Summary
نقدم هنا، بروتوكولا لتنقية اكسوسوميس من البلازما والمصل مع انخفاض تنقية المشارك من بروتينات الدم غير اكسوسومال. ويشمل البروتوكول الأمثل ultrafiltration وعلاج مبطلات وحجم الاستبعاد اللوني. تنقية اكسوسوميس فوائد تحليل المتلقين للمعلومات، بما في ذلك تقدير أكثر دقة من حويصلات وتوصيف البروتين المعزز.
Abstract
اكسوسوميس، نوع من نانوفيسيكلي صدر من جميع أنواع الخلايا، يمكن أن تكون معزولة عن أي السوائل الجسدية. محتويات اكسوسوميس، بما في ذلك البروتينات والكشف، فريدة من نوعها للخلايا التي يتم اشتقاق ويمكن أن تستخدم كمؤشرات للمرض. عدة بروتوكولات تخصيب مشتركة، بما في ذلك تنبيذ فائق، تسفر عن اكسوسوميس محملة بالملوثات بروتين قابل للذوبان. على وجه التحديد، لقد وجدنا أن البروتينات الأكثر وفرة في الدم غالباً ما تنقية يشترك مع اكسوسوميس ويمكن الخلط بين دراسات البروتين المصب، وإحباط تحديد المرشحين العلامات البيولوجية وفرة منخفضة. لقلق إضافي إيريبرودوسيبيليتي اكسوسومي البروتين الكمي بسبب التمثيل غير متناسقة من مستويات البروتين غير اكسوسومال. ووضع البروتوكول بالتفصيل هنا لإزالة البروتينات غير اكسوسومال التي شارك تنقية جنبا إلى جنب مع اكسوسوميس، مشيراً إلى الصرامة في عملية تنقية اكسوسومي. وقورنت خمس طرق استخدام إقران بلازما الدم والمصل من خمس جهات مانحة. وكشف التحليل باستخدام نانوحبيبات تتبع تحليل وفحص البروتين حمض بيسينتشونينيك الصغرى أن بروتوكول المجمعة باستخدام أولترافيلتريشن وحجم الاستبعاد اللوني أسفرت عن إثراء حويصلة الأمثل وإزالة البروتين للذوبان. واستخدمت للتحقق من أنه تم استنفاد بروتينات الدم الوفيرة المتوقعة، بما في ذلك الزلال وأبوليبوبروتينس، النشاف الغربية.
Introduction
اكسوسوميس نانوفيسيكليس (يتراوح حجمها بين 30 نانومتر إلى 150 nm) نشرته تقريبا جميع الخلايا الموجودة في جسم الإنسان لتسهيل الاتصالات خلية إلى خلية العمليات1،2. من المثير للاهتمام، التغييرات تكوين اكسوسوميس تبعاً لخلايا المنشأ، فضلا عن الحالة الصحية ل الفرد3،4،5. بالإضافة إلى ذلك، اكسوسوميس يمكن استردادها من سوائل بيولوجية عديدة مثل: اللعاب والبول والدم2. وبسبب هذه الميزات، تعتبر اكسوسوميس يكون مصدرا جيدا للمؤشرات الحيوية في الأمراض. ولسوء الحظ، لا يوجد أي أسلوب القياسية لعزل اكسوسوميس. النظر بعض معامل الطرد المركزي متعددة الخطوات، مع خطوة عالية السرعة نهائية في س 100,000 ز استخدام التدرجات الكثافة كأسلوب المعيار الذهبي لعزل اكسوسومي. ومع ذلك، أظهرت دراسات أجريت مؤخرا أن تنبيذ فائق الحث على تجميع اكسوسوميس مع البروتينات القابلة للذوبان وأخرى اكسوسوميس، بالإضافة إلى التأثير على سلامة اكسوسومي، التي قد تعوق تطبيقات المصب6،7 . تشمل أساليب أخرى مشتركة من العزلة اكسوسومي، ولكن لا تقتصر على: هطول الأمطار بالتجاري البولي إثيلين غليكول (شماعة) على أساس الكواشف والطرد المركزي أولترافيلتريشن وحجم الاستبعاد اللوني (ثانية). إثراء الكواشف التجارية استخدام البوليمرات البولي إثيلين غليكول (شماعة) اكسوسوميس التي تسبب لهم أن يعجل وتشكيل من بيليه. قيود استخدام هذا البوليمر تلوث ببقايا شماعة البوليمر، ووفرة من البروتينات اكسوسومال غير قابلة للذوبان في المنتج النهائي. ويستخدم أولترافيلتريشن الطرد المركزي لتنقية وتركز حويصلات استخدام غشاء السليولوز؛ يتم الاحتفاظ اكسوسوميس فوق عامل التصفية، بينما أصغر من الشوائب والبروتينات الأخرى تمر عبر غشاء7،8. تماما مثل أساليب أخرى، قد أولترافيلتراتيون الطرد المركزي قدرة محدودة على تنقية اكسوسوميس بسبب الاحتفاظ بمستويات عالية من البروتينات غير اكسوسومال، بما في ذلك مجمعات البروتين والمجاميع. وأخيراً، يستخدم تنقية ثانية راتنج مسامية لفصل الجزيئات بحجم. ثانية وقد أظهرت نتائج واعدة، التغلب على معظم المشاكل التي تعاني منها مع الأساليب الأخرى التي استولت على غالبية البروتينات الملوث والحفاظ على سلامة اكسوسومال، منذ عزل استناداً إلى خطورة أو أنظمة الضغط المنخفض7، 9. ومع ذلك، يؤثر عزلة أكبر المجاميع والبروتينات الدهنية البروتين10 المشارك خلال ثانية نقاء إعداد اكسوسومي النهائي. في حين تم اختبار بعض الأساليب لتنقية اكسوسومي من supernatants ثقافة الخلية والبلازما7أو9،البلازما فقط11، لا توجد معلومات حول أداء طرق مباشرة مقارنة الدم البلازما والمصل من الفرد نفسه.
هنا، علينا أن نركز على تنقية الدم اكسوسوميس بمقارنة مجموعة متنوعة من مهام سير العمل لتحديد ما إذا كانت تقنيات التخصيب حويصلة قابل للنقل بين البلازما والمصل. نانوحبيبات تتبع التحليل ووصمة عار الغربية استخدمت لقياس الاختلافات في تكوين اكسوسومي التركيز والنقاء والبروتين في المنتجات النهائية. يزيد أرقام حويصلة الأسلوب النهائي، المفصلة في هذا البروتوكول، ويقلل من مستويات البروتين غير اكسوسومال. الأهم من ذلك، هو أظهر انخفاض حاد للبروتينات عجلت المشترك المشتركة بما في ذلك الزلال وأبوليبوبروتينس. وفرة عالية من هذه البروتينات اثنين في الدم وتواتر فيه أنها شاركت تنقية مع اكسوسوميس أسباب التضارب بين عينات "النقية"، وانحراف التحليلات المتلقين للمعلومات. ويشمل هذا البروتوكول استخدام راتنج SEC المتوفرة تجارياً؛ وتتألف من الخرز المليئة بالثغرات التي يمكن أن تدخل البروتينات أقل من 700 كاتشين الخرز الراتنج. مرة واحدة في الداخل، يتم الاحتفاظ بالبروتينات قبل يجند أوكتيلاميني. النذرة يتكون من اكسوسوميس وجزيئات أكبر من 700 كاتشين12. بالإضافة إلى ذلك، بغية الحد من المجاميع البروتين وأبوليبوبروتينس التي تهرب حبة الملائمة، ندرج خطوة هضم حوزتي في سير العمل. حاليا، هناك لا توجد تقنية واحدة قادرة على تحقيق الحد الأقصى من الغلة اكسوسومي بينما الحد المشترك تنقية البروتينات غير اكسوسومال. وتبين هذه الدراسة أن بروتوكول تنقية يجمع بين المعالجة هضم حوزتي مع أساليب الاسترداد وتنقية متعددة يمكن استخدامها لزيادة الغلة اكسوسومي والنقاء من مصل الدم والبلازما.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وتقرر هذا العمل لا أن تكون البشرية موضوع البحث من الاستعراض الأولى من المؤسسية استعراض المجلس (مجلس الهجرة واللاجئين جامعة ولاية كولورادو)، كما تم الحصول عليها كعينات الشطب المحددة من بيوريبوسيتوري IVT بيوريكلاميشن جميع العينات البشرية وكانت جمعت تحت بروتوكولات وافق مجلس الهجرة واللاجئين.
1-إعداد "نموذج النفط الخام" (المصل أو البلازما) "التكوير حويصلات أكبر" و "الحطام الخلوية"
ملاحظة: النظر في سلامة: البلازما والمصل وسوائل بيولوجية أخرى هي مواد اوتوكلاف وينبغي تناولها بعناية خاصة، حين ارتداء معدات الوقاية الشخصية الأساسية، بما في ذلك القفازات ومعطف المعمل. يوصي بشدة أن تتم معالجة العينات البيولوجية في السلامة الأحيائية مجلس الوزراء؛ أن لم يكن متاح، ينصح باستخدام حماية العين.
- حجته مصل أو عينة بلازما عن طريق وضع الأنبوب تحت ظروف غير الهز في ثلاجة 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها (من-20 أما أو التخزين-80 درجة مئوية).
- الكوة 250 ميليلتر من العينة في أنبوب ميكروسينتريفوجي باستخدام ماصة ميليلتر 1,000.
- الطرد المركزي العينة في 18,000 س ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- استخدام ماصة 200 ميليلتر، إزالة 200 ميليلتر من المادة المطهرة طافية وإضافته إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي جديدة. تجنب أي مواد الأعلاف أثناء نقل المادة طافية. تجاهل مواد الأعلاف.
- تقدير محتوى البروتين من العينة بمقايسة حمض (اتفاق التعاون الأساسي) بيسينتشونينيك، باستخدام البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة. للقيام التحليل، تضعف العينة 01:50 في 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS). اختبار كل عينة في مكررة.
ملاحظة: استخدم برنامج تلفزيوني x 1 في جميع أنحاء البروتوكول ما لم ينص على خلاف ذلك. وفي المتوسط، سوف تسفر عن 200 ميليلتر لتوضيح المصل أو البلازما (بعد س 18,000 ز) ملغ 15 من مجموع البروتين. أنواع العينات الأخرى، مع أدنى أو أعلى من البروتين، وقد يتطلب إضافية اتفاق التعاون الأساسي تخفيف. - الكوة 10 ملغ من العينة في أنبوب ميكروسينتريفوجي جديدة. استخدام تركيز التي تم الحصول عليها في الخطوة 1، 5 لحساب حجم العينة المناظرة. قاسمة العينة باستخدام ماصة 200 ميليلتر.
ملاحظة: من المستحسن تخزين العينة المتبقية في-80 درجة مئوية. الكوة استخدام العينة في أنابيب مختلفة في 10 ملغ في أنبوب لتجنب تجميد أذاب عدة دورات في المستقبل.
2-هضم بروتينات الدم غير اكسوسومال
ملاحظة: الخطوة الهضم يهدف إلى الحد من البروتينات غير اكسوسومال التي يمكن تنقية يشترك مع اكسوسوميس. إذا كان الحفاظ على البروتينات السطحية اكسوسومي المطلوبة لتحليل المتلقين للمعلومات، فإنه ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار أن هذه الخطوة يمكن أن تتداخل مع هذا التحليل. الكشف عن اكسوسومال CD63، بروتين تيتراسبانين سطح مكشوف، كان لم يؤثر سلبا إلى حد كبير بهذه العملية.
- إعداد بروتيناز ك الحل بتركيز 500 ميكروغرام/مل في برنامج تلفزيوني. إضافة المبلغ المقابل بروتيناز ك في أنبوب مخروطي. قم بإضافة المخزن المؤقت ودوامه لمدة 30 ثانية، x 3 في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة 50 ميليلتر من البروتيناز ك حل للعينة 10 ملغ الكوة وتخلط بلطف من بيبيتينج صعودا وهبوطاً باستخدام ماصة ميليلتر 200.
- احتضان العينة في 37 درجة مئوية في حمام مائي للحد الأدنى 30 مكان الأنبوبة في حامل أنبوب تعويم وتجنب الغمر الكامل للأنبوبة في حمام الماء لتجنب احتمالات التسرب.
- نقل العينة والعائمة أنبوب رف إلى حمام مائي 60 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، لإلغاء تنشيط بروتيناز ك.
3-إزالة البروتينات الصغيرة والببتيدات بالطرد المركزي أولترافيلتريشن
- شطف جهاز أولترافيلتريشن الذي يحتوي على الوزن الجزيئي كاتشين 100 وقف إنتاج المواد الانشطارية (موكو) عامل التصفية مع برنامج تلفزيوني قبل الاستخدام. القيام بذلك عن طريق إضافة 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني لعامل التصفية، باستخدام ماصة ميليلتر 1,000. تدور الجهاز في 3,700 س ز لأدنى 5 تجاهل أي ريتينتاتي المتبقية، فضلا عن النذرة.
ملاحظة: يجب أن تكون قدرة حجم العينة من الجهاز أولترافيلتريشن مل 0.5-4 مل التأكد من أن حجم العينة مخفض النهائي 50 ميكروليتر قابل للتحقيق. - أخذ العينة من الخطوة 2، 4 وزيادة الحجم إلى 500 ميليلتر بإضافة برنامج تلفزيوني. "الماصة؛" العينة في الجهاز ultrafiltration مشطوف مسبقاً.
ملاحظة: في المتوسط، هو حجم العينة من الخطوة 2، 4 ميليلتر 185 (120 إلى 150 ميليلتر من عينة و 50 ميليلتر من حل بروتيناز ك). - مكان الجهاز أولترافيلتريشن في أجهزة الطرد مركزي benchtop زاوية ثابتة في س 3,700 ز في 4 درجات مئوية حتى العينة قد خفض حجم 50 ميليلتر.
تنبيه: عند استخدام أجهزة أولترافيلتريشن مع توقف الميت وحدة التخزين، يجب الحرص على تجنب جفاف الغشاء تصفية كاملة خلال خطوات استخدام الطرد المركزي. - إضافة 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني مباشرة في غشاء التصفية وماصة صعودا وهبوطاً 5 مرات. الطرد المركزي كما هو الحال في الخطوة 3، 3. تنفيذ هذه الخطوة يغسل ما مجموعة 3 مرات.
- نقل ريتينتاتي النهائي 50 ميليلتر في أنبوب ميكروسينتريفوجي جديدة.
- شطف غشاء التصفية مع برنامج تلفزيوني 200 ميليلتر، بيبيتينج صعودا وهبوطاً 10 مرات، ونقل الغسيل للأنبوب من الخطوة 3، 5.
- وضع الفلتر في الموضع معكوس في أنبوب جديد. تشغيل انتعاش عكس سبين لمدة 5 دقائق في س 2,000 ز لاسترداد العينة المتبقية من الغشاء. تجمع العينة بالعينة من الخطوة 3، 5.
4-تنقية حويصلات من حجم الاستبعاد اللوني (ثانية)
- إضافة ميليلتر 850 من الملاط ثانية، مع الخرز بعد موكو من 700 كاتشين، إلى عمود تدفق جاذبية فارغة، توج باستخدام ماصة ميليلتر 1,000. وضع الأعمدة بحجم الرف مناسبة مزودة بعلبة بالتنقيط.
- زجاجتين أسفل العمود والسماح لاستنزاف السائل لمدة 5 دقائق. عندما ينضب، إضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني لغسل الراتنج. تسمح 20 دقيقة للغسيل لاستنزاف من العمود.
- ضع مركزة، بروتيناز ك تعامل عينة من الخطوة 3.5 في أنبوب مخروطي 15 مل، وزيادة حجم العينة إلى 5 مل إضافة برنامج تلفزيوني مع ماصة مصلية. خلط الأنبوب بلطف هزاز لمدة 1 دقيقة ومن ثم ببطء تطبيق العينة إلى العمود بإعدادها في الخطوة 4، 2 مع ماصة مصلية.
ملاحظة: حالما تتم إزالة الحد الأقصى للعمود، العينة سوف تتدفق من خلال الراتنج بالجاذبية؛ وسيتدفق العينة 5 مل تماما من خلال العمود في 10 دقيقة. - جمع التدفق من خلال في أنبوب مخروطي 15 مل جديدة.
- استخدام ماصة مصلية، تطبيق المواد التي تم جمعها إلى الراتنج مرة أخرى لإزالة أي مواد المتبقية أدناه كاتشين 700.
- جمع التدفق من خلال في أنبوب مخروطي 15 مل جديدة. أغسل الراتنج مرتين إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني. جمع من خلال التدفق في الأنبوب من الخطوة 4-5؛ إجمالي الحجم النهائي سيكون تقريبا 7 مل.
ملاحظة: بعد الخطوة 4، 6، العينة سوف تكون مخففة حوالي 35 مرة من حجم العينة الأصلية؛ الخطوات التالية سوف تقلل الحجم وتركيز العينة اكسوسومي المنقي.
5-تركيز اكسوسوميس المنقي وتقدير كمية البروتين الكلي
- شطف جهاز أولترافيلتريشن مع عامل تصفية موكو كاتشين 3 مع برنامج تلفزيوني قبل الاستخدام، كما هو موضح في الخطوة 3، 1.
- إضافة العينة من الخطوة 4، 6 إلى جهاز أولترافيلتريشن وجهاز الطرد المركزي في دوار دلو يتأرجح في 3,700 س ز في 4 درجات مئوية. المخزن المؤقت سوف تمر من خلال عامل التصفية، ويمكن التخلص. سيتم الاحتفاظ بمركزه اكسوسوميس فوق عامل التصفية. الطرد المركزي العينة حتى يتم تقليل الحجم فوق عامل التصفية (ريتينتاتي) إلى 200 ميليلتر.
- نقل ريتينتاتي إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي جديدة.
- شطف غشاء التصفية مع 200 برنامج تلفزيوني ميليلتر من بيبيتينج عبر الغشاء 10 مرات، ونقل الغسيل للأنبوب من الخطوة 5.3. وهذا سيسمح لجمع أي عينة اكسوسومي المتبقية.
- إحضار حجم عينة تصل إلى 500 ميليلتر بإضافة برنامج تلفزيوني. مزيج من بيبيتينج ببطء صعودا وهبوطاً 10 مرات.
ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا. يجب تخزين العينات في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها أو في-20-80 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل. - تقدير محتوى البروتين من العينة بمقايسة اتفاق التعاون الأساسي، باستخدام البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة. تمييع عينة 01:10 و 01:50 في برنامج تلفزيوني. قم بتشغيل كل عينة في مكررة.
ملاحظة: بدءاً من 10 ملغ بروتين الكلي للمصل أو البلازما، العائد مجموع البروتين في اكسوسوميس المنقي من الخطوة 5.6، في المتوسط، تخفيف 150 ميكروغرام. إضافية قد تكون ضرورية إذا استخدمت عينات خلاف المصل أو البلازما؛ العائد قد تختلف مع نوع العينة.
6-التحديد الكمي والتحجيم من اكسوسوميس نانوحبيبات تتبع تحليل (NTA)
- إضافة 5 ميكروغرام من اكسوسوميس المنقي (كما كمياً في 5.6) إلى 1 مل من برنامج تلفزيوني ودوامه لمدة 15 ثانية على السرعة المنخفضة والمتوسطة.
- ضع العينة في حقنه المتاح 1 مل. إذا كان متوفراً، مجموعة المحاقن في مضخة محقن تلقائي لتعيين إلى حقن العينة اكسوسومي المخفف بمعدل 30 ميليلتر/دقيقة.
- إجراء قياسات الإدارة الوطنية للسياحة باستخدام إعدادات التقاط الفيديو: شاشة للحصول على مستوى 3-4 والكاميرا من 12-13.
- تعريف البرنامج النصي للتحليل لتشغيل ثلاثة replicates التقني للحد ني 30 ثانية باستخدام تدفق مستمر لكل تكرار. للتحليل، وتعيين عتبة القبض على 5.
ملاحظة: تتوفر التفاصيل المتعلقة باستخدام المحاقن التلقائية، والإعدادات لالتقاط الفيديو في مرجع13. يجب أن تكون إعدادات التقاط وتحليل للإدارة الوطنية للسياحة متسقة عبر عينات مختلفة لضمان القابلية للمقارنة.
7-تحديد الحد بروتين قابل للذوبان
- إضافة 1-10 ميكروغرام من اكسوسوميس المنقي للمخزن المؤقت لنموذج صحيفة بيانات السلامة وتنفيذ polyacrylamide هلام التفريد (الصفحة) باستخدام "هلام" مكررا-تريس 4-12% في تشغيل المخزن المؤقت لمدة 35 دقيقة في 200 صحيفة بيانات السلامة x MES 1 حل خامسا-نقل البروتينات إلى غشاء النيتروسليلوز 0.2 ميكرون بتطبيق س جهد و 50 الخامس حاء – 1-1.5 إجراء تحليل لطخة غربية لتقييم وجود الزلال، أبوليبوبروتينس أ وب، وعلامة اكسوسومي 63 مؤتمر نزع السلاح بعد المنهجيات القياسية.
ملاحظة: ويمكن الاطلاع على البروتوكولات الكامل للأساليب في 7.1 في مرجع14؛ على وجه التحديد، SP007: تشغيل الهلام بولياكريلاميدي و SP011: بروتوكول لطخة غربية. - فصل 10 ميكروغرام لتنقية اكسوسوميس استخدام الصفحة كما هو الحال في الخطوة 7، 1 ووصمة عار للعصابات البروتين صبغ أخذ التوصيات القياسية التالية، تصور اختلاف البروتين والحد بين العينات.
ملاحظة: وترد مزيد من التفاصيل فيما يتعلق بالبروتوكول للبقع الغربية محددة إلى CD63 دياز وآخرون. 15
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم الحصول على البيانات المعروضة أدناه باستخدام عينات البلازما والمصل المزدوجة من المتبرعين بالدم صحية خمسة. لتحديد آثار كل خطوة من خطوات التجهيز، أجريت خمسة اختلافات البروتوكول المقدم، وقورنت إزالة البروتين الاسترداد وغير اكسوسومي اكسوسومي. أساليب تجربته وشملت: 1) كاتشين 700 ثانية + كاتشين أولترافيلتريشن 3؛ 2) كاتشين ultrafiltration 100؛ 3) بروتيناز ك + كاتشين أولترافيلتريشن 100؛ 4) ثانية كاتشين 700 + كاتشين أولترافيلتراتيون 100، و 5) بروتيناز ك + + + 700 ثانية كاتشين كاتشين أولترافيلتراتيون 100 كاتشين أولترافيلتراتيون 3.
جماعياً، تنتج كل الأساليب التي تنطوي على كاتشين 700 ثانية (1 و 4 و 5) عدد أكبر بكثير من حويصلات الواحدة ميكروغرام بروتين في كلا النوعين من عينة والمصل والبلازما (الشكل 1 أ-ب). ومع ذلك، إنشاء الأسلوب 5 عدد أكبر بكثير من حويصلات الواحدة ميكروغرام بلازما مقارنة بالمصل (الشكل 1). على العكس من ذلك، كان تركيز البروتين في عينات اكسوسومي المنقي أقل بكثير أثناء استخدام الأساليب المستندة إلى كاتشين 700 ثانية (1 و 4 و 5). أحادي الاتجاه ANOVA وتوكي في اختبارات المقارنات متعددة أظهرت أن تركيز البروتين النهائي بعد أساليب 2 و 3 كانت أعلى بكثير من تركيز البروتين النهائي بعد أساليب 1 و 4 و 5 (ف < 0.001). الاختلافات تتفق واستخدام البلازما أو مصل الدم، ومع ذلك، كان تركيز البروتين النهائي اكسوسوميس المنقي أعلى بكثير مع الأسلوب 1 (اختبار t, p < 0.05) عند استخدام مصل (الشكل 2A). لتقييم توزيع البروتين المنقي اكسوسوميس بخمس طرق مختلفة، حل في صفحة 10 ميكروغرام من عينة من كل أسلوب والملون مع أخذ صبغ. النتائج يوحي بأن غالبية البروتين موجودة في "اكسوسوميس المنقي" من أساليب 2 و 3 الزلال مصحوبا كاتشين الفرقة قوية ~ 65 (الشكل 2).
الخطوة التالية لتأكيد أن الزيادة في نقاء المعزولة اكسوسوميس استناداً إلى وجود الزلال، البروتين الأكثر وفرة في الدم. وأظهرت عملية ultrafiltration تركيز ملحوظ من الزلال في الكسر اكسوسومال التي تم تخفيض جزئيا من قبل معالجة العينة مع بروتيناز ك (الشكل 3 ألف، الممرات S و P). إدراج كاتشين 700 ثانية في العملية تناقص كمية الزلال (الشكل 3 ألف، الممرات P1/S1 و P4/S4) لكن الجمع بين 700 ثانية كاتشين، بروتيناز ك، وأظهرت الأكثر كفاءة إزالة الزلال من المنقي اكسوسوميس ( أولترافيلتريشن الشكل 3A، لين P5/S5). وقد أظهرت الدراسات الأخيرة أن أبوليبوبروتينس أيضا عادة معزولة شارك خلال اكسوسومي تنقية10،16. على وجه التحديد، تم العثور على أبوب، وموجودة في البروتينات الدهنية منخفضة الكثافة، عالية تتركز في اكسوسوميس المنقي من الدم البشري10. ولذلك، يمكننا تقييم المشارك عزل البروتينات الدهنية أبوب وبرنامج عمل ألماتي-1. أساليب تنبيذ فائق والمزيج من كاتشين تنبيذ فائق و 700 ثانية أظهرت كمية مماثلة من أبوب مقارنة بالمبلغ الذي اكتشفه في المصل والبلازما لطخة غربية (الشكل 3B، الممرات P1/S1، P2/S2، و P4/S4؛ التكميلية الأرقام 1/2). من المثير للاهتمام، إضافة بروتيناز ك أدت إلى تدهور أبوب كاملة من العينة النقية (الشكل 3B، الممرات P3/S3 و P5/S5). وبالمثل، تم تخفيض برنامج عمل ألماتي-1، عنصر البروتين الرئيسية في كثافة عالية البروتينات الدهنية في البلازما البشرية، كل الأساليب التي تنطوي على كاتشين 700 ثانية أو بروتيناز ك (الشكل 3). على الرغم من ذلك، مثل الزلال، لم يتمكن ultrafiltration موكو 100 بمفردها من تقلل إلى حد كبير كمية تنقية شارك برنامج عمل ألماتي-1.
وأخيراً، لتحديد أثر بروتيناز ك على البروتينات المعرضة للغشاء الخارجي اكسوسوميس، نحن تقييم وجود تيتراسبانين CD63، بروتين السمة مميزة اكسوسوميس. تحليل البقع الغربية أظهرت أن البروتين لم يكن فقط يمكن اكتشافها في أساليب استخدام بروتيناز ك (3D الشكل، الممرات P3/S3 و P5/S5)، ولكن العصابات ل CD63 باستخدام الأسلوب 5 كان إشارة أكثر كثافة (3D الشكل، الممرات P5/S5). هذه النتيجة تشير إلى الأسلوب 5 غلة أما تركيز أعلى من اكسوسوميس أو زيادة CD63 جسم ملزم بسبب انخفاض المجاميع البروتين المرتبطة بالسطح اكسوسومي.
الشكل 1 : اكسوسومي العائد من البلازما والمصل بعد خمس طرق لتنقية مختلفة. (أ) تركيز اكسوسوميس التي تم الحصول عليها من البلازما (n = 5). (ب) تركيز اكسوسوميس التي تم الحصول عليها من مصل الدم (n = 5). (C) مقارنة بين أرقام اكسوسوميس كل ميكروغرام بروتين من 5 مجموعات المزدوجة للبلازما والمصل. الأرقام على المحور السيني يمثل استخدام كل طريقة، 1 = 700 ثانية كاتشين + كاتشين أولترافيلتريشن 3؛ 2 = ultrafiltration 100 كاتشين؛ 3 = بروتيناز ك + كاتشين أولترافيلتريشن 100؛ 4 = 700 ثانية كاتشين + كاتشين أولترافيلتريشن 100 و 5 = بروتيناز ك + + + 700 ثانية كاتشين كاتشين أولترافيلتريشن 100 كاتشين أولترافيلتريشن 3. في A و B، حسبت الفروق من ANOVA أحادي الاتجاه وتوكي اختبارات المقارنات متعددة. في ج، حسبت الفروق بين المصل والبلازما كل أسلوب باختبار t. ف < 0.05؛ أشرطة الخطأ: 95% فاصل الثقة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : الغلة البروتين في اكسوسوميس المنقي من البلازما والمصل باستخدام خمس طرق مختلفة- (أ) مقارنة بين الغلة مجموع البروتين في اكسوسوميس النقية التي تم الحصول عليها من البلازما والمصل (n = 5). (ب) صورة تمثيلية لأخذ صبغة من 10 ميكروغرام لتنقية اكسوسوميس حل بالحزب الديمقراطي الصربي صفحة؛ n = 1، إقران البلازما والمصل. تمثل الأرقام في الشكل كل أسلوب، 1 = 700 ثانية كاتشين + Ultrafiltration 3 كاتشين؛ 2 = ultrafiltration 100 كاتشين؛ 3 = بروتيناز ك + كاتشين أولترافيلتريشن 100؛ 4 = 700 ثانية كاتشين + كاتشين أولترافيلتريشن 100 و 5 = بروتيناز ك + + + 700 ثانية كاتشين كاتشين أولترافيلتريشن 100 كاتشين أولترافيلتريشن 3. في A، حسبت الفروق بين البلازما والعينات المستمدة من المصل باختبار t. ف < 0.05. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : الحد الملوثات الطبيعية من اكسوسوميس المعزولة من الدم البشري والاستقرار من البروتين السمة المميزة CD63. تقييم لطخة غربية: (A) الزلال، 1 ميكروغرام كل حارة؛ (ب) الابوليبوبروتين ب، 1 ميكروغرام كل حارة؛ و (ج) الابوليبوبروتين A1، 10 ميكروغرام كل حارة؛ (د) CD63، 1 ميكروغرام كل حارة. L = سلم؛ S = مصل الخام؛ P = بلازما النفط الخام. اكسوسومي المنقي: التنقية باستخدام أساليب مختلفة 5. تمثل الأرقام في الشكل كل أسلوب، 1 = 700 ثانية كاتشين + كاتشين أولترافيلتريشن 3؛ 2 = ultrafiltration 100 كاتشين؛ 3 = بروتيناز ك + كاتشين أولترافيلتريشن 100؛ 4 = 700 ثانية كاتشين + كاتشين أولترافيلتريشن 100 و 5 = بروتيناز ك + + + 700 ثانية كاتشين كاتشين أولترافيلتريشن 100 كاتشين أولترافيلتريشن 3. نتائج تمثيلية من إقران المصل والبلازما لمريض واحد؛ وكانت الاتجاهات متسقة بين المانحين عينات. تحميل البروتين تختلف بوصمة عار؛ التطبيع يستند إلى اتفاق التعاون الأساسي تحديد تركيز العينة الكلية. تم تحديد مجموع البروتين تحميل كل حارة لكل اسطوانة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
التكميلية الرقم 1: اسطوانات يقوم الأصلي محاصيلها الغربية من الشكل 3- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الإضافي رقم 2: تقدير كثافة الزلال، أبوب، وبرنامج عمل ألماتي-1 والعصابات CD63 من الشكل 3؛ تم استخدام برنامج إيماجيج. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أسلوب أمثل لزيادة نقاء والعائد من اكسوسوميس من الدم سوف تزيد القدرة على دقة الألغام حويصلات خارج الخلية كمصدر للمؤشرات الحيوية لأمراض عدة. الأساليب القياسية المستخدمة حاليا لعزل اكسوسوميس، على وجه التحديد، تنبيذ فائق وأساليب هطول الأمطار، ولها عيوب عديدة بما في ذلك تجميع اكسوسومي والتكوير من البروتينات القابلة للذوبان7،، من17 18. وبدلاً من ذلك، استخدام ثانية أظهرت تحسنا كبيرا في عزلة اكسوسومي، حماية اكسوسوميس من التراكم، وتحسين إزالة المشتركة الملوث غير اكسوسومال البروتينات9،،من1118 , 19-ومع ذلك، أبوليبوبروتينس10وحويصلات أكبر المجاميع البروتين، بما في ذلك الزلال، غالباً معزولة يشترك مع اكسوسوميس، إذا استخدمت وحدة ثانية. خطوتين الحرجة في المعونة المقدمة من البروتوكول في التغلب على القيود المذكورة الأخيرتين. أولاً، استخدام الطرد المركزي للعينة البلازما أو المصل في 18,000 س ز رواسب معظم الحويصلات الكبيرة الموجودة في العينة. ثانيا، بالمعالجة المسبقة لعينات المصل أو البلازما مع بروتيناز ك، حوزتي سيرين مع20من خصوصية واسعة، أمر حاسم للحد من كمية الزلال وأبوليبوبروتينس A-1 وب المرتبطة اكسوسوميس خلال تنقية. نحن يقترن استخدام بروتيناز ك خطوة ultrafiltration استخدام غشاء مع موكو كاتشين 100 إلى جزئيا الوت الببتيدات والبروتينات الصغيرة، وثم علينا تكييف استخدام راتنج ثانية مع موكو من 700 كاتشين لمسح كذلك الببتيدات/البروتينات أصغر من اكسوسوميس. يلتقط هذا الراتنج، أصلاً الأمثل لعزل الفيروس والبروتينات الكبيرة المتبقية و/أو المجمعات تحت كاتشين 700. يسمح مبدأ عزل هذا الراتنج ثانية انتعاش لطيف اكسوسوميس، نظراً لتدفق العينة عن طريق الراتنج تحركها الجاذبية. وهذا يسمح للتجميع أقل وسلامة اكسوسوميس، التغلب على اثنين من القيود الرئيسية من الأساليب المستندة إلى تنبيذ فائق المحتفظ بها. وأخيراً، وقد تجلى بارانياي et al. أن يحسن تخفيف البلازما قبل تجهيز ثانية اكسوسومي الاسترداد21. في هذا البروتوكول، أدرجنا خطوة تمييع قبل ثانية لزيادة وقت الاتصال من العينة مع الراتنج.
قيداً هاما من البروتوكول المقدم من هضم البروتينات في الغشاء اكسوسومال بمعاملة ك بروتيناز المحتملة. وهذا يضعف تجارب المتلقين للمعلومات إذا كانت مطلوبة بروتينات الغشاء سطح مكشوف لتحليلات المتلقين للمعلومات بما في ذلك الغربية وصمة عار، أليسا، أو التدفق الخلوي. لاختبار أثر بروتيناز ك على بروتينات الغشاء المرتبط جزئيا، قمنا بتحليل العينات المعالجة بحوزتي لوجود CD63، بروتين تيتراسبانين، التي عادة موجودة في اكسوسوميس. وأظهرت هذه النتائج أن استخدام بروتيناز ك مع وصف ظروف الوقت الهضم وتركيز لم تؤد إلى تدهور CD63 كبيرة. ومع ذلك، سوف يلزم مزيد من التقييم للاستقرار المرتبطة بغشاء بروتين على أساس المصالح المحددة للبحث.
وفي الختام، قدم البروتوكول يوفر العديد من المزايا عبر الأساليب القائمة الحالية. كل خطوة المدرجة في البروتوكول قد أظهر في دراسات مستقلة لتكون مفيدة لنقاء اكسوسوميس: التكوير أكبر الحويصلات والمصل أو تمييع البلازما و Additionally ثانية، كما ذكر أعلاه، كان خطوة هضم بروتيناز المضمنة لإزالة أبوليبوبروتينس والمجاميع البروتين، فضلا عن تركيز خطوة في نهاية عملية تنقية تعود بالفائدة على الاستقرار اكسوسومي والغلة. وأخيراً، هذا البروتوكول يمكن تكييفها بسهولة لعزل اكسوسوميس من أكبر حجم العينات مثل البول أو خلية supernatants ثقافة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وأيد هذا البحث الأموال الداخلية من CSU (إلى KMD) و ATCC العقد #2016-0550-0002 (عقدا من الباطن من HHSN272201600013C نييد)، ومشروع القانون ووميليندا غيتس (OPP1039688) (إلى KMD/نكج). ونحن نشكر "تجربة البحث جبهة الخلاص الوطني" "الطلاب الجامعيين" (منتدبين) البرنامج الصيفي في جامعة ولاية كولورادو لدعم إضافي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nanosight | Malvern | NS300 | |
| Benchtop microcentrifuge | Thermo | Legend Mico21 | |
| Benchtop centrifuge | Beckman Coulter | Allegra 6R | |
| Waterbath | Benchmark | B2000-4 | |
| Microplate reader | BIOTEK | Epoch | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | THERMO | 23227 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | THERMO | 23235 | |
| Phosphate buffered saline | Corning | 21-040-CV | |
| 96 well plate | Corning | 15705-066 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane | EMD-Millipore | UFC510096 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units | EMD-Millipore | UFC800324 | |
| Capto Core 700 | GE Healthcare | 17548103 | |
| Poly-Prep Chromatography Columns | BIORAD | 7311550 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | THERMO | NP0323BOX | |
| Nitrocellulose Membrane, Roll, 0.2 µm | BIORAD | 1620112 | |
| Proteinase K, Tritirachium album | EMD-Millipore | 539480 | |
| SimplyBlue SafeStain | THERMO | LC6065 | |
| SIGMAFAST BCIP/NBT | Millipore-SIGMA | B5655 | |
| 4-Chloro-1-naphthol | Millipore-SIGMA | C6788 | |
| Anti-CD63 Antibody (rabbit anti-human) with goat anti-rabbit HRP secondary antibody | SYSTEM BIOSCIENCES | EXOAB-CD63A-1 | Primary and secondary antibodies |
| ALB Antibody (F-10) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-271605 | Primary antibody |
| apoB Antibody (C1.4) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-13538 | Primary antibody |
| apoA-I Antibody (B-10) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-376818 | Primary antibody |
References
- Stoorvogel, W., Kleijmeer, M. J., Geuze, H. J., Raposo, G. The biogenesis and functions of exosomes. Traffic. 3 (5), 321-330 (2002).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).
- Schorey, J. S., Harding, C. V. Extracellular vesicles and infectious diseases: new complexity to an old story. J Clin Invest. 126 (4), 1181-1189 (2016).
- Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. Exosome platform for diagnosis and monitoring of traumatic brain injury. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 369 (1652), (2014).
- Nilsson, J., et al. Prostate cancer-derived urine exosomes: a novel approach to biomarkers for prostate cancer. Br J Cancer. 100 (10), 1603-1607 (2009).
- Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 4, 29509 (2015).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031 (2015).
- Vergauwen, G., et al. Confounding factors of ultrafiltration and protein analysis in extracellular vesicle research. Scientific Reports. 7 (1), 2704 (2017).
- Welton, J. L., Webber, J. P., Botos, L. A., Jones, M., Clayton, A. Ready-made chromatography columns for extracellular vesicle isolation from plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27269 (2015).
- Sódar, B. W., et al. Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection. Sci Rep. 6, 24316 (2016).
- de Menezes-Neto, A., et al. Size-exclusion chromatography as a stand-alone methodology identifies novel markers in mass spectrometry analyses of plasma-derived vesicles from healthy individuals. J Extracell Vesicles. 4, 27378 (2015).
- Corso, G., et al. Reproducible and scalable purification of extracellular vesicles using combined bind-elute and size exclusion chromatography. Scientific Reports. 7 (1), 11561 (2017).
- Nanosight Ltd. NanoSight NTA 2.1 Analytical Software, Operating Manual. , Available from: http://nanobio.physics.ucsb.edu/pdfs/equipment/Nanosight%20NTA2.1%20software%20manual.pdf (2010).
- Dobos, K. Production Manuals & SOPs. , Available from: http://csu-cvmbs.colostate.edu/academics/mip/research/Pages/dobos-lab-production-manuals-sops.aspx (2017).
- Diaz, G., Wolfe, L. M., Kruh-Garcia, N. A., Dobos, K. M. Changes in the Membrane-Associated Proteins of Exosomes Released from Human Macrophages after Mycobacterium tuberculosis Infection. Sci Rep. 6, 37975 (2016).
- Yuana, Y., Levels, J., Grootemaat, A., Sturk, A., Nieuwland, R. Co-isolation of extracellular vesicles and high-density lipoproteins using density gradient ultracentrifugation. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3 Unit 3.22 (2006).
- Muller, L., Hong, C. S., Stolz, D. B., Watkins, S. C., Whiteside, T. L. Isolation of biologically-active exosomes from human plasma. J Immunol Methods. 411, 55-65 (2014).
- Böing, A. N., et al. Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
- Sweeney, P. J., Walker, J. M.
- Baranyai, T., et al. Isolation of Exosomes from Blood Plasma: Qualitative and Quantitative Comparison of Ultracentrifugation and Size Exclusion Chromatography Methods. PLoS One. 10 (12), e0145686 (2015).
