Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

प्रोटीन पाचन, Ultrafiltration, और आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी मानव रक्त प्लाज्मा और सीरम से Exosomes के अलगाव का अनुकूलन करने के लिए

Published: April 13, 2018 doi: 10.3791/57467
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1, 1
1Department of Microbiology, Immunology and Pathology, Colorado State University, 2Department of Biological Sciences, Eck Institute for Global Health, University of Notre Dame

Summary

यहां, हम दोनों प्लाज्मा और सीरम कम सह के साथ exosomes शुद्ध करने के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद गैर exosomal रक्त प्रोटीन की शुद्धि । अनुकूलित प्रोटोकॉल ultrafiltration, चिढ़ा उपचार, और आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी भी शामिल है । exosomes लाभों का बढ़ाया शुद्धिकरण बुलबुले और proteomic लक्षण वर्णन के अधिक सटीक ठहराव सहित अनुप्रवाह विश्लेषण, ।

Abstract

Exosomes, सभी प्रकार के सेल से जारी nanovesicle का एक प्रकार, किसी भी शारीरिक तरल पदार्थ से अलग किया जा सकता है । exosomes की सामग्री, प्रोटीन और RNAs सहित, कोशिकाओं है जिसमें से वे प्राप्त कर रहे है और रोग के संकेतकों के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है के लिए अद्वितीय हैं । कई आम संवर्धन प्रोटोकॉल, ultracentrifugation सहित, घुलनशील प्रोटीन संदूषण के साथ लादेन exosomes उपज । विशेष रूप से, हमने पाया है कि रक्त के भीतर सबसे प्रचुर मात्रा में प्रोटीन अक्सर सह exosomes के साथ शुद्ध और बहाव proteomic अध्ययन पाया, कम बहुतायत के अगोचर उंमीदवारों की पहचान को विफल कर सकते हैं । अतिरिक्त चिंता का irreproducibility exosome प्रोटीन ठहराव के गैर-exosomal प्रोटीन के स्तर के असंगत प्रतिनिधित्व के कारण है । यहां विस्तृत प्रोटोकॉल को हटाने के लिए गैर exosomal प्रोटीन है कि सह exosomes के साथ शुद्ध, exosome शोधन प्रक्रिया के लिए कठोरता जोड़ने विकसित किया गया था । पांच तरीकों से पांच दाताओं से जोड़ा रक्त प्लाज्मा और सीरम का उपयोग कर की तुलना में थे । विश्लेषण nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण और सूक्ष्म bicinchoninic एसिड प्रोटीन परख का उपयोग कर पता चला कि एक संयुक्त ultrafiltration और आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी उपयोग प्रोटोकॉल इष्टतम पुटिका संवर्धन और घुलनशील प्रोटीन हटाने झुकेंगे । पश्चिमी सोख्ता सत्यापित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था कि एल्ब्युमिन और apolipoproteins सहित अपेक्षित प्रचुर मात्रा में रक्त प्रोटीन, समाप्त कर रहे थे ।

Introduction

Exosomes है nanovesicles (आकार में 30 एनएम से १५० एनएम के लिए) में लगभग सभी कोशिकाओं द्वारा जारी मानव शरीर में सेल की सुविधा के लिए सेल संचार प्रक्रियाओं1,2। दिलचस्प है, exosomes परिवर्तन की संरचना के रूप में अच्छी तरह के रूप में व्यक्तिगत3,4,5के स्वास्थ्य की स्थिति के रूप में मूल की कोशिकाओं पर निर्भर करता है । इसके अतिरिक्त, exosomes जैसे कई जैविक तरल पदार्थ से प्राप्त किया जा सकता है: लार, मूत्र, और रक्त2। इन सुविधाओं के कारण exosomes को रोग प्रतिरोधकों का अच्छा स्रोत माना जाता है । दुर्भाग्य से, वहां exosomes के अलगाव के लिए कोई मानक विधि है । कुछ प्रयोगशालाओं multistep केंद्रापसारक पर विचार, एक अंतिम उच्च गति १००,००० x g पर कदम exosome अलगाव के लिए सोने के मानक विधि के रूप में घनत्व ढाल का उपयोग कर के साथ । हालांकि, हाल के अध्ययनों से पता चला है कि ultracentrifugation घुलनशील प्रोटीन और अंय exosomes के साथ exosomes के एकत्रीकरण लाती है, exosome अखंडता को प्रभावित करने के अलावा, जो दोनों के बहाव अनुप्रयोगों में बाधा हो सकती है6,7 . exosome अलगाव के अन्य आम तरीकों में शामिल हैं, लेकिन करने के लिए सीमित नहीं हैं: वाणिज्यिक पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) आधारित रिएजेंट, केंद्रापसारक ultrafiltration, और आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) द्वारा वर्षा । सुरक्षात्मक ग्लाइकोल (खूंटी) पॉलिमर का उपयोग कर उन्हें हाला और एक गोली के रूप में पैदा करके exosomes को समृद्ध । सीमाएं इस बहुलक का उपयोग अवशिष्ट खूंटी बहुलक और अंतिम उत्पाद में घुलनशील गैर exosomal प्रोटीन की एक बहुतायत के साथ संदूषण हैं । Ultrafiltration एक फाइबर झिल्ली का उपयोग कर बुलबुले को शुद्ध और ध्यान केंद्रित करने के लिए उपयोग करता है; exosomes फिल्टर के ऊपर बने हुए हैं, जबकि छोटे अशुद्धियों और अन्य प्रोटीन झिल्ली7,8के माध्यम से गुजरती हैं । बस अन्य तरीकों की तरह, केंद्रापसारक ultrafiltration प्रोटीन परिसरों और समुच्चय सहित गैर exosomal प्रोटीन के उच्च स्तर की अवधारण के कारण exosomes को शुद्ध करने के लिए एक सीमित क्षमता है । अंत में, एसईसी शुद्धि के आकार से अणुओं को अलग करने के लिए असुरक्षित राल का उपयोग करता है । एसईसी आशाजनक परिणाम दिखाया गया है, contaminant प्रोटीन और exosomal अखंडता के संरक्षण के बहुमत पर कब्जा करके अंय तरीकों के साथ अनुभवी समस्याओं के सबसे काबू पाने, अलगाव के बाद से गुरुत्वाकर्षण या कम दबाव प्रणालियों पर आधारित है7, 9. हालांकि, एसईसी के दौरान बड़ा प्रोटीन समुच्चय और लिपो10 के सह अलगाव अंतिम exosome तैयारी की पवित्रता को प्रभावित करता है । जबकि कुछ तरीकों सेल संस्कृति supernatants और प्लाज्मा7, या केवल प्लाज्मा9,11से exosome शोधन के लिए परीक्षण किया गया है, वहां तरीकों के प्रदर्शन के बारे में कोई जानकारी नहीं है सीधे रक्त की तुलना एक ही व्यक्ति से प्लाज्मा और सीरम ।

यहाँ, हम पुटिका संवर्धन तकनीक प्लाज्मा और सीरम के बीच अनुवाद कर रहे हैं, तो यह निर्धारित करने के लिए कार्यप्रवाह की एक किस्म की तुलना करके रक्त exosomes की शुद्धि पर ध्यान केंद्रित. Nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण और पश्चिमी दाग exosome एकाग्रता, पवित्रता, और अंत उत्पादों में प्रोटीन संरचना में मतभेदों को यों तो इस्तेमाल किया गया । अंतिम विधि, इस प्रोटोकॉल में विस्तृत, पुटिका संख्या बढ़ जाती है और गैर exosomal प्रोटीन के स्तर को कम कर देता है । महत्वपूर्ण रूप से, एल्ब्युमिन और apolipoproteins सहित आम सह-हाला प्रोटीन की एक भारी कमी का प्रदर्शन किया है । रक्त में इन दो प्रोटीन और आवृत्ति जिस पर वे सह exosomes के साथ शुद्ध "शुद्ध" नमूनों के बीच विसंगतियों का कारण बनता है, बहाव का विश्लेषण विषम के उच्च बहुतायत । इस प्रोटोकॉल एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एसईसी राल का उपयोग भी शामिल है; राल छिद्रित मोतियों से बना है जिसमें प्रोटीन से छोटे ७०० केडीए मोतियों में प्रवेश कर सकता है. एक बार अंदर, प्रोटीन एक octylamine ligand द्वारा बनाए रखे हैं । eluate exosomes और ७०० केडीए12से बड़ा अणुओं से बना है. इसके अतिरिक्त, आदेश में प्रोटीन समुच्चय और apolipoproteins जो मनका फंसाने से बचने को कम करने के लिए, हम कार्यप्रवाह में एक तंग पाचन कदम शामिल हैं । वर्तमान में, वहां कोई भी exosome उपज को अधिकतम करने में सक्षम तकनीक है, जबकि सह शुद्ध गैर exosomal प्रोटीन । इस अध्ययन से पता चलता है कि एक शुद्धि प्रोटोकॉल है कि एकाधिक वसूली और शोधन विधियों के साथ एक तंग पाचन उपचार को जोड़ती है exosome उपज और रक्त सीरम और प्लाज्मा से शुद्धता बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

यह काम कोलोराडो राज्य विश्वविद्यालय के संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) से प्रारंभिक समीक्षा पर मानव विषय अनुसंधान नहीं होना निर्धारित किया गया था, के रूप में सभी मानव नमूनों Bioreclamation IVT से de-पहचान के नमूनों के रूप में प्राप्त किए गए थे और थे आईआरबी अनुमोदित प्रोटोकॉल के तहत एकत्र.

1. कच्चे तेल के नमूने की तैयारी (या तो प्लाज्मा या सीरम) बड़ा बुलबुले और सेलुलर मलबे गोली से

नोट: सुरक्षा पर विचार: प्लाज्मा, सीरम, और अंय जैविक तरल पदार्थ है जैव खतरनाक सामग्री और विशेष देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए, जबकि दस्ताने और लैब कोट सहित बुनियादी व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरण, पहने हुए । यह अत्यधिक की सिफारिश की है कि जैविक नमूनों एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में संसाधित कर रहे हैं; यदि उपलब्ध नहीं है, नेत्र संरक्षण के उपयोग की सिफारिश की है ।

  1. Equilibrate एक 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में गैर-झटकों की स्थिति के तहत ट्यूब रखकर एक सीरम या एक प्लाज्मा नमूना (या तो-20 या-८० डिग्री सेल्सियस भंडारण से) ।
  2. Aliquot २५० एक १,००० µ एल पिपेट का उपयोग कर एक microcentrifuge ट्यूब में नमूने के µ एल ।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए १८,००० x g पर नमूना केंद्रापसारक ।
  4. एक २०० µ l पिपेट का उपयोग कर, द्वाा supernatant के २०० µ l को निकालें और इसे एक नई microcentrifuge ट्यूब पर जोड़ें । supernatant स्थानांतरित करते हुए किसी भी गोली सामग्री से बचें । गोली सामग्री को त्यागें ।
  5. bicinchoninic एसिड (बीसीए) परख द्वारा नमूने की प्रोटीन सामग्री को बढ़ाता है, निर्माता के प्रोटोकॉल का उपयोग कर । करने के लिए परख प्रदर्शन, 1x फॉस्फेट में नमूना 1:50 पतला-खारा (पंजाब) । डुप्लिकेट में प्रत्येक नमूने का परीक्षण ।
    नोट: प्रोटोकॉल भर में 1x पंजाबियों का प्रयोग करें जब तक अंयथा कहा । औसत पर, स्पष्ट सीरम या प्लाज्मा के २०० µ एल (१८,००० एक्स जी के बाद) कुल प्रोटीन की 15 मिलीग्राम निकलेगा । अंय नमूना प्रकार, कम या अधिक प्रोटीन सामग्री के साथ, अतिरिक्त बीसीए कमजोर पड़ने की आवश्यकता हो सकती है ।
  6. Aliquot 10 एक नई microcentrifuge ट्यूब में नमूने के मिलीग्राम । नमूना के अनुरूप मात्रा की गणना करने के लिए चरण १.५ में प्राप्त एकाग्रता का उपयोग करें. एक २०० µ l पिपेट का उपयोग करते हुए नमूना Aliquot ।
    नोट: यह-८० ° c पर शेष नमूना संग्रह करने के लिए अनुशंसित है । Aliquot पर अलग ट्यूबों में नमूना 10 ट्यूब प्रति मिलीग्राम भविष्य में उपयोग में कई फ्रीज-गल चक्र से बचने के लिए ।

2. गैर exosomal रक्त प्रोटीन का पाचन

नोट: पाचन कदम exosomes के साथ सह-शुद्धि कर सकते हैं जो गैर-exosomal प्रोटीन को कम करने के लिए बनाया गया है । यदि exosome सतह प्रोटीन के संरक्षण के बहाव के विश्लेषण के लिए आवश्यक है, यह ध्यान में रखा जाना चाहिए कि इस कदम के लिए इस विश्लेषण के साथ हस्तक्षेप की क्षमता है । exosomal CD63, एक सतह उजागर tetraspanin प्रोटीन का पता लगाने, काफी नकारात्मक इस प्रक्रिया से प्रभावित नहीं था ।

  1. proteinase K समाधान ५०० µ g/एमएल की एकाग्रता पर तैयार करें । एक शंकु ट्यूब में proteinase कश्मीर की इसी राशि जोड़ें । फिर बफर और भंवर 30 एस के लिए, कमरे के तापमान पर 3x जोड़ें ।
  2. जोड़ें ५० µ के proteinase कश्मीर समाधान के लिए 10-एमजी नमूना aliquot और धीरे से मिश्रण pipetting द्वारा और नीचे एक २०० µ l पिपेट का उपयोग कर.
  3. 30 मिनट के लिए एक पानी के स्नान में ३७ डिग्री सेल्सियस पर नमूना मशीन । एक नाव ट्यूब रैक में ट्यूब जगह है और संभावित रिसाव से बचने के लिए पानी में स्नान ट्यूब के पूर्ण विसर्जन से बचें ।
  4. नमूना और फ्लोटिंग ट्यूब रैक के लिए एक ६० ° c जल स्नान 10 मिनट के लिए स्थानांतरण, proteinase कश्मीर को निष्क्रिय करने के लिए ।

3. छोटे प्रोटीन और पेप्टाइड्स द्वारा केंद्रापसारक Ultrafiltration हटाने

  1. उपयोग करने से पहले पंजाबियों के साथ १०० केडीए आणविक वजन कट ऑफ (MWCO) फिल्टर युक्त एक ultrafiltration डिवाइस कुल्ला । इस मत को जोड़कर पंजाब के ५०० µ l को फ़िल्टर करने के लिए, एक १,००० µ l पिपेट का उपयोग कर. 5 मिनट के लिए ३,७०० x g पर डिवाइस स्पिन । किसी भी शेष retentate के साथ ही eluate को छोड़ें ।
    नोट: ultrafiltration डिवाइस का नमूना वॉल्यूम क्षमता ०.५ एमएल-4 एमएल होना चाहिए यह सुनिश्चित करने के लिए कि अंतिम कम नमूना मात्रा ५० µ l प्राप्त है ।
  2. २.४ कदम से नमूना ले लो और पंजाबियों जोड़कर ५०० µ एल के लिए मात्रा में वृद्धि । पिपेट पूर्व कुल्ला ultrafiltration डिवाइस में नमूना है ।
    नोट: औसत पर, चरण २.४ से नमूना वॉल्यूम १८५ µ l (१२० के लिए १५० µ l का नमूना है और proteinase K समाधान के ५० µ l) है ।
  3. ultrafiltration डिवाइस एक निश्चित कोण benchtop में 4 ° c पर ३,७०० x g पर केंद्रापसारक जब तक नमूना ५० µ एल की एक मात्रा को कम कर दिया है प्लेस ।
    सावधानी: मृत रोक मात्रा के साथ ultrafiltration उपकरणों का उपयोग करते समय, देखभाल केंद्रापसारक चरणों के दौरान फिल्टर झिल्ली का पूरा सूखापन से बचने के लिए लिया जाना चाहिए ।
  4. पंजाब के ५०० µ एल जोड़ें सीधे फिल्टर झिल्ली में और ऊपर और नीचे 5 बार पिपेट । ३.३ चरण में के रूप में केंद्रापसारक । इस वाश स्टेप को कुल 3 बार परफॉर्म करें ।
  5. एक नए microcentrifuge ट्यूब में अंतिम ५० µ l retentate स्थानांतरण ।
  6. २०० µ एल पंजाबियों के साथ फिल्टर झिल्ली कुल्ला, ऊपर और नीचे 10 बार pipetting, और ३.५ कदम से ट्यूब को धोने हस्तांतरण ।
  7. एक नई ट्यूब में व्युत्क्रम स्थिति में फिल्टर धारक प्लेस । २,००० एक्स जी में 5 मिनट के लिए एक रिवर्स स्पिन वसूली भागो झिल्ली से शेष नमूने प्राप्त करने के लिए । नमूना नमूना के साथ चरण ३.५ से पूल ।

4. आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) द्वारा बुलबुले की शुद्धि

  1. SEC घोल के ८५० µ l जोड़ें, मोतियों के साथ ७०० केडीए के एक MWCO, एक खाली, छाया हुआ गुरुत्वाकर्षण प्रवाह स्तंभ में एक १,००० µ l पिपेट का उपयोग कर. एक आकार उपयुक्त रैक एक ड्रिप ट्रे के साथ लगे में कॉलम प्लेस ।
  2. Uncap कॉलम के नीचे और 5 मिनट के लिए तरल नाली चलो । एक बार सूखा, राल धोने के लिए पंजाब के 10 मिलीलीटर जोड़ें । धोने के लिए 20 मिनट के लिए स्तंभ से पलायन की अनुमति दें ।
  3. ध्यान रखें, proteinase K एक 15 एमएल शंकु ट्यूब में कदम ३.५ से नमूना इलाज, और 5 मिलीलीटर एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट के साथ पंजाबियों को जोड़ने के लिए नमूना मात्रा में वृद्धि । मिश्रण धीरे ट्यूब 1 मिनट के लिए कमाल है और फिर धीरे से एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट के साथ ४.२ कदम में तैयार कॉलम के लिए नमूना लागू होते हैं ।
    नोट: स्तंभ की टोपी हटा दिया जाता है एक बार, नमूना गुरुत्वाकर्षण द्वारा राल के माध्यम से प्रवाह होगा; 5-एमएल नमूना पूरी तरह से 10 मिनट में कॉलम के माध्यम से प्रवाह होगा ।
  4. एक नया 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब के माध्यम से प्रवाह ले लीजिए ।
  5. एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट का प्रयोग, राल के लिए एकत्र सामग्री फिर से लागू ७०० केडीए नीचे किसी भी शेष सामग्री को दूर करने के लिए.
  6. एक नया 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब के माध्यम से प्रवाह ले लीजिए । दो बार पंजाब के 1 मिलीलीटर जोड़ने राल धो लो । कदम ४.५ से ट्यूब में के माध्यम से प्रवाह को इकट्ठा; कुल अंतिम मात्रा लगभग 7 मिलीलीटर होगा ।
    नोट: चरण ४.६ के बाद, नमूने के बारे में ३५ बार मूल नमूना मात्रा से पतला हो जाएगा; निम्न चरणों की मात्रा कम हो जाएगा और शुद्ध exosome नमूना ध्यान केंद्रित.

5. शुद्ध Exosomes और कुल प्रोटीन ठहराव की एकाग्रता

  1. उपयोग करने से पहले पंजाबियों के साथ एक 3 केडीए MWCO फिल्टर के साथ एक ultrafiltration डिवाइस कुल्ला, चरण ३.१ में वर्णित के रूप में.
  2. ultrafiltration डिवाइस के लिए ४.६ कदम से नमूना जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर ३,७०० x g पर एक झूल-बाल्टी रोटर में केंद्रापसारक । बफर फ़िल्टर के माध्यम से पारित होगा और छोड़ दिया जा सकता है । फिल्टर के ऊपर केंद्रित exosomes रखी जाएगी । जब तक फिल्टर (retentate) के ऊपर की मात्रा २०० µ एल के लिए कम है नमूना केंद्रापसारक
  3. retentate को एक नए microcentrifuge ट्यूब पर ट्रांसफर करें ।
  4. २०० µ एल पंजाबियों के साथ फिल्टर झिल्ली कुल्ला 10 बार झिल्ली पर pipetting द्वारा और कदम ५.३ से ट्यूब को धो हस्तांतरण । यह किसी भी अवशिष्ट exosome नमूना के संग्रह के लिए अनुमति देगा ।
  5. पंजाबियों को जोड़कर ५०० µ l तक नमूना मात्रा लाएं । धीरे से pipetting ऊपर और नीचे 10 बार मिश्रण ।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां ठहर सकता है । नमूने लंबी अवधि के भंडारण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस या रात में 20/-80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जाना चाहिए ।
  6. बीसीए परख द्वारा नमूना के प्रोटीन सामग्री यों तो, निर्माता के प्रोटोकॉल का उपयोग कर । नमूना 1:10 और 1:50 पंजाब में पतला । प्रत्येक नमूना डुप्लिकेट में चलाएँ ।
    नोट: सीरम या प्लाज्मा के कुल प्रोटीन के 10 मिलीग्राम के साथ शुरू, ५.६ कदम से शुद्ध exosomes में कुल प्रोटीन की उपज है, औसत पर, १५० µ जी अतिरिक्त कमजोर पड़ने नमूने सीरम या प्लाज्मा के अलावा अन्य नमूनों का उपयोग किया जाता है, तो आवश्यक हो सकता है; उपज नमूना प्रकार के साथ भिन्न हो सकते हैं ।

6. ठहराव और Nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण द्वारा Exosomes का आकार घटाने (ंत्)

  1. शुद्ध exosomes के 5 µ जी जोड़ें (के रूप में quantified में ५.६) पंजाबियों और भंवर की 1 मिलीलीटर के लिए कम मध्यम गति पर 15 एस के लिए ।
    1. एक 1 मिलीलीटर डिस्पोजेबल सिरिंज में नमूना प्लेस । यदि उपलब्ध है, एक स्वत: सिरिंज सेट में सिरिंज सेट करने के लिए पतला exosome नमूना सुई की दर से 30 µ l/
    2. प्रदर्शन ंत् माप वीडियो कैप्चर सेटिंग्स का उपयोग कर: 3-4 और 12-13 के कैमरा स्तर के स्क्रीन लाभ ।
    3. विश्लेषण के लिए स्क्रिप्ट के लिए एक ंयूनतम 30 s के लिए तीन तकनीकी प्रतिकृतियां परिभाषित करने के लिए हर दोहराने के लिए एक निरंतर प्रवाह का उपयोग कर । विश्लेषण के लिए, कैप्चर थ्रेशोल्ड 5 पर सेट करें ।
      नोट: स्वचालित सिरिंज के उपयोग के संबंध में विवरण, और वीडियो कैप्चर के लिए सेटिंग संदर्भ13में उपलब्ध हैं । ंत् के लिए कैप्चर और विश्लेषण सेटिंग्स भिन्न नमूनों में एकरूपता सुनिश्चित करने के लिए संगत होनी चाहिए.

7. घुलनशील प्रोटीन की कमी का निर्धारण

  1. शुद्ध exosomes के 1-10 µ g जोड़ें नमूना बफर एसडीएस करने के लिए और प्रदर्शन polyacrylamide जेल ट्रो (पृष्ठ) का उपयोग कर एक 4-12% बीआईएस-Tris जेल 1x एमईएस में ३५ मिनट के लिए बफर चल एसडीएस में २०० V. स्थानांतरण हल प्रोटीन एक nitrocellulose ०.२ µm झिल्ली को लागू करने से एक वोल्टेज हे एफ ५० वी के लिए 1-१.५ एच. एल्ब्युमिन, apolipoproteins ए और बी, और exosome मार्कर सीडी ६३ मानक के तरीके के बाद की उपस्थिति का मूल्यांकन करने के लिए पश्चिमी दाग विश्लेषण प्रदर्शन ।
    नोट: ७.१ में विधियों के लिए पूर्ण प्रोटोकॉल संदर्भ में पाया जा सकता है14; विशेष रूप से, SP007: polyacrylamide जैल और SP011 के रनिंग: पश्चिमी दाग प्रोटोकॉल ।
  2. अलग 10 µ जी शुद्ध exosomes चरण ७.१ में के रूप में पृष्ठ का उपयोग कर और प्रोटीन बैंड दाग coomassie डाई का उपयोग कर, मानक सिफारिशों का पालन, प्रोटीन भिन्नता और नमूनों के बीच कमी कल्पना करने के लिए.
    नोट: CD63 के लिए विशिष्ट पश्चिमी दाग के लिए प्रोटोकॉल के बारे में अधिक जानकारी Diaz एट अलद्वारा वर्णित हैं । 15

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

नीचे प्रस्तुत डेटा पांच स्वस्थ रक्त दाताओं से युग्मित प्लाज्मा और सीरम नमूने का उपयोग कर प्राप्त किया गया । प्रत्येक प्रसंस्करण कदम के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए, प्रस्तुत प्रोटोकॉल के पांच रूपों प्रदर्शन किया गया है, और exosome वसूली और गैर exosome प्रोटीन हटाने की तुलना में थे । परीक्षण विधियों में शामिल: 1) SEC ७०० केडीए + Ultrafiltration 3 केडीए; 2) Ultrafiltration १०० केडीए; 3) Proteinase K + Ultrafiltration १०० केडीए; 4) sec ७०० केडीए + Ultrafiltration १०० केडीए, और 5) Proteinase K + Ultrafiltration १०० केडीए + सेकंड ७०० केडीए + Ultrafiltration 3 केडीए.

सामूहिक रूप से, सभी एसईसी ७०० केडीए शामिल तरीके (1, 4, और 5) नमूना, सीरम के दोनों प्रकार में प्रोटीन की माइक्रोग्राम प्रति बुलबुले की एक काफी अधिक संख्या का उत्पादन किया, और प्लाज्मा (आंकड़ा 1aबी). हालांकि, विधि 5 सीरम (चित्रा 1C) की तुलना में प्लाज्मा माइक्रोग्राम प्रति बुलबुले की एक काफी अधिक संख्या में उत्पन्न । इसके विपरीत, शुद्ध exosome नमूनों में प्रोटीन एकाग्रता काफी कम था जबकि एसईसी ७०० केडीए-आधारित तरीकों (1, 4, और 5) का उपयोग कर । एक तरह से ANOVA और Tukey की एकाधिक तुलना परीक्षणों से पता चला है कि तरीकों के बाद अंतिम प्रोटीन एकाग्रता 2 और 3 तरीकों 1, 4, और 5 (पी < 0.001) के बाद अंतिम प्रोटीन एकाग्रता की तुलना में काफी अधिक थे । मतभेद प्लाज्मा या सीरम का उपयोग सुसंगत थे, हालांकि, विधि 1 के साथ शुद्ध exosomes की अंतिम प्रोटीन एकाग्रता काफी अधिक था (टी परीक्षण, p < 0.05) सीरम का उपयोग करते समय (चित्र 2a) । विभिंन पांच तरीकों से शुद्ध exosomes के प्रोटीन वितरण का मूल्यांकन करने के लिए, प्रत्येक विधि से 10 नमूने के µ जी एक पृष्ठ में हल और coomassie डाई के साथ दाग थे । परिणाम सुझाव है कि प्रोटीन के अधिकांश तरीकों से "शुद्ध exosomes" 2 और 3 में मौजूद मजबूत बैंड द्वारा एल्ब्युमिन का प्रतीक था ~ ६५ केडीए (चित्रा 2 बी).

अगला कदम एल्ब्युमिन की उपस्थिति के आधार पर पृथक exosomes की शुद्धता में वृद्धि की पुष्टि करने के लिए किया गया था, रक्त में सबसे प्रचुर मात्रा में प्रोटीन. ultrafiltration प्रक्रिया exosomal अंश है कि आंशिक रूप से पूर्व द्वारा कम किया गया था में एल्ब्युमिन के एक चिह्नित एकाग्रता से पता चला proteinase K (चित्र 3ए, लेन एस और पी) के साथ नमूना इलाज. इस प्रक्रिया में सेकंड ७०० केडीए के शामिल किए जाने से एल्ब्युमिन की मात्रा में कमी आई (चित्र 3ए, गलियाँ P1/s और पी 4/लेकिन एसईसी ७०० केडीए, proteinase कश्मीर, और ultrafiltration का संयोजन शुद्ध exosomes से एल्ब्युमिन का सबसे कुशल हटाने दिखाया ( चित्र 3ए, लेन P5/ हाल के अध्ययनों से पता चला है कि apolipoproteins भी सामांयतः exosome शुद्धि10,16के दौरान सह अलग हैं । विशेष रूप से, ApoB, जो कम घनत्व लिपो में मौजूद है, को अत्यधिक मानव रक्त से शुद्ध exosomes में ध्यान केंद्रित किया गया10पाया गया । इसलिए, हमने लिपो ApoB और ApoA-1 के सह-अलगाव का मूल्यांकन किया । Ultracentrifugation तरीके और Ultracentrifugation और एसईसी के संयोजन ७०० केडीए ने पश्चिमी ब्लाटर द्वारा सीरम और प्लाज्मा में पाई गई राशि की तुलना में ApoB की एक समान राशि दिखाई (चित्र बी, गलियाँ P1/s, P2/S2, और पी 4/ अनुपूरक आंकड़े 1/2) । दिलचस्प है, proteinase कश्मीर के अलावा शुद्ध नमूना से ApoB की पूरी गिरावट के परिणामस्वरूप (चित्र बी, गलियाँ पी इ/S3 और P5/S5) । इसी प्रकार, ApoA-1, मानव प्लाज्मा में उच्च घनत्व लिपो के प्रमुख प्रोटीन घटक, या तो एसईसी ७०० केडीए या proteinase K (चित्रा 3सी) शामिल सभी तरीकों से कम किया गया था । हालांकि, बहुत एल्ब्युमिन की तरह, अपने दम पर १०० MWCO ultrafiltration काफी सह की मात्रा को कम करने में असमर्थ था-शुद्ध ApoA-1 ।

अंत में, exosomes की बाहरी झिल्ली को उजागर प्रोटीन पर proteinase कश्मीर के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए, हम CD63 tetraspanin, exosomes की एक बानगी प्रोटीन की उपस्थिति का मूल्यांकन किया । पश्चिमी दाग के एक विश्लेषण से पता चला है कि प्रोटीन proteinase कश्मीर का उपयोग कर तरीकों में ही detectable नहीं था (चित्रा 3d, गलियाँ p/S3 और P5/s5), लेकिन CD63 के लिए बैंड 5 विधि का उपयोग करते हुए एक अधिक तीव्र संकेत (चित्र 3d, लेन P5/s5) था । यह खोज विधि 5 पैदावार या तो exosomes की एक उच्च एकाग्रता या CD63 एंटीबॉडी exosome सतह के साथ जुड़े प्रोटीन समुच्चय की कमी के कारण बाध्यकारी की वृद्धि का सुझाव है ।

Figure 1
चित्र 1 : पांच अलग शुद्धि तरीकों के बाद प्लाज्मा और सीरम से Exosome उपज । (क) प्लाज्मा से प्राप्त exosomes की एकाग्रता (एन = ५). (B) सीरम से प्राप्त exosomes की एकाग्रता (n = 5) । (ग) प्लाज्मा और सीरम के 5 मीन्स सेट से प्रोटीन की exosomes प्रति माइक्रोग्राम की संख्या के बीच तुलना. x-अक्ष पर संख्याएँ उपयोग की गई प्रत्येक पद्धति का प्रतिनिधित्व करती हैं, 1 = SEC ७०० केडीए + Ultrafiltration 3 केडीए; 2 = Ultrafiltration १०० केडीए; 3 = Proteinase K + Ultrafiltration १०० केडीए; 4 = sec ७०० केडीए + Ultrafiltration १०० केडीए, और 5 = Proteinase K + Ultrafiltration १०० केडीए + सेकंड ७०० केडीए + Ultrafiltration 3 केडीए. A और B में, अंतर एक-तरफ़ा ANOVA और Tukey की एकाधिक तुलना परीक्षणों द्वारा परिकलित किए गए थे । सी में, प्रति विधि सीरम और प्लाज्मा के बीच अंतर टी परीक्षण द्वारा गणना की गई । *p < 0.05; त्रुटि पट्टियां: विश्वास अंतराल का ९५% । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : प्लाज्मा और सीरम से शुद्ध exosomes में प्रोटीन की उपज पांच विभिंन तरीकों का उपयोग । (क) प्लाज्मा और सीरम (n = 5) से प्राप्त शुद्ध exosomes में कुल प्रोटीन उपज की तुलना. (ख) एसडीएस द्वारा हल की गई शुद्धि exosomes के 10 µ g के एक coomassie धुंधलान का प्रतिनिधि चित्र पृष्ठ; n = 1, जोड़ा प्लाज्मा और सीरम । चित्रा में संख्या प्रत्येक विधि का प्रतिनिधित्व करते हैं, 1 = SEC ७०० केडीए + Ultrafiltration 3 केडीए; 2 = Ultrafiltration १०० केडीए; 3 = Proteinase K + Ultrafiltration १०० केडीए; 4 = sec ७०० केडीए + Ultrafiltration १०० केडीए, और 5 = Proteinase K + Ultrafiltration १०० केडीए + सेकंड ७०० केडीए + Ultrafiltration 3 केडीए. एकमें, प्लाज्मा और सीरम व्युत्पंन नमूनों के बीच मतभेद टी परीक्षण द्वारा गणना की गई । *p < 0.05 । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : मानव रक्त और पहचान प्रोटीन CD63 की स्थिरता से पृथक exosomes के सामांय दूषित पदार्थों की कमी । पश्चिमी ब्लाट का मूल्यांकन: (A) एल्ब्युमिन, 1 µ g प्रति लेन; (b) Apolipoprotein b, 1 µ g प्रति लेन; और (ग) Apolipoprotein A1, 10 µ g प्रति लेन; (D) CD63, 1 µ g प्रति लेन । L सीढ़ी =; S = क्रूड सीरम; पी = क्रूड प्लाज्मा । शुद्ध exosome: शुद्धि 5 विभिंन तरीकों का उपयोग कर । चित्रा में संख्या प्रत्येक विधि का प्रतिनिधित्व करते हैं, 1 = SEC ७०० केडीए + Ultrafiltration 3 केडीए; 2 = Ultrafiltration १०० केडीए; 3 = Proteinase K + Ultrafiltration १०० केडीए; 4 = sec ७०० केडीए + Ultrafiltration १०० केडीए, और 5 = Proteinase K + Ultrafiltration १०० केडीए + सेकंड ७०० केडीए + Ultrafiltration 3 केडीए. युग्मित सीरम और एक रोगी के प्लाज्मा से प्रतिनिधि परिणाम; प्रवृत्तियों दाता नमूनों के बीच सुसंगत थे । प्रोटीन लोड दाग द्वारा विविध; सामांयीकरण कुल नमूना एकाग्रता का बीसीए निर्धारण पर आधारित था । प्रत्येक दाग के लिए कुल प्रोटीन लोड प्रति लेन निर्दिष्ट किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

अनुपूरक चित्रा 1: चित्रा 3से मूल unफसली पश्चिमी दाग. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

अनुपूरक चित्रा 2: एल्ब्युमिन के घनत्व ठहराव, ApoB, ApoA-1, और चित्रा 3से CD63 बैंड; ImageJ सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल किया गया । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

एक अनुकूलित विधि को शुद्धता और रक्त से exosomes की उपज बढ़ाने के लिए कई रोगों के लिए एक स्रोत के रूप में सही extracellular बुलबुले की क्षमता में वृद्धि होगी । मानक वर्तमान में exosomes को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया तरीकों, विशेष रूप से, ultracentrifugation और वर्षा के तरीकों, exosome एकत्रीकरण और घुलनशील प्रोटीन की गोली सहित कई नुकसान है7,17, 18. वैकल्पिक रूप से, एसईसी के उपयोग exosome अलगाव में एक महत्वपूर्ण सुधार दिखाया गया है, एकत्रीकरण से exosomes की रक्षा, और आम contaminant गैर exosomal प्रोटीन के हटाने में सुधार9,11,18 , 19. हालांकि, apolipoproteins10, बड़ा बुलबुले, और एल्ब्युमिन सहित प्रोटीन समुच्चय, अक्सर exosomes के साथ सह-पृथक कर रहे हैं, अगर अकेले सेकंड का इस्तेमाल किया जाता है । दो पिछले दो उल्लेख सीमाओं पर काबू पाने में प्रस्तुत प्रोटोकॉल सहायता में महत्वपूर्ण कदम । सबसे पहले, १८,००० x g पर प्लाज्मा या सीरम नमूने के केंद्रापसारक नमूने में मौजूद बड़े बुलबुले के सबसे हाला । दूसरा, proteinase कश्मीर, व्यापक विशिष्टता20के साथ एक serine के साथ सीरम या प्लाज्मा नमूनों के पूर्व उपचार, एल्ब्युमिन की मात्रा को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है और apolipoproteins ए-1 और बी शुद्धि के दौरान exosomes के साथ जुड़े. हम एक ultrafiltration १०० केडीए के एक MWCO के साथ एक झिल्ली का उपयोग करने के लिए आंशिक रूप से छोटे प्रोटीन और पेप्टाइड्स elute कदम के साथ proteinase कश्मीर का उपयोग संयुक्त, और फिर हम ७०० केडीए के एक MWCO के साथ एक एसईसी राल के उपयोग को अनुकूलित आगे स्पष्ट छोटे पेप्टाइड्स/ exosomes । इस राल, मूल रूप से वायरस अलगाव के लिए अनुकूलित, ७०० केडीए के तहत शेष बड़े प्रोटीन और/ इस एसईसी राल के अलगाव के सिद्धांत exosomes के एक सौंय वसूली की अनुमति देता है, राल के माध्यम से नमूने के प्रवाह के बाद से गुरुत्वाकर्षण से प्रेरित है । यह कम एकत्रीकरण और exosomes की बनी अखंडता के लिए अनुमति देता है, ultracentrifugation आधारित तरीकों की प्रमुख सीमाओं के दो काबू पाने । अंत में, यह Baranyai एट अल द्वारा प्रदर्शन किया गया । कि सेकंड प्रोसेसिंग से पहले प्लाज्मा के कमजोर पड़ने से exosome रिकवरी21में सुधार होता है । इस प्रोटोकॉल में, हम एक कमजोर पड़ने से पहले सेकंड के लिए राल के साथ नमूना के संपर्क समय बढ़ाने के कदम शामिल है ।

प्रस्तुत प्रोटोकॉल की एक महत्वपूर्ण सीमा proteinase कश्मीर उपचार द्वारा exosomal झिल्ली में प्रोटीन के संभावित पाचन है । सतह उजागर झिल्ली प्रोटीन पश्चिमी दाग, एलिसा, या प्रवाह cytometry सहित बहाव के विश्लेषण के लिए आवश्यक हैं, तो यह बहाव प्रयोगों ख़राब कर सकते हैं । आंशिक रूप से झिल्ली जुड़े प्रोटीन पर proteinase कश्मीर के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए, हम CD63, एक tetraspanin प्रोटीन है, जो आम तौर पर exosomes में मौजूद है की उपस्थिति के लिए छेड़ने का इलाज नमूनों का विश्लेषण किया । इन परिणामों से पता चला कि पाचन समय और एकाग्रता की वर्णित शर्तों के साथ proteinase कश्मीर का उपयोग महत्वपूर्ण CD63 क्षरण के लिए नेतृत्व नहीं किया । हालांकि, विशिष्ट अनुसंधान हितों के आधार पर झिल्ली से जुड़े प्रोटीन स्थिरता के मूल्यांकन की आवश्यकता होगी ।

अंत में, प्रस्तुत प्रोटोकॉल वर्तमान मौजूदा तरीकों पर कई लाभ प्रदान करता है । प्रत्येक कदम प्रोटोकॉल में शामिल स्वतंत्र अध्ययन में दिखाया गया है exosomes की पवित्रता के लिए फायदेमंद हो: बड़ा बुलबुले, सीरम या प्लाज्मा कमजोर पड़ने की गोली, और एसईसी । इसके साथ ही, जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है, एक proteinase पाचन कदम हटाने के लिए शामिल किया गया था apolipoproteins और प्रोटीन समुच्चय के साथ ही शुद्धिकरण प्रक्रिया के अंत में एक एकाग्रता कदम है कि लाभ exosome स्थिरता और उपज । अंत में, इस प्रोटोकॉल को आसानी से मूत्र या कोशिका संस्कृति supernatants की तरह बड़ी मात्रा के नमूनों से exosomes अलग अनुकूलित किया जा सकता है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस शोध को CSU (to KMD), ATCC कॉन्ट्रैक्ट #2016-0550-0002 (NIAID HHSN272201600013C का एक उपठेका), और बिल एण्ड मेलिंडा गेट्स फाउंडेशन (OPP1039688) (KMD/NKG) से आंतरिक निधियों द्वारा समर्थित किया गया । हम अतिरिक्त सहायता के लिए कोलोराडो राज्य विश्वविद्यालय में स्नातक (रीउ) ग्रीष्मकालीन कार्यक्रम के लिए NSF अनुसंधान अनुभव का शुक्र है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nanosight Malvern NS300
Benchtop microcentrifuge  Thermo Legend Mico21
Benchtop centrifuge  Beckman Coulter Allegra 6R
Waterbath  Benchmark B2000-4
Microplate reader BIOTEK Epoch
Pierce BCA Protein Assay Kit THERMO 23227
Micro BCA Protein Assay Kit THERMO 23235
Phosphate buffered saline Corning 21-040-CV
96 well plate Corning 15705-066
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane EMD-Millipore UFC510096
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units EMD-Millipore UFC800324
Capto Core 700 GE Healthcare 17548103
Poly-Prep Chromatography Columns BIORAD 7311550
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels THERMO NP0323BOX
Nitrocellulose Membrane, Roll, 0.2 µm BIORAD 1620112
Proteinase K, Tritirachium album EMD-Millipore 539480
SimplyBlue SafeStain THERMO LC6065
SIGMAFAST BCIP/NBT Millipore-SIGMA B5655
4-Chloro-1-naphthol Millipore-SIGMA C6788
Anti-CD63 Antibody (rabbit anti-human) with goat anti-rabbit HRP secondary antibody SYSTEM BIOSCIENCES EXOAB-CD63A-1 Primary and secondary antibodies
ALB Antibody (F-10) SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. sc-271605 Primary antibody
apoB Antibody (C1.4) SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. sc-13538 Primary antibody
apoA-I Antibody (B-10) SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. sc-376818 Primary antibody

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stoorvogel, W., Kleijmeer, M. J., Geuze, H. J., Raposo, G. The biogenesis and functions of exosomes. Traffic. 3 (5), 321-330 (2002).
  2. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).
  3. Schorey, J. S., Harding, C. V. Extracellular vesicles and infectious diseases: new complexity to an old story. J Clin Invest. 126 (4), 1181-1189 (2016).
  4. Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. Exosome platform for diagnosis and monitoring of traumatic brain injury. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 369 (1652), (2014).
  5. Nilsson, J., et al. Prostate cancer-derived urine exosomes: a novel approach to biomarkers for prostate cancer. Br J Cancer. 100 (10), 1603-1607 (2009).
  6. Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 4, 29509 (2015).
  7. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031 (2015).
  8. Vergauwen, G., et al. Confounding factors of ultrafiltration and protein analysis in extracellular vesicle research. Scientific Reports. 7 (1), 2704 (2017).
  9. Welton, J. L., Webber, J. P., Botos, L. A., Jones, M., Clayton, A. Ready-made chromatography columns for extracellular vesicle isolation from plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27269 (2015).
  10. Sódar, B. W., et al. Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection. Sci Rep. 6, 24316 (2016).
  11. de Menezes-Neto, A., et al. Size-exclusion chromatography as a stand-alone methodology identifies novel markers in mass spectrometry analyses of plasma-derived vesicles from healthy individuals. J Extracell Vesicles. 4, 27378 (2015).
  12. Corso, G., et al. Reproducible and scalable purification of extracellular vesicles using combined bind-elute and size exclusion chromatography. Scientific Reports. 7 (1), 11561 (2017).
  13. Nanosight Ltd. NanoSight NTA 2.1 Analytical Software, Operating Manual. , Available from: http://nanobio.physics.ucsb.edu/pdfs/equipment/Nanosight%20NTA2.1%20software%20manual.pdf (2010).
  14. Dobos, K. Production Manuals & SOPs. , Available from: http://csu-cvmbs.colostate.edu/academics/mip/research/Pages/dobos-lab-production-manuals-sops.aspx (2017).
  15. Diaz, G., Wolfe, L. M., Kruh-Garcia, N. A., Dobos, K. M. Changes in the Membrane-Associated Proteins of Exosomes Released from Human Macrophages after Mycobacterium tuberculosis Infection. Sci Rep. 6, 37975 (2016).
  16. Yuana, Y., Levels, J., Grootemaat, A., Sturk, A., Nieuwland, R. Co-isolation of extracellular vesicles and high-density lipoproteins using density gradient ultracentrifugation. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
  17. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3 Unit 3.22 (2006).
  18. Muller, L., Hong, C. S., Stolz, D. B., Watkins, S. C., Whiteside, T. L. Isolation of biologically-active exosomes from human plasma. J Immunol Methods. 411, 55-65 (2014).
  19. Böing, A. N., et al. Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
  20. Sweeney, P. J., Walker, J. M. Proteinase K (EC 3.4.21.14). Methods Mol Biol. 16, 305-311 (1993).
  21. Baranyai, T., et al. Isolation of Exosomes from Blood Plasma: Qualitative and Quantitative Comparison of Ultracentrifugation and Size Exclusion Chromatography Methods. PLoS One. 10 (12), e0145686 (2015).

Tags

जैव रसायन अंक १३४ Exosomes आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी Ultrafiltration Nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण मार्कर प्रोटियोमिक्
प्रोटीन पाचन, Ultrafiltration, और आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी मानव रक्त प्लाज्मा और सीरम से Exosomes के अलगाव का अनुकूलन करने के लिए
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Diaz, G., Bridges, C., Lucas, M.,… More

Diaz, G., Bridges, C., Lucas, M., Cheng, Y., Schorey, J. S., Dobos, K. M., Kruh-Garcia, N. A. Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum. J. Vis. Exp. (134), e57467, doi:10.3791/57467 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter