Summary
Здесь мы представляем протокол для очистки exosomes из плазмы и сыворотки с сокращением Сопредседатель очистки белков крови не exosomal. Оптимизированный протокол включает ультрафильтрации, лечение протеазы и размер гель-проникающей хроматографии. Расширение очистки exosomes преимущества течению анализов, включая более точной количественной оценки везикулы и протеомных характеристика.
Abstract
Exosomes, тип nanovesicle, освобожден от всех типов клеток, могут быть изолированы от любых телесных жидкости. Содержание exosomes, в том числе белков и РНК, являются уникальными для клетки, от которых они наследуются и может использоваться как показатели заболевания. Несколько общих протоколов обогащения, включая ultracentrifugation, выход exosomes, нагруженные белковых загрязнений. Конкретно мы нашли что самые обильные белков в крови часто совместно очищают с exosomes и может посрамить течению протеомических исследований, срыве выявление низкой изобилие биомаркера кандидатов. Дополнительную обеспокоенность является невоспроизводимость exosome белка количественной оценки из-за несовместимых представление уровня белка не exosomal. Чтобы удалить не exosomal белки, которые совместно очищают наряду с exosomes, добавление строгость в процессе очистки exosome был разработан протокол, подробно здесь. Пять методов были сопоставлены с помощью парных плазмы крови и сыворотки из пяти доноров. С помощью наночастиц, отслеживания, анализа и микро bicinchoninic кислоты белка пробирного анализа показали, что сводный протокол, используя ультрафильтрации и размер гель-проникающей хроматографии принесли оптимальный везикул обогащения и удаления растворимого белка. Западный blotting использовался для проверки, что ожидаемые обильные крови белков, в том числе альбумина и аполипопротеинов, были истощены.
Introduction
Exosomes являются nanovesicles (размером от 30 Нм до 150 Нм) выпустила почти всех клеток в организме человека для облегчения связи в ячейке обрабатывает1,2. Интересно, что состав exosomes изменяется в зависимости от клетки происхождения, а также состояние здоровья отдельных3,4,5. Кроме того, exosomes могут быть получены из нескольких биологических жидкостей, таких как: слюна, моча и крови2. Из-за этих особенностей exosomes считаются хорошим источником болезни биомаркеров. К сожалению это не стандартный метод для изоляции exosomes. Некоторые лаборатории считают многоступенчатое центрифугирования, с последним высокоскоростной шагом на 100,000 x g с помощью градиентов плотности как метод золотой стандарт для exosome изоляции. Однако недавние исследования показали, что ultracentrifugation индуцирует агрегацию exosomes с растворимые белки и другие exosomes, в дополнение к затрагивающим целостность exosome, оба из которых могут препятствовать нисходящие приложения6,7 . Другие распространенные методы изоляции exosome включают, но не ограничиваются: количество осадков в коммерческих полиэтиленгликоля (PEG) на основе реагентов, центробежные ультрафильтрации и размер-гель-проникающей хроматографии (SEC). Коммерческих реактивов, с помощью полиэтиленгликоля (PEG) полимеров обогатить exosomes, заставляя их осадка и форма гранул. Ограничения, используя этот полимер являются загрязнение с остаточной PEG полимера и обилие растворимых не exosomal белков в конечный продукт. Ультрафильтрация использует центрифугирования для очищения и сконцентрировать пузырьки с помощью мембраны целлюлозы; exosomes сохраняются выше фильтр, в то время как меньше примесей и другие белки проходят через мембрану7,8. Так же, как другие методы центробежные ультрафильтрации имеет ограниченные возможности для очистки exosomes из-за сохранения высокого уровня не exosomal белков, белковых комплексов и агрегатов. Наконец SEC очистки использует пористых смолы для разделения молекул по размеру. SEC показал многообещающие результаты, преодоление большую часть проблем, возникших с другими методами, захватив часть загрязнений белков и сохранения целостности exosomal, так как изоляция основан на гравитации или низкого давления системы7, 9. Однако, Сопредседатель изоляции больше белка агрегатов и липопротеинов10 во время SEC влияет на чистоту подготовки окончательного exosome. Хотя некоторые методы были протестированы для exosome очистки от supernatants культуры клеток и плазмы7или только плазмы9,11, нет никакой информации о производительности методов прямого сопоставления крови плазмы и сыворотки от того же лица.
Здесь мы сосредоточены на очищение крови exosomes путем сравнения различных рабочих процессов, чтобы определить, если методы обогащения везикул переводимых между плазмой и сыворотки. Наночастицы, отслеживания, анализа и Западная помарка были использованы для количественного определения различий в составе концентрации, чистоты и белка exosome в конечных продуктах. Последний метод, подробно изложены в настоящем Протоколе, увеличение числа везикул и уменьшает уровни белка не exosomal. Важно отметить, что свидетельствует резкое сокращение общего совместного осаждения белков, включая альбумин и аполипопротеинов. Высокое обилие этих двух белков в крови и частота, с которой они совместно очищают с exosomes причины несоответствия между «очищенного» образцы, наклон вниз по течению анализы. Этот протокол включает в себя использование коммерчески доступных SEC смолы; смола состоит из пористых бусы, в которых меньше чем 700 кДа белками можно ввести бисер. Раз внутри, белки удерживаются octylamine лиганда. Элюата состоит из exosomes и больше чем 700 кДа12молекул. Кроме того для того, чтобы уменьшить белка агрегатов и аполипопротеинов, который уклониться от шарик треппинга, мы включать протеазы пищеварение шаг в рабочем процессе. В настоящее время не способен ни один метод максимального exosome доходности при одновременном снижении совместно очистки белков не exosomal. Это исследование показывает, что протокол очистки, который сочетает в себе протеазы пищеварение предварительной обработки с нескольких методов очистки и восстановления может использоваться для увеличения урожайности exosome и чистоты из сыворотки крови и плазмы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Эта работа преисполнено решимости не быть человеческого субъекта исследования по итогам первоначального рассмотрения из университета штата Колорадо институционального обзора (КИБ), как все человеческие образцы были получены как обезличенных образцов от Bioreclamation IVT biorepository и были собранные под IRB утвержденных протоколов.
1. подготовка сырой образца (плазме или сыворотке) гранулирование большие пузырьки и сотовой мусора
Примечание: Безопасность внимание: плазмы, сыворотке крови и других биологических жидкостях являются зараженные материалы и должны быть обработаны с особой осторожностью, при ношении основные средства индивидуальной защиты, включая перчатки и халате. Настоятельно рекомендуется, что биологические образцы обрабатываются в биобезопасности кабинета; Если нет доступных, рекомендуется использовать защиту для глаз.
- Сбалансировать сыворотки или плазмы образца, поместив трубки-пожимая условиях на ночь в холодильнике 4 ° C (от-либо 20 или хранения-80 ° C).
- Аликвота 250 мкл пример в microcentrifuge трубу с помощью пипетки 1000 мкл.
- Центрифугуйте образцы на 18,000 x г за 30 мин при 4 ° C.
- С помощью пипетки 200 мкл, удалите 200 мкл очищается супернатант и добавить его в новые пробки microcentrifuge. Избегайте любых гранулированного материала при передаче супернатант. Выбросите гранулированного материала.
- Количественно содержание белка образца по Пробирной bicinchoninic кислоты (BCA), используя протокол изготовителя. Для выполнения анализа, разбавляют образец 1:50 в 1 x фосфат амортизированное saline (PBS). Тестирование каждого образца в двух экземплярах.
Примечание: Используйте на протяжении всего протокола ПБС, если не указано иное. В среднем 200 мкл осветленный сыворотки или плазмы (после 18 000 x g) даст 15 мг общего белка. Другие типы образцов, с содержанием белка ниже или выше, может потребовать дополнительных BCA разведениях. - Аликвота 10 мг образца в новые пробки microcentrifuge. Используйте концентрацию, полученного на шаге 1.5 для расчета соответствующего объема образца. Алиготе образца с помощью пипетки 200 мкл.
Примечание: Рекомендуется для хранения оставшихся образца при температуре-80 ° C. Аликвота образца в различных труб на 10 мг на трубу, чтобы избежать нескольких замораживания оттаивания циклов в будущем использовать.
2. переваривание белков крови не exosomal
Примечание: Пищеварение шаг предназначен для снижения не exosomal белков, которые могут совместно очищают с exosomes. Если для вниз по течению анализов требуется сохранение белков exosome поверхности, следует во внимание, что этот шаг имеет потенциал, чтобы вмешиваться в этот анализ. Обнаружение exosomal CD63, открытые поверхности tetraspanin белок, не был значительно отрицательно сказалось на этот процесс.
- Готовят раствор протеиназы K в концентрации 500 мкг/мл в PBS. Добавьте соответствующее количество протеиназы K в коническую пробирку. Затем добавьте буфер и вихрь 30 s, 3 x при комнатной температуре.
- Добавьте 50 мкл раствора протеиназы K 10 мг образца аликвота и смешайте нежно закупорить вверх и вниз с помощью пипетки 200 мкл.
- Инкубировать образца при 37 ° C на водяной бане 30 мин место трубки в стойку пробки поплавок и избежать полного погружения трубки на водяной бане, чтобы избежать потенциальной утечки.
- Передача образца и плавучие трубки стойку до 60 ° C водяной бане 10 минут, чтобы инактивировать K. протеиназы
3. Удаление небольших белков и пептидов ультрафильтрацией центрифуги
- Промойте устройство ультрафильтрации, содержащие 100 кДа молекулярный вес производства (MWCO) фильтр с PBS до использования. Это можно сделать, добавив 500 мкл PBS на фильтр, с помощью пипетки 1000 мкл. Спиновые устройства на 3700 x g 5 мин отменить любые оставшиеся концентрируются, а также элюата.
Примечание: Объем образца ультрафильтрации устройство должно быть 0,5-4 мл для обеспечения что окончательное сокращение образца объем 50 мкл достижимо. - Взять образец из шаг 2.4 и повышайте громкость до 500 мкл, добавив PBS. Пипетка образца в предварительно промыть ультрафильтрации устройство.
Примечание: В среднем объем образца от шаг 2.4 составляет 185 мкл (120-150 мкл пример и 50 мкл раствора протеиназы K). - Место ультрафильтрации устройство в фиксированный угол настольная центрифуга на 3700 x g при 4 ° C до тех пор, пока образец имеет уменьшить объем 50 мкл.
ОСТОРОЖНОСТЬЮ: При использовании устройств ультрафильтрации с мертвой остановкой тома, необходимо позаботиться чтобы избежать полной сухости мембраны фильтра во время центрифугирования шаги. - Добавьте 500 мкл PBS непосредственно в мембране фильтра и пипетки вверх и вниз 5 раз. Центрифуга как шаг 3.3. Выполните этот шаг мыть в общей сложности 3 раза.
- Передача окончательного 50 мкл концентрируются в новые пробки microcentrifuge.
- Промойте фильтр мембраны с 200 мкл PBS, закупорить вверх и вниз в 10 раз и передать трубку мыть из шага 3.5.
- Установите держатель фильтра в обратной позиции в новой трубки. Выполните Обратный Спиновое восстановление 5 мин на 2000 x g для извлечения оставшихся образцов из мембраны. Бассейн образец с образцом от шаг 3.5.
4. Очистка везикулы, размер гель-проникающей хроматографии (сек)
- Мкл 850 SEC шлама, бисером, имея MWCO 700 кДа, в столбец пустой, ограничен тяжести потока с помощью пипетки 1000 мкл. Разместите столбцы в размер, соответствующий стойку оснащен поддон.
- ЭСКАТО в нижней части столбца и пусть жидкого стока за 5 мин. После того, как слить, добавьте 10 мл PBS мыть смолы. Разрешить 20 мин на промывку слейте из столбца.
- Концентрированный, протеиназы K рассматривать пример от шаг 3.5 в 15 мл конические пробки и увеличить объем образца по 5 мл, добавив PBS с Серологические Пипетки. Mix трубку осторожно тряся за 1 мин, а затем медленно применить образец столбце подготовлен на шаге 4.2 с Серологические Пипетки.
Примечание: После Кап столбец удаляется, образец будет проходить через смолы под действием силы тяжести; Пример 5-мл полностью будет поступать через колонку в 10 мин. - Сбор через поток в новой 15 мл Конические трубки.
- С помощью Серологические Пипетки, применить собранного материала в смолу снова, чтобы удалить любые оставшиеся материал ниже 700 кДа.
- Сбор через поток в новой 15 мл Конические трубки. Вымойте смолы, дважды добавляя 1 мл ФСБ. Сбор через поток в трубе из шага 4.5; Окончательный объем будет примерно 7 мл.
Примечание: После шага 4.6 образец будет разведен около 35 раз от первоначального объема образца; следующие шаги будут сократить объем и сконцентрировать очищенный exosome образца.
5. концентрация очищенный Exosomes и количественной оценки общего белка
- Промойте ультрафильтрации устройство с фильтром 3 кДа MWCO с PBS до использования, как описано в пункте 3.1.
- Добавьте образец из шага 4.6 ультрафильтрации устройство и центрифуги в ротор размахивая ведро на 3700 x g при 4 ° C. Буфер будет проходить через фильтр и может быть удален. Концентрированные exosomes будет храниться выше фильтра. Центрифугуйте образцы до тех пор, пока объем выше фильтра (концентрируются) уменьшается до 200 мкл.
- Передать новые пробки microcentrifuge концентрируются.
- Промойте фильтр мембраны с 200 мкл PBS, закупорить над мембраной 10 раз и передать трубку мыть из шага 5.3. Это позволит коллекции любого остаточного exosome образца.
- Довести объем образца до 500 мкл, добавив PBS. Смешайте медленно закупорить вверх и вниз по 10 раз.
Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь. Образцы должны храниться при температуре 4 ° C на ночь или на 20-80 ° C для долгосрочного хранения. - Количественно содержание белка образца по Пробирной BCA, используя протокол изготовителя. Разбавьте образец 1:10 и 1:50 в PBS. Запуск каждого образца в двух экземплярах.
Примечание: Начиная с 10 мг общего белка сыворотки или плазмы, общего белка урожай в очищенной exosomes от шага 5.6 составляет, в среднем, 150 мкг. Дополнительные разведениях может быть необходимым, если используются образцы сыворотки или плазмы; доходность может варьироваться с образца типа.
6. Количественная оценка и размеров Exosomes, наночастицы, отслеживания анализа (НТА)
- Добавить 5 мкг очищенный exosomes (как количественно 5.6) в 1 мл PBS и вихрь для 15 s на Низкая средняя скорость.
- Поместите образец в одноразовые шприц 1 мл. Если возможно, установите шприц в автоматической шприцевый насос, набор для вставки образца разбавленных exosome со скоростью 30 мкл/мин.
- Выполняют НТА измерения с использованием параметров захвата видео: экран прирост уровня 3-4 и камеры 12-13.
- Определить сценарий для анализа для запуска трех технических реплицирует минимум 30 s с помощью постоянного потока для каждого репликации. Для анализа установите порог захвата на 5.
Примечание: Подробности относительно использования автоматический шприц и настройки для захвата видео доступны в ссылку13. Захвата и анализа параметрами для ЗТК должен быть согласован во различных образцов для обеспечения сопоставимости.
7. определение масштабов растворимого белка
- Добавить 1-10 мкг очищенный exosomes SDS буфер образца и выполнять электрофореза геля полиакриламида (страницы) с помощью 4-12%-бис-трис, гель в 1 x MES SDS работает буфер для 35 минут при 200 V. передачи решена белков на нитроцеллюлозную 0,2 мкм мембрану, применяя напряжения o f 50 V на 1-1,5 ч. выполнять Западный анализ помаркой оценить наличие альбумина, аполипопротеинов A и B и exosome маркер CD 63 после стандартных методологий.
Примечание: Полное протоколы для методов в 7.1 можно найти в справочных14; в частности, SP007: запуск полиакриламидных гелей и SP011: Западная помарка протокол. - Отдельные 10 мкг очищенный exosomes, с помощью страницы как шаг 7.1 и выведение белка полосы с помощью Кумасси краситель, следующие стандартные рекомендации, чтобы визуализировать белка и снижения между выборками.
Примечание: Более подробная информация о протоколе для западных помарки, специфичные для CD63 характеризуются Диас и др. 15
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Представленные ниже данные были получены с помощью парных проб плазмы и сыворотки из пяти крови здоровых доноров. Чтобы определить влияние каждого шага обработки, были проведены пять вариантов представленных протокола, и удаления белка exosome восстановления и не exosome были сопоставлены. Тестируется методы включали: 1) кДа SEC 700 + ультрафильтрации 3 kDa; 2) ультрафильтрации 100 кДа; 3) протеиназы K + ультрафильтрации 100 кДа; 4) секунд 700 кДа + ультрафильтрации 100 кДа и 5) протеиназы K + SEC 700 кДа + ультрафильтрации 100 кДа, ультрафильтрация 3 кДа.
Коллективно все методы, связанные с SEC 700 кДа (1, 4 и 5) производится значительно большее количество пузырьков на мкг белка в обоих типах образца, сыворотки и плазмы (рис. 1A-B). Однако метод 5 создается значительно большее количество пузырьков за микрограмм плазмы по сравнению с сыворотки (рис. 1 c). И наоборот концентрация белка в очищенной exosome образцов был значительно ниже при использовании методов на основе кДа SEC 700 (1, 4 и 5). Односторонний дисперсионный анализ и Тьюки несколько сравнений тесты показали, что концентрации окончательный белка после того, как методы 2 и 3 были значительно выше, чем окончательный белка концентрацию после методы 1, 4 и 5 (p < 0,001). Различия согласуются с помощью плазме или сыворотке, однако, с методом 1 окончательный белка концентрацию очищенный exosomes был значительно выше ( p , t тест < 0,05) при использовании сыворотки (рис. 2A). Чтобы оценить распределение белка очищенный exosomes, разные пять методов, 10 мкг образца от каждого метода были решены на странице и окрашенных краской Кумасси. Результаты показывают, что большинство белков, присутствующих в «очищенный exosomes» от методы 2 и 3 было альбумина, знаменованное сильной группы ~ 65 кДа (Рисунок 2Б).
Следующим шагом было подтвердить увеличение в чистоте изолированных exosomes, основанный на присутствии альбумина, наиболее обильные белков в крови. Процессе ультрафильтрации показали заметное концентрацию альбумина в дроби exosomal, который был частично сокращен путем предварительной обработки образца с протеиназы K (рис. 3A, полос S и P). Включение SEC 700 kDa в процессе уменьшилось количество альбумина (рис. 3A, полосы P1/S1 и P4/S4) но сочетание SEC 700 кДа, протеиназы K и ультрафильтрации, показали наиболее эффективного удаления альбумина из очищенного exosomes ( Рисунок 3A, Лейн P5/S5). Недавние исследования показали, что аполипопротеинов изолированы также обычно совместно во время exosome очистки10,16. В частности апов, который присутствует в липопротеинов низкой плотности, был найден очень сосредоточены в очищенной exosomes из крови человека10. Таким образом мы оценивали совместное изоляции липопротеинов апов и АПОА-1. Ultracentrifugation методы и сочетание Ultracentrifugation и SEC 700 кДа показали аналогичные количество апов, по сравнению с суммой, обнаруженных в сыворотке и плазме крови иммуноблоттинга (рис. 3Б, полосы P1/S1, P2/С2 и P4/S4; Дополнительные цифры 1/2). Интересно, что добавлением протеиназы K привело к полной деградации апов из очищенного образца (рис. 3Б, полосы P3/S3 и P5/S5). Аналогичным образом АПД-1, компонент основных белков липопротеинов высокой плотности в плазме крови человека, был сокращен на все методы, связанные с SEC 700 кДа или протеиназы K (рис. 3 c). Несмотря на то, как альбумин, 100 ультрафильтрации MWCO самостоятельно смог значительно уменьшить количество совместно очищающая АПОА-1.
Наконец чтобы определить влияние протеиназы K на белки, подвержены внешней мембраны exosomes, мы оценивали наличие CD63 tetraspanin, клеймо белок exosomes. Анализ западных помарках показал, что белок обнаружен не был только в методах, с помощью протеиназы K (рис. 3D, полосы P3/S3 и P5/S5), но полосы для CD63 с помощью метода 5 был более интенсивным сигнал (рис. 3D, полосы P5/S5). Этот вывод свидетельствует о том, что метод 5 дает более высокую концентрацию exosomes или увеличение CD63 антитела связывая благодаря снижению белка агрегатов, связанный с поверхностью exosome.
Рисунок 1 : Exosome выход из плазмы и сыворотки после пяти методов различных очищения. (A) концентрация exosomes получил от плазмы (n = 5). (B) концентрация exosomes получил от сыворотки (n = 5). (C) сравнение между количеством exosomes на мкг белка от 5 парных наборов плазмы и сыворотки. Чисел на оси x представляют каждый метод используется, 1 = kDa SEC 700 + ультрафильтрации 3 kDa; 2 = 100 ультрафильтрации kDa; 3 = протеиназы K + ультрафильтрации 100 кДа; 4 = kDa SEC 700 + ультрафильтрации 100 кДа и 5 = протеиназы K + SEC 700 кДа + ультрафильтрации 100 кДа, ультрафильтрация 3 кДа. В A и B, различия были рассчитаны путем односторонней ANOVA и Тьюки в несколько сравнения тестов. В C различия между сыворотки и плазмы в метод были рассчитаны t теста. p < 0,05; Планки погрешностей: 95% доверительного интервала. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : В очищенной exosomes из плазмы и сыворотки, с использованием пяти различных методов урожайность белка. (A) Сравнение доходности общего белка в очищенной exosomes получены из плазмы и сыворотки (n = 5). (B) представитель картина Окрашивание Кумасси 10 мкг очищенный exosomes, устраняемые SDS-PAGE; n = 1, парных плазмы и сыворотки. Цифры на рисунке представляют каждый метод, 1 = SEC 700 кДа + 3 ультрафильтрации kDa; 2 = 100 ультрафильтрации kDa; 3 = протеиназы K + ультрафильтрации 100 кДа; 4 = kDa SEC 700 + ультрафильтрации 100 кДа и 5 = протеиназы K + SEC 700 кДа + ультрафильтрации 100 кДа, ультрафильтрация 3 кДа. В Aразличия между плазмы и сыворотки, полученных образцов были рассчитаны t теста. p < 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Сокращение обычных загрязнителей exosomes, изолированный от человеческой крови и стабильности отличительной белка CD63. Западная помарка оценки: (A) альбумина, 1 мкг на переулок; (B) аполипопротеина B, 1 мкг на переулок; и (C) Аполипопротеин А1, 10 мкг на переулок; (D) CD63, 1 мкг на пер. L = лестницы; S = сырой сыворотке; P = сырой плазмы. Очищенный exosome: очищение, используя 5 различных методов. Цифры на рисунке представляют каждый метод, 1 = kDa SEC 700 + ультрафильтрации 3 kDa; 2 = 100 ультрафильтрации kDa; 3 = протеиназы K + ультрафильтрации 100 кДа; 4 = kDa SEC 700 + ультрафильтрации 100 кДа и 5 = протеиназы K + SEC 700 кДа + ультрафильтрации 100 кДа, ультрафильтрация 3 кДа. Представитель результаты из парных сыворотки и плазмы одного пациента; тенденции согласуются между доноров образцы. Белка загрузки различается по помаркой; нормализация была основана на BCA определения концентрации общего образца. Общий белок нагрузка на Лейн был указан для каждой помарки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Дополнительный Рисунок 1: оригинал невозделываемых западных помарок из рисунка 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Дополнительный Рисунок 2: количественная оценка плотности альбумина, апов, АПД-1 и CD63 полосы из рис. 3; ImageJ программное обеспечение было использовано. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Оптимизированный метод для повышения чистоты и доходность exosomes из крови будет увеличить способность точно шахта внеклеточного везикулы как источник биомаркеров для ряда заболеваний. Стандартные методы в настоящее время используется для изоляции exosomes, в частности, ultracentrifugation и методы осадков, имеют ряд недостатков, включая exosome агрегации и гранулирование растворимые белки7,,17 18. Кроме того использование SEC показал значительное улучшение в exosome изоляции, защита exosomes от агрегата и улучшение удаления общих загрязнений не exosomal белки9,11,18 , 19. Однако, аполипопротеинов10, большие пузырьки и белка агрегаты, включая альбумин, изолированы часто совместно с exosomes, если используется только сек. Два важнейших шагов в представленных протокол помощи в преодолении последних двух упомянутых ограничений. Во-первых, центрифугирование плазме или сыворотке образца на 18,000 x g преципитаты, большинство крупных пузырьков, присутствующих в образце. Во-вторых, предварительной обработки образцов сыворотки или плазмы с протеиназы K, сериновые протеазы с широким специфика20, имеет решающее значение для снижения количества альбумина и аполипопротеинов A-1 и B связанные с exosomes во время очистки. Мы объединили использование протеиназы K с шагом ультрафильтрации, с помощью мембраны с MWCO 100 кДа частично элюировать маленькие белки и пептиды, и затем мы адаптировали использование SEC смолы с MWCO 700 кДа для дальнейшей очистки мелких пептидов/белки от exosomes. Эта смола, изначально оптимизирован для изоляции вируса, захватывает оставшихся крупных белков и/или комплексов под 700 кДа. Принцип изоляции этой смолы SEC позволяет нежный восстановления exosomes, так как поток выборки через смола основан на гравитации. Это позволяет меньше агрегации и сохранить целостность exosomes, преодоление два основных ограничения методов на основе ultracentrifugation. И наконец она была продемонстрирована Барания и др. что разведение плазмы перед обработкой SEC улучшает exosome восстановления21. В этом протоколе мы включили разрежения шаг перед сек, чтобы увеличить время контакта образца со смолой.
Существенным ограничением представленных протокола является потенциальным переваривание белков в exosomal мембраны протеиназы K лечение. Это может ухудшить течению эксперименты, если поверхность подвергается мембранных белков требуются для вниз по течению анализов, включая западную помарку, ELISA, или проточная цитометрия. Чтобы частично протестировать влияние протеиназы K на связанные мембранных белков, мы проанализировали образцы протеаз лечение на наличие CD63, tetraspanin белок, который обычно присутствует в exosomes. Эти результаты показали, что использование протеиназы K с описанных условий время пищеварения и концентрации не привело к значительной деградации CD63. Однако потребуется дальнейшая оценка стабильности связанные мембранных белков, основанные на конкретных исследовательских интересов.
В заключение представленный протокол предлагает несколько преимуществ по сравнению с текущей существующих методов. Каждый шаг, включенных в протокол показал в независимых исследованиях, полезными для чистоты exosomes: грануляции большие пузырьки, сыворотки или плазмы разрежения и SEC. Additionally, как упоминалось выше, протеиназы пищеварение шаг был включен для удаления аполипопротеинов и белка агрегатов, а также концентрация шаг в конце процесса очистки, что выгоды exosome стабильности и доходности. Наконец этот протокол может быть легко адаптирована изолировать exosomes от большего объема образцы как мочи или ячейки supernatants культуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано внутренних средств от CSU (чтобы КМД), ATCC контракт #2016-0550-0002 (субподряда NIAID HHSN272201600013C) и Фонд Билла и Мелинды Гейтс (OPP1039688) (КМД/НКГ). Мы благодарим NSF исследовательский опыт для студентов (REU) летняя программа в университете штата Колорадо для дополнительной поддержки.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nanosight | Malvern | NS300 | |
| Benchtop microcentrifuge | Thermo | Legend Mico21 | |
| Benchtop centrifuge | Beckman Coulter | Allegra 6R | |
| Waterbath | Benchmark | B2000-4 | |
| Microplate reader | BIOTEK | Epoch | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | THERMO | 23227 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | THERMO | 23235 | |
| Phosphate buffered saline | Corning | 21-040-CV | |
| 96 well plate | Corning | 15705-066 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane | EMD-Millipore | UFC510096 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units | EMD-Millipore | UFC800324 | |
| Capto Core 700 | GE Healthcare | 17548103 | |
| Poly-Prep Chromatography Columns | BIORAD | 7311550 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | THERMO | NP0323BOX | |
| Nitrocellulose Membrane, Roll, 0.2 µm | BIORAD | 1620112 | |
| Proteinase K, Tritirachium album | EMD-Millipore | 539480 | |
| SimplyBlue SafeStain | THERMO | LC6065 | |
| SIGMAFAST BCIP/NBT | Millipore-SIGMA | B5655 | |
| 4-Chloro-1-naphthol | Millipore-SIGMA | C6788 | |
| Anti-CD63 Antibody (rabbit anti-human) with goat anti-rabbit HRP secondary antibody | SYSTEM BIOSCIENCES | EXOAB-CD63A-1 | Primary and secondary antibodies |
| ALB Antibody (F-10) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-271605 | Primary antibody |
| apoB Antibody (C1.4) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-13538 | Primary antibody |
| apoA-I Antibody (B-10) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-376818 | Primary antibody |
References
- Stoorvogel, W., Kleijmeer, M. J., Geuze, H. J., Raposo, G. The biogenesis and functions of exosomes. Traffic. 3 (5), 321-330 (2002).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).
- Schorey, J. S., Harding, C. V. Extracellular vesicles and infectious diseases: new complexity to an old story. J Clin Invest. 126 (4), 1181-1189 (2016).
- Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. Exosome platform for diagnosis and monitoring of traumatic brain injury. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 369 (1652), (2014).
- Nilsson, J., et al. Prostate cancer-derived urine exosomes: a novel approach to biomarkers for prostate cancer. Br J Cancer. 100 (10), 1603-1607 (2009).
- Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 4, 29509 (2015).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031 (2015).
- Vergauwen, G., et al. Confounding factors of ultrafiltration and protein analysis in extracellular vesicle research. Scientific Reports. 7 (1), 2704 (2017).
- Welton, J. L., Webber, J. P., Botos, L. A., Jones, M., Clayton, A. Ready-made chromatography columns for extracellular vesicle isolation from plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27269 (2015).
- Sódar, B. W., et al. Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection. Sci Rep. 6, 24316 (2016).
- de Menezes-Neto, A., et al. Size-exclusion chromatography as a stand-alone methodology identifies novel markers in mass spectrometry analyses of plasma-derived vesicles from healthy individuals. J Extracell Vesicles. 4, 27378 (2015).
- Corso, G., et al. Reproducible and scalable purification of extracellular vesicles using combined bind-elute and size exclusion chromatography. Scientific Reports. 7 (1), 11561 (2017).
- Nanosight Ltd. NanoSight NTA 2.1 Analytical Software, Operating Manual. , Available from: http://nanobio.physics.ucsb.edu/pdfs/equipment/Nanosight%20NTA2.1%20software%20manual.pdf (2010).
- Dobos, K. Production Manuals & SOPs. , Available from: http://csu-cvmbs.colostate.edu/academics/mip/research/Pages/dobos-lab-production-manuals-sops.aspx (2017).
- Diaz, G., Wolfe, L. M., Kruh-Garcia, N. A., Dobos, K. M. Changes in the Membrane-Associated Proteins of Exosomes Released from Human Macrophages after Mycobacterium tuberculosis Infection. Sci Rep. 6, 37975 (2016).
- Yuana, Y., Levels, J., Grootemaat, A., Sturk, A., Nieuwland, R. Co-isolation of extracellular vesicles and high-density lipoproteins using density gradient ultracentrifugation. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3 Unit 3.22 (2006).
- Muller, L., Hong, C. S., Stolz, D. B., Watkins, S. C., Whiteside, T. L. Isolation of biologically-active exosomes from human plasma. J Immunol Methods. 411, 55-65 (2014).
- Böing, A. N., et al. Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
- Sweeney, P. J., Walker, J. M.
- Baranyai, T., et al. Isolation of Exosomes from Blood Plasma: Qualitative and Quantitative Comparison of Ultracentrifugation and Size Exclusion Chromatography Methods. PLoS One. 10 (12), e0145686 (2015).
