアを渡します。
- 実験を開始する前に 30 分の 20 mL の約数を配置、37 ° C のビーズのお風呂で酵素分解酵素液を凍結、2% を置く政府短期証券と 37 ° C のビーズのお風呂で 10% FBS RPMI 1640 メディア ロッキング水浴を入れます、37 ° C に設定、2 g および 4 ° C に温度制御された遠心分離機のセット
2. 長期胎盤膜の脱落膜組織のコレクション
- HBSS のボトルを配置 + +、HBSS-/- とヒューム フードの下のラックに 5 つの 50 mL チューブ。HBSS の 25 mL をピペット + + 1 つの管で。
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手袋をはめた手を使って、満期胎盤から取り出す手術室劇場から輸送に使用されるコンテナー。おむつパッド (を母体側) の胎盤を置き、はさみとピンセットを使用して胎児膜を拡散します。
- ヒューム フードの重複のおむつパッドを置きます。
- おむつを使用して、母体側は表向きになり、胎盤を反転します。
- 膜破裂のポイントを検索し、見つけ、展開しドラフト表面に平らになった膜を許可するように切開します。
注: 膜は胎盤から返したが、一度脱落膜顔になります後ろに羊膜層に、絨毛膜層に休憩を。
- 絨毛膜と 25 mL HBSS を含む 50 の mL の管の場所から脱落膜組織をこすりプラスチック電池スクレーパーを使用して慎重に + +。
- 適度な圧力で膜をこすり。絨毛膜汚染で起因するかもしれないのであまりプレッシャーは適用されません。同様に、これらはいくつかの脱落膜細胞を含んでいる小さな血塊を収集します。
注意: 脱落膜のコレクションの後胎盤バイオハザード プラスチック箱にパッケージ化、(あなたの制度的規則) に従って適切に廃棄する前に-20 ° C のフリーザーで凍結します。血まみれのおむつパッドを密閉ビニール袋に包まれ、バイオハザード安全ボックス内に配置する必要があります。
3. 洗浄、酵素消化脱落膜組織の
- 優しく手で 50 mL のチューブを揺すり、無菌検体 (尿) コンテナー上休憩 250 μ m (250 μ m、サイズ 60 メッシュ) 金属製ふるいを通過によって収集された組織を洗浄します。
- HBSS で 2 回洗浄を繰り返す +/+ と 2 回 HBSS-/- 新鮮な管内各洗浄のため。(最終洗浄 HBSS-/-カルシウムやマグネシウムの HBSS の存在の除去では、+ +、次の酵素の消化力プロセスを妨害だろうそれ以外の場合)。
注意してください。洗浄のステップの間に絨毛膜組織汚染が脱落膜組織がうっすらとピンク色と白、密で、糸は非晶質、絨毛膜中、明らかにします。したがって、鉗子で絨毛膜汚染を簡単に削除することができます。 - 必要に応じて、脱落膜組織が厚い場合、滅菌 10 cm 径シャーレに転送して皿に 2 つの反対のメスと組織のミンチに進みます。
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組織/mL の酵素消化溶液の 100 mg を含む滅菌 50 mL チューブに洗浄ティッシュを置き (準備を参照してください)。
- 基準点として脱落膜組織のレベルの 50 mL チューブに 5-10 mL マークに達することを確認します。
- 全期間胎児膜から収集された合計脱落膜を消化する酵素消化液 (1.1 の手順で準備) 約 20 mL を使用します。
- パラフィン フィルム チューブのキャップ シール (チューブをしっかりとシールし、キャップとチューブの上部の周りパラフィン フィルムをラップ)、文化の下でフードし、振動水浴 (145 rpm で 20 分間 37 ° C で脱落膜組織を孵化させなさい、2 g)。
- インキュベーション後、パラフィンの膜を削除して消化組織の 70% エタノールを含むチューブの表面を殺菌してヒューム フードの下でもたらします。手で簡単にチューブを振る。
- 金属ふるい (250 μ m、サイズ 60 メッシュ) を通じて新しい無菌検体容器に細胞懸濁液を収集します。酵素反応を停止する RPMI + 10 %fbs 含む 0.1 %normocin の等しいボリューム (20 mL) で希釈します。遠心分離のステップ 4.1 に直接進みます。
- 必要に応じて、残りの未消化の組織を 20 ml の新鮮な酵素消化ソリューションの新しい 50 mL のチューブに配置し、消化 (20 分、37 ° C の水浴を揺れ) を繰り返します。
- 2 番目の消化が必要な場合、氷 (滅菌を維持するパラフィン フィルムでカバー) に細胞懸濁液の最初の管を配置します。3.5 3.6 の手順を繰り返し、二つの細胞懸濁液を結合します。
4. 単一細胞懸濁液を生成します。
- 遠心分離機の細胞懸濁液 (420 g、4 ° C、11 分)。
- 上澄みを除去し、RPMI + 2 %fbs 含む 0.1 %normocin (「洗浄バッファー」) の 40 mL の細胞を再懸濁します。
注: 細胞ペレットに緩いと赤血球の混入によるゼラチン状、注意して上清を吸引します。手動ピペットの上部の段階の除去が必要な可能性があります。 - 11 分の 4 ° C で 420 g で遠心分離を繰り返します。
- 慎重に (前述の注の手順 4.2)、上清を削除 5 mL の洗浄バッファーで細胞ペレットを再懸濁し、同じ管で 35 mL の赤血球溶解バッファーを追加します。
注: 大規模なまたは非常に血なまぐさいペレットになった場合、それに分割できます赤血球溶解ステップの 2 つのチューブ 10 mL の洗浄バッファーを追加して、2 つの管に均等に分割各管に赤血球換散バッファーの 35 mL を追加して。 - 20 分赤の血液細胞を溶解するインキュベーションの前後で簡単に渦尿管の氷の上を孵化させなさい。
- 4 ° C で 11 分 420 g で遠心します。
- 慎重に、上澄みを除去し、洗浄バッファーの 40 mL にペレットを再懸濁します。
- セルをセルの塊を除去する 70 μ m ナイロン フィルターに通過します。
- 420 g で 4 ° C で 11 分間遠心
- 上澄みを除去し、10 mL の完全培地で細胞ペレットを再懸濁します (RPMI 10% + FBS 0.1 %normocin を含む)。
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トリパン ブルー色素排除の検定手順次のようを使用してセルをカウントします。
- 文化フードの下でそっとトリパン ブルー色素と結合する前に徹底的に混ぜるために 3 x 上下細胞懸濁液をピペットします。1.5 mL チューブを準備細胞懸濁液、1:2 (結合トリパン ブルー溶液 20 μ L) と脱落膜細胞懸濁液 20 μ L を希釈します。慎重に (このソリューションは滅菌されていない) 数回上下ピペットでトリパン ブルー携帯ソリューションをミックスします。
- 場所の上にガラス基板を顕微鏡のステージ上の検定。
注: 検定はトリプル ライン割った 9 つの大きな正方形をみるためにグリッドを顕微鏡スライドです。それぞれの大きな広場は 1 mm2の面積を有し、チャンバー内の液体の深さは 0.1 mm。したがって、それぞれの大きな広場を埋めることができる液量は 1 mm * 1 mm * 0.1 mm = 0.1 mm3= 10 の-4 mL。 - ゆっくりと全体スライド (ストップ混合物いっぱいでなくなる前に) 細胞の混合物を分散させるために毛細管をできるように、検定の溝にトリパン青細胞混合物の 10 μ L を追加します。
- (10 倍) で顕微鏡下で細胞を表示し、トリパン ブルー (これらは実行可能なセル)、検定の 4 つの大きい外側の四角を除外するすべてのホワイト/グリーン セルをカウントします。線に接するセルをカウントするときは、そのタッチの右と上の行が左と下の線に触れるものではなくのみカウントします。暗い青いセルはカウントされません。青い色は、トリパン ブルー色素が、簡単に細胞膜細胞質に侵入すると、細胞は死んでいることを示します。
- 細胞懸濁液 (X) の 1 mL 中の生菌数の数を計算するには。
2希釈倍率を =
10,000 = 変換係数 (1 mL = 1 cm3 = 10、000 * 0.1 mm3)
- 望ましい最終的な濃度 RPMI + 10% に脱落膜細胞を希釈 FBS (成長中)。
注: 組織培養めっき用ピペットの 2 * 106細胞/ウェル プラスチック 6 ウェル プレート、10 cm プラスチック プレート 10 * 106セルまたはガラス基板に 75,000 セルに。
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Representative Results
効率性と隔離されたセルの実行可能性を検証するため、彼らは 2 つの方法により特徴づけられた: 流れの cytometry と免疫細胞化学 (ICC)。4 細胞集団を対象としました。decidualized 間質細胞は抗ビメンチン抗体によって検出された汎白血球マーカー CD45 は脱落膜免疫細胞を識別するために使用された、サイトケラチンは、上皮・内皮細胞の検出に使用された、サイトケラチン 7 が検出に使用した最後に、潜在的な胎盤絨毛細胞 (絨毛膜や胎盤) 汚染。
マルチカラー イメージング フローサイトメトリーによるキャラクタリゼーションのため新鮮単離脱落膜細胞は細胞の生存率を決定する修正可能な染料で染色された.セルされたグリセリンと固定、続いてターゲット ビメンチン APC、CD45 APC H7、サイトケラチン FITC、サイトケラチン 7 PerCP マウスの蛍光色素標識されたモノクローナル抗体で染色します。抗体情報は、材料のテーブルに表示されます。固定と染色細胞染色タンデム色素の分解を防ぎ、イメージ ストリーム MK2 イメージング フローサイトの次の日を実行するバッファーで一晩 4 ° C で保存されていました。ソフトウェアを使用して分析を行った。細胞の残骸と集計は、3 つのシーケンシャル機能/マスクの組み合わせ (図 1 aB) を使用してシリアル ゲートによって除外されました。蛍光マイナス 1 つ (FMO) ゲート コントロールは肯定的な脱落膜細胞集団を識別するために使用、単一染色細胞が補償 (図 2) ために使用されました。最終的なドット プロットは 4 つのマーカー (図 2) 積極的に汚された細胞集団と 80% (図 1) の細胞の生存率を示しています。積極的に陽性細胞の代表的なイメージは、図 1で見ることができます。このメソッドを使用して、分かった人口主に間質細胞 (55-60%)、白血球 (35%)、上皮から成る (1%) または栄養膜 (0.01%) 細胞 (図 1E)。実験を 3 回繰り返した。これらの結果は、純度 (絨毛膜絨毛汚染の不在) およびプライマリひと脱落膜細胞を収集し、用語胎盤の胎児膜から分離したの高い生存率を確認します。
別の ICC 実験で新鮮単離脱落膜細胞播種ガラス coverslips (75,000 セル/coverslip)、添付する許可し、48 時間の文化に残った。メディアは非添付の死んだ細胞を除去する 24 時間後に変更されました。セル、0.02% 非イオン性界面活性剤とグリセリン 50% 50% アセトン メタノール固定した、非特異的結合ソリューションをブロックでふさがれた。セルがマウス型モノクローナル抗体で染色した、: 抗 CD45 (汎白血球マーカー)、サイトケラチン (上皮細胞マーカー) とサイトケラチン 7 (胎盤絨毛細胞マーカー) とヤギ ポリクローナル抗ビメンチン抗体 (間質細胞マーカー)。ロバ反ヤギとロバ抗マウスは、二次抗体として使用されました。DAPI は、核を染色に使用されました。マウス IgG、ヤギ IgG および二次抗体だけでは、負の値および特異性のコントロールとして使用されました。画像は、回転ディスク共焦点顕微鏡で 20 倍の倍率で撮影されました。抗体は、材料表に記載されて、図 3に代表的な画像が表示されます。私たちの目視を示します接続されているプライマリ脱落膜細胞の大半はビメンチン陽性間質細胞 (約 95%)、少数の白血球 (約 1-2%)、上皮 (約 1%) と栄養膜細胞集団 (単一セルであった会計を検出 < すべての 0.01%)。流れフローサイトメトリーと ICC の結果の大きな違いは、フローサイトメトリーで検出された CD45 陽性白血球人口の減少です。この不一致は 2 つの実験を行った方法で説明できる: フロー フローサイトメトリー解析における分離脱落膜細胞がすぐに処理され、末梢血白血球ポピュレーションが分析に含まれていたステンド グラス、意味。ICC は、合計の脱落膜細胞懸濁液はメッキし、実質と上皮細胞ですがない免疫細胞の付着を支えていた主メディアで 48 時間培養します。24 h 後は添付されませんでした免疫細胞はメディアの変更は、これらの 2 つの方法によって提示された結果の違いを会計時に削除されました。ハイリスク妊娠は特別な予防措置からひと脱落膜におけるサブ集団によって末梢血白血球ポピュレーションの偶発的な除去が回避される白血球を勉強の結論。
図 1: ゲーティング脱落膜細胞人口の差別のための戦略。(A)たて分離固定脱落膜細胞が細胞ダブレット、および(B)その後ゲート 3 つシーケンシャル機能/マスクの組み合わせを使用して細胞の残骸を除外する除外するゲート最初。(C)生きているセル (ピンク ゲート、総人口の 80%) (青いゲート、総人口の 20%) の死んだ細胞から分化した修正可能性染料を使用します。(D)脱落膜細胞の代表的なイメージは、生存性マーカーと 4 つの蛍光色素標識された抗体 (Ab) (ビメンチン APC、CD45 APC H7、サイトケラチン FITC、サイトケラチン 7-PerCP) ステンド グラス。点線スケール バー 7 μ m に相当します。(E)破片無料、ライブの細胞集団が決定され、一度、これらのマーカーは脱落膜細胞集団内でセル タイプごとの割合を決定するため使用されました。図 1 bと1 Cは、各ドットは単一の脱落膜細胞を表します。図 1 a 1 Cは、ドット プロットの色の範囲は赤い意味高密度細胞と細胞の密度が低い青の細胞密度を示しています。ここで表示されるデータは、3 の生物的複製の代表です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: FMO のプロットをゲーティングとプライマリのひと脱落膜細胞のフローサイトメトリーによる解析を Representativeflow.細胞の代表色ドット プロット用語脱落膜から分離したし、 (A)ビメンチン APC (間質細胞マーカー)、 (B) CD45-APC-H7 (白血球マーカー)、 (C)サイトケラチン FITC (上皮細胞マーカー) (D)とステンド グラス各それぞれの FMO コントロールと一緒にサイトケラチン 7 (胎盤絨毛細胞マーカー) PerCP質問にマーカーを引いたカクテルと完全に染色実験サンプルと全く同じに準備された完全抗体を含んでいるチューブ蛍光灯マイナス 1 (FMO) コントロールは真陽性を決定する流れ cytometry データ分析中に使用されました。脱落膜細胞集団。FMO コントロールは、相対的な背景を表示して、真の肯定的な信号の正確なゲート開閉を可能にします。ここで表示されるデータは、3 の生物的複製の代表です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: プライマリのひと脱落膜細胞の代表免疫細胞化学的解析します。48 h、24 h. 細胞いたアセトン ・ メタノールで固定し、モノクローナル マウス抗 CD45 (白血球マーカー) で染色後、メディア変更用ガラス coverslips 上プライマリひと脱落膜細胞に成長したサイトケラチン (上皮細胞マーカー) と抗サイトケラチン 7 (胎盤絨毛細胞マーカー) 抗体とヤギ ポリクローナル抗ビメンチン抗体 (間質細胞マーカー)。代表的な画像表示(A)ビメンチン陽性線維芽細胞 (セカンダリ Abs: ロバの反やぎ)、 (B) CD45 + 白血球 (セカンダリ Abs: ロバ抗マウス)、 (C)サイトケラチン陽性上皮細胞 (セカンダリ Abs: ロバ抗マウス) と(D)サイトケラチン 7 陽性の栄養膜細胞 (セカンダリ Abs: ロバ抗マウス) が検出された (赤染色)。DAPI 染色 (青染色) 細胞の核を染めるに使用されました。マウスの非特異的とヤギ igg 抗体 (IgG M と G の IgG) のネガティブ コントロールとして使用された、主を省略する Abs は、二次抗体のコントロール (M 2ndのみと G 2ndのみ) として使われていた。画像は、DMI の回転のディスク共焦点顕微鏡で 20 倍の倍率で撮影されます。スケール バー = 32 μ m。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
ここで説明されているプロトコルは、非常に身近で簡単な一次脱落膜細胞を分離するための効果的な方法で採集された全体ひと満期胎盤の胎児膜時間とコストを示しています。このプロトコルの成功は 2 つの重要な要因、(1) (2) プロトコルを通して脱落膜細胞の処理とケアと胎児膜の絨毛膜層から脱落膜を削りの効率に依存しています。絨毛膜組織汚染がどれもが誤って含まれて脱落膜をこする時に、特定し、洗浄のステップ (脱落膜と絨毛膜の形態の違いの間にあらゆる汚染を削除によって制御されていることが重要です。絨毛, 脱落膜と誤って収集が簡単に除去できます)。脱落膜細胞が壊れやすいため高速かつ頻繁にピペッティング減らされた実行可能性可能性があります。私達は、その後、低速、ピペット エジェクタ速度を設定しておくし、細胞を混合するときに使用する最低限のピペッティングを提案します。
このプロトコルが絨毛の汚染を防止する方法の 1 つはもっぱら (脱落膜 parietalis から成る) 胎盤の胎児膜の脱落膜を収集することにより取って生検によって行われ、脱落膜マイネルトのコレクションを除く胎盤の母体側。したがって、私たちの現在のプロトコルは、我々 は分離脱落膜細胞の人口の純度を向上し、一方それは脱落膜のこの部分を対象とする研究の限界として生じる脱落膜 (すなわち脱落膜によって) のセクションを除外してとき、または両方脱落膜のセクションが必要です。この除外には、この研究の最大の制限が構成されています。さらに、人間の患者から脱落膜細胞を分離しながら、脱落により生物学的関連性の高い洞察力と妊娠研究、少ない操作と少ない期間を学ぶことができる倫理的な理由のための齧歯動物ベースの研究と比較しています。
このプロトコルで作成難易度を証明するかもしれないステップがありますと正しく軽減 5 月細胞収量および生存率に影響を与えます。これを一周するには、変更は、行われる必要があります。胎児膜の脱落膜の削りが十分な (ステップ 2.4) であることを確認する最も重要なことです。人間の可変性のため各胎盤が脱落膜組織、組織の一貫性および組織の乾燥のレベルの量の点で異なる場合があります。脱落膜のみが削除されていることを確実に削りを調節することが重要です。脱落膜と膜が乾いて、PBS/缶は簡単にこするように膜の上に注がれます。2 番目のステップは、脱落膜細胞懸濁液 (ステップ 3.4) の赤血球溶解です。前述のとおり、細胞ペレットが非常に大きく、血の高い金額が含まれている場合も、ペレットは、生産効率を向上させる 2 つの管に分割できます。このステップの後赤い血液細胞がある場合は、最大効率のためのより多くのチューブにペレットを分割する必要があります。
胎盤と子宮を受ける非妊娠女性から子宮内膜細胞の分離からの異なる脱落膜の隔離のプロトコルは、以前に公開された18,19をされているが、これらのメソッドは各種を対応していません制限、低細胞生存率など隣接組織汚染。我々 は大きい細胞収量につながるこれらの範囲、ここで提示されたプロトコルを設計する際の生存率を増加し、周囲組織からの汚染のリスクを低減と見なされます。以前は、機械的に脱落膜組織19,20を打破する自動分離が使用されています。このメソッドは比較的厳しいの結果同様にミキサーに迅速に組織を打破する鋏を回転させることにより機能するマシンに挿入されたチューブの脱落膜組織が収集した積極的な機械的解離が含まれています。減少した細胞の生存率。ここで説明した新手法は、酵素の消化力は穏やかな揺動水バス動きの組織に適用される機械的な力ではなく演技と組み合わせてショート (20 分) を組み合わせたものです。細胞生存率と収量, 脱落膜組織の細胞外マトリックスを消化する (1) コラゲナーゼを含む増加する酵素消化ソリューションを設計します。(コラゲナーゼ; の残り trypsinolytic 活動により非特異的消化を防ぐために 2) の大豆トリプシンインヒビター(3) DNase 1 浮遊 DNA (4) ウシ胎児血清 (FBS) とウシ血清アルブミン (BSA) 蛋白質過剰消化から細胞を保護するために削除します。先行研究の 2 番目の主要な制限が実際に存在する脱落膜によっては、胎盤絨毛性汚染を引き起こす可能性がありますの母方の上位層を切断することによって収集されました。私たちの新しいプロトコル分離脱落膜、脱落膜を軽く削って parietalis 胎児膜 (絨毛膜) をオフし、洗浄のステップの間に絨毛膜汚染を簡単に除去できます。
したがって、私たちメソッドを使用するプライマリの脱落膜細胞の単純な隔離のため胎盤膜から収集した (全体のプロセスにかかる約 3 時間) 時間の短い期間で細胞の高と優秀な細胞生存率の結果します。脱落膜細胞が分離されたら使えると多数の実験のため例えば、免疫細胞化学的解析 coverslips にシードするひと脱落膜細胞、彼らすることができます様々 なトリートメントや操作の文化で育つ同様直接評価する多色フローサイトメトリー解析のためステンド、異なる細胞集団の役割を理解しよう妊娠合併症とひと脱落膜の組成物。ここで紹介した方法は胎盤 (人間の妊娠の第 3 学期末) から細胞を分離する使用されますが、このプロトコルも妊娠期の柔軟性を可能にする 2 番目の妊娠胎盤の最初に簡単に適応できます。1 つの研究に取り組んでいます。
以前公開されたプロトコルは、離れて脱落膜組織や酵素消化だけで21,22を破る自動分離を使用しています。酵素消化カクテル消化と細胞生存率の両方を最適化するように設計だけでなく、(37 ° c の水浴を揺動) 穏やかな機械力を用いて上記プロトコルは細胞収率と生存率との間の理想的なバランスを作成します。さらに、以前のプロトコルは、分離からのみ存在細胞生存率19総細胞収量が得られる言及に失敗しました。脱落膜細胞の細胞 (1000 万胎盤ごとに至る) をカウントすることによって決定の高収率を示します。さらに、現在の出版物の多くはネズミからプライマリ/子宮内膜脱落膜細胞の分離を示す私達のプロトコルは実験23細胞のもっと生物学的に関連するソースをレンダリングする人間の組織の研究のためことができます。このプロトコルでは、最初に容易に適応することができ、妊娠ステージ、1 つの研究の柔軟性を可能にする 2 番目の妊娠胎盤のアドレスします。細胞が分離されたら、彼らで使える各種、フローサイトメトリー、タンパク質と RNA の抽出、白血球等の後続分離など実験技術の様々 な試みで別の細胞の役割を理解するにはサブ集団。補助できる新たな標的を提供可能性があります関連付けられているリアルタイム PCR やゲノム広いを使用して (妊娠中毒症や早産の労働) など健康的で複雑な妊娠の間脱落膜研究における遺伝子および蛋白質の表現の違いを識別します。診断法と治療法の開発。また、脱落膜細胞、特に白血球、フローサイトメトリーを使用して容易に識別することができますの割合の変化では、両方白血球の変化など、妊娠合併症の病因に対する回答を提供可能性がありますも早産24や的に変調すること示されている彼らの活発化の状態と同様、個体の比率。
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Disclosures
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Acknowledgments
著者は、この研究で使用される人間の標本のドナー、RCWIH バイオバンク マウント シナイ病院/UHN 産科婦人科を感謝したいです。灰汁ラボ、特に博士キャロラインのダンク シュート法開発と彼女の助けのためのメンバーに感謝したいと思います。この作品はバロウズようこそ基金 (グラント #1013759) によってサポートされます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hank’s balanced salt solution with calcium and magnesium | Prepared in facility (LTRI) | ||
| Hank’s balanced salt solution without calcium and magnesium | Prepared in facility (LTRI) | ||
| Diaper pads | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Large surgical scissors | AL Medical | 2018-12-20. | |
| Large surgical forceps | Fine Science Tools | 11000-18 | |
| Plastic disposable cell scraper (25 cm) | Sarstedt | 83.183 | |
| 250 mm (size 60 mesh) metal sieve | Sigma-Aldrich | S1020-5EA | |
| Disposable scalpel with plastic handle (#21) | Fisher Scientific | 08-927-5D | |
| Sterile plastic petri dish (diameter 10 cm) | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| Sterile specimen container (urine cup, 4.5 oz) | VWR | 25384-146 | |
| Nylon filter (70 mm) | VWR/Corning | 21008-952 | |
| Erythrocyte lysis buffer | Qiagen | 79217 | |
| Trypan blue, 0.4% solution | Lonza | 17-942E | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Hemocytometer | Reichert | 1490 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 culture media | Invitrogen | 11835-055 | |
| Fetal bovine serum | Wisent | 080-150 | |
| Normocin (50mg/ mL) | Invivogen | ant-nr-1 | |
| Plastic top filtration unit (0.22 mm membrane, 500 mL) | Millipore | SCGPT05RE | |
| Collagenase 2, lyophilized powder | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| Soy bean trypsin inhibitor, powder | Sigma-Aldrich | T9003-250mg | |
| DNase powder | Roche | 10104159001 | |
| Bovine serum albumin (BSA powder) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Spinning disc confocal microscope - Leica DMI 6000B | Leica | ||
| Imaging Flow cytometer - Image Stream MK2 | Amnis | ||
| IDEA software | Millipore Sigma | ||
| APC-conjugated Vimentin antibody | R&D Systems | IC2105A | |
| APC H7-conjugated CD45 antibody | BD | 641399 | |
| FITC-conjugated Cytokeratin antibody | MACs Miltenyi Biotec | 130-080-101 | |
| PerCP -conjugated Cytokeratin 7 antibody | Novus | NBP2-47941PCP | |
| eFluor450 Fixable Viability dye | Thermo Fisher Scientific | 65-0863-14 | |
| Vimentin primary antibody | Santa Cruz | sc-7558 | |
| CD45 primary antibody | Dako | M0701 | |
| Cytokeratin primary antibody | Dako | M0821 | |
| Cytokeratin 7 primary antibody | Dako | M7018 | |
| Mouse IgG | Santa Cruz | sc-2025 | |
| Goat IgG | Santa Cruz | sc-2028 | |
| Alexa Fluor 546 secondary antibody | Invitrogen | A10036 | |
| Alexa Fluor 594 secondary antibody | Fisher Scientific | A-11058 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 |
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