Summary
Detta protokoll visar en metod för isolering av primära mänskliga decidual celler som samlats in från fostrets hinnor av termen efterbörd som kan användas för en mängd applikationer (dvs immuncytokemi, flödescytometri, etc.) som syftar att studera olika cellpopulationer i graviditetskomplikationer roll.
Abstract
Decidua, även känd som gravid endometriet, är ett kritiskt viktiga reproduktiva vävnad. Decidual celler, består huvudsakligen av decidualized stromaceller och immunceller, är ansvariga för utsöndringen av hormonella och inflammatoriska faktorer som är avgörande för framgångsrik blastocysten implantation, placenta utveckling och spela en roll i den initiering av arbete på sikt och prematura. Många komplikationer kan uppstå störningar i en fin balans av olika cellpopulationer bestående av decidua. Förändringar i andelen särskilda decidual celltyper kan störa dessa avgörande processer och öka risken för att utveckla allvarliga komplikationer av graviditet, embryo implantation misslyckande, intrauterin tillväxt begränsning, preeklampsi och prematura labor. Protokollet beskrivs här visar en kostnad och tid effektiv metod för isolering av primära mänskliga decidual celler som samlats in från fostrets hinnor av termen efterbörd. Genom att kombinera enzymatisk nedbrytning och skonsam mekaniska störningar av decidual vävnad, erhölls en hög avkastning av decidual celler med praktiskt taget ingen chorion förorening. Ännu viktigare, isolerade decidual celler präglades (stromaceller (55-60%), leukocyter (35%), epitelial (1%) eller trofoblaster (0,01%) celler) och underhålls hög lönsamhet (80%) vilket bekräftades av multicolor imaging flöde flödescytometri assay. Detta protokoll är specifik för den decidua parietalis och kan anpassas till första och andra trimestern efterbörd. När isolerade, kan decidual celler användas för en mängd experimentella program som syftar till att förstå rollen som olika decidual cell subpopulationer i graviditetskomplikationer.
Introduction
Endometriet, en av de mest aktiva vuxna kvinnliga vävnaderna, genomgår dramatiska remodeling varje menstruationscykel som svar på stimulering av äggstockshormoner, östrogen (E2) och progesteron (P4). Decidua, även känd som gravid endometriet, är ett kritiskt viktiga reproduktiva vävnad som bildas i slutet av fasen postovulatory till följd av P4-driven differentiering efter E2-dominerande proliferativa fas. Decidual celler är ansvariga för utsöndringen av hormonella faktorer för framgångsrik blastocysten implantation och för utveckling av utero-placenta-gränssnittet för att upprätthålla maternell tolerans mot den fetala transplantatavstötning.
Decidualization krävs för implantation och efterföljande omdaning av decidual spiral artärerna. Livmodercancer stromaceller genomgå decidualization, under kontroll av P4 och läger, under sena lutealfas av menstruationscykeln1. Denna process initieras runt blodkärl och sprider sig i hela stroma, föreslår dess roll i kärlsystemet remodeling och leukocyt människohandel förordning. Denna cellulära omvandling kännetecknas av en cirkulär morfologi, ökad kärnkraft storlek och utbyggnad av grov endoplasmatiska retiklet och Golgi apparaturen2. Decidualized stromaceller kan producera parakrin faktorer som stöder blastocysten implantation och kännetecknas av utsöndringen av ett flertal hormoner (dvs prolaktin), tillväxt angiogena, insulin tillväxtfaktor bindande protein-1 (IGFBP-1), prostaglandin (PG) E (stimulator av intracellulära cAMP), cytokiner, extracellulär matrix komponenter och näringsämnen som är väsentliga för placenta implantation och utveckling3,4,5,6 .
Decidual cell befolkningen består inte enbart av decidualized stromaceller men innehåller också stora, graviditet-specifika decidual leukocyt populationer. Decidualization innebär övergående lokaliserade ödem och tillströmningen av Natural killer (NK) celler, T-celler, dendritiska celler och makrofager. Den största leukocyt subpopulationen är livmoderns NK-celler, som omfattar cirka 50-70% av alla mödrars leukocyter infiltrera de decidua som är en källa av cytokiner och angiogena faktorer som får stöd i processen decidualization och öka i antal under hela graviditeten7. Makrofager, är den näst största subpopulationen av immunceller, finns runt implanteringsstället och öka under graviditeten8. De är en källa av cytokiner och tillväxt faktorer såsom kolonistimulerande faktor (CSF-1)9, tumörnekrosfaktor α (TNFα)10 och prostaglandin (PG) E11.
Under hela graviditeten, och innan termen förlossningen är decidua en stor källa av cytokiner och chemokiner ansvarar för maternell perifera leukocyter aktivering och efterföljande migration in i livmoderns vävnaderna att inleda arbete. Djurstudier visade att många pro-inflammatoriska cytokiner är uppreglerat i mus decidua under förlossningen, såsom TNF-a, IL-6, IL-12 och IL-1b12. I den mänskliga decidua uppvisar pro-inflammatoriska cytokiner IL-1b, IL-6 och IL-8 (stora neutrofila korrektiv) högre uttryck under förlossningen jämfört inte i labor13. Dessa utsöndras cytokiner leder till en aktivering och tillströmningen av leukocyter i den decidual vävnader14; en ökning av decidual makrofag och neutrofil infiltration i både mänskliga och råtta ses under benämna arbete, med decidual infiltration föregår myometrium 4-fold större, vilket indikerar en kaskad av aktivering mellan denna två intilliggande uterin vävnader 15. dessa infiltrera leukocyter producerar PGs kan aktivera synkron sammandragningar av myometriet16, matrix metalloproteinaser (MMP) att inleda membran brista17,18, samt Pro-inflammatoriska cytokiner att förstärka uterin aktiveringsprocessen ('cytokin storm').
På grund av många viktiga funktioner i decidual celler, som spelar en avgörande roll i implantationsprocessen, upprätthålla mödra-fetal tolerans i tidig dräktighet och deltar i aktiveringen av arbetskraft på sikt, kan olika sjukdomar uppstå under graviditet. Till exempel kan (1) infertilitet på grund av återkommande implantation misslyckande och återkommande missfall resultera i ett misslyckande av decidual mognad; (2) intrauterin tillväxt begränsning (Genanalys) och havandeskapsförgiftning på grund av felaktig utveckling och dysfunktion av decidua/moderkakan eller komprometterad vaskulär omvandling vid decidual-myometrium korsningen; samt (3) prematur förlossning vilket kan resultera från tidig decidual aktivering.
Mot bakgrund av dessa stora störningar, tillsammans med de etiska och praktiska begränsningarna av mänskliga i vivo studier, om inrättande av primära mänskliga decidual cellinjer är viktigt för in vitro- analys med syfte att bättre förstå och att förbättra klinisk behandling av komplikationer under graviditeten. Därför var syftet med vår forskning att utveckla ett protokoll som möjliggör för isolering av mänskliga primära decidual celler med hög cell avkastning och lönsamhet som samlats in från fostrets hinnor av termen efterbörd. Här aktuella protokollet tydligt beskriver en tid - och cost effective metod för isolering av specifika subtyper av decidual celler som ska användas för en mängd olika in vitro- analyser. Karakterisering av överflödet och fenotyp av decidual delpopulation på sikt och jämförelse till första och andra trimestern är avgörande för att definiera deras roller i hela mänskliga dräktigheten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Efterbörd samlas från friska sikt, inte i labor kvinnor som genomgår elektiv cesarean avsnitt. Insamling, bearbetning, och disponibel mänskliga prover följa riktlinjerna i Mount Sinai Hospital etikprövningsnämnd. Ett skriftligt samtycke från varje patient. Denna studie är godkänt av etikprövningsnämnd forskning vid Mount Sinai Hospital.
1. förberedelser
Obs: Alla åtgärder måste genomföras under en spiskåpa och alla kirurgiska utrustning måste steriliseras via autoklav innan placering i dragskåp. Alla andra material (flaskor, 50 mL rör, etc.) måste steriliseras med 70% etanol-lösning. Alltid Använd personlig skyddsutrustning vid alla tillfällen när du arbetar med biologiskt farligt avfall (labbrock, handskar, långt hår bunden tillbaka, etc.).
-
Enzymatisk nedbrytning lösning (slutlig lösning: 200 mL)
- Överför med pipett 180 mL HBSS-/ - till en 500 mL-bägare, tillsätt sterila omrörning magnet och placera på omrörning plattan vid rumstemperatur.
- Väg in och Lägg till följande HBSS-/-lösningen långsamt och sekventiellt: 20 mL av FBS, 400 mg kollagenas 2 ([slutlig] = 2 mg/mL), 20 mg Soy bean trypsin hämmare ([slutlig] = 0,1 mg/mL), 30 mg DNAS 1 ([slutlig] = 0,15 mg/mL), och 200 mg BSA ([slutlig] = 1 mg/mL)
- Inställd omrörningen på medellång hastighet och låt blandningen, rör om 10-20 minuter (omslag med tenn folie eller paraffin film under omrörning).
- Häll den blanda lösningen i en 250 mL glasflaska med hjälp av en plast tratt och placera i spiskåpa.
- Låt lösningen rinna genom en plast topp filtrering enhet (0,22 μm membranfilter, 500 mL), alikvotens 20 mL i 50 mL rör (10 rör totalt) och förvaras vid-20 ° C fram till användning.
-
RPMI 1640 Media (2% lösning och 10% komplett odlingsmedium)
- Kombinera RPMI 1640 och FBS i en glasflaska i dragskåp.
- För 2% FBS lösning, kombinera 490 mL RPMI 1640 och 10 mL FBS.
- För 10% FBS lösning, kombinera 450 mL RPMI 1640 och 50 mL FBS.
- Pipettera över 500 μL av normocin till 500 mL glasflaska från föregående steg som innehåller RPMI media och FBS (50 mg/mL lager, 0,05 mg/mL arbetande koncentration).
- Passera media genom ett 0,22 μm membranfilter och store i en 500 mL glasflaska vid 4 ° C fram till användning.
- 30 min före start experimentet, en 20 mL alikvot av frysta enzymatisk nedbrytning lösning i ett 37 ° C pärla bad, plats 2% FBS och 10% FBS RPMI 1640 media i ett 37 ° C pärla bad, slå på gungande vattenbad och Ställ till 37 ° C , 2 g, och sätta en kontrollerad temperatur centrifug till 4 ° C.
2. insamling av Decidual vävnad från termen placenta-membranet
- Placera flaskor med HBSS +/ +, HBSS-/- och fem 50 mL rör i ett rack under spiskåpa. Pipettera 25 mL HBSS +/ + i en tub.
-
Med handskar på händerna, ta termen moderkakan ut från den behållare som används för att transportera den från teatern operationssalen. Placera placenta på blöjan pad (moderns sida upp) och sprida fostrets membranen ut med sax och pincett.
- Låg överlappande blöja pads på till dragskåp.
- Använd en separat blöja för att vända moderkakan så på moderns sida är vänd uppåt.
- Hitta punkten av membran bristning och göra snitt så att membranet att veckla upp och ligga platt på den fumehood ytan.
Obs: När membranet dras tillbaka från moderkakan, decidua blir ansikte upp vilar på chorion lagret, med det amnionen lagret på baksidan.
- Försiktigt använda en plast cell skrapa, skrapa decidual vävnaden utanför chorion och plats i en 50 mL tub som innehåller 25 mL HBSS +/ +.
- Skrapa membranet med måttligt tryck. Applicera inte för mycket tryck eftersom det kan resultera i chorion kontaminering. Samla in små blodproppar liksom, dessa innehåller vissa decidual celler.
Varning: Efter decidual samling, moderkakan måste förpackas i en biohazard plast bin och frysta i-20 ° C frys före lämpligt bortskaffande (enligt din institutionella regler). Blodiga blöja kuddar måste vara insvept i en seal-tight plastpåse och bortskaffas i biohazard safetybox.
3. tvätt- och enzymatisk nedbrytning av Decidual vävnad
- Tvätta de insamlade vävnaderna genom att försiktigt skaka 50 mL röret för hand och passering genom en 250 μm metall sikten (250 μm, storlek 60 mesh) vilar över ett sterilt exemplar (urin) container.
- Upprepa tvätten två gånger med HBSS +/ + och två gånger med HBSS-/ - i färska rör för varje tvätt. (slutlig tvättar med HBSS-/-möjliggör avlägsnande av kalcium och magnesium i HBSS +/ +, som annars skulle störa följande enzymatisk nedbrytning process).
OBSERVERA. Under tvätt steg skall chorion vävnad kontaminering framgå som decidual vävnaden är ljus rosa i färg och amorft, medan chorion är vit, tät och trådiga. Därför kan chorion kontaminering tas enkelt bort med pincett. - Alternativt, om decidual vävnaden är tjock, överföra den till en steril 10 cm diameter petriskål och vidare till färs av vävnad med två motsatta skalpeller i skålen.
-
Placera den tvättade vävnaden i sterila 50 mL tub innehållande 100 mg vävnad/mL enzymatisk nedbrytning lösning (se preparat).
- Som en referenspunkt, se till att nivån av decidual vävnad når 5-10 mL märket på 50 mL röret.
- Använda ca 20 mL av enzymatisk nedbrytning lösningen (förberedd i steg 1.1) att smälta den totala decidua som samlats in från hela terminen fostrets membran.
- Förslut locket på röret med paraffin filma (tätning röret tätt och Linda paraffin filma runt locket och toppen av tuben) under kulturen huva och inkubera vid 37 ° C i 20 min i en skakande vattenbad (145 rpm decidual vävnad 2 g).
- Efter inkubation, bort paraffin filma och sterilisera ytan av röret som innehåller smält vävnad med 70% etanol och föra under spiskåpa. Skaka tuben kort för hand.
- Samla in cellsuspension genom metall sikten (250 μm, storlek 60 mesh) i en ny sterila exemplar behållare. Späd med en lika stor volym (20 mL) RPMI + 10% FBS som innehåller 0,1% normocin för att stoppa enzymatisk reaktion. Gå direkt till centrifugeringssteget 4.1.
- Vid behov, placera den återstående osmälta vävnaden tillbaka i en ny 50 mL tub med 20 mL färsk enzymatisk nedbrytning och upprepa matsmältningen (20 min, 37 ° C, skaka vattenbad).
- Om en andra matsmältning är nödvändigt, placera första röret med cellsuspension på is (omslag med paraffin film att hålla steril). Upprepa steg 3.5-3.6 och kombinera de två celler suspensioner.
4. generera en enda cellsuspension
- Centrifugera cellsuspensionen (420 g, 4 ° C, 11 min).
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i 40 mL RPMI + 2% FBS som innehåller 0,1% normocin (”tvättbuffert”).
Obs: Cellpelleten kommer att vara lös och geléartad på grund av röda blodkroppar kontaminering, Aspirera supernatanten med försiktighet. Borttagning av den övre fasen med en manuell pipett kan krävas. - Upprepa centrifugeringen vid 420 g vid 4 ° C för 11 min.
- Noggrant avlägsna supernatanten (som nämns i anmärkning steg 4,2) och återsuspendera cellpelleten i 5 mL av tvättlösning och tillsätt 35 mL erytrocyt lyseringsbuffert i samma rör.
Obs: Om pelleten är stor eller mycket blodigt, det kan delas in i två rör för erytrocyt lysis steg genom att tillsätta 10 mL tvättbuffert och att dela lika in två rören och sedan lägga 35 mL erytrocyt lyseringsbuffert till varje rör. - Inkubera på is för 20 min. kort vortex rör i början och slutet av inkubering att lysera röda blodkroppar.
- Centrifugera vid 420 g i 11 minuter vid 4 ° C.
- Försiktigt, avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 40 mL av tvättbuffert.
- Passera cellerna genom en 70 μm nylon filter ta bort cell klumpar.
- Centrifugera vid 420 g under 11 minuter vid 4 ° C.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 10 mL av komplett medium (RPMI 10% + FBS som innehåller 0,1% normocin).
-
Räkna celler med hjälp av trypan blå dye-utslagning hemocytometer proceduren som beskrivs nedan:
- Under kultur huven Pipettera försiktigt cellsuspension upp och ner 3 x för att kunna blanda innan kombinera med trypan blå. I en 1,5 mL tub Förbered cellsuspension, utspädd 1:2 (kombinera 20 μL av trypan blå lösning) och 20 μL av decidual cellsuspension. Blanda omsorgsfullt trypan blå-cell lösning av pipettering upp och ner ett par gånger (denna lösning inte är steril).
- Placera hemocytometer på scenen av mikroskopet med täckglas på toppen.
Obs: Hemocytometer är ett objektglas med galler på den för att ge nio stora rutor dividerat med tredubbla rader. Varje Reichsstrasse har en yta på 1 mm2och djupet av vätska i kammaren är 0,1 mm. Volymen av vätska som kan fylla varje Reichsstrasse är därför 1 mm * 1 mm * 0,1 mm = 0.1 mm3= 10-4 mL. - Långsamt tillsätt 10 μL av trypan blå-cell blandningen in i spåret av den hemocytometer, att låta kapillärkraft att skingra cell blandningen över hela bilden (stopp innan blandningen fyller bra).
- Visa cellerna i Mikroskop (vid 10 X förstoring) och räkna alla vit/grön celler som utesluter trypan blå (dessa är de viabla cellerna) i fyra stora yttre kvadraterna av hemocytometer. När räknar celler som berör linjen, räkna bara de att touch höger och övre linjer men inte de röra vänster och nedre rader. Räknas inte mörka blå celler; blå färg indikerar att cellen är död som trypan blått färgämne kan lätt tränga in genom plasmamembranet i cytoplasman.
- Att beräkna antalet livskraftiga celler i 1 mL cellsuspension (X):
2 = utspädningsfaktor
10 000 = omvandlingsfaktor (1 mL = 1 cm3 = 10, 000 * 0,1 mm3)
- Späd decidual celler önskvärd koncentration i RPMI + 10% FBS (odlingsmedium).
Obs: För vävnadsodling plätering, Pipettera 2 * 106 celler per brunn i en plastplatta 6-well, 10 * 106 celler till en 10-cm plast platta eller 75 000 celler till ett täckglas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att validera den effektiviteten och genomförbarheten av de isolera cellerna, de präglades av två metoder: flöda flödescytometri och immuncytokemi (ICC). 4 cellpopulationer riktade; decidualized stromaceller upptäcktes av anti-vimentin antikroppen, pan-leukocyt markör CD45 användes för att identifiera decidual immunceller, cytokeratin användes för att upptäcka epitelial/endotelceller och slutligen cytokeratin 7 användes för att upptäcka någon potentiella trofoblaster (chorion eller placenta) kontaminering.
För karakterisering av multicolor imaging flödescytometri, var nymalen isolerade decidual celler målat med ett fastställbara färgämne att bestämma cellulära livskraft. Cellerna var permeabilized och fast, följt av färgning med fluorokrom-konjugerad monoklonal musantikroppar inriktning vimentin-APC, CD45-APC-H7, cytokeratin-FITC och cytokeratin 7-PerCP. Antikropp information finns i Tabellen för material. Fasta och färgade celler var lagras vid 4 ° C över natten i färgning buffert för att förhindra dissociation av tandem färgämne och kör följande dag på den Image stream MK2 imaging flödescytometer. Analysen utfördes med hjälp av en programvara. Cellfragment och aggregat har undantagits av seriell gating med tre sekventiella funktion/mask kombinationer (figur 1A-B). Fluorescens Minus en (FMO) Usenets kontroller användes för att identifiera positiva decidual cellpopulationer och enda fläcken celler användes för ersättning (figur 2). Slutliga dot tomter visar positivt färgade cellen befolkningen av de fyra markörerna (figur 2) och 80% (figur 1 c) cellulär livskraft. Representativa bilder av positivt färgade celler kan ses i figur 1 d. Med den här metoden, fann vi att befolkningen huvudsakligen består av stromaceller (55-60%), leukocyter (35%), epitelial (1%) eller trofoblaster (0,01%) celler (figur 1E). Experimentet upprepades tre gånger. Dessa resultat verifierar renhet (frånvaron av trofoblaster kontamination från chorion) och hög lönsamhet av primära mänskliga decidual celler samlas in och isoleras från fostrets hinnor av termen efterbörd.
I en separat ICC experiment seedade nymalen isolerade decidual celler på glas coverslips (75 000 celler/täckglas), tillåtet att fästa och förblev i kultur i 48 timmar. Media har ändrats efter 24 timmar att ta bort grupplösa döda celler. Cellerna var sedan fast med 50% aceton - 50% metanol, permeabilized med 0,02% icke-jonisk tensid och ospecifik bindning blockerades med blockering lösning. Cellerna var sedan färgas med musen monoklonala antikroppar: anti-CD45 (pan-leukocyt markör), anti-cytokeratin (epitelceller markör) och anti-cytokeratin 7 (trofoblaster markör), och get polyklonala anti-vimentin antikropp (stromaceller cell markör). Åsnan anti get och åsna antimus användes som sekundära antikroppar. DAPI användes för att färga atomkärnor. Mus IgG, get IgG och sekundära antikroppar enbart användes som negativa och specificitet kontroller. Bilder togs på 20 X förstoring på en snurrande skiva confocal Mikroskop. Antikroppar som används anges i Tabell för material och representativa bilder presenteras i figur 3. Vår visuella observation visar att majoriteten av bifogade primära decidual celler är vimentin-positiv stromaceller (ca 95%), med ett litet antal leukocyter (ca 1-2%), epitelial (ca 1%) och trofoblaster cellpopulationer (enstaka celler var upptäcks redovisning för < 0,01% av alla). Den stora skillnaden mellan flöde flödescytometrisk och ICC resultat är minskningen i CD45 positiva leukocyter befolkningen upptäcks av flödescytometri. Denna skillnad kan förklaras av de metoder som de två experiment utfördes: i flödet flödescytometri analysen, var isolerade decidual celler behandlas omedelbart och färgade, vilket innebär leukocyt befolkningen ingick i analysen. Med ICC, var den totala decidual cellsuspensionen Pläter och odlade under 48 timmar i media som var mestadels att stödja fastsättning av stromal och epitelial celler, men inte immunceller. Efter 24 h togs de immunceller som inte fästes bort under media förändring, står för skillnaden i resultat som presenteras av dessa två metoder. Vi slutsatsen att för att studera leukocyt subpopulationer i mänskliga decidua från komplicerade graviditeter special försiktighet bör användas för att undvika oavsiktlig avskaffande av leukocyter befolkningen.
Figur 1: Gating strategi för decidual cell befolkningen diskriminering. (A) nyligen isolerade fast decidual celler var ursprungligen gated Uteslut cell midjekort jacka, och (B) därefter gated med tre sekventiella funktion/mask kombinationer för att utesluta cellfragment. (C) levande celler (rosa gate, 80% av befolkningen) var åtskilt från döda celler (blå porten, 20% av befolkningen) använder ett fastställbara livskraft färgämne. (D) representativa bilder av decidual celler fläckade livskraft markör och fyra lysrör-konjugerade antikroppar (Ab) (vimentin-APC, CD45-APC-H7, cytokeratin-FITC och cytokeratin 7-PerCP). Prickade skalstapeln motsvarar 7 μm. (E) när en skräp-fri, levande cell befolkningen var beslutsamt, användes dessa markörer att bestämma procentsatserna för varje celltyp inom decidual cell befolkningen. För siffror 1B och 1 Crepresenterar varje prick en decidual cell. För figurerna 1A och 1 Cskildrar färgintervallet av dot tomterna cell densiteten, med röda betecknar mycket täta celler och blå mindre täta celler. Data som presenteras här är representant för 3 biologiska replikat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Representativeflow flödescytometrisk analys av primära mänskliga decidual celler med FMO gating tomter. Representativa färg dot tomter av celler isolerade från termen decidua och färgas med (A) vimentin-APC (stromaceller cell markör), (B) CD45-APC-H7 (leukocyt markör), (C) cytokeratin-FITC (epitelceller markör) och (D) cytokeratin 7-PerCP (trofoblaster markör) tillsammans med varje respektive FMO-kontroll. Lysrör-Minus-One (FMO) kontroller, rör som innehåller fullständiga antikroppen cocktail minus markören i fråga och förberedda identiskt till fullt färgade experimentella provet, användes under flöde flödescytometri dataanalys för att bestämma sant positiva decidual cellpopulationer. FMO kontroller visar den relativa bakgrunden och möjliggör korrekt gating sant positiva signaler. Data som presenteras här är representant för 3 biologiska replikat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: representant Immunocytochemical analys av primära decidual människaceller. Primära mänskliga decidual celler odlades på glas coverslips för 48 h, med media ändringar efter 24 h. celler var fast med aceton-metanol och färgas med monoklonal mus anti-CD45 (leukocyt markör), anti-cytokeratin (epitelceller markör) och anti-cytokeratin 7 (trofoblaster markör) antikroppar, och get polyklonala anti-vimentin antikropp (stromaceller cell markör). Representativa bilder Visa (A) vimentin-positiv fibroblaster (sekundär Abs: åsna anti get), (B) CD45 + leukocyter (sekundär Abs: åsna antimus), (C) cytokeratin positiva epitelceller (sekundära Abs: åsna anti-mus) och (D) cytokeratin 7-positiv trofoblaster celler (sekundär Abs: åsna antimus) var upptäckta (röda färgning). DAPI färgning användes för att färga atomkärnor av celler (blå färgning). Icke-specifika mus och geten IgG (M IgG och IgG-G) användes som negativa kontroller, utelämna primära Abs användes som sekundära antikroppar kontroller (M 2nd endast och G 2nd endast). Bilderna är tagna i 20 X förstoring på DMI snurrande skiva confocal Mikroskop. Skala barer = 32 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet beskrivs här visar en kostnad och tid effektiv metod för att isolera primära decidual celler som samlats in från fostrets membranen i hela den mänskliga termen efterbörd som är mycket tillgängliga och okomplicerad. Framgången med detta protokoll är beroende av två kritiska faktorer, (1) effektiviteten i decidual skrapa från chorion lagret av fostrets membran och (2) vård som hanteras de decidual cellerna i hela protokollet. Det är viktigt att chorion vävnad kontaminering kontrolleras genom att säkerställa att ingen av misstag ingår under decidual skrapning och genom att identifiera och ta bort all kontaminering under tvätt stegen (skillnaden i decidua och chorion morfologi möjliggör enkel borttagning av chorion som kan samlas in av misstag med decidua). Decidual celler är bräcklig därför snabba och täta pipettering kan resultera i minskad lönsamhet. Vi föreslår sedan att inställningen pipett ejektor hastighet bör ligga kvar på långsam och minimal pipettering bör användas vid blandning celler.
Ett sätt som förhindrar detta protokoll trofoblaster kontaminering genom att enbart samla decidua från fostrets membranen av moderkakan (som omfattar de decidua parietalis), exklusive insamling av den decidua basalis vilket görs genom att ta biopsier från moderns sida av moderkakan. Därför, medan våra nuvarande protokollet förbättrar renhet av decidual cell befolkningen vi isolera, man utesluter en del av den decidua (dvs decidua basalis) som kan innebära som en begränsning för forskning riktar sig denna del av decidua eller när båda delar av decidua krävs. Detta undantag omfattar den största begränsningen av denna studie. Dessutom samtidigt isolera decidual celler från mänskliga patienter ger en mer biologiskt relevant insikt i decidual och graviditet forskning, mindre manipulation och färre tidsperioder kan studeras jämfört med gnagare-baserade studier på grund av etiska skäl.
I hela detta protokoll, det finns steg som kan bevisa för att skapa svårigheter, och om inte ordentligt mildras maj påverkar cellen avkastning och lönsamhet. För att kringgå detta, kan modifikationer behöva göras. De mest kritiska är att se till att den decidual skrapa bort av fostrets membranen är tillräcklig (steg 2,4); på grund av mänsklig föränderlighet, kan varje moderkakan vara olika när det gäller mängden decidual vävnad, vävnad konsekvens och nivå av vävnad torrhet. Det är viktigt att modulera en skrapning för att säkerställa att endast decidua tas bort. Om decidua och membran är torr, vara PBS-/-kan hälls på membranen som möjliggör enklare skrapning. Det andra steget är erytrocyt lys av decidual cellsuspensionen (steg 3,4). Som nämnts, om cellpelleten är mycket stor och innehåller en hög mängd blod, kan pelleten delas in i två rör att förbättra effektiviteten i den lyseringslösning. Om det fortfarande finns röda blodkroppar efter detta steg kan det finnas ett behov av att dela upp pelleten i mer rör för maximal effektivitet.
Även olika decidual isolering protokoll från termen moderkakan och isolering av livmodercancer cellen från icke gravida kvinnor som genomgår hysterektomi har funnits tidigare publicerade18,19, behandlar dessa metoder inte olika begränsningar, såsom låg cellernas viabilitet och intilliggande vävnad kontaminering. Vi ansåg dessa ramarna när du utformar protokollet presenteras här, vilket leder till större cell kapacitet, ökad lönsamhet och minskad risk för kontaminering från omgivande vävnader. Automatiska dissociations har tidigare använts för att mekaniskt bryta ner de decidual vävnad19,20. Denna metod är relativt hård eftersom det innehåller en kraftig mekanisk dissociation där decidual vävnaden samlas i en tub, infogas i maskinen som fungerar på samma sätt till en mixer genom att snabbt vrida saxen att bryta ner vävnad, vilket resulterar i minskad cellernas viabilitet. Vår nya metod som beskrivs här kombinerar en kort (20 minuter) enzymatisk nedbrytning kombinerat med mjuka gungande vatten bad rörelser agerar i stället för mekanisk kraft vävnaden. Enzymatisk nedbrytning lösningen är utformad för att öka cellernas viabilitet och avkastning, som innehåller (1) kollagenas att smälta den extracellular matrisen av decidual vävnad; (2) en sojabönor trypsin hämmare att förhindra icke-specifik nedbrytning på grund av en återstående trypsinolytic aktivitet av kollagenas; (3) DNAS 1 ta bort friflytande DNA (4) fetalt bovint serum (FBS) och bovint serumalbumin (BSA) protein för att skydda celler från över matsmältningen. Den andra stora begränsningen av tidigare studier är bosatt i faktumet att den decidua basalis samlades in genom att klippa det övre lagret av moderns sida av moderkakan som potentiellt kan resultera i trofoblastisk kontaminering. Vår nya protokollet isolerar den decidua parietalis genom att försiktigt skrapa decidua av fostrets membranet (chorion) och möjliggör enkel borttagning av chorion kontaminering under tvätt stegen.
Därför vår metod möjliggör en okomplicerad isolering av primära decidual celler insamlade från placenta-membranet i en kort tidsperiod (hela processen tar cirka 3 timmar) vilket resulterar i hög cell avkastning och utmärkta cellernas viabilitet. När decidual celler har isolerats kan de användas för en mängd experiment; till exempel mänskliga primära decidual celler kan vara seedad på coverslips för immunocytochemical analys, de kan vara odlas i kultur för olika behandlingar och manipulationer, samt direkt färgas för multicolor Flödesanalys för flödescytometri att bedöma den sammansättningen av mänskliga decidua med graviditetskomplikationer i försök att förstå rollen av annan cell delpopulationer. Medan metoden presenteras här användes för att isolera cellerna från termen moderkakan (i slutet av tredje trimestern mänskliga graviditetsveckan), kan detta protokoll också enkelt anpassas till först och andra trimestern moderkakan möjliggör flexibilitet av dräktigheten scenen att ens forskning behandlar.
Tidigare har publicerade protokoll använt automatisk dissociations för att bryta isär decidual vävnad eller enzymatisk nedbrytning ensam21,22. Genom att kombinera en mild mekanisk kraft (gunga vattenbad vid 37 ° C) samt en enzymatisk nedbrytning cocktail utformat för att optimera både matsmältningen och cellernas viabilitet, skapar protokollet ovan den perfekta balansen mellan cell avkastning och lönsamhet. Dessutom har tidigare protokoll underlåtit att nämna summacell avkastningen erhålls från deras isoleringar och endast nuvarande cell lönsamhet procentandelen19. Här visar vi en hög avkastning av decidual celler bestäms genom cell räknar (mellan 10-20 miljoner per moderkakan). Dessutom visar många av de aktuella publikationerna isolering av primära decidual/livmodercancer celler från möss; våra protokoll möjliggör studiet av mänskliga vävnader, gör den en mer biologiskt relevant källa av celler för experimenterande23. Detta protokoll kan också enkelt anpassas till först och andra trimestern moderkakan möjliggör flexibilitet av dräktigheten scenen att ens forskning behandlar. När cellerna har varit isolerade, kan de användas i en mängd olika experimentella tekniker såsom immuncytokemi, flödescytometri, proteiner och RNA-extraktion, efterföljande isolering av leukocyter, etc. i försök för att förstå rollen som olika cell delpopulationer. Identifiera skillnader i gen och protein uttryck i decidua mellan friska och komplicerade graviditeter (till exempel havandeskapsförgiftning eller prematura arbete) med hjälp av realtids PCR eller genomet brett associerade studier kan ge nya mål som kan hjälpa utvecklingen av diagnostiska och terapeutiska verktyg. Dessutom kan förändringar i förhållandet av decidual celler, särskilt leukocyter, som lätt kan identifieras med hjälp av flödescytometri också ge svar för etiologin till graviditetskomplikationer, såsom förändringar i båda leukocyt subpopulation nyckeltal samt deras aktiveringen ställningen som har visat att moduleras på både sikt och prematura labor24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja
Acknowledgments
Författarna vill tacka givarna, RCWIH biobanken, och Mount Sinai Hospital/UHN avdelningen för obstetrik och gynekologi för de mänskliga prover som används i denna studie. Vi skulle vilja tacka ledamöterna i lut labbet, särskilt Dr Caroline Dunk för hennes hjälp med metodutvecklingen. Detta arbete stöds av Burroughs Välkommen fonden (grant #1013759).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hank’s balanced salt solution with calcium and magnesium | Prepared in facility (LTRI) | ||
| Hank’s balanced salt solution without calcium and magnesium | Prepared in facility (LTRI) | ||
| Diaper pads | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Large surgical scissors | AL Medical | 2018-12-20. | |
| Large surgical forceps | Fine Science Tools | 11000-18 | |
| Plastic disposable cell scraper (25 cm) | Sarstedt | 83.183 | |
| 250 mm (size 60 mesh) metal sieve | Sigma-Aldrich | S1020-5EA | |
| Disposable scalpel with plastic handle (#21) | Fisher Scientific | 08-927-5D | |
| Sterile plastic petri dish (diameter 10 cm) | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| Sterile specimen container (urine cup, 4.5 oz) | VWR | 25384-146 | |
| Nylon filter (70 mm) | VWR/Corning | 21008-952 | |
| Erythrocyte lysis buffer | Qiagen | 79217 | |
| Trypan blue, 0.4% solution | Lonza | 17-942E | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Hemocytometer | Reichert | 1490 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 culture media | Invitrogen | 11835-055 | |
| Fetal bovine serum | Wisent | 080-150 | |
| Normocin (50mg/ mL) | Invivogen | ant-nr-1 | |
| Plastic top filtration unit (0.22 mm membrane, 500 mL) | Millipore | SCGPT05RE | |
| Collagenase 2, lyophilized powder | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| Soy bean trypsin inhibitor, powder | Sigma-Aldrich | T9003-250mg | |
| DNase powder | Roche | 10104159001 | |
| Bovine serum albumin (BSA powder) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Spinning disc confocal microscope - Leica DMI 6000B | Leica | ||
| Imaging Flow cytometer - Image Stream MK2 | Amnis | ||
| IDEA software | Millipore Sigma | ||
| APC-conjugated Vimentin antibody | R&D Systems | IC2105A | |
| APC H7-conjugated CD45 antibody | BD | 641399 | |
| FITC-conjugated Cytokeratin antibody | MACs Miltenyi Biotec | 130-080-101 | |
| PerCP -conjugated Cytokeratin 7 antibody | Novus | NBP2-47941PCP | |
| eFluor450 Fixable Viability dye | Thermo Fisher Scientific | 65-0863-14 | |
| Vimentin primary antibody | Santa Cruz | sc-7558 | |
| CD45 primary antibody | Dako | M0701 | |
| Cytokeratin primary antibody | Dako | M0821 | |
| Cytokeratin 7 primary antibody | Dako | M7018 | |
| Mouse IgG | Santa Cruz | sc-2025 | |
| Goat IgG | Santa Cruz | sc-2028 | |
| Alexa Fluor 546 secondary antibody | Invitrogen | A10036 | |
| Alexa Fluor 594 secondary antibody | Fisher Scientific | A-11058 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 |
References
- Brosens, N., Hayashi, N., White, J. O. Progesterone receptor regulates decidual prolactin expression in differentiating human endometrial stromal cells. Endocrinology. 140, 4809-4820 (1999).
- Bell, S. C., D'Arcangues, C., Frase, I. S., Newton, J. R., Odlind, V. Decidualization and relevance to menstruation. , Cambridge University press. 187-212 (1990).
- Kariya, M. Interleukin-1 inhibits in vitro decidualization of human endometrial stromal cells. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 73, 1170-1174 (1991).
- Dimitriadis, E., Robb, L., Salamonsen, L. A. Interleukin 11 advances progesterone-induced decidualization of human endometrial stromal cells. Molecular and Human Reproduction. 8, 636-643 (2002).
- Wu, W. -X., Brooks, J., Glasier, A. F., McNeilly, A. S. The relationship between decidualization and prolactin mRNA and production at different stages of human pregnancy. Society for Endocrinology. 14, 255-261 (1995).
- Bell, S. C. Synthesis and secretion of protein by the endometrium and decidua. Implantation: Biology and Clinical Aspects. , 95-118 (1988).
- Croy, B. A., Chantakru, S., Esadeg, S., Ashkar, A. A., Wei, Q. Decidual natural killer cells: key regulators of placental development. Journal of Reproductive Immunology. 57, 151-168 (2002).
- Smarason, A. K., Gunnarsson, A., Alfredsson, J. H., Valdimarsson, H. Monocytosis and monocytic infiltration of decidua in early pregnancy. Journal of Clinical and Laboratory Immunology. 21, 1-5 (1986).
- Daiter, E., Pampfer, S., Yeung, Y. G., Barad, D., Stanley, E. R., Pollard, J. W. Expression of colony- stimulating factor-1 in the human uterus and placenta. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 74, 850-858 (1992).
- Casey, M. L., Cox, S. M., Beutler, B., Milewich, L., MacDonald, P. C. Cachectin/tumor necrosis factor-alpha formation in human decidua. Potential role of cytokines in infection-induced preterm labor. Journal of Clinical Investigation. 83, 430-436 (1989).
- Lala, P. K., Kennedy, T. G., Parhar, R. S. Suppression of lymphocyte alloreactivity by early gestational human decidua. II. Characterization of the suppressor mechanisms. Cellular Immunology. 127, 368-381 (1988).
- Shynlova, O., Nedd-Roderique, T., Li, Y., Dorogin, A., Nguyen, T., Lye, S. J. Infiltration of myeloid cells into decidua is a critical early event in the labour cascade and post-partum uterine remodelling. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17, 311-324 (2013).
- Osman, I., Young, A., Ledingham, M. A., Thomson, A. J., Jordan, F., Greer, I. A., Norman, J. E. Leukocyte density and pro-inflammatory cytokine expression in human fetal membranes, decidua, cervix and myometrium before and during labour at term. Molecular Human Reproduction. 9, 41-45 (2003).
- Farine, T., Lye, S. J., Shynlova, O. Peripheral maternal leukocytes are activated in response to cytokines secreted by uterine tissues of pregnant women. Journal of Cellular and Molecular Immunology. 14, 635-638 (2017).
- Hamilton, S., et al. Macrophages infiltrate the human and rat decidua during term and preterm labor: evidence that decidual inflammation precedes labor. Biology of Reproduction. 86, 39 (2011).
- Casey, M. L., Cox, S. M., Word, A., Macdonald, P. C. Cytokines and infection-induced preterm labour. Reprodution Fertility and Development. 2, 499-510 (1990).
- Yellon, S. M., Mackler, A. M., Kirby, M. A. The role of leukocyte traffic and activation in parturition. Journal of the Society for Gynecologic Investigation. 10, 323-338 (2003).
- Gomez-Lopez, N., StLouis, D., Lehr, M. S., Sanchez-Rodriguez, E. N., Arenas-Hernandez, M. Immune cells in term and preterm labor. Cellular & Molecular Immunology. 11, 571-581 (2014).
- Xu, Y., Plazyo, O., Romero, R., Hassan, S. S., Gomez-Lopez, N. Isolation of leukocytes from the human maternal-fetal interface. Journal of Visualized Experiments. 99, (2015).
- Trundley, T., Gardner, L., Northfield, J., Moffett, A. Methods for isolation of cells from the human fetal-maternal interface. Methods in Molecular Medicine. 122, 109-122 (2006).
- Jividen, K., Movassagh, M. J., Jazaeri, A., Li, H. Two methods for establishing primary human endometrial stromal cells from hysterectomy specimens. Journal of Visualized experiments. 87, (2014).
- Pelekanos, R. A., Sardesai, V. S., Futrega, K., Lott, W. B., Kuhn, M., Doran, M. R. Isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells derived from human placenta tissue. Journal of Visualized experiments. 112, (2016).
- De Clercq, K., Hennes, A., Vrien, J. Isolation of mouse endometrial epithelial and stromal cells for in vitro decidualization. Journal of Visualized Experiments. 121, (2017).
- Zhang, J., Shynlova, O., Sabras, S., Bang, A., Briollais, L., Lye, S. J. Immunophenotyping and activation status of maternal and peripheral blood leukocytes during pregnancy and labour, both term and preterm. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 10, 2386-2402 (2017).
