Summary
פרוטוקול זה מדגים שיטת הבידוד של תאים אנושיים decidual הראשית שנאסף בקרום עוברי של המונח placentae אשר יכול לשמש למגוון רחב של יישומים (קרי immunocytochemistry, cytometry זרימה, וכו ') מכוון ללמוד את התפקיד של אוכלוסיות תאים שונים בסיבוכים בהריון.
Abstract
רותמי, המכונה גם רירית הרחם בהריון, היא רקמה הרבייה חשובה ביותר. תאים decidual, המורכב בעיקר תאי סטרומה decidualized של תאים חיסוניים, אחראים הפרשת גורמים הורמונליים דלקתית אשר הם קריטיים עבור הבלסטוציסט מוצלחת השרשה, פיתוח היפרדות לשחק תפקיד חניכה של העבודה לטווח, לידה מוקדמת. רבים הריון לסיבוכים לפליטת של איזון עדין של אוכלוסיות תאים שונים הכוללת רותמי. שינויים ביחס של סוגי תאים decidual מסוים עשוי לשבש תהליכים חיוניים אלה ולהגביר את הסיכון לפתח סיבוכים חמורים של ההריון, כגון כשל השרשה של העובר, פיגור גדילה תוך רחמי, רעלת, צירי. פרוטוקול שמפורטות כאן מדגים את העלות ואת הזמן שיטה יעילה עבור בידודו של התאים decidual העיקרי של האדם שנאסף בקרום עוברי של המונח placentae. על ידי שילוב עיכול אנזימטי ובהפסקות מכני עדין של הרקמה decidual, הושג תשואה גבוהה של תאים decidual עם כמעט ללא זיהום chorion. חשוב, מאופיינים מבודד תאים decidual (תאי סטרומה (55-60%), לויקוציטים (35%), אפיתל (% 1) או trophoblast (0.01%) תאים) ומתוחזק הכדאיות גבוהים (80%) אשר אושר ע י ססגוניות assay cytometry זרימה הדמיה. פרוטוקול זה ספציפית parietalis רותמי, ניתן להתאים בשליש הראשון והשני placentae. מבודדת בעבר, תאים decidual יכול לשמש עבור מספר רב של יישומים ניסיוני במטרה להבין את התפקיד של אוכלוסיות תת תא decidual שונים של סיבוכים בהריון.
Introduction
רירית הרחם, אחד הפעילים ביותר למבוגרים נקבה ברקמות, עובר שיפוץ דרמטי בכל מחזור הוסת בתגובה לגירוי על ידי השחלה הורמונים, אסטרוגן (E2) ופרוגסטרון (P4). רותמי, המכונה גם רירית הרחם בהריון, היא רקמה הרבייה חשובה ביותר שנוצר עד לסוף השלב postovulatory כתוצאה מונחה P4 בידול בעקבות השלב proliferative E2-הדומיננטי. תאים decidual אחראים הפרשת ההורמונים גורמים הבלסטוציסט מוצלחת השרשה ועל פיתוח של הממשק עם רחם-היפרדות לשמירה על סובלנות אימהי להשתלת העובר.
Decidualization נדרש השרשת ובניה עוקבות של העורקים ספירלה decidual. תאי סטרומה רירית הרחם עוברים decidualization, תחת השליטה של P4, מחנה, במהלך שלב luteal מאוחר של המחזור החודשי1. תהליך זה הוא יזם סביב כלי הדם מתפשט ברחבי stroma, רומז תפקידה להערכת ואבו ליקוציט סחר רגולציה. זה שינוי הסלולר מאופיין של מורפולוגיה מעגלית, גודל הגרעין גדל והרחבה של תוך-פלזמית קשה ו גולג'י2. Decidualized תאי סטרומה הם מסוגלים לייצר paracrine גורמים התומכים הבלסטוציסט השרשה, המאופיינת על ידי הפרשת הורמונים (קרי פרולקטין) רבים, גורמי גדילה אנגיוגנזה, אינסולין גורם גדילה מחייב חלבון-1 (IGFBP-1), פרוסטגלנדין (עמוד) E (ממריץ של מחנה תאיים), ציטוקינים, מטריצה חוץ-תאית רכיבים וחומרים מזינים חיוניים עבור היפרדות השרשה ופיתוח3,4,5,6 .
האוכלוסייה תא decidual לא מורכבת אך ורק תאי סטרומה decidualized אבל מכיל גם אוכלוסיות גדולות, הריון ספציפי ליקוציט decidual. Decidualization כרוך קרדיוגני מקומי חולף זרם של תאים הטבעיים (NK) רוצח, תאי-T, תאים דנדריטי macrophages. Subpopulation ליקוציט הגדול הוא תאי NK הרחם, הכוללת כ- 50-70% של כל לויקוציטים אימהי שחדר רותמי אשר הם מקור של ציטוקינים וגורמים האנגיוגנזה אשר עשויים לסייע בתהליך decidualization, לודיג מספר לאורך כל ההריון7. מקרופאגים, להיות subpopulation השנייה בגודלה של תאים חיסוניים, נמצאות סביב האתר השרשה ולהגדיל במהלך הריון8. הם מקור של ציטוקינים, צמיחה גורמים כגון המושבה מגרה פקטור (CSF-1)9, הגידול נקרוזה מקדם α (TNFα)10 ופרוסטגלנדין (עמוד) E11.
לאורך כל ההריון, לפני הלידה המונח, רותמי היא המקור העיקרי של ציטוקינים ו נוגדנים אחראית ליקוציט היקפיים אימהי הפעלה והעברה עוקבות לרקמות הרחם ליזום עבודה. מחקרים שנעשו בבעלי חיים הראה כי ציטוקינים פרו-דלקתיים רבים הם למעלה מוסדר ב רותמי העכבר במהלך העבודה, כגון TNF-a, IL-6, IL-12, ו- IL-1b12. ב האדם רותמי, ציטוקינים פרו דלקתיים IL-1b, IL-6 ו- IL-8 (הגדולות chemoattractant נויטרופילים) התערוכה ביטוי גבוה יותר במהלך העבודה לעומת לא העבודה13. אלו ומופרש ציטוקינים תוצאה הפעלת ואת זרם של לויקוציטים אל רקמות decidual14; מקרופאג decidual, נויטרופילים בחדירת שני האדם ואת עכברוש ביבוא במהלך תקופת העבודה, עם חדירת decidual שקדמו myometrial 4-fold רבתי, המציינת את מפל של הפעלת בין רקמות הרחם שני סמוכים זה 15. אלה שחדר לויקוציטים לייצר PGs מסוגל להפעיל התכווצויות סינכרונית של ה myometrium16, מטריקס metalloproteinases (MMPs) ליזום ממברנה לקרע17,18, כמו גם ציטוקינים פרו-דלקתיים כדי להגביר את תהליך הפעלת הרחם ('סערת ציטוקינים').
בשל תפקידים חשובים רבים של תאים decidual, כמו משחק תפקיד קריטי בתהליך ההשתלה, שמירה על רגישות אימהית-עוברית ההיריון המוקדמים, השתתפות ההפעלה של העבודה-מונח הלקויות השונות יכול להיווצר במהלך הריון. למשל, בעיות פוריות (1) בשל השרשה חוזרים ונשנים כישלון ואובדן הריון חוזרים ונשנים יכול לנבוע כשל של התבגרות decidual; (2) הגבלת גדילה תוך רחמי (IUGR), רעלת עקב פיתוח לקוי, חוסר תפקוד של רותמי/השליה או טרנספורמציה וסקולרית פרוץ בצומת decidual-myometrial; כמו גם לידה לידה מוקדמת (3) אשר יכול לנבוע הפעלה decidual מוקדמת.
לנוכח הפרעות עיקריים אלה, יחד עם המגבלות מוסרי ומעשי של האדם ויוו מחקרים, הקמת שורות תאים decidual אנושיים העיקרי הוא חיוני עבור ניתוח במבחנה במטרה הבנה טובה יותר, שיפור ניהול קליני של סיבוכים בהריון. לפיכך, מטרת המחקר שלנו היה לפתח פרוטוקול המאפשר ניתוקה של תאים אנושיים decidual ראשי עם תשואה גבוהה התא ואת הכדאיות שנאסף בקרום עוברי של המונח placentae. בפרוטוקול הנוכחי זה מתאר בבירור זמן cost effective שיטה עבור בידוד של תתי סוגים ספציפיים של decidual תאים אשר לשמש למגוון רחב של ניתוחים במבחנה . אפיון של שפע של פנוטיפ של decidual תת אוכלוסיות המונח, בהשוואה בשליש הראשון או השני הוא חיוני כדי הגדרת התפקידים שלהם לאורך כל ההיריון האנושי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Placentae נאספים מהסמסטר בריא, לא בנשים העבודה שעברו קיסרי אלקטיבי. איסוף, עיבוד, חד פעמית של דגימות האדם לדבוק הקווים המנחים של הלוח הר סיני החולים אתיקה. בכתב מתקבל של כל מטופל. מחקר זה אושרה על ידי מועצת המנהלים של אתיקה מחקר בבית החולים הר סיני.
1. תכשירים
הערה: כל השלבים להתבצע תחת ברדס fume, כל ציוד כירורגי חייב להיות מעוקר דרך החיטוי לפני השמה בשכונה fume. כל חומר אחר (בקבוקים, צינורות 50 מ ל, וכו ') חייב להיות מעוקר עם 70% אתנול פתרון. תמיד ללבוש ציוד מגן אישי בכל עת בעת עבודה עם פסולת ותברואה (חלוק, כפפות, שיער ארוך אסוף, וכו ').
-
פתרון עיכול אנזימטי (הפתרון הסופי: 200 מ ל)
- פיפטה 180 מ של HBSS-/ - לתוך גביע 500 מ"ל, להוסיף מגנט מלהיב סטרילי ומניחים על ערבוב צלחת בטמפרטורת החדר.
- שוקל ולהוסיף את הפעולות הבאות לפתרון של HBSS-/-לאט ברצף: 20 מ ל FBS, 400 מ"ג Collagenase 2 ([הסופי] = 2 מ"ג/מ"ל), 20 מ ג מעכבי טריפסין שעועית סויה ([סופי] = 0.1 מ"ג/מ"ל), 30 מ"ג DNase 1 ([הסופי] = 0.15 מ"ג/מ"ל), ו- 200 מ"ג BSA ([סופי] = 1 מ"ג/מ"ל)
- הגדר את ערבוב במהירות בינונית, ולאפשר את התערובת ומערבבים למשך 10-20 דקות (כיסוי עם סרט נייר כסף או פרפין פח תוך כדי ערבוב).
- שופכים את הפתרון מעורב לתוך בקבוק זכוכית 250 מ ל באמצעות משפך פלסטיק ולמקם בשכונה fume.
- עוברים את הפתרון באמצעות יחידת סינון העליון פלסטיק (0.22 μm ממברנה מסנן, 500 מ"ל), aliquot 20 מ"ל לתוך צינורות 50 מ ל (סה כ 10 צינורות), חנות ב-20 ° C עד השימוש.
-
RPMI 1640 מדיה (2% שטיפה פתרון ו- 10% צמיחה מלאה בינוני)
- לשלב RPMI 1640 FBS בבקבוק זכוכית בשכונה fume.
- 2% FBS פתרון, לשלב 490 מ של RPMI 1640, 10 מ ל FBS.
- 10% FBS הפתרון, לשלב 450 mL RPMI 1640 ו- 50 מ ל FBS.
- פיפטה 500 μL של normocin לתוך בקבוק הזכוכית 500 מ"ל מהשלב הקודם המכיל RPMI ומדיה FBS (50 מ"ג/מ"ל מניות, 0.05 מ"ג/מ"ל ריכוז בעבודה).
- להעביר מדיה דרך μm ממברנה מסנן 0.22 בחנות בבקבוק זכוכית 500 מ"ל ב 4 ° C עד השימוש.
- 30 דקות לפני הפעלת הניסוי, מקום aliquot של 20 מ"ל של קפוא עיכול אנזימטי פתרון באמבט חרוז 37 ° C, למקם את 2% FBS ואמצעי התקשורת FBS RPMI 1640 10% באמבט חרוז 37 ° C, להפעיל את האמבט במים נדנדה והגדר 37 ° C , דור 2, והינו ממוקם צנטריפוגה מבוקרת טמפרטורה עד 4 ° C.
2. אוסף של רקמת Decidual מן המונח היפרדות הקרומים
- למקם בקבוקים עם HBSS + +, HBSS-/-חמישה צינורות 50 מ ל במעמד מתחת למכסה המנוע fume. פיפטה 25 מ של HBSS + / + צינור אחד.
-
באמצעות הידיים בכפפה, להוציא את השליה המונח מהגורם המכיל המשמש להובלת זה מן התיאטרון חדר הניתוח. מקם את השליה על משטח החתלה (אימהית בצד למעלה) ולהפיץ את הקרומים העובריים בעזרת מלקחיים ומספריים.
- שכב רפידות חיתול חופפים על מכסה המנוע fume.
- השתמש חיתול נפרד כדי להעיף את השליה אז הצד האימהי הוא הפנים למעלה.
- למצוא נקודת של קרום קרע ולבצע חתכים כדי לאפשר את הממברנה כדי לגולל ושכבה פרקדן על פני השטח fumehood.
הערה: לאחר הקרום שהוחזר מן השליה, רותמי יהיה עם הפנים למעלה נח על השכבה chorion, עם השכבה השפיר מאחור.
- בזהירות באמצעות המגרד של תא פלסטיק, לגרד את הרקמה decidual chorion ואת המקום לשפופרת 50 מ ל המכיל 25 מ ל HBSS + / +.
- לגרד את הקרום עם לחץ מתון. אל תחיל מדי לחץ כמו זה עלול לגרום זיהום chorion. לאסוף קרישי דם קטנים כמו גם, אלה מכילים מספר תאים decidual.
התראה: לאחר אוסף decidual, השליה חייב להיות ארוז בתוך סל פלסטיק חומרים מסוכנים, קפוא במקפיא-20 ° C לפני סילוק מתאים (לפי הכללים מוסדית). רפידות חיתול מדם חייב להיות עטוף בשקית ניילון חותם חזק והשמדתי בתוך קופסת הבטיחות הביולוגי.
3. שטיפת, אנזימטי עיכול של הרקמה Decidual
- לשטוף את רקמות שנאספו על ידי בעדינות רועד הצינור 50 מ ל בעבודת יד ולהעביר אותו דרך מסננת מתכת (250 μm, רשת שינוי גודל 60) 250 μm מנוחה מעל מיכל הדגימה סטרילי (שתן).
- חזור על לשטוף את פעמיים עם HBSS + / + פעמיים עם HBSS-/ - צינורות טריים עבור כל כביסה. (סופי שוטף עם HBSS-/-מאפשר הסרת סידן ומגנזיום נוכח HBSS + +, אשר יפריע אחרת תהליך עיכול אנזימטי הבא).
שימו לב. במהלך השלבים כביסה, זיהום רקמות chorion יהיה כפי הרקמה decidual הוא אור ורוד בצבע הוא אמורפי, בזמן chorion הלבן, דחוס וצמיגי. לכן, זיהום chorion ניתן להסירו בקלות עם מלקחיים. - לחלופין, אם הרקמה decidual עבה, להעביר אותו צלחת פטרי בקוטר 10 ס מ סטרילי והמשך מינצ של הרקמה עם שני אזמלים מנוגדות בצלחת.
-
למקם את הרקמה שטף סטרילי 50 מ ל שפופרת המכילה 100 מ ג של רקמות/mL של פתרון עיכול אנזימטי (ראו הכנות).
- כנקודת התייחסות, לוודא הרמה של רקמת decidual יגיע הסימן 5-10 מ"ל ברכבת התחתית 50 מ.
- השתמש בערך 20 מ"ל של פתרון עיכול אנזימטי (הוכן בשלב 1.1) לעכל את רותמי הכולל שנאסף קרום עוברי כל. המונח.
- לסגור את הפקק של הצינור עם הסרט פרפין (לאטום את הצינור בחוזקה, לעטוף פרפין הסרט סביב פקקי העליון של הצינור) תחת התרבות הוד, דגירה רקמת decidual ב 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות באמבט מים חזק (145 סל ד דור 2).
- לאחר דגירה, להסיר את הסרט פרפין לעקר את פני השטח של הצינור המכיל רקמות מתעכל עם 70% אתנול, מתחת למכסה המנוע fume. לנער את הצינור בקצרה בעבודת יד.
- לאסוף תא ההשעיה דרך מסננת מתכת (250 μm, רשת שינוי גודל 60) לתוך מיכל הדגימה סטרילי חדש. לדלל עם אמצעי אחסון שווה (20 מ ל) של RPMI + 10% FBS המכיל 0.1% normocin כדי לעצור את התגובה אנזימטיות. המשך ישירות לשלב צנטריפוגה 4.1.
- במידת הצורך, למקם את הרקמה מעוכל הנותרים בחזרה לתוך צינור 50 מ עם 20 מ של עיכול אנזימטי טריים פתרון וחזור על מערכת העיכול (20 דקות, 37 ° C, רועד אמבט מים).
- אם עיכול השני הוא הכרחי, במקום ברכבת התחתית הראשונה עם תא השעיה על קרח (כיסוי עם סרט פרפין לשמור סטרילי). חזור על שלבים 3.5-3.6 ולשלב את המתלים שני תאים.
4. יצירת השעיה תא בודד
- Centrifuge התליה תא (420 גרם, 4 ° C, 11 דקות).
- הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend התאים 40 מ"ל של RPMI + 2% FBS המכיל 0.1% normocin ("מאגר שטיפת").
הערה: תא גלולה להיות רפוי, כמו ג'לי עקב זיהום תאי הדם האדומים, תשאף תגובת שיקוע בזהירות. הסרה של השלב העליון עם פיפטה ידני ייתכן שתידרש. - חזור על צנטריפוגה-420 גרם ב 4 מעלות צלזיוס למשך 11 דקות.
- בזהירות להסיר את תגובת שיקוע (כאמור הערה שלב 4.2) ו resuspend בגדר תא ב 5 מ של שטיפת מאגר ולהוסיף 35 מ של מאגר פירוק כדוריות דם אדומות בצינור אותו.
הערה: אם בגדר גדולים או מדמם מאוד, זה ניתן לחלק את שני צינורות עבור השלב פירוק כדוריות דם אדומות על-ידי הוספת 10 מ"ל של מאגר לשטוף ואת חלוקת באותה מידה שני צינורות ואז הוספת 35 מ של מאגר פירוק כדוריות דם אדומות כל שפופרת. - דגירה על קרח במשך 20 דקות בקצרה מערבולת צינור בתחילתה ואת בסוף הדגירה כדי lyse כדוריות דם אדומות.
- צנטריפוגה-420 g עבור 11 דקות ב 4 º C.
- . בזהירות, להסיר את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב- 40 מ של מאגר לשטוף.
- עוברים את התאים μm 70 ניילון מסנן כדי להסיר תאים גושים.
- צנטריפוגה-420 גרם עבור 11 דקות ב 4 º C.
- הסר את תגובת שיקוע, resuspend בגדר תא ב- 10 מ"ל של מדיום מלאה (RPMI 10% + FBS המכיל 0.1% normocin).
-
לספור תאים באמצעות trypan צבען כחול-הדרה hemocytometer ההליך כמפורט להלן:
- מתחת למכסה המנוע תרבות בעדינות פיפטה תא ההשעיה לאורך 3 x כדי לערבב ביסודיות לפני שילוב עם trypan blue. ב- mL 1.5 שפופרת להכין תא ההשעיה, מדולל 1:2 (לשלב, 20 μL של פתרון trypan blue) וμl 20 של השעיה תא decidual. מערבבים בזהירות trypan blue-תא פתרון על-ידי pipetting למעלה ולמטה כמה פעמים (פתרון זה אינו סטרילי).
- מניחים את hemocytometer על השלב של המיקרוסקופ עם זכוכית coverslip על העליונה.
הערה: Hemocytometer היא מיקרוסקופ שקופית עם רשתות עליו לתת תשעה ריבועים גדולים מחולק לשלושה קווים. כל ריבוע גדול יש אזור של 1 מ מ2, העומק של נוזל בבית הבליעה 0.1 מ מ. לכן, שאמצעי האחסון של נוזל יכול למלא כל ריבוע גדול 1 מ"מ * 1 מ"מ * 0.1 מ"מ = 0.1 מ"מ3= 10 מ ל-4 . - לאט לאט להוסיף 10 μL של תערובת trypan blue-תא לתוך החריץ של hemocytometer, המאפשר נימיות לפזר את תערובת תא מעל השקופית כולה (לעצור לפני תערובת ממלא טוב).
- הצג את התאים במיקרוסקופ (ב 10 X הגדלה), לספור את כל התאים לבן/ירוק השוללים trypan blue (אלה הם התאים קיימא) ארבע המשבצות החיצוניות גדול של hemocytometer. בעת ספירת תאים יגעו בשורה, לספור רק את אותו מגע בצד ימין ואת השורות העליונות, אך לא כאלה נוגע לימין ואת התחתון קווים. לא לספור תאים כחול כהה; צבע כחול מציין כי התא מת כפי trypan blue צבען יכול בקלות לחדור דרך קרום פלזמה לתוך הציטופלסמה.
- כדי לחשב את מספר התאים קיימא ב 1 מ"ל של התא השעיה (X):
2 = גורם לדילול
10,000 = פקטור המרה (1 מ"ל = 1 ס מ3 = 10, 000 * 0.1 מ מ3)
- לדלל decidual לתאים ריכוז סופי רצוי RPMI + 10% FBS (מדיום הגידול).
הערה: עבור ציפוי תרביות רקמה, פיפטה 2 * 106 תאים/היטב לתוך צלחת פלסטיק 6-ובכן, 10 * 106 תאים לתוך צלחת פלסטיק 10 ס מ או 75,000 לתאים coverslip זכוכית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי לאמת את היעילות ואת הכדאיות של תאים מבודדים, אופיינו על ידי שתי שיטות: flow cytometry, immunocytochemistry (ICC). אוכלוסיות תאים 4 ממוקדים; decidualized תאי סטרומה אותרו על ידי הנוגדן אנטי-vimentin, פן-ליקוציט סמן CD45 שימש כדי לזהות תאים חיסוניים decidual, cytokeratin שימש כדי לזהות תאים אפיתל אנדותל, בסופו של דבר, cytokeratin 7 שימש כדי לזהות כל trophoblast פוטנציאליים (chorion או היפרדות) זיהום.
על אפיון באמצעות מיכשור הדמיה ססגוניות, תאים decidual טרי בודדים היו מוכתמים צבע שניתן לתקן כדי לקבוע הכדאיות הסלולר. התאים היו permeabilized קבוע, ואחריו מכתים עם העכבר fluorochrome מצומדת נוגדנים חד-שבטיים מיקוד 7-PerCP vimentin-APC, CD45-APC-H7, cytokeratin-FITC ו- cytokeratin. נוגדן מידע מפורט בטבלה שלחומרים. תאים קבוע, מיטה אוחסנו ב 4 ° C לילה בצביעת המאגר כדי למנוע דיסוציאציה של צבע טנדם, להפעיל ביום המחרת התמונה זרם MK2 הדמיה זרימה cytometer. הניתוח בוצע באמצעות תוכנה. שאריות תאים, אגרגטים היו לא נכלל בשל טורי gating באמצעות תכונת רציפים/מסיכה שלושה שילובים (איור 1 א'-ב'). פקדים המגביל פלורסצנטיות מינוס אחד (FMO) שימשו כדי לזהות אוכלוסיות תא decidual חיובית, כתם אחד התאים שימשו פיצויים (איור 2). נקודה סופית לחלקות מדגימים האוכלוסייה תא מוכתם באופן חיובי סמני ארבע (איור 2) ואת הכדאיות הסלולר של 80% (איור 1C). להחליפן בתמונות של תאים מוכתם באופן חיובי ניתן לראות באיור 1D. באמצעות שיטה זו, מצאנו כי את האוכלוסייה מורכבת בעיקר תאי סטרומה (55-60%), לויקוציטים (35%), אפיתל (1%) או trophoblast (0.01%) התאים (איור 1E). הניסוי חזר על עצמו שלוש פעמים. תוצאות אלו לאמת את טוהר (היעדר זיהום trophoblast מ chorion) ואת הכדאיות גבוהה של ראשי תאי decidual אדם שנגבו, מבודד בקרום עוברי של המונח placentae.
בניסוי ICC נפרד, מבודד טרי תאים decidual היו נזרע על coverslips זכוכית דקה (75,000 תאים/coverslip), מותר לצרף ונשארתי בתרבות למשך 48 שעות. מדיה השתנה לאחר 24 שעות להסרת תאים מתים שאינם מצורפים. התאים היו לאחר מכן קבועה עם אצטון 50% - 50%, permeabilized עם חומרים פעילי שטח ללא יונית 0.02% מתנול, האיגוד לא ספציפי נחסם עם חסימת פתרון. התאים אז. היו מוכתמות נוגדנים חד-שבטיים העכבר: אנטי-CD45 (פאן-ליקוציט מרקר), אנטי-cytokeratin (תאים אפיתל סמן) ו- anti-cytokeratin 7 (trophoblast מרקר), ולא עז נוגדנים נגד polyclonal-vimentin (תאי סטרומה מרקר). החמור נגד עז ועכבר נגד דונקי שימשו נוגדנים משניים. דאפי שימש כדי להכתים את הגרעינים. העכבר אג, עז אג, לבד משני נוגדנים שימשו כפקדי שלילי וספציפיות. התמונות צולמו בהגדלה X 20 במיקרוסקופ קונפוקלי של הדיסק מסתובב. נוגדנים שימוש מפורטים בטבלה של חומרים, להחליפן בתמונות מוצגות באיור3. התצפית הויזואלית שלנו מציין את רוב המצורפת תאים decidual הראשי הם תאי סטרומה vimentin-חיוביות (כ – 95%), עם מספר קטן של לויקוציטים (כ – 1-2%), אפיתל (כ – 1%), trophoblast אוכלוסיות תאים (תאים בודדים היו זוהה החשבונאי < 0.01% מכל). ההבדל העיקרי בין זרימה cytometric ICC תוצאות הוא הירידה באוכלוסיה ליקוציט חיובית CD45, זוהה על ידי cytometry זרימה. אי-התאמה זו יכולה להיות מוסברת על ידי השיטות שבהן נערכו שני ניסויים: בניתוח cytometry זרימה, תאים decidual מבודדים עובדו באופן מיידי, ויטראז'ים, משמעות האוכלוסייה ליקוציט נכללה בניתוח. עם ICC, התליה תא decidual הסכום היה מצופה ותרבותית למשך 48 שעות בתקשורת זה בעיקר תמך ההחזקה של סטרומה ותאי אפיתל, אבל תאים חיסוניים לא. לאחר 24 שעות תאים חיסוניים כי לא צורפו הוסרו במהלך שינוי מדיה, והיוו ההבדל בתוצאות שהוצגו על ידי שתי שיטות אלו. הגענו למסקנה כי לימוד ליקוציט תת אוכלוסיות ב רותמי האנושי מתוך זהירות מיוחד הריונות מסובך צריך לשמש כדי למנוע מקרי חיסול של האוכלוסייה ליקוציט.
איור 1: Gating אסטרטגיה עבור תא decidual האוכלוסייה אפליה. (א) טרי מבודד התאים decidual קבועים היו בתחילה מגודרת כדי לא לכלול תא doublets, ו- (B) לאחר מכן מגודרת באמצעות שלושה שילובים תכונת רציפים/מסכה כדי לא לכלול שאריות תאים. (ג) תאים חיים (שער ורוד, 80% מכלל האוכלוסיה) היו תריז תאים מתים (שער כחול, 20% מכלל האוכלוסיה) באמצעות צבע הכדאיות ניתן לתיקון. (ד) להחליפן בתמונות של תאים decidual צבעונית עם סמן הכדאיות ואת ארבע מצומדת פלורסנט נוגדנים (אלב) (vimentin-APC, CD45-APC-H7, cytokeratin-FITC ו- cytokeratin 7-PerCP). בר מנוקד בקנה מידה שווה 7 μm. (E) , ברגע אוכלוסיה ללא פסולת, חיה תא נקבע, סמנים אלה שימשו כדי לקבוע את האחוזים של כל אחד מסוגי התאים בתוך האוכלוסייה תא decidual. עבור דמויות 1B ו- 1 C, כל נקודה מייצגת תא decidual בודד. עבור דמויות 1A ו- 1 C, טווח הצבעים של החלקות נקודה מתארת צפיפות התאים, עם תאים בעלי צפיפות גבוהה וכזירה המסמנת אדום וכחול פחות צפוף של תאים. הנתונים המובאים כאן היא הנציגה של משכפל ביולוגית 3. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: Representativeflow ניתוח cytometric של ראשי תאים אנושיים decidual עם FMO gating חלקות. צבע מייצג נקודה חלקות תאים מבודד מן המונח רותמי, מוכתם (א) vimentin-APC (סמן תאי סטרומה), (B) CD45-APC-H7 (סמן ליקוציט), (ג) cytokeratin-FITC (תאים אפיתל סמן) ו- (ד) cytokeratin 7-PerCP (סמן trophoblast) לצד כל פקד FMO בהתאמה. פקדים פלורסנט-מינוס-אחד (FMO), צינורות אשר מכילים הנוגדן מלא קוקטיילים מינוס בסמן שאלה ו מוכן באופן זהה המדגם ניסיוני מוכתם באופן מלא, שימשו במהלך ניתוח נתונים cytometry זרימה כדי לקבוע חיובי אמיתי תא decidual אוכלוסיות. פקדים FMO להראות על רקע יחסי ולאפשר gating מדויק של אותות חיובי אמיתי. הנתונים המובאים כאן היא הנציגה של משכפל ביולוגית 3. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: ניתוח Immunocytochemical נציג של התאים decidual העיקרית של האדם. התאים decidual העיקרי של האדם גדלו על coverslips זכוכית דקה במשך 48 שעות, עם שינויים מדיה לאחר 24h. התאים היו קבוע עם אצטון-מתנול, צבעונית עם העכבר monoclonal אנטי-CD45 (ליקוציט מרקר), אנטי-cytokeratin (תאים אפיתל מרקר), נוגדנים אנטי-cytokeratin 7 (סמן trophoblast), נוגדנים נגד polyclonal-vimentin עזים (סמן תאי סטרומה). להחליפן בתמונות להראות (א) vimentin-חיוביות fibroblasts (Abs משני: החמור נגד עז), CD45 (B) + לויקוציטים (Abs משני: אנטי-העכבר חמור), בתאי אפיתל חיובי cytokeratin (ג) (Abs משני: חמור אנטי עכבר) (ד) cytokeratin trophoblast 7-חיוביות תאים (Abs משני: העכבר אנטי חמור) היו שזוהו (אדום צביעת). דאפי מכתים שימשה צובעים את הגרעינים של תאים (צביעת הכחול). עכבר שאינו ספציפי עז IgG (מ' אג ו- G אג) שימשו כפקדי שלילי, תוך השמטת העיקרי Abs שימשו כפקדי נוגדנים משניים (M 2nd בלבד ו- G 2nd בלבד). תמונות נלקחים בהגדלה X 20-DMI ספינינג דיסק מיקרוסקופ קונפוקלי. גודל ברים = 32 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן מדגים את העלות ואת הזמן שיטה יעילה עבור בידוד תאים decidual הראשית שנאסף בקרום עוברי של המונח האנושיות placentae כי הוא מאוד נגיש וברור. ההצלחה של פרוטוקול זה תלויה בשני גורמים קריטיים, (1) יעילות של גירוד decidual מהשכבה chorion בקרום עוברי וטיפול (2) שבה התאים decidual מטופלות לאורך כל הפרוטוקול. זה חשוב כי זיהום רקמות chorion נשלטת על-ידי הבטחת כי לא נכלל בטעות במהלך גירוד decidual, על-ידי זיהוי והסרה של כל זיהום במהלך השלבים כביסה (ההבדל מורפולוגיה רותמי, chorion מאפשר הסרה קלה של chorion אשר שייאסף בטעות עם רותמי.) תאים decidual חלשים ולכן מהיר ותכוף pipetting עלול לגרום ירידה הכדאיות. אנו מציעים, אם כך, כי הגדרת מהירות מפליט פיפטה צריכים להישאר בבית איטי, pipetting מינימלי צריך לשמש בעת ערבוב תאים.
אחת הדרכים שבה פרוטוקול זה מניעת זיהום trophoblast היא על ידי איסוף אך ורק רותמי של הממברנות העוברי של השליה (הכוללת את parietalis רותמי), למעט אוסף basalis רותמי אשר נעשה על ידי לקיחת ביופסיות מן הצד האימהי של השליה. לכן, בעוד הפרוטוקול הנוכחי שלנו משפר את הטוהר של האוכלוסייה תא decidual נוכל לבודד, זה לכלול מקטע של רותמי (קרי רותמי basalis) אשר עשוי להוות מגבלה למחקר מיקוד זה חלק רותמי או כאשר שניהם קטעים של רותמי נדרשים. הדרה זו כוללת המגבלה הגדולה ביותר של מחקר זה. בנוסף, תוך כדי לבודד תאים decidual מן בני אדם חולים מאפשר יותר ביולוגית רלוונטית תובנה decidual ופחות הריון מחקר, מניפולציה ותקופות זמן פחות יכול להילמד בהשוואה מבוססי מכרסם מחקרים מסיבות אתיות.
לאורך כל פרוטוקול זה, ישנם צעדים אשר עשויה ליצור קושי, ואם לא נכונה התמודדות עימם מאי להשפיע תא ביבול ובאיכות ובמקרים רבים הכדאיות. כדי להקיף את זה, שינויים עשוי צריך להתבצע. הוא הקריטי ביותר על מנת להבטיח כי גירוד decidual ממני הקרומים העובריים מספיקות (שלב 2.4); בשל הבדלים בין אישיים, כל השליה עשוי להיות שונה מבחינת כמות רקמת decidual, רקמות עקביות ורמת יובש ברקמות. חשוב לווסת גירוד כדי להבטיח כי רק רותמי להיות הוסר. אם רותמי של ממברנות יבשות, PBS-/-can שפכו על הממברנות כדי לאפשר גירוד קל יותר. השלב השני הוא פירוק כדוריות דם אדומות של התליה תא decidual (שלב 3.4). כפי שהוזכר, אם בגדר תא גדול מאוד, מכיל כמות גבוהה של דם, בגדר ניתן לחלק את שני צינורות כדי לשפר את היעילות של lysing. אם עדיין יש כדוריות דם אדומות לאחר שלב זה ייתכנו צורך לחלק את צניפה צינורות יותר ליעילות מירבית.
בעוד פרוטוקולים שונים בידוד decidual המונח השליה ובידוד של התא רירית הרחם מנשים שאינה בהריון שעברו hysterectomies כבר שפורסמו בעבר18,19, שיטות אלה אינן מטפלות שונים מגבלות, כגון הכדאיות נמוכה תא וזיהום רקמות סמוכים. שקלנו אלה וביתנו בעת עיצוב פרוטוקול המובאים כאן, מה שמוביל תפוקת תא גדול יותר, גדלה הכדאיות, להפחית את הסיכון של זיהום מן הרקמות הסובבות. בעבר, היו בשימוש dissociations אוטומטי לשבור באופן מכני את הרקמה decidual19,20. שיטה זו קשה יחסית שכן היא כוללת דיסוציאציה מכני נמרצת שבו נאסף הרקמה decidual בשפופרת, מוכנס לתוך המכונה אשר מתפקד באופן דומה כדי בלנדר מתחלפות במהירות שירס לשבור את רקמות, וכתוצאה מכך תא ירד הכדאיות. השיטה החדשה שלנו המתוארים כאן משלב קצר (20 דקות) עיכול אנזימטי בשילוב עם נדנדה מים באמבטיה בתנועות עדינות מתנהג במקום כוח מכני חלה על הרקמה. הפתרון עיכול אנזימטי נועד להגביר את הכדאיות תא ועם תשואה, המכיל collagenase (1) לעכל את מטריצה חוץ-תאית של הרקמה decidual; (2) מעכבי טריפסין סויה למניעת עיכול לא ספציפית בשל פעילות trypsinolytic הנותרים collagenase; (3) 1 DNase להסיר לתרשים דנ א (4) העובר שור סרום (FBS), חלבון אלבומין שור (BSA) כדי להגן על התאים מפני עיכול יתר. המגבלה העיקרית השנייה של מחקרים קודמים נמצא בעובדה כי basalis רותמי נאסף על ידי חיתוך השכבה העליונה של הצד האימהי של השליה אשר פוטנציאלי עלול לגרום זיהום trophoblastic. פרוטוקול חדש שלנו מבודד את רותמי parietalis על ידי גירוד בעדינות את רותמי off קרום עוברי (chorion) ומאפשרת הסרה קלה של זיהום chorion במהלך השלבים כביסה.
לכן, השיטה שלנו מאפשר בידוד מסובכת של תאים decidual הראשית שנאספו מתוך היפרדות הקרומים בתקופה קצרה של זמן (התהליך כולו לוקח כ- 3 שעות) וכתוצאה מכך תשואה גבוהה תא תא מעולה הכדאיות. ברגע תאים decidual היו מבודדים הם יכולים לשמש עבור מספר רב של ניסויים; למשל, התאים decidual העיקרי של האדם יכול להיות נזרע על coverslips לניתוח immunocytochemical, הם יכולים להיות גדלו בתרבות עבור טיפולים שונים, מניפולציות, כמו גם צבעונית ישירות לניתוח cytometry זרימה ססגוניות להעריך ההרכב של האדם רותמי סיבוכים בהריון, בניסיון להבין את התפקיד של אוכלוסיות תת תא שונים. בעוד השיטה המובאת כאן שימש כדי לבודד תאים מן המונח השליה (סוף השליש השלישי של ההיריון האנושי), פרוטוקול זה גם ניתן להתאים בקלות הראשון ואת השליה בשליש השני ומאפשר גמישות של השלב ההיריון מחקר זה הוא פונה.
בעבר פרוטוקולים שפורסמו השתמשו dissociations אוטומטי רקמת decidual בנפרד או עיכול אנזימטי לבד21,22. על ידי שילוב כוח מכני עדין (נדנדה תנורים ב 37 מעלות צלזיוס) כמו גם עיכול אנזימטי קוקטייל שנועד לייעל את מערכת העיכול והן תא הכדאיות, פרוטוקול שפורטו לעיל יוצר את האיזון האידיאלי בין התשואה תא ואת הכדאיות. בנוסף, הפרוטוקולים הקודמים נכשלו להזכיר התשואה בתא סכום המתקבל שלהם ומשום, רק נוכח תא הכדאיות אחוז19. הנה אנחנו מראים תשואה גבוהה של תאים decidual נקבע דרך התא לספור (הנע בין 10-20 מיליון לכל השליה). יתר על כן, רבים מהפרסומים הנוכחי להדגים את הבידוד של תאים decidual/רירית הרחם העיקרי של עכברים; פרוטוקול שלנו מאפשר הלימוד של רקמות אנושיות, טיוח זה מקור רלוונטי יותר ביולוגית של תאים עבור ניסויים23. פרוטוקול זה גם ניתן להתאים בקלות הראשון ונותנת השליה בשליש השני ומאפשר גמישות של השלב ההיריון. זה המחקר. ברגע התאים היו מבודדים, הם יכולים לשמש במגוון של טכניקות ניסיוני כגון immunocytochemistry, cytometry זרימה, חלבון ו RNA החילוץ, בידוד עוקבות של לויקוציטים, וכו ' בניסיון להבין את התפקיד של תאים שונים תת אוכלוסיות. זיהוי הבדלים בביטוי גנים וחלבונים ללימודי רותמי בין הריונות בריאים ומסובך (כגון עבודה רעלת או לידה מוקדמת) באמצעות PCR בזמן אמת או גנום רחב הקשורים עשוי לספק מטרות חדשניים אשר יוכלו לסייע לך התפתחות כלי האבחון והטיפול. בנוסף, שינויים יחס של תאים decidual, במיוחד לויקוציטים, אשר ניתן לזהות בקלות באמצעות cytometry זרימה עשויים גם כן לספק תשובות עבור האטיולוגיה של ההריון סיבוכים, כגון שינויים בשני ליקוציט יחסי subpopulation, כמו גם את מצב ההפעלה שלהם אשר הוכחו להיות מאופנן המונח והן צירי24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף
Acknowledgments
המחברים רוצה להודות התורמים, את BioBank RCWIH, ואת ביה ח הר סיני/UHN המחלקה למיילדות גינקולוגיה עבור דגימות האנושי השתמשו במחקר זה. ברצוננו להודות לחברים של המעבדה בורית, במיוחד ד ר קרוליין דאנק עזרה עם פיתוח השיטה. עבודה זו נתמכת על ידי הקרן ברוכים הבאים בורוז (גרנט #1013759).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hank’s balanced salt solution with calcium and magnesium | Prepared in facility (LTRI) | ||
| Hank’s balanced salt solution without calcium and magnesium | Prepared in facility (LTRI) | ||
| Diaper pads | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Large surgical scissors | AL Medical | 2018-12-20. | |
| Large surgical forceps | Fine Science Tools | 11000-18 | |
| Plastic disposable cell scraper (25 cm) | Sarstedt | 83.183 | |
| 250 mm (size 60 mesh) metal sieve | Sigma-Aldrich | S1020-5EA | |
| Disposable scalpel with plastic handle (#21) | Fisher Scientific | 08-927-5D | |
| Sterile plastic petri dish (diameter 10 cm) | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| Sterile specimen container (urine cup, 4.5 oz) | VWR | 25384-146 | |
| Nylon filter (70 mm) | VWR/Corning | 21008-952 | |
| Erythrocyte lysis buffer | Qiagen | 79217 | |
| Trypan blue, 0.4% solution | Lonza | 17-942E | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Hemocytometer | Reichert | 1490 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 culture media | Invitrogen | 11835-055 | |
| Fetal bovine serum | Wisent | 080-150 | |
| Normocin (50mg/ mL) | Invivogen | ant-nr-1 | |
| Plastic top filtration unit (0.22 mm membrane, 500 mL) | Millipore | SCGPT05RE | |
| Collagenase 2, lyophilized powder | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| Soy bean trypsin inhibitor, powder | Sigma-Aldrich | T9003-250mg | |
| DNase powder | Roche | 10104159001 | |
| Bovine serum albumin (BSA powder) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Spinning disc confocal microscope - Leica DMI 6000B | Leica | ||
| Imaging Flow cytometer - Image Stream MK2 | Amnis | ||
| IDEA software | Millipore Sigma | ||
| APC-conjugated Vimentin antibody | R&D Systems | IC2105A | |
| APC H7-conjugated CD45 antibody | BD | 641399 | |
| FITC-conjugated Cytokeratin antibody | MACs Miltenyi Biotec | 130-080-101 | |
| PerCP -conjugated Cytokeratin 7 antibody | Novus | NBP2-47941PCP | |
| eFluor450 Fixable Viability dye | Thermo Fisher Scientific | 65-0863-14 | |
| Vimentin primary antibody | Santa Cruz | sc-7558 | |
| CD45 primary antibody | Dako | M0701 | |
| Cytokeratin primary antibody | Dako | M0821 | |
| Cytokeratin 7 primary antibody | Dako | M7018 | |
| Mouse IgG | Santa Cruz | sc-2025 | |
| Goat IgG | Santa Cruz | sc-2028 | |
| Alexa Fluor 546 secondary antibody | Invitrogen | A10036 | |
| Alexa Fluor 594 secondary antibody | Fisher Scientific | A-11058 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 |
References
- Brosens, N., Hayashi, N., White, J. O. Progesterone receptor regulates decidual prolactin expression in differentiating human endometrial stromal cells. Endocrinology. 140, 4809-4820 (1999).
- Bell, S. C., D'Arcangues, C., Frase, I. S., Newton, J. R., Odlind, V. Decidualization and relevance to menstruation. , Cambridge University press. 187-212 (1990).
- Kariya, M. Interleukin-1 inhibits in vitro decidualization of human endometrial stromal cells. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 73, 1170-1174 (1991).
- Dimitriadis, E., Robb, L., Salamonsen, L. A. Interleukin 11 advances progesterone-induced decidualization of human endometrial stromal cells. Molecular and Human Reproduction. 8, 636-643 (2002).
- Wu, W. -X., Brooks, J., Glasier, A. F., McNeilly, A. S. The relationship between decidualization and prolactin mRNA and production at different stages of human pregnancy. Society for Endocrinology. 14, 255-261 (1995).
- Bell, S. C. Synthesis and secretion of protein by the endometrium and decidua. Implantation: Biology and Clinical Aspects. , 95-118 (1988).
- Croy, B. A., Chantakru, S., Esadeg, S., Ashkar, A. A., Wei, Q. Decidual natural killer cells: key regulators of placental development. Journal of Reproductive Immunology. 57, 151-168 (2002).
- Smarason, A. K., Gunnarsson, A., Alfredsson, J. H., Valdimarsson, H. Monocytosis and monocytic infiltration of decidua in early pregnancy. Journal of Clinical and Laboratory Immunology. 21, 1-5 (1986).
- Daiter, E., Pampfer, S., Yeung, Y. G., Barad, D., Stanley, E. R., Pollard, J. W. Expression of colony- stimulating factor-1 in the human uterus and placenta. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 74, 850-858 (1992).
- Casey, M. L., Cox, S. M., Beutler, B., Milewich, L., MacDonald, P. C. Cachectin/tumor necrosis factor-alpha formation in human decidua. Potential role of cytokines in infection-induced preterm labor. Journal of Clinical Investigation. 83, 430-436 (1989).
- Lala, P. K., Kennedy, T. G., Parhar, R. S. Suppression of lymphocyte alloreactivity by early gestational human decidua. II. Characterization of the suppressor mechanisms. Cellular Immunology. 127, 368-381 (1988).
- Shynlova, O., Nedd-Roderique, T., Li, Y., Dorogin, A., Nguyen, T., Lye, S. J. Infiltration of myeloid cells into decidua is a critical early event in the labour cascade and post-partum uterine remodelling. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17, 311-324 (2013).
- Osman, I., Young, A., Ledingham, M. A., Thomson, A. J., Jordan, F., Greer, I. A., Norman, J. E. Leukocyte density and pro-inflammatory cytokine expression in human fetal membranes, decidua, cervix and myometrium before and during labour at term. Molecular Human Reproduction. 9, 41-45 (2003).
- Farine, T., Lye, S. J., Shynlova, O. Peripheral maternal leukocytes are activated in response to cytokines secreted by uterine tissues of pregnant women. Journal of Cellular and Molecular Immunology. 14, 635-638 (2017).
- Hamilton, S., et al. Macrophages infiltrate the human and rat decidua during term and preterm labor: evidence that decidual inflammation precedes labor. Biology of Reproduction. 86, 39 (2011).
- Casey, M. L., Cox, S. M., Word, A., Macdonald, P. C. Cytokines and infection-induced preterm labour. Reprodution Fertility and Development. 2, 499-510 (1990).
- Yellon, S. M., Mackler, A. M., Kirby, M. A. The role of leukocyte traffic and activation in parturition. Journal of the Society for Gynecologic Investigation. 10, 323-338 (2003).
- Gomez-Lopez, N., StLouis, D., Lehr, M. S., Sanchez-Rodriguez, E. N., Arenas-Hernandez, M. Immune cells in term and preterm labor. Cellular & Molecular Immunology. 11, 571-581 (2014).
- Xu, Y., Plazyo, O., Romero, R., Hassan, S. S., Gomez-Lopez, N. Isolation of leukocytes from the human maternal-fetal interface. Journal of Visualized Experiments. 99, (2015).
- Trundley, T., Gardner, L., Northfield, J., Moffett, A. Methods for isolation of cells from the human fetal-maternal interface. Methods in Molecular Medicine. 122, 109-122 (2006).
- Jividen, K., Movassagh, M. J., Jazaeri, A., Li, H. Two methods for establishing primary human endometrial stromal cells from hysterectomy specimens. Journal of Visualized experiments. 87, (2014).
- Pelekanos, R. A., Sardesai, V. S., Futrega, K., Lott, W. B., Kuhn, M., Doran, M. R. Isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells derived from human placenta tissue. Journal of Visualized experiments. 112, (2016).
- De Clercq, K., Hennes, A., Vrien, J. Isolation of mouse endometrial epithelial and stromal cells for in vitro decidualization. Journal of Visualized Experiments. 121, (2017).
- Zhang, J., Shynlova, O., Sabras, S., Bang, A., Briollais, L., Lye, S. J. Immunophenotyping and activation status of maternal and peripheral blood leukocytes during pregnancy and labour, both term and preterm. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 10, 2386-2402 (2017).
