Summary
Her presenterer vi en protokoll for å rense exosomes fra både plasma og serum med redusert co rensing av ikke-exosomal Blodproteiner. Optimalisert protokollen inneholder ultrafiltrasjon, protease behandling og størrelse utelukkelse kromatografi. Forbedret rensing av exosomes fordelene nedstrøms analyser, inkludert mer nøyaktig kvantifisering av blemmer og proteomic karakterisering.
Abstract
Exosomes, en slags nanovesicle fra alle celletyper, kan isoleres fra alle kroppslige væske. Innholdet i exosomes, inkludert proteiner og RNAs, er unike for cellene som de er avledet og kan brukes som indikatorer på sykdommen. Flere felles berikelse protokoller, inkludert ultracentrifugation, gi exosomes med løselig protein forurensninger. Spesielt, har vi funnet at de mest tallrike proteinene i blod ofte co renser med exosomes og kan forvirre nedstrøms proteomic studier, ødela identifikasjon av lav overflod biomarkør kandidater. Av ekstra bekymring er irreproducibility av exosome protein kvantifisering på grunn av inkonsekvent representasjon av ikke-exosomal protein nivå. Protokollen finnesher ble utviklet for å fjerne ikke-exosomal proteiner som co renser sammen med exosomes, legge rigor til en exosome renselsesprosess. Fem måter ble sammenlignet med sammenkoblede blod plasma og serum fra fem givere. Analyse bruker hydrogenion analyse og mikro bicinchoninic syre protein analysen viste at en kombinert protokoll utnytte ultrafiltrasjon og størrelse utelukkelse kromatografi gitt den optimale vesicle berikelse og løselig protein fjerning. Vestlige blotting ble brukt til å bekrefte at de forventede rikelig blod proteinene, inkludert albumin og apolipoproteins, var oppbrukt.
Introduction
Exosomes er nanovesicles (varierer i størrelse fra 30 nm til 150 nm) utgitt av nesten alle cellene i kroppen å forenkle celle til celle kommunikasjonen prosesser1,2. Interessant, sammensetningen av exosomes endres cellene opprinnelsesland samt helsetilstanden til individuelle3,4,5. I tillegg exosomes kan hentes fra flere biologiske væsker som: spytt, urin og blood2. På grunn av disse funksjonene anses exosomes å være en god kilde til sykdom biomarkers. Dessverre, det finnes ingen standard metode for isolering av exosomes. Noen laboratorier vurdere må sentrifugering, med en siste høyhastighets trinnet på 100.000 x g bruker tetthet forløpninger som gull standard metode for exosome isolasjon. Men har nyere studier vist at ultracentrifugation induserer samling av exosomes med løselig proteiner og andre exosomes, i tillegg til påvirker exosome integritet, begge kan hemme nedstrøms programmer6,7 . Andre vanlige metoder for exosome isolasjon inkluderer, men er ikke begrenset til: nedbør av kommersielle polyetylenglykol (PEG) basert reagenser, sentrifugal ultrafiltrasjon og størrelse-utestenging kromatografi (SEC). Kommersielle reagenser med polyetylenglykol (PEG) polymerer berike exosomes av forårsaker dem til å utløse og danne pellets. Begrensninger ved hjelp av dette polymer er forurensning med gjenværende PEG polymer og en overflod av løselig ikke-exosomal proteiner i sluttproduktet. Ultrafiltrasjon benytter sentrifugering å rense og konsentrere blemmer med en cellulose membran; exosomes beholdes over filteret, mens mindre urenheter og andre proteiner går gjennom membranen7,8. Akkurat som andre metoder har sentrifugal ultrafiltrasjon begrenset kapasitet til å rense exosomes på grunn av oppbevaring av høye nivåer av ikke-exosomal proteiner, inkludert protein komplekser og aggregat. Til slutt bruker SEC rensing porøse harpiks skille molekyler av størrelse. SEC har vist lovende resultater, overvinne de fleste problemene erfarne med andre metoder av fanger flertallet av miljøgifter proteiner og bevare exosomal integritet, siden isolasjon er basert på tyngdekraften eller lavt trykk systemer7, 9. Imidlertid påvirker co isolering av større protein aggregater og lipoproteiner10 under SEC renheten av siste exosome utarbeidelse. Mens noen metoder har blitt testet for exosome rensing fra celle kultur supernatants og plasma7eller bare plasma9,11, er det ingen informasjon om resultatene av metoder for direkte sammenligne blod plasma og serum fra samme individ.
Her fokusere vi på rensing av blod exosomes ved å sammenligne en rekke arbeidsflyter for å finne ut om vesicle berikelse teknikker er oversettbare mellom plasma og serum. Hydrogenion analyse og western blot ble brukt om å kvantifisere forskjellene i exosome konsentrasjon, renhet og protein komposisjon i slutten produkter. Siste metoden beskrevet i denne protokollen, øker vesicle tall og reduserer ikke-exosomal protein nivå. Viktigst, er en drastisk reduksjon av felles co fremskynde proteiner inkludert albumin og apolipoproteins demonstrert. Høy overflod av disse to proteinene i blodet og frekvensen som de co renser med exosomes forårsaker inkonsekvenser mellom "renset" eksempler, forvrenger nedstrøms analysene. Denne protokollen inkluderer bruk av en kommersielt tilgjengelig SEC harpiks; harpiks består av porøse perler der proteiner mindre enn 700 kDa kan angi perler. En gang inne, proteiner beholdes av en octylamine ligand. Eluate består av exosomes og molekyler større enn 700 kDa12. I tillegg for å redusere protein Aggregatene og apolipoproteins som unngå perle overlapping, inkluderer vi en protease fordøyelsen trinn i arbeidsflyten. Det er foreløpig ingen enkelt teknikk i stand til å maksimere exosome avkastning samtidig redusere co rensing ikke-exosomal proteiner. Denne studien viser at en rensing protokoll som kombinerer en protease fordøyelsen forbehandling med flere gjenvinnings- og renseutstyr metoder kan brukes å øke exosome avkastning og renhet fra blod serum og plasma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dette arbeidet var bestemt på ikke å være subjektet forskning ved første gjennomgang fra Colorado State Universitys institusjonelle Review Board (IRB), som alle mennesker prøver ble innhentet som de identifiserte prøver fra Bioreclamation IVT-biorepository og ble samlet under IRBS godkjent protokoller.
1. utarbeidelse av råolje prøven (Plasma eller Serum) ved Pelleting større blemmer og mobilnettet rusk
Merk: Sikkerhet: plasma og serum andre biologiske væsker er biologisk farlige materialer og må håndteres med forsiktighet, mens iført grunnleggende personlig verneutstyr, inkludert hansker og Laboratoriefrakk. Det anbefales sterkt at biologiske prøver er behandlet i en biosafety skap; Hvis ikke tilgjengelig, bruk av øyebeskyttelse anbefales.
- Equilibrate en serum- eller en plasmaprøve ved å plassere røret under ikke-shaking forhold i 4 ° C kjøleskap over natten (fra enten -20 eller-80 ° C).
- Aliquot 250 µL av prøven inn i et microcentrifuge rør med en 1000 µL pipette.
- Sentrifuge prøven på 18 000 x g i 30 min på 4 ° C.
- Bruke en 200 µL pipette, fjerne 200 µL ryddet nedbryting av og legge den til en ny microcentrifuge tube. Unngå pelleted materiale ved overføring nedbryting. Kast pelleted materiale.
- Kvantifisere proteininnholdet i utvalget av bicinchoninic syre (BCA) analysen, bruker produsentens protokollen. For å utføre analysen, fortynne eksempel 1:50 i 1 x fosfat-bufret saltvann (PBS). Test hvert utvalg i duplikat.
Merk: Bruke 1 x PBS gjennom protokollen ikke annet er angitt. Gjennomsnittlig vil 200 µL av avklart serum- eller (etter 18 000 x g) gi 15 mg totale protein. Andre eksempel typer, med lavere eller høyere proteininnhold, kan kreve ekstra BCA fortynninger. - Aliquot 10 mg av prøven inn i et nytt microcentrifuge rør. Bruke konsentrasjonen fikk i trinn 1.5 for å beregne det tilsvarende volumet av prøven. Aliquot prøven ved hjelp av en 200 µL pipette.
Merk: Det anbefales å lagre resterende utvalget på-80 ° C. Aliquot prøven i forskjellige rør på 10 mg per røret for å unngå flere fryse-Tin sykluser i fremtiden bruke.
2. fordøyelsen av ikke-exosomal Blodproteiner
Merk: Fordøyelsen trinnet er utformet for å redusere ikke-exosomal proteiner som kan co renser med exosomes. Hvis bevaring av exosome overflate proteiner kreves for nedstrøms analyser, bør det tas i betraktning at dette trinnet har potensial til å forstyrre denne analysen. Deteksjon av exosomal CD63, en overflate-eksponerte tetraspanin protein, var ikke betydelig negativt påvirket av denne prosessen.
- Forberede proteinasen K løsning i en konsentrasjon av 500 µg/mL i PBS. Legge til det tilsvarende antallet proteinasen K i en konisk rør. Deretter legger buffer og vortex for 30 s, 3 x ved romtemperatur.
- Legg 50 µL proteinasen K løsning 10-mg utvalg aliquot og bland forsiktig av pipettering opp og ned ved hjelp av en 200 µL pipette.
- Inkuber prøven på 37 ° C i et vannbad i 30 min. sted røret i en float rør rack og unngå fullstendig nedsenking av røret i vannbad for å unngå potensielle.
- Overføre utvalg og flytende tube rack til et 60 ° C vannbad for 10 min, hvis du vil deaktivere proteinasen K.
3. fjerning av små proteiner og peptider ved sentrifuge ultrafiltrasjon
- Skyll en ultrafiltrasjon enhet som inneholder 100 kDa molekylvekt cut-off (MWCO) filter med PBS før bruk. Gjør dette ved å legge 500 µL av PBS til filteret, en 1000 µL pipette. Spinne enheten på 3700 x g 5 min. kast eventuelle gjenværende retentate samt eluate.
Merk: Eksempel volum kapasiteten til ultrafiltrasjon enheten må være 0,5 mL - 4 mL slik at den endelige reduserte eksempel mengden 50 µL er oppnåelig. - Ta prøven fra trinn 2.4 og øke volumet til 500 µL ved å legge til PBS. Pipetter prøven i pre skylles ultrafiltrasjon enheten.
Merk: I gjennomsnitt er prøven volumet fra trinn 2.4 185 µL (120 til 150 µL av prøve og 50 µL proteinasen K løsning). - Plass ultrafiltrasjon enheten i en bestemt vinkel Borstemmaskin sentrifuge 3700 x g på 4 ° C før prøven er redusert til et volum på 50 µL.
Forsiktig: Når du bruker ultrafiltrasjon enheter med død stopp volum, må være forsiktig å unngå fullstendig tørrhet i filteret membranen i sentrifugering trinnene. - Legg til 500 µL av PBS direkte inn i filteret membran og pipette opp og ned 5 ganger. Sentrifuge som i trinn 3.3. Utføre denne wash trinn totalt 3 ganger.
- Overføre de siste 50 µL retentate i en ny microcentrifuge tube.
- Skyll filter membranen med 200 µL PBS, pipettering opp og ned 10 ganger, og overføre vask til røret fra trinn 3.5.
- Plass filterholderen er omvendt plassert i en ny tube. Kjøre en omvendt spinn gjenoppretting for 5 min 2000 x g å hente gjenstående utvalg fra membranen. Basseng prøven med prøven fra trinn 3.5.
4. rensing av blemmer av størrelse utelukkelse kromatografi (sek)
- Legge til 850 µL av SEC slurry, med perler å ha en MWCO av 700 kDa, i en tom, avkortet gravitasjon flow kolonne ved hjelp av en 1000 µL pipette. Plass kolonnene i en størrelse passer rack utstyrt med en dryppbegeret.
- Slipp bunnen av kolonnen og la væsken renne i 5 min. Når drenert, legge 10 mL PBS å vaske harpiks. Tillate 20 min vaskes renne fra kolonnen.
- Plasser den konsentrert, proteinasen K behandlet eksempel fra trinn 3.5 i et 15-mL konisk rør, og øke eksempel volumet til 5 mL legge til PBS med en serologisk pipette. Bland røret forsiktig av rocking for 1 min og deretter langsomt bruke prøven til kolonnen i trinn 4.2 med en serologisk pipette.
Merk: Når hetten kolonnen fjernes, vil utvalget strømme gjennom harpiks av tyngdekraften 5-mL prøven vil helt strømme gjennom kolonnen i 10 min. - Samle flyten gjennom i en ny 15 mL konisk tube.
- Bruker en serologisk pipette, gjelde det innsamlede materialet harpiks igjen for å fjerne gjenværende materiale under 700 kDa.
- Samle flyten gjennom i en ny 15 mL konisk tube. Vask harpiks dobbelt legge 1 mL av PBS. Samle flyten gjennom i røret fra trinn 4.5; Totalt siste volum blir omtrent 7 mL.
Merk: Etter trinn 4.6, vil prøven bli utvannet ca 35 ganger fra det opprinnelige prøven volumet; følgende trinn vil redusere volumet og konsentrere renset exosome prøven.
5. konsentrasjon av renset Exosomes og totalt Protein kvantifisering
- Skyll en ultrafiltrasjon enhet med et 3 kDa MWCO filter med PBS før bruk, som beskrevet i trinn 3.1.
- Legg til prøven fra trinn 4.6 ultrafiltrasjon enhet og sentrifuger i en svingende bøtte rotor 3700 x g på 4 ° C. Buffer passerer gjennom filteret og kan kastes. Konsentrert exosomes beholdes over filteret. Sentrifuge prøven til volumet over filteret (retentate) er redusert til 200 µL.
- Overføring av retentate til en ny microcentrifuge tube.
- Skyll filter membranen med 200 µL PBS av pipettering over membranen 10 ganger og overføre vask til røret fra trinn 5.3. Dette vil tillate for innsamling av enhver gjenværende exosome prøven.
- Ta prøven volum opp til 500 µL ved å legge til PBS. Bland ved sakte pipettering opp og ned 10 ganger.
Merk: Protokollen kan pauses her. Prøver bør lagres på 4 ° C over natten eller på-20 /-80 ° C for langsiktig lagring. - Kvantifisere proteininnholdet i utvalget av BCA analysen, bruker produsentens protokollen. Fortynne den eksempel 1:10 og 1:50 i PBS. Kjør hver prøve i duplikat.
Merk: Starter med 10 mg av totale protein av serum- eller, er totalt protein avkastningen i renset exosomes fra trinn 5.6 i gjennomsnitt, 150 µg. flere fortynninger kan være nødvendig hvis eksempler enn serum- eller brukes; avkastning kan variere med eksempel type.
6. kvantifisering og dimensjonering av Exosomes av hydrogenion sporing analyse (NTA)
- Legge til 5 µg av renset exosomes (som kvantifisert i 5.6) i 1 mL av PBS og vortex 15 s på lav-middels hastighet.
- Plass prøven i 1 mL disponibel sprøyte. Hvis tilgjengelig, angi sprøyten i en automatisk sprøytepumpe sette å injisere utvannet exosome prøven med en hastighet på 30 µL/min.
- Utføre NTA mål med innstillinger for videoinnspilling: skjermen gevinst på 3-4 og kameraet nivå av 12-13.
- Definere script analyse å kjøre tre tekniske replikat i minst 30 s med en konstant flyt for hver replikere. For analysen, angi fange terskelen på 5.
Merk: Detaljer om bruk av automatisk sprøyten og innstillinger for videoopptak finnes i referanse13. Fangst og analyse innstillinger for NTA må være konsekvent på tvers av forskjellige prøver å forsikre sammenlignbarheten.
7. fastsettelse av løselig Protein reduksjon
- Legge til 1-10 µg av renset exosomes til SDS eksempel bufferen og utføre polyakrylamid gel geleelektroforese (side) med en 4-12% Bis-Tris Gel i 1 x MES SDS kjører bufferen for 35 min 200 V. overføring løst proteiner til en nitrocellulose 0,2 µm membran ved å bruke en spenning o f 50 V for 1-1,5 h. utføre western blot analyse for å vurdere tilstedeværelsen av albumin, apolipoproteins A og B og exosome markøren CD 63 etter standardmetoder.
Merk: Full protokoller for metodene i 7.1 finnes i referanse14; spesielt SP007: kjører polyakrylamid gels og SP011: Western blot protokollen. - Separate 10 µg av renset exosomes bruke siden som i trinn 7.1 og flekken protein bandene bruker coomassie fargestoff, følgende standard anbefalinger, visualisere protein variasjon og reduksjon mellom eksempler.
Merk: Mer informasjon om protokollen for vestlige blots gjelder for CD63 er beskrevet av Diaz et al. 15
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dataene som presenteres nedenfor ble innhentet med sammenkoblede plasma og serum eksempler fra fem friske blodgivere. For å fastslå effekten av hvert, fem varianter av presentert protokollen ble utført, og exosome utvinning og ikke-exosome protein fjerning ble sammenlignet. Metodene trialed: 1) SEC 700 kDa + ultrafiltrasjon 3 kDa; 2) ultrafiltrasjon 100 kDa; 3) proteinasen K + ultrafiltrasjon 100 kDa; 4) SEC 700 kDa + ultrafiltrasjon 100 kDa og 5) proteinasen K + ultrafiltrasjon 100 kDa + sek 700 kDa + ultrafiltrasjon 3 kDa.
Samlet produsert alle metoder som involverer SEC 700 kDa (1, 4 og 5) et betydelig større antall blemmer per mikrogram protein i begge typer utvalg, serum og plasma (figur 1A-B). Men generert metoden 5 et betydelig større antall blemmer per mikrogram plasma sammenlignet serum (figur 1 c). Derimot var protein konsentrasjonen i renset exosome prøver betydelig lavere mens du bruker SEC 700 kDa-baserte metoder (1, 4 og 5). Enveis ANOVA og Tukeys flere sammenligninger tester viste at siste protein konsentrasjonen etter metoder 2 og 3 var betydelig høyere enn den endelige protein konsentrasjonen etter metoder 1, 4 og 5 (p < 0,001). Forskjellene var konsekvent med plasma eller serum, men med metoden 1 siste protein konsentrasjonen av renset exosomes var betydelig høyere (t-test, p < 0.05) ved serum (figur 2A). For å evaluere protein fordelingen av renset exosomes av forskjellige fem metoder, 10 µg i utvalg fra hver metode var løst på en side og farget med coomassie dye. Resultatene tyder på at flertallet av protein tilstede i de "renset exosomes" fra metoder 2 og 3 var albumin tilkjennegitt av sterke band ~ 65 kDa (figur 2B).
Neste skritt var å bekrefte økningen i renhet av isolerte exosomes basert på tilstedeværelsen av albumin, mest rikelig protein i blodet. Ultrafiltrasjon prosessen viste en markant konsentrasjon av albumin i exosomal fraksjonen som ble delvis redusert med pre behandling av prøven med proteinasen K (figur 3A, baner S og P). Inkludering av SEC 700 kDa i prosessen redusert mengden albumin (figur 3A, baner P1/S1 og P4/S4) men kombinasjonen av SEC 700 kDa, proteinasen K og ultrafiltrasjon viste mest effektiv fjerning av albumin fra renset exosomes ( Figur 3A, lane P5/S5). Nyere studier har vist at apolipoproteins er også vanligvis co isolert under exosome rensing10,16. Spesielt ble ApoB, som er tilstede i lav tetthet lipoproteiner, funnet å være sterkt konsentrert i renset exosomes menneskeblod10. Derfor vurdert vi co isolering av lipoproteiner ApoB og ApoA-1. Ultracentrifugation metoder og kombinasjonen av Ultracentrifugation og SEC 700 kDa viste en lignende mengde ApoB sammenlignet med hvor oppdaget i plasmaprøver ved western blot (figur 3B, baner P1/S1, P2/S2, og P4/S4; Supplerende tall 1/2). Interessant, førte tillegg av proteinasen K til en fullstendig nedvurdering av ApoB fra renset eksempel (figur 3B, baner P3/S3 og P5/S5). Tilsvarende ble ApoA-1, høy tetthet lipoproteiner i humant plasma, store proteinkomponenter redusert med alle metoder som involverer SEC 700 kDa eller proteinasen K (Figur 3 c). Men mye som albumin, kunne 100 MWCO ultrafiltrasjon på egen hånd ikke redusere mengden co rensing ApoA-1.
Til slutt, for å fastslå effekten av proteinasen K på proteiner utsatt for eksterne membran av exosomes, vi vurdert tilstedeværelsen av den CD63 tetraspanin, et kjennetegn protein av exosomes. En analyse av vestlige blots viste at protein var ikke bare i ved hjelp av proteinasen K (figur 3D, baner P3/S3 og P5/S5), men band for CD63 ved hjelp av metoden 5 hadde en mer intens signal (figur 3D, baner P5/S5). Dette funnet antyder metoden 5 gir enten en høyere konsentrasjon av exosomes eller økning av CD63 antistoff binding på grunn av reduksjon av protein aggregater knyttet exosome overflaten.
Figur 1 : Exosome avkastning fra plasma og serum etter fem forskjellige rensing metoder. (A) konsentrasjonen av exosomes innhentet fra plasma (n = 5). (B) konsentrasjonen av exosomes innhentet fra serum (n = 5). ()C) sammenligning mellom antall exosomes per mikrogram protein fra 5 sammenkoblet sett plasma og serum. Tallene på x-aksen representerer hver metode brukes, 1 = SEC 700 kDa + ultrafiltrasjon 3 kDa; 2 = ultrafiltrasjon 100 kDa; 3 = proteinasen K + ultrafiltrasjon 100 kDa; 4 = SEC 700 kDa + ultrafiltrasjon 100 kDa og 5 = proteinasen K + ultrafiltrasjon 100 kDa + sek 700 kDa + ultrafiltrasjon 3 kDa. I A og B, forskjellene ble beregnet ved veis VARIANSANALYSE og Tukey er flere sammenligninger tester. I C, ble forskjellene mellom serum og plasma per metoden beregnet av t-test. p < 0,05; Feilfelt: 95% av konfidensintervall. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Protein yield i renset exosomes fra plasma og serum med fem forskjellige metoder. (A) sammenligning av totale protein avkastningen i den renset exosomes innhentet fra plasma og serum (n = 5). (B) representativt bilde av en coomassie farging av 10 µg av renset exosomes løses ved SDS-siden. n = 1, sammenkoblet plasma og serum. Tallene i figuren representerer hver metode 1 = SEC 700 kDa + ultrafiltrasjon 3 kDa; 2 = ultrafiltrasjon 100 kDa; 3 = proteinasen K + ultrafiltrasjon 100 kDa; 4 = SEC 700 kDa + ultrafiltrasjon 100 kDa og 5 = proteinasen K + ultrafiltrasjon 100 kDa + sek 700 kDa + ultrafiltrasjon 3 kDa. I A, ble forskjeller mellom plasma og serum-avledet prøver beregnet av t-test. p < 0,05. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Reduksjon av vanlige forurensninger av exosomes isolert fra menneskeblod og stabilitet av hallmark protein CD63. Western blot evaluering av: (A) Albumin, 1 µg per bane; (B) Apolipoprotein B, 1 µg per bane; og (C) Apolipoprotein A1, 10 µg per bane; (D) CD63, 1 µg per kjørefelt. L = stigen; S = råolje serum; P = råolje plasma. Renset exosome: rensing med 5 forskjellige metoder. Tallene i figuren representerer hver metode 1 = SEC 700 kDa + ultrafiltrasjon 3 kDa; 2 = ultrafiltrasjon 100 kDa; 3 = proteinasen K + ultrafiltrasjon 100 kDa; 4 = SEC 700 kDa + ultrafiltrasjon 100 kDa og 5 = proteinasen K + ultrafiltrasjon 100 kDa + sek 700 kDa + ultrafiltrasjon 3 kDa. Representant resultater fra sammenkoblede serum og plasma av en pasient; trender var konsekvent mellom donor prøvene. Protein lasting variert av blot; normalisering var basert på BCA fastsettelse av totale eksempel konsentrasjon. Totalt protein belastning per kjørefelt ble angitt for hver blot. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 1: Original uncropped vestlige blotter fra Figur 3. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 2: tetthet kvantifisering av Albumin, ApoB, ApoA-1 og CD63 band fra Figur 3; ImageJ programvare ble brukt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En optimalisert metode for å øke renhet og avkastning på exosomes fra blod vil øke evnen til å nøyaktig min ekstracellulære blemmer som biomarkers for flere sykdommer. Standard metodene som brukes til å isolere exosomes, spesielt ultracentrifugation og nedbør metoder, har flere ulemper inkludert exosome aggregering og pelleting av løselig proteiner7,17, 18. Alternativt, bruk av SEC har vist en betydelig forbedring i exosome isolasjon, beskytte exosomes fra aggregering og bedre fjerning av felles miljøgifter ikke-exosomal proteiner9,11,18 , 19. apolipoproteins10, større blemmer og protein aggregat, inkludert albumin, er imidlertid ofte co isolert med exosomes, hvis SEC alene brukes. To viktige trinn i presentert protokollen hjelp i å overvinne de to siste nevnte begrensningene. Første, sentrifugering for plasma- eller serumprøver utvalget på 18 000 x g precipitates mesteparten av større blemmer presentere i utvalget. Andre forbehandling serum- eller prøver med proteinasen K, en serine protease med bred spesifisitet20, er avgjørende for å redusere albumin og apolipoproteins A-1 og B knyttet til exosomes under renselsen. Vi kombinert bruk av proteinasen K med en ultrafiltrasjon trinn med en membran med en MWCO av 100 kDa å delvis elute små proteiner og peptider, og deretter vi tilpasset bruk av en SEC harpiks med en MWCO av 700 kDa til videre klart mindre peptider/proteiner fra den exosomes. Denne harpiks, opprinnelig optimalisert for virus aisolering, fanger gjenværende store proteiner og/eller komplekser under 700 kDa. Prinsippet om isolering av denne SEC harpiks gir en mild gjenoppretting av exosomes, fordi flyten av utvalget gjennom harpiksen er drevet av tyngdekraften. Dette gir mindre aggregering og beholdt integriteten til exosomes, overvinne to store begrensningene av ultracentrifugation-baserte metoder. Til slutt, det ble demonstrert av Baranyai et al. at fortynning av plasma før SEC behandling forbedrer exosome utvinning21. I denne protokollen, har vi inkludert en fortynning trinn før SEC å øke kontakt på utvalget med harpiks.
En viktig begrensning av presentert protokollen er potensielle fordøyelsen av proteiner i exosomal membranen av proteinasen K behandling. Dette kan svekke nedstrøms eksperimenter hvis overflaten-eksponerte membran proteiner kreves for nedstrøms analyser inkludert western blot, ELISA, eller flow cytometri. Delvis test effekten av proteinasen K på membran forbundet proteiner, analyserte vi prøvene protease-behandlet etter CD63, en tetraspanin protein, som vanligvis finnes i exosomes. Disse resultatene viste at bruk av proteinasen K med beskrevet betingelsene for fordøyelsen tid og konsentrasjon ikke føre til betydelig CD63 fornedrelse. Videre evaluering av membran-assosiert protein stabilitet basert på bestemte forskningsinteresser vil imidlertid være nødvendig.
Avslutningsvis tilbyr presentert protokollen flere fordeler over gjeldende eksisterende metoder. Hvert trinn protokollen har vist i uavhengige studier å være gunstig for renheten av exosomes: pelleting av større blemmer, serum eller plasma fortynning og sek Additionally, som nevnt ovenfor, et proteinasen fordøyelsen skritt var inkludert å fjerne Apolipoproteins og protein aggregater samt en konsentrasjon trinn på slutten av en renselsesprosess som fordeler exosome stabilitet og ytelse. Til slutt kan denne protokollen lett tilpasses isolere exosomes fra større volum prøver som urin eller celle kultur supernatants.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av interne penger fra CSU (til KMD), ATCC kontrakt #2016-0550-0002 (en sub av NIAID HHSN272201600013C), og The Bill og Melinda Gates Foundation (OPP1039688) (til KMD/NKG). Vi takker NSF forskning opplevelsen for studenter (REU) sommerprogram ved Colorado State University for ytterligere støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nanosight | Malvern | NS300 | |
| Benchtop microcentrifuge | Thermo | Legend Mico21 | |
| Benchtop centrifuge | Beckman Coulter | Allegra 6R | |
| Waterbath | Benchmark | B2000-4 | |
| Microplate reader | BIOTEK | Epoch | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | THERMO | 23227 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | THERMO | 23235 | |
| Phosphate buffered saline | Corning | 21-040-CV | |
| 96 well plate | Corning | 15705-066 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane | EMD-Millipore | UFC510096 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units | EMD-Millipore | UFC800324 | |
| Capto Core 700 | GE Healthcare | 17548103 | |
| Poly-Prep Chromatography Columns | BIORAD | 7311550 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | THERMO | NP0323BOX | |
| Nitrocellulose Membrane, Roll, 0.2 µm | BIORAD | 1620112 | |
| Proteinase K, Tritirachium album | EMD-Millipore | 539480 | |
| SimplyBlue SafeStain | THERMO | LC6065 | |
| SIGMAFAST BCIP/NBT | Millipore-SIGMA | B5655 | |
| 4-Chloro-1-naphthol | Millipore-SIGMA | C6788 | |
| Anti-CD63 Antibody (rabbit anti-human) with goat anti-rabbit HRP secondary antibody | SYSTEM BIOSCIENCES | EXOAB-CD63A-1 | Primary and secondary antibodies |
| ALB Antibody (F-10) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-271605 | Primary antibody |
| apoB Antibody (C1.4) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-13538 | Primary antibody |
| apoA-I Antibody (B-10) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-376818 | Primary antibody |
References
- Stoorvogel, W., Kleijmeer, M. J., Geuze, H. J., Raposo, G. The biogenesis and functions of exosomes. Traffic. 3 (5), 321-330 (2002).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).
- Schorey, J. S., Harding, C. V. Extracellular vesicles and infectious diseases: new complexity to an old story. J Clin Invest. 126 (4), 1181-1189 (2016).
- Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. Exosome platform for diagnosis and monitoring of traumatic brain injury. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 369 (1652), (2014).
- Nilsson, J., et al. Prostate cancer-derived urine exosomes: a novel approach to biomarkers for prostate cancer. Br J Cancer. 100 (10), 1603-1607 (2009).
- Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 4, 29509 (2015).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031 (2015).
- Vergauwen, G., et al. Confounding factors of ultrafiltration and protein analysis in extracellular vesicle research. Scientific Reports. 7 (1), 2704 (2017).
- Welton, J. L., Webber, J. P., Botos, L. A., Jones, M., Clayton, A. Ready-made chromatography columns for extracellular vesicle isolation from plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27269 (2015).
- Sódar, B. W., et al. Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection. Sci Rep. 6, 24316 (2016).
- de Menezes-Neto, A., et al. Size-exclusion chromatography as a stand-alone methodology identifies novel markers in mass spectrometry analyses of plasma-derived vesicles from healthy individuals. J Extracell Vesicles. 4, 27378 (2015).
- Corso, G., et al. Reproducible and scalable purification of extracellular vesicles using combined bind-elute and size exclusion chromatography. Scientific Reports. 7 (1), 11561 (2017).
- Nanosight Ltd. NanoSight NTA 2.1 Analytical Software, Operating Manual. , Available from: http://nanobio.physics.ucsb.edu/pdfs/equipment/Nanosight%20NTA2.1%20software%20manual.pdf (2010).
- Dobos, K. Production Manuals & SOPs. , Available from: http://csu-cvmbs.colostate.edu/academics/mip/research/Pages/dobos-lab-production-manuals-sops.aspx (2017).
- Diaz, G., Wolfe, L. M., Kruh-Garcia, N. A., Dobos, K. M. Changes in the Membrane-Associated Proteins of Exosomes Released from Human Macrophages after Mycobacterium tuberculosis Infection. Sci Rep. 6, 37975 (2016).
- Yuana, Y., Levels, J., Grootemaat, A., Sturk, A., Nieuwland, R. Co-isolation of extracellular vesicles and high-density lipoproteins using density gradient ultracentrifugation. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3 Unit 3.22 (2006).
- Muller, L., Hong, C. S., Stolz, D. B., Watkins, S. C., Whiteside, T. L. Isolation of biologically-active exosomes from human plasma. J Immunol Methods. 411, 55-65 (2014).
- Böing, A. N., et al. Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
- Sweeney, P. J., Walker, J. M.
- Baranyai, T., et al. Isolation of Exosomes from Blood Plasma: Qualitative and Quantitative Comparison of Ultracentrifugation and Size Exclusion Chromatography Methods. PLoS One. 10 (12), e0145686 (2015).
