Summary
Ce protocole présente une méthode pour l’isolement de cellules primaires de decidual humains prélevés dans les membranes foetales du placenta à terme qui peut être utilisé pour une variété d’applications (c'est-à-dire l’immunocytochimie, cytométrie en flux, etc.) visant pour étudier le rôle des différentes populations cellulaires dans les complications de la grossesse.
Abstract
La caduque, également connu sous le nom de l’endomètre enceinte, est un tissu reproducteur extrêmement important. Des cellules déciduale, composés principalement de cellules stromales decidualized et des cellules immunitaires, sont responsables de la sécrétion de facteurs hormonaux et inflammatoires qui sont essentiels pour l’implantation réussie de blastocyste, développement placentaire et jouent un rôle dans la déclenchement du travail à terme et prématurés. Plusieurs complications de la grossesse peuvent en découler des perturbations d’un équilibre subtil des différentes populations cellulaires comprenant caduque. Altérations de la proportion des types spécifiques de cellules déciduale peuvent perturber ces processus cruciales et augmenter le risque de développer de graves complications de la grossesse, tels que l’échec de l’implantation embryonnaire, retard de croissance intra-utérin, prééclampsie et travail prématuré. Le protocole décrit ici montre un coût et le temps, une méthode efficace pour l’isolement de cellules primaires de decidual humaines prélevée dans les membranes foetales du placenta à terme. En combinant la digestion enzymatique et douce rupture mécanique du tissu déciduale, un rendement élevé de cellules déciduale a été obtenu avec pratiquement aucune contamination du chorion. Ce qui est important, les cellules isolées de decidual ont été caractérisés (cellules stromales (55-60 %), de leucocytes (35 %), épithélial (1 %) ou cellules trophoblastiques (0,01 %)) et maintenu la viabilité élevée (80 %) qui a été confirmée par multicolore imagerie dosage cytométrie de flux. Ce protocole est spécifique à la parietalis caduque et peut être adapté aux placentas de premier et deuxième trimestres. Une fois isolés, cellules déciduale peuvent être utilisés pour une multitude d’applications expérimentales visant à comprendre le rôle des sous-populations cellulaires déciduale dans les complications de la grossesse.
Introduction
L’endomètre, un des plus actifs tissus femelles adultes, subit une dramatique transformant chaque cycle menstruel en réponse à une stimulation par les hormones ovariennes, le œstrogène (E2) et la progestérone (P4). La caduque, également connu sous le nom de l’endomètre enceinte, est un tissu reproducteur extrêmement important qui est formé à la fin de la phase post-ovulatoire, à la suite de différentiation axée sur les P4 suit la phase proliférative E2-dominante. Déciduale cellules sont responsables de la sécrétion de facteurs hormonaux pour l’implantation du blastocyste réussie et pour le développement de l’interface utéro-placentaire pour maintenir la tolérance maternelle à l’allogreffe foetale.
Décidualisation est nécessaire pour l’implantation et le remodelage subséquente des artères déciduale spirale. Les cellules du stroma endométriales subissent une décidualisation, sous le contrôle du cAMP et P4 pendant la phase lutéale du cycle menstruel1. Ce processus est engagé autour des vaisseaux sanguins et se propage partout dans le stroma, suggérant son rôle dans le remodelage de la vascularisation et de leucocytes traite de règlement. Cette transformation cellulaire se caractérise par une morphologie circulaire, accru la taille du noyau et l’expansion du réticulum endoplasmique et l’appareil de Golgi2. Cellules stromales decidualized sont capables de produire des facteurs paracrines soutenir l’implantation du blastocyste et caractérisent par la sécrétion de nombreuses hormones (prolactine,c'est-à-dire ), facteurs de croissance angiogéniques, facteur de croissance insuline binding protein-1 (IGFBP-1), prostaglandines (PG) E (stimulateur de l’AMPc intracellulaire), les cytokines, les constituants de la matrice extracellulaire et les éléments nutritifs essentiels pour placentaire l’implantation et le développement de3,4,5,6 .
La population cellulaire déciduale n’est pas uniquement composée de cellules stromales decidualized mais contient également des populations de leucocytes déciduale grand, spécifiques à la grossesse. Décidualisation implique un œdème localisé transitoire et afflux de cellules tueuses naturelles de (NK), lymphocytes T, cellules dendritiques et macrophages. La plus grande population de leucocytes est les cellules NK utérines, comprenant environ 50-70 % de tous les leucocytes maternelles s’infiltrer dans la caduque qui sont une source de cytokines et facteurs angiogéniques qui peuvent faciliter le processus de décidualisation et augmenter en nombre tout au long de la grossesse,7. Étant la deuxième plus grande population de cellules immunitaires, les macrophages, sont trouvent autour du site d’implantation et augmentent au cours de la grossesse8. Ils sont une source de cytokines et facteurs de croissance comme colonie stimulant facteur (CSF-1)9, le facteur de nécrose tumorale α (TNFα)10 et prostaglandine (PG) E11.
Tout au long de la grossesse et avant le travail à terme, la caduque est une source majeure de cytokines et de chimiokines, responsable de l’activation des leucocytes périphériques maternelle et migrations subséquentes dans les tissus utérins d’ouvrir la main de œuvre. Les études animales ont montré que nombreuses cytokines pro-inflammatoires sont régulée dans la caduque de souris pendant le travail, telles que TNF-a, IL-6, IL-12 et IL-1 b12. Dans l’humaine caduque, des cytokines pro-inflammatoires IL-1 b, IL-6 et IL-8 (grand chemoattractant neutrophil) pièce expression plus élevée pendant le travail ne contre pas en main de œuvre13. Ces sécrété cytokines entraînent une activation et l’afflux de leucocytes dans les tissus déciduale14; est constaté une augmentation déciduale macrophage et infiltration des neutrophiles dans les deux l’homme et le rat pendant l’accouchement à terme, avec une infiltration déciduale précédant myométriales 4 fois plus grande, ce qui indique une cascade d’activation entre ce deux adjacentes tissus utérins 15. celles-ci s’infiltrer dans les leucocytes produisent PGs capables d’activer les contractions du myomètre16synchrones, métalloprotéinases matricielles (MMP) d’ouvrir la membrane rompent17,18, ainsi que cytokines pro-inflammatoires afin d’amplifier le processus d’activation utérine (« tempête de cytokines »).
En raison de nombreuses fonctions importantes de cellules déciduale, comme jouant un rôle essentiel dans le processus d’implantation, entretien de tolérance materno-foetale en début de gestation et de participer à l’activation du travail à terme, les différentes pathologies peuvent survenir pendant grossesse. Par exemple, (1) infertilité due à l’échec de l’implantation récurrente et perte récurrente de grossesse peut résulter d’une omission de decidual maturation ; (2) restriction de la croissance intra-utérine (RCIU) et pré-éclampsie dues à une mauvaise évolution et dysfonction de la caduque/placenta ou compromise transformation vasculaire à la jonction de decidual-myométriales ; ainsi que de la prématurité (3), qui peut résulter d’activation déciduale prématurée.
À la lumière de ces troubles majeurs, couplés avec des limites éthiques et pratiques humaines in vivo études, établir des lignées humaines déciduale primaire est essentielle pour in vitro d’analyse dans le but de mieux comprendre et améliorer la prise en charge clinique des complications de la grossesse. Par conséquent, l’objectif de notre recherche était d’élaborer un protocole qui permet d’isoler des cellules humaines de decidual primaires avec un rendement cellulaire élevée et viabilité prélevés dans les membranes foetales du placenta à terme. Ce protocole actuel a clairement décrit une méthode de temps - et rapport coût - entrée pour isoler des sous-types spécifiques de decidual cellules qui être utilisé pour une variété d’analyses de in vitro . Caractérisation de l’abondance et le phénotype des sous-populations déciduale à terme et comparaison au premier ou deuxième trimestre sont cruciales de définir leurs rôles tout au long de la gestation humaine.
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Protocol
Placentas sont recueillies auprès de terme et en santé, pas chez les femmes de travail en cours de césarienne élective. La collecte, traitement et jetable d’échantillons humains respecte les lignes directrices du Conseil du Mount Sinai Hospital éthique. Un consentement écrit est obtenu à partir de chaque patient. Cette étude est approuvée par le Comité d’éthique de recherche de l’hôpital Mount Sinai.
1. les préparatifs
Remarque : Toutes les mesures doivent être effectuées sous une hotte aspirante et tout l’équipement chirurgical doit être stérilisé par autoclave avant le placement sous la hotte. Tous les autres matériaux (bouteilles, tubes de 50 mL, etc.) doivent être stérilisés avec une solution d’éthanol à 70 %. Toujours porter un équipement de protection personnelle à tout moment lorsque vous travaillez avec des déchets biologiques (blouse, gants, cheveux longs attachés en arrière, etc.).
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Solution de digestion enzymatique (solution finale : 200 mL)
- Pipetter 180 mL de HBSS-/ - dans un bécher de 500 mL, ajouter aimant agitation stérile et placez le remuant plaque à température ambiante.
- Peser et ajouter ce qui suit à la HBSS-/-solution lentement et de façon séquentielle : 20 mL de FBS, 400 mg 2 collagénase ([final] = 2 mg/mL), 20 mg inhibiteur trypsique du soja bean ([final] = 0,1 mg/mL), 30 mg de DNase 1 ([finale] = 0,15 mg/mL) et 200 mg BSA ([final] = 1 mg/mL)
- Mettre l’agitation à vitesse moyenne et laisser le mélange de remuer pendant 10-20 min (couverture avec film de papier ou paraffine étain tout en remuant).
- Verser la mélange de la solution dans un flacon de verre de 250 mL à l’aide d’un entonnoir en plastique et le placer sous la hotte.
- Passer la solution à travers une unité de filtration haut en plastique (0,22 μm membrane filtrante, 500 mL), aliquote 20 mL en tubes de 50 mL (totales 10 tubes) et les conserver à-20 ° C jusqu'à l’utilisation.
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Médias de RPMI 1640 (lavage solution et le milieu de croissance complète de 10 % à 2 %)
- Combiner le RPMI 1640 et FBS dans une bouteille en verre dans la hotte de laboratoire.
- Pour une solution de 2 % FBS, combiner 490 mL du milieu RPMI 1640 et 10 mL FBS.
- Pour une solution de 10 % FBS, mélanger 450 mL RPMI 1640 et 50 mL FBS.
- Pipeter 500 μL de normocin dans la bouteille de verre de 500 mL de l’étape précédente contenant les médias RPMI et FBS (concentration de travail sur les 0,05 mg/mL stock, 50 mg/mL).
- Passer les médias grâce à un filtre à membrane μm 0,22 et le magasin dans un flacon de verre de 500 mL à 4 ° C jusqu'à l’utilisation.
- 30 min avant de commencer l’expérience, placer une aliquote de 20 mL de gelée de solution de digestion enzymatique dans un bain de perle de 37 ° C, placer les 2 % FBS et les médias de FBS RPMI 1640 de 10 % dans un bain de perle de 37 ° C, allumez le bain-marie bascule et réglé à 37 ° C , 2 g et ensemble une centrifugeuse de régulation de température à 4 ° C.
2. collection de tissu déciduale terme Membranes placentaires
- Placer les bouteilles avec HBSS + / +, HBSS-/- et cinq tubes de 50 mL dans un rack sous la hotte. Pipetter 25 mL de HBSS + / + dans un tube.
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À l’aide des mains gantées, sortir le placenta à terme du récipient utilisé pour transporter du théâtre salle d’opération. Placer le placenta sur le pad de couche-culotte (côté maternel vers le haut) et la propagation des membranes foetales à l’aide de ciseaux et pinces.
- Poser les tampons de couches qui se chevauchent sur la hotte.
- Utilisez une couche distincte pour faire basculer le placenta, donc du côté maternel est face vers le haut.
- Trouver le point de rupture des membranes et faire des incisions pour permettre à la membrane pour le déplier et étaler à plat sur la surface de la hotte.
Remarque : Une fois que la membrane est tiré vers l’arrière du placenta, la caduque seront orientés vers le haut reposant sur la couche de chorion, avec la couche de l’amnios à l’arrière.
- À l’aide d’un grattoir en plastique cellulaire, gratter délicatement le tissu déciduale hors le chorion et le place dans le tube de 50 mL contenant 25 mL HBSS + / +.
- Grattez la membrane avec une pression modérée. Ne pas appliquer trop de pression car il peut entraîner une contamination de chorion. Collecter des petits caillots de sang aussi bien, qu’ils contiennent certaines cellules déciduale.
ATTENTION : Après la collection déciduale, placenta doit être emballé dans un bac en plastique de biohazard et congelé dans un congélateur à-20 ° C avant l’élimination appropriée (selon vos règles institutionnelles). Couche-culotte sanglante plaquettes doivent être enveloppés dans un sac plastique étanche seal et jetés dans un coffre-fort de biohazard.
3. laver et enzymatique Digestion du tissu déciduale
- Laver les tissus prélevés par doucement agiter le tube de 50 mL à la main et en lui passant à travers un tamis métallique (250 μm, maille taille 60) de 250 μm reposant sur un récipient à échantillon stérile (urine).
- Répéter le laver deux fois avec HBSS + / + et deux fois avec HBSS-/ - dans des tubes de frais pour chaque lavage. (final se lave avec HBSS-/-permet l’élimination du calcium et de magnésium présent dans HBSS + / +, qui pourrait interférer avec la suite du processus de digestion enzymatique).
REMARQUE. Au cours des étapes de lavage, contamination des tissus chorion ressortira comme le tissu déciduale est rose clair en couleur et amorphe, tandis que le chorion est blanc, dense et filandreuse. Par conséquent, contamination chorion peut être facilement enlevée avec une pince. - Éventuellement, si le tissu déciduale est épais, transférer dans un plat de Pétri stérile 10 cm diamètre et mâcher du tissu avec deux scalpels adverses dans le plat.
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Placer le tissu lavé dans tube stérile de 50 mL contenant 100 mg de tissu/mL de solution de digestion enzymatique (voir préparation).
- Comme point de référence, s’assurer que le niveau de decidual tissu atteint la marque de 5-10 mL sur le tube de 50 mL.
- Utiliser environ 20 mL de solution de digestion enzymatique (préparé à l’étape 1.1) pour digérer la caduque totale prélevée une membrane fœtale de toute la durée.
- Sceller le bouchon du tube avec le film de paraffine (fermer le tube hermétiquement et envelopper de film de paraffine autour du cap et le haut du tube) en vertu de la culture hotte et incuber déciduale tissu à 37 ° C pendant 20 min dans un bain d’eau secouer (145 tr/min 2 g).
- Après incubation, enlever la pellicule de paraffine et stériliser la surface du tube contenant des tissus digérés avec l’éthanol à 70 % et ramener sous la hotte. Agiter le tube brièvement à la main.
- Recueillir la suspension cellulaire à travers le tamis métallique (250 μm, maille taille 60) dans un nouveau récipient à échantillon stérile. Diluer avec un volume égal (20 mL) de RPMI + 10 % FBS contenant 0,1 % normocin pour arrêter la réaction enzymatique. Passez directement à l’étape de centrifugation 4.1.
- Si nécessaire, remettre le tissu restant non digéré dans un nouveau tube de 50 mL avec 20 mL de solution de digestion enzymatique fraîches et répétez la digestion (20 min, 37 ° C, secouant le bain-marie).
- Si une seconde digestion est nécessaire, placer le premier tube avec suspension cellulaire sur la glace (couverture avec film de paraffine pour garder stérile). Répétez les étapes 3,5 à 3,6 et combiner les suspensions de deux cellules.
4. générer une Suspension monocellulaire
- Centrifuger la suspension cellulaire (420 g, 4 ° C, 11 min).
- Retirez le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 40 mL de RPMI + 2 % FBS contenant 0,1 % normocin (« tampon de lavage »).
NOTE : Culot cellulaire sera lâche et gélatineux en raison de la contamination par les globules rouges, aspirer le surnageant avec prudence. Suppression de la phase supérieure avec une pipette manuelle peut être nécessaire. - Répétez la centrifugation à 420 g à 4 ° C pendant 11 min.
- Avec précaution, retirez le surnageant (comme mentionné dans la Note point 4.2) et Resuspendre le culot dans 5 mL de tampon de lavage et ajouter 35 mL de tampon de lyse des érythrocytes dans le même tube.
Remarque : Si la pastille est grande ou très sanglante, il peut être divisé en deux tubes pour l’étape de lyse des érythrocytes en ajoutant 10 mL de tampon de lavage et diviser également entre deux tubes puis 35 mL de tampon de lyse des érythrocytes dans chaque tube. - Incuber sur glace pendant 20 min. brièvement vortex tubes au début et la fin de l’incubation à lyser les globules rouges.
- Centrifuger à 420 g pour 11 minutes à 4 ° C.
- Avec précaution, retirez le surnageant et Resuspendre le culot dans 40 mL de tampon de lavage.
- Passer les cellules à travers un filtre en nylon 70 μm pour enlever les amas de cellules.
- Centrifuger à 420 g pour 11 min à 4 ° C.
- Retirez le surnageant et Resuspendre le culot dans 10 mL de milieu complet (RPMI 10 % + FBS contenant 0,1 % normocin).
-
Compter les cellules utilisant l’exclusion colorant bleu trypan hémocytomètre procédure tel que décrit ci-dessous :
- Sous le capot de la culture Pipetez doucement la suspension cellulaire et descendre 3 x afin de bien mélanger avant de les combiner avec le bleu trypan. Dans un 1,5 mL tube préparer suspension cellulaire, dilué 1:2 (combiner 20 μL de solution de bleu de trypan) et 20 μL de la suspension cellulaire déciduale. Mélanger soigneusement la solution de cellules bleu trypan en pipettant également monter et descendre une couple de fois (cette solution n’est pas stérile).
- Placez l’hémocytomètre sur la scène du microscope avec une lamelle de verre sur le dessus.
NOTE : Hémocytomètre est une lame de microscope avec grilles sur elle de donner neuf grands carrés divisés par trois lignes. Chaque grand carré a une superficie de 1 mm2, et la profondeur du liquide dans la chambre est de 0,1 mm. Par conséquent, le volume de liquide qui peut remplir chaque grand carré est 1 mm * 1 mm * 0,1 mm = 0,1 mm3= 10-4 mL. - Lentement, ajouter 10 μL du mélange de cellules bleu trypan dans la rainure de la hémocytomètre, permettant l’action capillaire disperser le mélange de la cellule sur l’ensemble de la diapositive (arrêt avant mélange remplit bien).
- Afficher les cellules au microscope (grossissement de 10 X) et de compter toutes les cellules de blanc/vert qui excluent le bleu trypan (ce sont les cellules viables) dans les quatre grandes places extérieures de l’hémocytomètre. Lors du comptage des cellules qui touchent la ligne, ne compter que ceux qui touchent le droit et les lignes supérieures mais pas ceux touchant la gauche et les lignes de fond. Ne comptez pas les cellules bleus foncés ; couleur bleue indique que la cellule est morte comme colorant bleu trypan peut facilement traverser la membrane plasmique dans le cytoplasme.
- Pour calculer le nombre de cellules viables dans 1 mL de suspension cellulaire (X) :
2 = facteur de dilution
10 000 = facteur de conversion (1 mL = 1 cm3 = 10, 000 * 0. 1 mm3)
- Diluer la déciduale cellules à une concentration finale souhaitable dans RPMI + 10 % SVF (milieu de culture).
Remarque : Pour le placage de culture tissulaire, Pipeter 2 * 106 cellules/puits dans une plaque en plastique de 6 puits, 10 * 106 cellules dans une plaque de plastique de 10 cm ou 75 000 cellules à une lamelle de verre.
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Representative Results
Pour valider l’efficacité et la viabilité des cellules isolées, elles ont été caractérisées par deux méthodes : flow cytometry et immunocytochimie (ICC). 4 populations de cellules ont été ciblées ; cellules stromales decidualized ont été détectés par l’anticorps anti-vimentine, marqueurs pan-leucocyte CD45 servait à identifier les cellules immunitaires déciduale, cytokératine servait à détecter des cellules épithéliales/endothéliale et enfin, cytokératine 7 a été utilisé pour détecter tout trophoblaste potentiel (chorion ou placentaire) contamination.
Pour la caractérisation par cytométrie en flux d’imagerie multicolore, cellules déciduale fraîchement isolées ont été colorés avec un colorant fixable pour déterminer la viabilité cellulaire. Les cellules ont été perméabilisées et fixe, suivies par la souillure avec anticorps monoclonaux de souris fluorochrome-conjuguées ciblant la vimentine-APC, CD45-APC-H7, cytokératine-FITC et cytokératine 7-PerCP. Informations de l’anticorps sont répertoriées dans la Table des matières. Les cellules fixes et colorées étaient stockés à 4 ° C jusqu’au lendemain au tampon pour empêcher la dissociation du colorant en tandem et exécuté le lendemain sur le cytomètre en flux d’imagerie Image flux MK2 de coloration. L’analyse a été réalisée à l’aide d’un logiciel. Débris cellulaires et les agrégats ont été exclus par l’ouverture de porte série à l’aide de trois combinaisons de fonctionnalité séquentielle/masque (Figure 1 a-B). Contrôles gating fluorescence Minus One (FMO) ont été utilisés pour identifier les populations cellulaires déciduale positive et unique tache cellules servaient d’indemnisation (Figure 2). Point final parcelles montrent la population de cellules colorées positivement des quatre marqueurs (Figure 2) et de la viabilité cellulaire de 80 % (Figure 1). Les images représentant des cellules colorées positivement peuvent être vu dans la Figure 1. En utilisant cette méthode, nous avons constaté que la population que se compose principalement de cellules stromales (55-60 %), leucocytes (35 %), épithéliales (1 %) ou les cellules trophoblastiques (0,01 %) (Figure 1E). L’expérience a été répétée trois fois. Ces résultats vérifier la pureté (absence de contamination de trophoblaste du chorion) et la grande viabilité de cellules déciduale humaines primaires collectées et isolé des membranes fœtales des placentas à terme.
Dans une expérience distincte de l’ICC, cellules déciduale fraîchement isolées ont été ensemencés sur des lamelles de verre (75 000 cellules/lamelle), autorisés à fixer et est resté dans la culture pendant 48 heures. Media a été changé après 24 heures pour éliminer les cellules mortes non inscrits. Les cellules ont été fixées puis 50 % acétone - méthanol à 50 %, perméabilisé avec 0,02 % tensioactif non ionique et liaison non-spécifique a été bloqué par la solution de blocage. Les cellules sont ensuite colorés avec des anticorps monoclonaux de souris : anti-CD45 (marqueur de pan-leucocyte), anti-cytokératine (marqueur de cellules épithéliales) et anti-cytokératine 7 (marqueur de trophoblaste) et des anticorps polyclonaux anti-vimentine de chèvre (marqueur de cellules stromales). Anti-chèvre âne et anti-souris âne étaient utilisés comme anticorps secondaires. DAPI a été utilisé pour colorer les noyaux. Souris IgG, IgG de chèvre et des anticorps secondaires seuls ont été utilisés comme témoins négatifs et de spécificité. Images ont été prises à un grossissement de X 20 sur un microscope confocal de disque de filature. Les anticorps utilisés sont répertoriés dans la Table des matières et images représentatives sont présentés à la Figure 3. Notre observation visuelle indique que la majorité des cellules déciduale principales attachées sont des cellules stromales de la vimentine positifs (environ 95 %), avec un petit nombre de leucocytes (env. 1-2 %), épithéliales (env. 1 %) et le trophoblaste populations cellulaires (cellules individuelles ont été détectés soit < 0,01 % de l’ensemble). La différence majeure entre la cytométrie en flux et les résultats de l’ICC est la diminution de population de leucocytes positif de CD45 détectée par cytométrie en flux. Cet écart peut s’expliquer par les méthodes dont les deux expériences ont été menées : dans l’analyse de cytométrie en flux, les cellules isolées de decidual ont été immédiatement traitées et colorées, ce qui signifie la population de leucocytes a été incluse dans l’analyse. Avec ICC, la suspension cellulaire déciduale total a été plaquée et cultivée pendant 48 heures dans les médias qui appuyait surtout l’attachement des cellules stromales et épithéliales, mais pas de système immunitaires cellules. Après 24 h, les cellules immunitaires qui n’étaient pas attachés ont été retirés pendant le changement de support, représentant la différence dans les résultats présentés par ces deux méthodes. Nous avons conclu que pour l’étude des leucocytes sous-populations dans humain caduque de précaution spéciale grossesses compliquées doivent être utilisées pour éviter la suppression accidentelle de la population de leucocytes.
Figure 1 : déclenchement de stratégie pour la discrimination de la population cellulaire déciduale. (A) les cellules fraîchement isolées de decidual fixes ont été initialement gated pour exclure les doublets de la cellule et (B) par la suite fermée à l’aide de trois combinaisons de fonctionnalité séquentielle/masque pour exclure les débris cellulaires. (C) des cellules vivantes (rose porte, 80 % de la population totale) sont différencient des cellules mortes (porte bleue, 20 % de la population totale) en utilisant un colorant de viabilité réparable. (D) des images représentatives des cellules déciduale colorées avec le marqueur de viabilité et quatre conjugué fluorescent anticorps (AC) (vimentine-APC, CD45-APC-H7, cytokératine-FITC et cytokératine 7-PerCP). Barre d’échelle en pointillés correspond à 7 μm. (E) une fois qu’une population cellulaire exempte de débris, vivre a été déterminée, ces marqueurs ont été utilisés pour déterminer le pourcentage de chaque type de cellule au sein de la population cellulaire déciduale. Pour les chiffres 1 b et 1C, chaque point représente une seule cellule déciduale. Pour les Figures 1 a et 1C, la gamme de couleurs des parcelles dot représente la densité cellulaire, des cellules très denses signifiants rouges et bleue moins dense de cellules. Les données présentées ici sont représentatif des réplicats biologiques 3. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : analyse par cytométrie en flux Representativeflow de cellules déciduale humaines primaires avec FMO gating parcelles. Parcelles de dot couleur représentative des cellules isolement de decidua terme et colorées avec (A) vimentine-APC (marqueur de cellules stromales), (B) CD45-APC-H7 (marqueur de leucocyte), (C) cytokératine-FITC (marqueur de cellules épithéliales) et (D) cytokératine 7-PerCP (marqueur de trophoblaste) aux côtés de chaque contrôle respectif de la FMO. Fluorescent-Minus-One (FMO) contrôles, tubes contenant l’anticorps complet cocktail moins le marqueur en question et préparé identiquement à l’échantillon expérimental entièrement coloré, ont été utilisés au cours de l’analyse de données de cytométrie en flux pour déterminer le vrai positif populations de cellules déciduale. FMO contrôles montrent le fond relatif et permettant un déclenchement précis de vrais signaux positifs. Les données présentées ici sont représentatif des réplicats biologiques 3. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : analyse Immunocytochemical représentant des cellules humaines primaires déciduale. Des cellules humaines primaires déciduale ont été cultivées sur des lamelles de verre pendant 48 h, avec les adaptations de médias après 24 h. cellules ont été fixés avec l’acétone-méthanol et colorées avec l’anticorps monoclonal de souris anti-CD45 (marqueur de leucocyte), anti-cytokératine (marqueur de cellules épithéliales) et des anticorps anti-cytokératine 7 (marqueur de trophoblaste) et des anticorps polyclonaux anti-vimentine de chèvre (marqueur de cellules stromales). Images représentant montrent les fibroblastes de vimentine positifs (A) (Abs secondaire : anti-chèvre âne), (B) CD45 + leucocytes (Abs secondaire : anti-souris âne), (C) les cellules épithéliales positives cytokératines (Abs secondaire : âne anti-souris) et (D) cytokératines trophoblaste positif 7 cellules (Abs secondaire : anti-souris âne) ont été détectés (coloration rouge). La coloration DAPI a été utilisée pour teindre les noyaux des cellules (coloration bleue). Souris non spécifiques et chèvre IgG (M IgG et G IgG) ont été utilisés comme témoins négatifs, omettant primaire Abs ont été utilisés comme témoins de l’anticorps secondaire (M 2nd seulement et G 2nd seulement). Les images sont prises à un grossissement de X 20 sur un microscope confocal de DMI tourne disque. Barreaux de l’échelle = 32 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Le protocole décrit ici montre un coût et le temps, une méthode efficace pour isoler des cellules primaires de decidual prélevée dans les membranes foetales de placenta humain à terme très accessible et simple. Le succès de ce protocole dépend de deux facteurs essentiels, (1) efficacité de decidual grattage de la couche de chorion des membranes foetales et (2) le soin avec lequel les cellules déciduale sont traités tout au long du protocole. Il est important que la contamination des tissus chorion est contrôlée en veillant à ce qu’aucun n’est inclus par inadvertance pendant le raclage déciduale et en identifiant et en éliminant toute contamination au cours des étapes de lavage (différence de morphologie decidua et chorion permet un retrait facile du chorion, qui peut-être être collecté accidentellement avec la caduque). Déciduale cellules sont fragiles par conséquent rapides et fréquents de pipetage peut entraîner une diminution viabilité. Nous suggérons, ensuite, que le réglage de vitesse d’éjection pipette resterait lent et pipetage minimal doit être utilisé lors du mélange de cellules.
Une des façons dont ce protocole prévient la contamination du trophoblaste est uniquement collecte caduque par les membranes foetales du placenta (comprenant le parietalis decidua), à l’exclusion de la collection de la basalis caduque qui se fait en prenant des biopsies du côté maternelle du placenta. Par conséquent, alors que notre protocole actuel améliore la pureté de la population cellulaire déciduale nous isoler, elle n’exclut une section de la caduque (c.-à-d. decidua basalis) qui peut-être poser comme une limitation de recherche ciblant cette partie de la caduque ou lorsque les deux sections de la caduque sont requises. Cette exclusion comprend la plus grande limite de cette étude. En outre, tout en isolant déciduale cellules provenant de patients humains permet un aperçu plus biologiquement pertinent decidual et recherche de grossesse, moins manipulation et moins des périodes de temps peuvent être étudiés par rapport aux études axées sur les rongeurs pour des raisons éthiques.
Tout au long de ce protocole, il y a des étapes qui pourraient pour créer des difficultés, et si mal atténués mai influer sur le rendement des cellules et la viabilité. Pour contourner cela, modifications peuvent il faut faire. Le plus important est de s’assurer que le raclage déciduale hors les membranes fœtales est suffisante (étape 2.4) ; en raison de la variabilité humaine, chaque placenta peut être différent en fonction de la quantité de tissu déciduale, consistance tissulaire et niveau de séchage de tissus. Il est important de moduler le grattage pour s’assurer que seule la caduque est enlevée. Si la caduque et les membranes sont sèches, PBS-/-peut être coulé sur les membranes pour permettre un grattage plus facile. La deuxième étape est la lyse des érythrocytes de la suspension cellulaire déciduale (étape 3.4). Tel que mentionné, si le culot cellulaire est très grand et contient une grande quantité de sang, les granulés peuvent être divisés en deux tubes pour améliorer l’efficacité de la lyse. S’il y a toujours des globules rouges après cette étape il peut y avoir un besoin de diviser le culot en plus de tubes pour une efficacité maximale.
Alors que l’isolement déciduale différents protocoles de placenta à terme et l’isolement de la cellule de l’endomètre de femmes non enceintes subissant une hystérectomie ont été publiées antérieurement18,19, ces méthodes ne traitent pas de divers limitations, telles que la viabilité cellulaire faible et contamination des tissus adjacents. Nous avons considéré ces limites lors de la conception du protocole présenté ici, qui conduit à grand rendement cellulaire, a augmenté de viabilité et réduit le risque de contamination des tissus environnants. Auparavant, les dissociations automatiques ont servi à briser mécaniquement les tissus déciduale19,20. Cette méthode est relativement sévère puisqu’il intègre une dissociation mécanique vigoureuse où le tissu déciduale est recueilli dans un tube, inséré dans la machine qui fonctionne de la même façon à un mélangeur en tournant rapidement les cisailles pour briser les tissus, ce qui entraîne viabilité cellulaire réduite. Notre nouvelle méthode décrite ici combine un court (20 minutes) digestion enzymatique combinée aux manœuvres douces et bascule l’eau bain agissant au lieu de force mécanique exercée sur le tissu. La solution de digestion enzymatique est conçue pour augmenter la viabilité cellulaire et le rendement, contenant la collagénase (1) pour digérer la matrice extracellulaire du tissu déciduale ; (2) un inhibiteur trypsique du soja pour prévenir la digestion non spécifiques en raison d’une activité trypsinolytic restante de la collagénase ; (3) DNase 1 pour enlever flottant sérum de bovin fœtal (SVF) ADN (4) et de protéine d’albumine sérique bovine (BSA) pour protéger les cellules contre la digestion. La deuxième limitation majeure des études antérieures réside dans le fait que le decidua basalis ont été recueillies en coupant la couche supérieure de la face maternelle du placenta qui peut entraîner la contamination trophoblastique. Notre nouveau protocole isole la caduque parietalis en grattant doucement la caduque hors tension de la membrane fœtale (chorion) et permet de faciliter le retrait d’une contamination de chorion pendant les étapes de lavage.
Par conséquent, notre méthode permet pour un simple isolement de cellules primaires de decidual prélevé par les membranes placentaires dans un court laps de temps (l’ensemble du processus prend environ 3 heures) aboutissant à rendement élevé de cellulaire et de la viabilité cellulaire excellent. Une fois que les cellules déciduale ont été isolés, ils peuvent être utilisés pour une multitude d’expériences ; par exemple, les cellules humaines de decidual primaires peuvent être semées sur lamelles couvre-objet pour l’analyse immunocytochimique, ils peuvent être cultivés en culture pour divers traitements et manipulations, ainsi que directement colorées pour analyse en cytométrie en flux multicolore évaluer la composition de decidua humaine avec complications de la grossesse pour tenter de comprendre le rôle des sous-populations de cellules différentes. Alors que la méthode présentée ici a été utilisée pour isoler les cellules du placenta à terme (la fin du troisième trimestre de la gestation humaine), ce protocole peut également être facilement adapté pour le premier et le second placenta trimestre permettant une flexibilité de la phase de gestation qu’il se penche sur sa recherche.
Protocoles publiés ont autrefois dissociations automatiques pour casser apart tissu déciduale ou digestion enzymatique seul21,22. En combinant une douce force mécanique (bascule bain-marie à 37 ° C) ainsi qu’une cocktail de digestion enzymatique conçue pour optimiser la digestion et la viabilité cellulaire, le protocole décrit ci-dessus crée l’équilibre idéal entre le rendement des cellules et la viabilité. En outre, les protocoles précédents ont omis de mentionner le rendement total de cellules provenant de leur isolement et seulement présent cellule viabilité pourcentage19. Nous montrons ici un rendement élevé de cellules déciduale déterminée au moyen de cellules de comptage (allant de 10 millions par le placenta). En outre, bon nombre des publications actuelles démontrent l’isolement de cellules primaires de decidual/endomètre de souris ; notre protocole permet l’étude de tissus humains, rendant une source plus biologiquement pertinente des cellules pour expérimentation23. Ce protocole peut également être facilement adapté pour le premier et le second placenta trimestre permettant une flexibilité de recherche de la phase de gestation que l'on se penche sur. Une fois que les cellules ont été isolés, ils peuvent être utilisés dans une variété de techniques expérimentales telles que la cytométrie en flux, protéine et extraction de l’ARN, immunocytochimie, isolement ultérieur des leucocytes, etc. dans la tentative de comprendre le rôle de cellule différente certaines sous-populations. Identifier les différences dans l’expression de gènes et des protéines dans les études de caduque entre les grossesses saines et compliqués (par exemple travail pré-éclampsie ou prématuré) grâce à l’utilisation de la PCR en temps réel ou le génome large associé peut-être fournir de nouvelles cibles qui peuvent aider à le développement d’outils diagnostiques et thérapeutiques. En outre, altérations du ratio de cellules déciduale, spécifiquement les leucocytes, qui peuvent être facilement identifiés grâce à l’utilisation de la cytométrie en flux peuvent également fournir des réponses pour l’étiologie des complications de la grossesse, tels que les changements dans les leucocytes les ratios de sous-population ainsi que leur statut d’activation qui se sont révélés être moduler en durée et en travail prématuré,24.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer
Acknowledgments
Les auteurs aimeraient remercier les donateurs, la biobanque de RCWIH et le département d’obstétrique de l’hôpital Mount Sinai/UHN et obstétrique pour les spécimens humains utilisés dans cette étude. Nous tenons à remercier les membres du laboratoire Lye, particulièrement le Dr Caroline Dunk pour son aide à l’élaboration de la méthode. Ce travail est soutenu par le Fonds de bienvenue de Burroughs (subvention #1013759).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hank’s balanced salt solution with calcium and magnesium | Prepared in facility (LTRI) | ||
| Hank’s balanced salt solution without calcium and magnesium | Prepared in facility (LTRI) | ||
| Diaper pads | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Large surgical scissors | AL Medical | 2018-12-20. | |
| Large surgical forceps | Fine Science Tools | 11000-18 | |
| Plastic disposable cell scraper (25 cm) | Sarstedt | 83.183 | |
| 250 mm (size 60 mesh) metal sieve | Sigma-Aldrich | S1020-5EA | |
| Disposable scalpel with plastic handle (#21) | Fisher Scientific | 08-927-5D | |
| Sterile plastic petri dish (diameter 10 cm) | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| Sterile specimen container (urine cup, 4.5 oz) | VWR | 25384-146 | |
| Nylon filter (70 mm) | VWR/Corning | 21008-952 | |
| Erythrocyte lysis buffer | Qiagen | 79217 | |
| Trypan blue, 0.4% solution | Lonza | 17-942E | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Hemocytometer | Reichert | 1490 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 culture media | Invitrogen | 11835-055 | |
| Fetal bovine serum | Wisent | 080-150 | |
| Normocin (50mg/ mL) | Invivogen | ant-nr-1 | |
| Plastic top filtration unit (0.22 mm membrane, 500 mL) | Millipore | SCGPT05RE | |
| Collagenase 2, lyophilized powder | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| Soy bean trypsin inhibitor, powder | Sigma-Aldrich | T9003-250mg | |
| DNase powder | Roche | 10104159001 | |
| Bovine serum albumin (BSA powder) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Spinning disc confocal microscope - Leica DMI 6000B | Leica | ||
| Imaging Flow cytometer - Image Stream MK2 | Amnis | ||
| IDEA software | Millipore Sigma | ||
| APC-conjugated Vimentin antibody | R&D Systems | IC2105A | |
| APC H7-conjugated CD45 antibody | BD | 641399 | |
| FITC-conjugated Cytokeratin antibody | MACs Miltenyi Biotec | 130-080-101 | |
| PerCP -conjugated Cytokeratin 7 antibody | Novus | NBP2-47941PCP | |
| eFluor450 Fixable Viability dye | Thermo Fisher Scientific | 65-0863-14 | |
| Vimentin primary antibody | Santa Cruz | sc-7558 | |
| CD45 primary antibody | Dako | M0701 | |
| Cytokeratin primary antibody | Dako | M0821 | |
| Cytokeratin 7 primary antibody | Dako | M7018 | |
| Mouse IgG | Santa Cruz | sc-2025 | |
| Goat IgG | Santa Cruz | sc-2028 | |
| Alexa Fluor 546 secondary antibody | Invitrogen | A10036 | |
| Alexa Fluor 594 secondary antibody | Fisher Scientific | A-11058 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 |
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