Summary
Este protocolo muestra un método para el aislamiento de las células decidual humanas primarias recogidas de las membranas fetales de la placenta de término que puede ser utilizada para una variedad de aplicaciones (es decir, inmunocitoquímica, citometría de flujo, etc.) con el objetivo de para estudiar el papel de diferentes poblaciones celulares en complicaciones del embarazo.
Abstract
La decidua, también conocido como endometrio embarazada, es un tejido reproductivo críticamente importante. Las células decidual, conformadas principalmente por decidualized células del estroma y las células inmunes, son responsables de la secreción de factores inflamatorios y hormonales que son esenciales para la implantación del blastocisto exitosa, desarrollo placentario y desempeñar un papel en la iniciación del parto a término y prematuros. Muchas complicaciones en el embarazo pueden surgir de las perturbaciones del equilibrio de diferentes poblaciones celulares compuesto por decidua. Alteraciones en la proporción de tipos específicos de células decidual pueden interrumpir estos procesos cruciales y aumentar el riesgo de desarrollar complicaciones graves del embarazo, como la falta de implantación del embrión, restricción del crecimiento intrauterino, preeclampsia y trabajo de parto prematuro. El protocolo aquí descrito muestra un costo y el tiempo efectivo método para el aislamiento de las células decidual humanas primarias recogida de las membranas fetales de la placenta de término. Mediante la combinación de digestión enzimática y la interrupción mecánica suave del tejido decidual, se obtuvo un alto rendimiento de las células decidual con virtualmente ninguna contaminación del corion. Importante, se caracterizaron las células decidual aisladas (células estromales (55-60%), leucocitos (35%), epitelial (1%) o las células del trofoblasto (0.01%)) y mantiene viabilidad alta (80%), que fue confirmada por análisis de citometría de flujo imágenes multicolor. Este protocolo es específico para los parietalis de los decedentes y puede ser adaptado a las placentas de primer y segundo trimestres. Una vez aislado, las células decidual se pueden utilizar para multitud de aplicaciones experimentales con el objetivo de entender el papel de las subpoblaciones diferentes células decidual en complicaciones del embarazo.
Introduction
El endometrio, uno de los más activos tejidos femeninos adultos, sufre espectacular remodelación cada ciclo menstrual en respuesta a la estimulación por las hormonas ováricas, estrógenos (E2) y progesterona (P4). La decidua, también conocido como endometrio embarazada, es un tejido reproductivo críticamente importante que está formado por el final de la fase postovulatoria como resultado de la diferenciación basada en P4 después de la fase proliferativa de E2-dominante. Las células decidual son responsables de la secreción de factores hormonales para la implantación del blastocisto exitoso y para el desarrollo de la interfaz de útero-placentaria para el mantenimiento de la tolerancia al aloinjerto fetal.
Decidualization se requiere para la implantación y la subsecuente remodelación de las arterias en espiral decidual. Las células estromales del endometrio experimentan decidualization, bajo el control de P4 y campamento, durante la fase lútea tardía del ciclo menstrual1. Este proceso se inicia alrededor de los vasos sanguíneos y se extiende a lo largo del estroma, lo que sugiere su papel en la remodelación de la vasculatura y leucocito tráfico regulación. Esta transformación celular se caracteriza por una morfología circular, aumento del tamaño nuclear y expansión del retículo endoplásmico y aparato de Golgi2. Decidualized células estromales son capaces de producir factores paracrinos apoyando la implantación del blastocisto y caracterizan por la secreción de numerosas hormonas (es decir, prolactina), factores de crecimiento angiogénicos, factor de crecimiento insulínico binding protein-1 (IGFBP-1), prostaglandina (PG) E (estimulador de cAMP intracelular), citoquinas, componentes de la matriz extracelular y nutrientes esenciales para la placenta implantación y desarrollo3,4,5,6 .
La población de células decidual no se compone únicamente de células stromal decidualized pero también contiene poblaciones leucocitarias decidual grandes y específicos del embarazo. Decidualization incluye edema localizado transitorio y afluencia de células de naturales del asesinas (NK), células T, células dendríticas y macrófagos. La subpoblación más grande del leucocito es las células NK uterinas, que comprende aproximadamente el 50-70% de todos los leucocitos maternos la decidua que son una fuente de citocinas y factores angiogénicos que pueden ayudar en el proceso de decidualization y aumento de la infiltración número a lo largo del embarazo7. Macrófagos, siendo la segunda subpoblación de las células inmunes, se encuentran alrededor del sitio de implantación y aumentan durante el embarazo8. Son una fuente de citocinas y factores de crecimiento como colonia estimulante factor (CSF-1)9, factor de necrosis tumoral α (TNFα)10 y prostaglandina (PG) E11.
Durante el embarazo y antes de parto prematuro, la decidua es una fuente importante de citoquinas y quimioquinas responsables de activación leucocitaria periférica materna y posterior migración a los tejidos uterinos para iniciar el trabajo. Estudios en animales demostraron que numerosas citoquinas pro-inflamatorias son para arriba-regulados en la decidua de ratón durante el parto, tales como TNF-a, IL-6, IL-12 y IL-1b12. En la decidua humana, citoquinas proinflamatorias IL-1b, IL-6 e IL-8 (principales chemoattractant neutrófilo) exhiben mayor expresión durante el parto frente a no en el trabajo13. Estas Secretan citocinas resulta en una activación y afluencia de leucocitos en el tejido decidual14; un aumento de macrófagos decidual e infiltración neutrófila en ambos el ser humano y la rata se ve durante el parto de término, con infiltración decidual anterior myometrial 4 mayor, indicando una cascada de activación entre este los tejidos uterinos dos adyacentes 15. éstos infiltración leucocitos producen PGs capaces de activar las contracciones sincrónicas del miometrio16, metaloproteinasas de matriz (MMPs) para iniciar la membrana ruptura17,18, así como citoquinas proinflamatorias a amplificar el proceso de activación uterina ('tormenta del cytokine').
Debido a muchas funciones importantes de las células decidual, como jugando un papel fundamental en el proceso de implantación, mantener tolerancia materno fetal en la gestación temprana y participando en la activación del parto a término, pueden surgir diferentes patologías durante el embarazo. Por ejemplo, (1) infertilidad por fallo de implantación recurrente y pérdida recurrente de embarazo puede ser resultado de una falta de maduración decidual; (2) restricción del crecimiento intrauterino (RCIU) y preeclampsia debido al inadecuado desarrollo y disfunción de la decidua/placenta o transformación vascular comprometido en el cruce de decidual myometrial; Además de parto prematuro (3) que puede resultar de la activación decidual prematura.
A la luz de estos trastornos mayores, juntados con las limitaciones éticas y prácticas de estudios humano en vivo , establecimiento de líneas de células decidual humano primario es esencial para análisis en vitro con el fin de comprender mejor y mejorar el manejo clínico de las complicaciones del embarazo. Por lo tanto, el objetivo de nuestra investigación fue desarrollar un protocolo que permite el aislamiento de las células decidual primarias humanas con celular alto rendimiento y viabilidad de las membranas fetales de la placenta de término. Este protocolo actual claramente describe un método de tiempo y costo efectiva para aislar de subtipos específicos de decidual de las células que se utilizan para una variedad de análisis en vitro . Caracterización de la abundancia y el fenotipo de las subpoblaciones decidual en término y en comparación al primer o segundo trimestre es cruciales para definir sus funciones a lo largo de la gestación humana.
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Protocol
Se recoge la placenta de término sano, no en las mujeres de trabajo sometidas a cesáreas electivas. La colección, procesamiento y desechable de muestras humanas se adhieren a las directrices de la Junta del Mount Sinai Hospital ética. Se obtiene un consentimiento por escrito de cada paciente. Este estudio es aprobado por la Junta de ética de investigación en el Hospital Mount Sinai.
1. preparaciones
Nota: Todos los pasos deben llevarse a cabo bajo una campana de humos y todo el equipo quirúrgico debe ser esterilizado por autoclave antes de la colocación de la campana. Todos los demás materiales (botellas, tubos de 50 mL, etc.) deben ser esterilizados con solución de etanol 70%. Siempre use equipo de protección personal en todo momento al trabajar con residuos biopeligrosos (bata, guantes, cabello largo atado hacia atrás, etc.).
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Solución de digestión enzimática (solución Final: 200 mL)
- Pipeta 180 mL de HBSS-/ - en un vaso de precipitados de 500 mL, añada imán agitación estéril y colocar sobre placa de agitación a temperatura ambiente.
- Pesar y agregar lo siguiente a la HBSS/solución lentamente y secuencialmente: 20 mL de SBF, 400 mg 2 de colagenasa ([final] = 2 mg/mL), 20 mg inhibidor de la tripsina de Soya bean ([final] = 0.1 mg/mL), 30 mg 1 DNasa ([final] = 0.15 mg/mL) y 200 mg de BSA ([final] = 1 mg/mL)
- Configurar la agitación a velocidad media y permiten la mezcla revolviendo durante 10-20 min (cubierta con película de papel o la parafina lata agitación).
- Vierta la solución mezclada en una botella de vidrio de 250 mL utilizando un embudo de plástico y colocar en la capilla del humo.
- Pasar la solución a través de una unidad de filtración superior plástico (0.22 μm filtro de membrana, 500 mL), alícuota 20 mL en tubos de 50 mL (10 tubos total) y almacenar a-20 ° C hasta su uso.
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Medio RPMI 1640 (2% de lavado solución y medio completa 10%)
- Combine el RPMI 1640 y FBS en un frasco de vidrio en la campana.
- Solución al 2% FBS, combinan 490 mL de RPMI 1640 y 10 mL de SBF.
- Solución al 10% FBS, combinan 450 mL de RPMI 1640 y 50 mL de SBF.
- Pipetear 500 μL de normocin en la botella de vidrio de 500 mL del paso anterior que contiene los medios RPMI y FBS (50 mg/mL stock, 0.05 mg/mL trabajo concentración).
- Pasar los medios a través de un 0,22 μm filtro de membrana y tienda en una botella de vidrio de 500 mL a 4 ° C hasta su uso.
- 30 min antes de comenzar el experimento, colocar una alícuota de 20 mL de congelados solución de digestión enzimática en un baño de grano de 37 ° C, coloque el 2% FBS y los medios de comunicación 10% FBS RPMI 1640 en un baño de 37 ° C grano, encender el baño de agua oscilante y a 37 ° C , 2 g y establecer una centrifugadora de temperatura controlada de 4 ° C.
2. colección de tejido Decidual de las membranas placentarias de término
- Coloque botellas con HBSS + / +, HBSS-/-cinco tubos de 50 mL en un estante bajo la campana. Pipetear 25 mL de HBSS + / + en un tubo.
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Con las manos enguantadas, sacar la placenta de término del envase utilizado para el transporte desde el teatro de sala de operaciones. Poner la placenta en el cojín del pañal (maternal hacia arriba) y extensión de las membranas fetales usando tijeras y pinzas.
- Poner cojines superpuestos de pañal en la campana.
- Utilice un pañal separado para voltear la placenta para que el lado materno está boca arriba.
- Encontrar el punto de ruptura de la membrana y hacer incisiones para permitir que la membrana desplegar y poner el plano en la superficie de fumehood.
Nota: Una vez que la membrana se tira detrás de la placenta, la decidua será boca arriba descansando sobre la capa del corion, con la capa de amnios en la parte posterior.
- Con un raspador de plástico celular, raspe con cuidado el tejido decidual del corion y lugar en el tubo de 50 mL conteniendo 25 mL HBSS + / +.
- Raspar la membrana con una presión moderada. No aplique demasiada presión ya que puede causar contaminación del corion. Recoger pequeños coágulos de sangre así como éstos contienen algunas células decidual.
PRECAUCIÓN: Después de colección decidual, placenta debe ser empaquetada en un cubo de plástico de biohazard y congelada en un congelador de-20 ° C antes de la eliminación apropiada (de acuerdo con las reglas institucionales). Pads pañal sangriento ser envuelto en una bolsa de plástico de cierre hermético y deben en una caja de seguridad de sustancias biopeligrosas.
3. lavadora y enzimática de la digestión del tejido Decidual
- Lavar los tejidos recogidos suavemente agitando el tubo de 50 mL con la mano y pasar por un tamiz metálico (250 μm, tamaño 60 mesh) de 250 μm descansando sobre un recipiente de muestra estéril (orina).
- Repetir el lavado dos veces con HBSS + / + y dos veces con HBSS-/ - en tubos de frescos para cada lavado. (final se lava con HBSS-/-permite la eliminación de calcio y magnesio presente en HBSS + / +, que de lo contrario interferiría con el proceso de digestión enzimática).
TENGA EN CUENTA. Durante los pasos de lavado, contaminación de tejido corión será evidente como el tejido decidual es luz color de rosa en color y amorfo, mientras que el corion es blanco, denso y fibroso. Por lo tanto, contaminación del corion puede eliminarse fácilmente con fórceps. - Opcionalmente, si el tejido decidual es grueso, transferirlo a una placa de Petri estéril 10 cm diámetro y proceder a partir del tejido con dos bisturíes opuestas en el plato.
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Coloque el tejido lavado en tubo estéril de 50 mL que contienen 100 mg de tejido/mL de solución de digestión enzimática (ver preparación).
- Como punto de referencia, asegúrese de que el nivel de tejido decidual alcanza la marca de 5-10 mL en el tubo de 50 mL.
- Use aproximadamente 20 mL de solución de digestión enzimática (preparado en el paso 1.1) para digerir la decidua total recopilada de una membrana fetal de todo término.
- Sellar la tapa del tubo con la película de parafina (sellar herméticamente el tubo y envolver película de parafina alrededor de la tapa y la parte superior del tubo) bajo la campana y se incuba el tejido decidual a 37 ° C por 20 min en un baño (145 rpm 2 g).
- Después de la incubación, retirar la película de parafina y esterilizar la superficie del tubo que contiene el tejido digerido con etanol al 70% y bajo la campana. Agite el tubo brevemente con la mano.
- Recoger la suspensión celular por el tamiz de metal (250 μm, tamaño 60 mesh) en un nuevo contenedor de muestra estéril. Diluir con un volumen igual (20 mL) de RPMI + 10% FBS que contiene 0.1% normocin para detener la reacción enzimática. Proceder directamente al paso de centrifugación 4.1.
- Si es necesario, coloque el tejido restante no digerido en un nuevo tubo de 50 mL con 20 mL de solución de digestión enzimática fresco y repetir la digestión (20 min, 37 º C, agitación en baño de agua).
- Si una segunda digestión es necesaria, colocar el primer tubo con la suspensión celular en hielo (cubierta con la película de parafina para mantener estéril). Repita los pasos del 3.5-3.6 y combinar las suspensiones de dos células.
4. generar una suspensión unicelular
- Centrifugue la suspensión de células (420 g, 4 ° C, min 11).
- Quite el sobrenadante y resuspender las células en 40 mL de RPMI + 2% FBS que contiene 0,1% normocin ("buffer de lavado").
Nota: Precipitado de células sueltas y gelatinoso debido a la contaminación de eritrocitos, aspirar el sobrenadante con cuidado. Eliminación de la fase superior con una pipeta manual puede ser necesaria. - Repetir la centrifugación a 420 g a 4 ° C durante 11 minutos.
- Cuidadosamente Quite el sobrenadante (como se menciona en la nota paso 4.2) y resuspender el precipitado de células en 5 mL de tampón de lavado y añadir 35 mL de tampón de lisis de eritrocitos en el mismo tubo.
Nota: Si la pastilla es grande o muy sangriento, se puede dividir en dos tubos para el paso de lisis de eritrocitos al agregar 10 mL de tampón de lavado y dividir igualmente en dos tubos y luego agregar 35 mL de tampón de lisis de eritrocitos a cada tubo. - Incubar en hielo durante 20 min tubos de vórtice brevemente al principio y al final de la incubación para lisar los glóbulos rojos.
- Centrifugue a 420 g durante 11 minutos a 4 ° C.
- Con cuidado, quite el sobrenadante y resuspender el pellet en 40 mL de tampón de lavado.
- Pasar las células a través de un filtro de nylon μm 70 para quitar grumos de células.
- Centrifugar a 420 g durante 11 minutos a 4 ° C.
- Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en 10 mL de medio completo (RPMI 10% + SBF que contiene 0.1% normocin).
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Contar las células mediante el procedimiento de hemocitómetro de exclusión de colorante azul de trypan como se describe a continuación:
- Bajo el capó de la cultura pipetee suavemente suspensión arriba y abajo 3 x para mezclar bien antes de combinar con azul tripán. De 1,5 mL tubo preparar suspensión celular, diluido 1:2 (combinar 20 μL de solución de azul tripán) y 20 μL de la suspensión celular decidual. Cuidadosamente mezcle trypan azul celular solución mediante pipeteo arriba y abajo un par de veces (esta solución no es estéril).
- Coloque el hemocitómetro sobre la platina del microscopio con cubreobjetos de cristal en la parte superior.
Nota: El hemocitómetro es un portaobjetos de microscopio con rejillas que dan nueve grandes plazas divididos por líneas triples. Cada cuadrado grande tiene una superficie de 1 mm2, y la profundidad de líquido en la cámara es de 0,1 mm. Por lo tanto, el volumen de líquido que puede llenar cada cuadrado grande es 1 mm * 1 mm * 0,1 mm = 0,1 mm3= 10-4 mL. - Lentamente agregar 10 μL de la mezcla de células azul trypan en la ranura del hemocitómetro, permitiendo la acción capilar dispersar la mezcla de células sobre la diapositiva entera (parada antes mezcla bien llena).
- Ver las células bajo el microscopio (con 10 aumentos) y contar todas las células de blanco/verde que excluyen trypan blue (son las células viables) en las cuatro plazas exteriores grandes del hemocitómetro. Al contar las células que tocan la línea, cuenta sólo ese toque el derecho y líneas superiores pero no los toca la izquierda y la líneas de fondo. No cuentan las células azul oscuras; color azul indica que la célula está muerta como colorante trypan azul puede penetrar fácilmente a través de la membrana plasmática en el citoplasma.
- Para calcular el número de células viables en 1 mL de la suspensión celular (X):
2 = factor de dilución
10.000 = factor de conversión (1 mL = 1 cm3 = 10, 000 * 0. 1 mm3)
- Diluir las células decidual a una concentración final deseable en RPMI + 10% FBS (medio de cultivo).
Nota: Para placas de cultivo de tejidos, pipetear 2 * 106 células/pozo en una placa plástica de pozo de 6, 10 * 106 células en una placa de plástico de 10 cm o 75.000 células a un cubreobjetos de vidrio.
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Representative Results
Para validar la eficiencia y la viabilidad de las células aisladas, se caracterizaron por dos métodos: flujo cytometry y la inmunocitoquímica (ICC). 4 poblaciones celulares fueron dirigidas; las células stromal decidualized fueron detectados por los anticuerpos anti-vimentina, marcador pan-leucocitos CD45 fue utilizado para identificar células inmunes decidual, cytokeratin fue utilizado para detectar células epiteliales/endoteliales y finalmente, el cytokeratin 7 fue utilizado para detectar cualquier trofoblasto potencial (corion o placenta) contaminación.
Para la caracterización por citometría de imagen multicolor, células decidual recién aisladas fueron teñidas con un tinte fijable para determinar viabilidad celular. Las células fueron permeabilized y fija, seguidas de tinción con anticuerpos monoclonales de ratón conjugado con fluorocromo contra vimentin-APC, CD45-APC-H7, FITC de cytokeratin y el cytokeratin 7-PerCP. Información de anticuerpo se enumera en la Tabla de materiales. Células fijas y teñidas se almacenaron a 4 ° C durante la noche en la tinción de tampón para evitar la disociación de tinte de tándem y ejecutar al día siguiente en el citómetro de flujo de imagen corriente MK2. El análisis se realizó utilizando un software. Restos celulares y agregados fueron excluidos por compuerta serie con tres combinaciones de función secuencial/máscara (figura 1A-B). Controles bloquea fluorescencia menos uno (FMO) fueron utilizados para identificar poblaciones de células decidual positivo y solo mancha las células fueron utilizadas para la compensación (figura 2). Punto final parcelas demuestran la población de células teñidas positivamente de los cuatro marcadores (figura 2) y la viabilidad celular de 80% (figura 1). Imágenes representativas de células teñidas positivamente pueden verse en la figura 1. Usando este método, encontramos la población principalmente conformada por células del estroma (55-60%), leucocitos (35%), epitelios (1%) o las células del trofoblasto (0.01%) (Figura 1E). El experimento fue repetido tres veces. Estos resultados verifican la pureza (ausencia de contaminación el corion trofoblasto) y alta viabilidad de células decidual humanas primarias recogida y aislada de las membranas fetales de la placenta de término.
En un experimento separado de la ICC, fueron sembradas recientemente aisladas células decidual en vidrio cubreobjetos (75.000 células/cubreobjetos), permiten conectar y permaneció durante 48 horas en cultura. Los medios de comunicación fue cambiado después de 24 horas para eliminar las células muertas no inscritos. Las células luego se fijaron con metanol 50% - 50% de la acetona, permeabilized con 0,02% de tensioactivo no iónico y vinculante fue bloqueado con solución de bloqueo. Las células luego se tiñen con anticuerpos monoclonales de ratón: anti-CD45 (marcador de pan-leucocito), anti-citoqueratina (marcador de células epiteliales) y anti-citoqueratina 7 (marcador del trofoblasto) y anticuerpo de cabra policlonales anti-vimentina (marcador de células estromales). Cabra el burro y el ratón contra burro fueron utilizados como anticuerpos secundarios. DAPI se utilizó para teñir los núcleos. IgG de ratón, cabra IgG y anticuerpos secundarios sólo fueron utilizados como controles negativo y especificidad. Imágenes fueron tomadas en 20 aumentos en un microscopio confocal de disco giratorio. Anticuerpos utilizados se listan en la Tabla de materiales y las imágenes representativas se presentan en la figura 3. Nuestra observación visual indica que la mayoría de las células decidual primarias adjuntas son vimentina positiva células estromales (aprox. 95%), con un pequeño número de leucocitos (aproximadamente 1-2%), epitelios (aprox. 1%) y trofoblasto poblaciones de la célula (las células fueron detectado representa < 0,01% del total). La principal diferencia entre los resultados de ICC y de citometría de flujo es la disminución de CD45 leucocitos positivo población detectado por citometría de flujo. Esta discrepancia puede ser explicada por los métodos en los que se llevaron a cabo dos experimentos: en el análisis de citometría de flujo, las células decidual aisladas fueron procesadas inmediatamente y manchada, es decir la población de leucocitos se incluyó en el análisis. Con ICC, la suspensión total de células decidual era plateada y cultivada durante 48 horas en los medios de comunicación que en su mayoría apoyaba a la fijación de las células epiteliales y stromal y células no inmunes. Después de 24 h las células inmunes que no se quitaron durante el cambio de los medios de comunicación, representa la diferencia en los resultados presentados por estos dos métodos. Llegamos a la conclusión para el estudio de las subpoblaciones en la decidua humana de precaución especial embarazos complicados deben usarse para evitar la eliminación accidental de la población de leucocitos leucocitos.
Figura 1: estrategia para la discriminación de la población de células decidual que bloquean. (A) las células decidual fijadas recién aisladas fueron inicialmente cerradas para excluir los dobletes de la célula y (B) posteriormente cerrada con tres combinaciones de función secuencial/máscara excluir restos celulares. (C) células vivas (puerta rosa, 80% de la población total) se distinguen de las células muertas (puerta azul, 20% de la población total) con un tinte de viabilidad pueden corregir. (D) imágenes representativas de células decidual mancharon con marcador de viabilidad y cuatro conjugados fluorescentes de anticuerpos (Ab) (APC vimentina, CD45-APC-H7, citoqueratina FITC y el cytokeratin 7-PerCP). Barra de escala de puntos es igual a 7 μm. (E) una vez determinada una población libre de residuos, vivo de la célula, estos marcadores se utilizaron para determinar los porcentajes de cada tipo de célula dentro de la población de células decidual. Para figuras 1B y 1C, cada punto representa una sola célula decidual. Figuras 1A y 1C, la gama de colores de las tramas de punto representa densidad celular, con células muy densas lo que significa rojo y el azul menos densa de las células. Los datos presentados aquí están representante de 3 repeticiones biológicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Análisis de citometría de Representativeflow de las células decidual humanas primarias con FMO gating parcelas. Diagramas de punto de color representativo de células aislaron de decidua de término y teñidas con (A) vimentin-APC (marcador de células estromales), (B) CD45-APC-H7 (marcador de leucocitos), (D) y (C) cytokeratin-FITC (marcador de células epiteliales) cytokeratin 7-PerCP (marcador del trofoblasto) junto a cada control respectivo de FMO. Fluorescentes-menos-uno (FMO) controles, tubos que contienen el anticuerpo completo cóctel menos el marcador en cuestión y preparado idénticamente a la muestra experimental completamente teñida, se utilizaron durante el análisis de datos de citometría de flujo para determinar verdadero positivo poblaciones de células decidual. FMO controles muestran el fondo relativo y permitan la sincronización precisa de señales positivas verdadera. Los datos presentados aquí están representante de 3 repeticiones biológicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Análisis de Immunocytochemical de la representante de las células decidual humanas primarias. Las células decidual humanas primarias crecieron sobre cubreobjetos de vidrio durante 48 h, con los cambios de los medios de comunicación después de 24 h. las células fueron fijadas con acetona-metanol y teñidas con anticuerpo monoclonal de ratón anti-CD45 (marcador de leucocitos), anti-citoqueratina (marcador de células epiteliales) y anti-citoqueratina 7 (marcador del trofoblasto) anticuerpos y anticuerpo de cabra policlonales anti-vimentina (marcador de células estromales). Imágenes representativas muestran fibroblastos de vimentina positivo (A) (secundaria Abs: cabra el burro), (B) CD45 + leucocitos (Abs secundaria: anti-ratón burro), (C) células epiteliales positivas de cytokeratin (Abs secundaria: burro anti-mouse) y (D) citoqueratina 7 positivo trophoblast células (Abs secundaria: anti-ratón burro) fueron detectados (coloración roja). Tinción DAPI se utilizó para teñir los núcleos de las células (coloración azul). Ratón no específica y cabra IgG (IgG M y G IgG) se utilizaron como controles negativos, omitiendo primaria Abs fueron utilizados como controles de anticuerpo secundario (M 2nd solamente y G 2nd solamente). Imágenes se toman con 20 aumentos en un microscopio confocal de DMI spinning disc. Barras de escala = 32 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El protocolo aquí descrito muestra un costo y el tiempo efectivo método para aislar las células decidual primarias recogida de las membranas fetales de la placenta de término todo humano que es muy accesible y sencilla. El éxito de este protocolo depende de dos factores fundamentales, (1) eficiencia de decidual raspar de la capa del corion de las membranas fetales y (2) el cuidado con que se manejan las células decidual en el protocolo. Es importante que la contaminación de tejido del corion está controlada por asegurando que ninguno está incluido accidentalmente durante el raspado decidual y mediante la identificación y eliminación de cualquier contaminación durante las etapas de lavado (la diferencia en la morfología de la decidua y corion permite la fácil remoción del corion que puede recopilarse accidentalmente con la decidua). Las células decidual son frágiles por lo tanto rápido y frecuente uso puede resultar en menor viabilidad. Sugerimos, entonces, que el ajuste de velocidad de expulsión de pipeta debe permanecer en el lento y mínimo pipeteo debe utilizarse cuando se mezclan las células.
Una de las maneras en que este protocolo previene la contaminación de trofoblasto es únicamente recogiendo decidua de las membranas fetales de la placenta (que abarca los parietalis de los decedentes), excepto la colección de la decidua basal que se realiza por tomar biopsias desde el lado materno de la placenta. Por lo tanto, mientras el protocolo actual mejora la pureza de la población de células decidual aislamos, excluyen una parte de la decidua (es decir, decidua basalis) que puede representar una limitación para la investigación dirigida a esta parte de la decidua o cuando ambos se requieren secciones de la decidua. Esta exclusión comprende la mayor limitación de este estudio. Además, al aislar las células decidual de pacientes humanos permite una visión biológicamente más relevante decidual e investigación embarazo, menos manipulación y menos períodos de tiempo pueden ser estudiados en comparación con estudios realizados en roedores debido a razones éticas.
A lo largo de este protocolo, hay pasos que pueden probar a crear dificultad, y si no está debidamente mitigados mayo influyen en el rendimiento de la célula y la viabilidad. Para esta vuelta, modificaciones deba hacerse. Es el más crítico para asegurar que el raspado decidual de las membranas fetales es suficiente (paso 2.4); debido a la variabilidad humana, cada placenta puede ser diferente en cuanto a la cantidad de tejido decidual, consistencia del tejido y nivel de sequedad del tejido. Es importante modular el raspado para asegurarse de que sólo la decidua se suprime. Si la decidua y las membranas están secas, PBS/puede ser vertido en las membranas para permitir más fácil raspar. El segundo paso es la lisis del eritrocito de la suspensión de células decidual (paso 3.4). Como se mencionó, si el precipitado de células es muy grande y contiene una gran cantidad de sangre, la pelotilla se puede dividir en dos tubos para mejorar la eficiencia de la lisis. Si todavía hay glóbulos rojos después de este paso puede ser necesario dividir la pastilla en tubos más para máxima eficiencia.
Mientras que los protocolos diferentes aislamiento decidual de la placenta de término y el aislamiento de la célula endometrial de las mujeres no embarazadas sometidas a histerectomías han sido previamente publicados18,19, estos métodos no abordan varios limitaciones, tales como la viabilidad celular baja y la contaminación de tejido adyacente. Se consideraron estos límites al diseñar el protocolo presentado aquí, que conduce a una mayor producción de células, mayor viabilidad y menor riesgo de contaminación de los tejidos circundantes. Previamente, disociaciones automáticos se han utilizado para romper mecánicamente el tejido decidual19,20. Este método es relativamente áspero como una disociación mecánica vigorosa donde el tejido decidual se recoge en un tubo insertado en la máquina que funciona de manera similar a una licuadora girando rápidamente Cizallas para romper el tejido, resultando en viabilidad celular disminuida. Nuestro nuevo método descrito aquí combina un corto (20 minutos) digestión enzimática combinada con suave balanceo agua baño movimientos actuando en lugar de fuerzas mecánicas aplicadas al tejido. La solución de digestión enzimática está diseñada para aumentar la viabilidad celular y la producción, que contiene (1) colagenasa para digerir la matriz extracelular del tejido decidual; (2) un inhibidor de la tripsina de soja para evitar la digestión inespecífica debido a una actividad trypsinolytic restante de la colagenasa; (3) DNasa 1 para quitar el flotante ADN (4) suero bovino fetal (FBS) y proteína de albúmina de suero bovino (BSA) para proteger a las células de digestión excesiva. La segunda limitación importante de los estudios anteriores reside en el hecho de que la decidua basalis fue recogida mediante la reducción de la capa superior de la parte materna de la placenta que potencialmente puede causar contaminación trofoblástica. Nuestro nuevo protocolo aísla la decidua parietalis raspando suavemente la decidua de la membrana fetal (corion) y permite la fácil remoción de contaminación corion durante los pasos de lavado.
Por lo tanto, nuestro método permite un aislamiento sin complicaciones de células decidual primarias de membranas placentarias en un corto periodo de tiempo (todo el proceso tarda aproximadamente 3 horas) dando por resultado la celda alta rendimiento y viabilidad celular excelente. Una vez que se han aislado células decidual puede utilizarse para multitud de experimentos; por ejemplo, las células decidual primarias humanas pueden ser sembradas en cubreobjetos para análisis de immunocytochemical, pueden ser crecidos en cultivo para diversos tratamientos y manipulaciones, así como directamente mancharon para que el análisis de citometría de flujo multicolor evaluar la composición de decidua humana con complicaciones del embarazo en un intento por comprender el papel de las subpoblaciones de células diferentes. Mientras que el método presentado aquí se utilizó para aislar células de placenta de término (el final del tercer trimestre de la gestación humana), este protocolo también se puede adaptar fácilmente a la primera y la segunda placenta trimestre permitiendo flexibilidad de la etapa de gestación que se dirige a la investigación.
Protocolos publicados han utilizado previamente dissociations automáticos para romper aparte tejido decidual o digestión enzimática solo21,22. Mediante la combinación de una suave fuerza mecánica (balanceo baño de agua a 37 ° C) así como una Cóctel de digestión enzimática diseñada para optimizar la digestión y la viabilidad celular, el protocolo descrito crea el balance ideal entre rendimiento celular y viabilidad. Además, protocolos anteriores no han podido mencionar el rendimiento total de la célula obtenida de sus aislamientos y sólo presente la célula viabilidad porcentaje19. A continuación os mostramos un alto rendimiento de las células decidual, determinado a través de la cuenta (desde 10 millones por la placenta) de la célula. Por otra parte, muchas de las publicaciones actuales demuestran el aislamiento de las células decidual endometrial/primarias de ratones; el protocolo permite el estudio de tejidos humanos, haciéndola una fuente biológicamente más relevante de las células para la experimentación23. Este protocolo también se puede adaptar fácilmente a la primera y la segunda placenta trimestre permitiendo flexibilidad de la investigación de la etapa de gestación que se está abordando. Una vez que las células han sido aisladas, puede utilizarse en una variedad de técnicas experimentales como la inmunocitoquímica, citometría de flujo, proteína y RNA extracción, aislamiento posterior de leucocitos, etc. en intento de comprender el papel de la célula diferentes las subpoblaciones. Identificar diferencias en la expresión de genes y proteínas en los estudios de decidua entre embarazos sanos y complicados (como preeclampsia prematuros mano de obra) mediante el uso en tiempo real PCR o amplia del genoma asociado puede proporcionar nuevas dianas que pueden ayudar en el desarrollo de herramientas diagnósticas y terapéuticas. Además, alteraciones en la relación de las células decidual, específicamente de leucocitos, que pueden identificarse fácilmente mediante el uso de citometría de flujo también pueden proporcionar respuestas para la etiología de las complicaciones del embarazo, tales como cambios en ambos del leucocito ratios de subpoblación, así como su estado de activación que se han demostrado para ser modulada en término y pretérmino24.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a los donantes, el Banco de RCWIH y el Hospital Mount Sinai/UHN Departamento de Obstetricia y Ginecología por el especímenes humanos utilizados en este estudio. Nos gustaría agradecer a los miembros del laboratorio de lejía, particularmente el Dr. Caroline Dunk por su ayuda con el desarrollo del método. Este trabajo es apoyado por el fondo de la recepción de Burroughs (grant #1013759).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hank’s balanced salt solution with calcium and magnesium | Prepared in facility (LTRI) | ||
| Hank’s balanced salt solution without calcium and magnesium | Prepared in facility (LTRI) | ||
| Diaper pads | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Large surgical scissors | AL Medical | 2018-12-20. | |
| Large surgical forceps | Fine Science Tools | 11000-18 | |
| Plastic disposable cell scraper (25 cm) | Sarstedt | 83.183 | |
| 250 mm (size 60 mesh) metal sieve | Sigma-Aldrich | S1020-5EA | |
| Disposable scalpel with plastic handle (#21) | Fisher Scientific | 08-927-5D | |
| Sterile plastic petri dish (diameter 10 cm) | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| Sterile specimen container (urine cup, 4.5 oz) | VWR | 25384-146 | |
| Nylon filter (70 mm) | VWR/Corning | 21008-952 | |
| Erythrocyte lysis buffer | Qiagen | 79217 | |
| Trypan blue, 0.4% solution | Lonza | 17-942E | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Hemocytometer | Reichert | 1490 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 culture media | Invitrogen | 11835-055 | |
| Fetal bovine serum | Wisent | 080-150 | |
| Normocin (50mg/ mL) | Invivogen | ant-nr-1 | |
| Plastic top filtration unit (0.22 mm membrane, 500 mL) | Millipore | SCGPT05RE | |
| Collagenase 2, lyophilized powder | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| Soy bean trypsin inhibitor, powder | Sigma-Aldrich | T9003-250mg | |
| DNase powder | Roche | 10104159001 | |
| Bovine serum albumin (BSA powder) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Spinning disc confocal microscope - Leica DMI 6000B | Leica | ||
| Imaging Flow cytometer - Image Stream MK2 | Amnis | ||
| IDEA software | Millipore Sigma | ||
| APC-conjugated Vimentin antibody | R&D Systems | IC2105A | |
| APC H7-conjugated CD45 antibody | BD | 641399 | |
| FITC-conjugated Cytokeratin antibody | MACs Miltenyi Biotec | 130-080-101 | |
| PerCP -conjugated Cytokeratin 7 antibody | Novus | NBP2-47941PCP | |
| eFluor450 Fixable Viability dye | Thermo Fisher Scientific | 65-0863-14 | |
| Vimentin primary antibody | Santa Cruz | sc-7558 | |
| CD45 primary antibody | Dako | M0701 | |
| Cytokeratin primary antibody | Dako | M0821 | |
| Cytokeratin 7 primary antibody | Dako | M7018 | |
| Mouse IgG | Santa Cruz | sc-2025 | |
| Goat IgG | Santa Cruz | sc-2028 | |
| Alexa Fluor 546 secondary antibody | Invitrogen | A10036 | |
| Alexa Fluor 594 secondary antibody | Fisher Scientific | A-11058 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 |
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