Summary
여기, 선물이 exosomes 플라즈마와 비 exosomal 혈액 단백질의 감소 공동 정화와 혈 청에서 순화 하는 프로토콜. 최적화 된 프로토콜 적용, 효소 치료, 및 크기 배타 착 색 인쇄기를 포함 한다. Exosomes 혜택 다운스트림 분석, 소포 및 proteomic 특성의 더 정확한 정량화를 포함 하 여 향상 된 정화.
Abstract
Exosomes, nanovesicle, 모든 세포 유형에 서 발표의 형식 어떤 신체 유체에서 격리 될 수 있습니다. Exosomes, RNAs, 단백질 등의 내용에서 그들이 파생 되 고 질병의 지시자로 사용 될 수 있는 셀에 독특합니다. Ultracentrifugation를 포함 하 여 몇 가지 일반적인 농축 프로토콜 exosomes 수용 성 단백질 오염 물질와 라덴 항복. 특히, 우리는 발견 혈액 내에서 가장 풍부한 단백질 종종 공동 exosomes와 정화와 다운스트림 proteomic 연구, 혼동 수 있습니다 낮은 풍부한 바이오 마커 후보 식별을 방해. 추가적인 관심사의 비 exosomal 단백질 레벨의 일관성 없는 표현으로 인해 exosome 단백질 정량화의 irreproducibility가입니다. 여기서 설명 하는 프로토콜 공동 exosome 정화 과정을 엄 함 추가, exosomes 함께 정화 비 exosomal 단백질 제거 개발 되었다. 5 개의 메서드 쌍된 혈액 플라스마 및 5 기증자에서 혈 청을 사용 하 여 비교 되었다. 나노 분석 및 마이크로 bicinchoninic 산 성 단백질 분석 결과 추적을 사용 하 여 분석 결합된 프로토콜 적용 및 크기 배제 크로마토그래피를 이용 하 여 최적의 소포 농축 및 수용 성 단백질 제거 나왔고 밝혔다. 서 부 럽 확인 예상된 풍부한 혈액 단백질, 알 부 민 및 apolipoproteins를 포함 하 여 고갈 되었다 사용 되었다.
Introduction
Exosomes는 nanovesicles (30에서 크기에 이르기까지 150 nm nm)1,2처리 셀을 통신을 용이 하 게 하는 인체에 거의 모든 세포에 의해 발표. 흥미롭게도, exosomes의 구성 원본 셀 뿐만 아니라 개별3,,45의 건강 상태에 따라 변경합니다. 또한, exosomes에서에서 검색할 수 있습니다 여러 가지 생물 학적 체액과 같은: 타 액, 소변, 혈액2. 이러한 기능 때문에 exosomes 질병 biomarkers의 좋은 원천이 될 여겨진다. 불행히도, exosomes의 격리에 대 한 표준 방법이입니다. 일부 실험실 exosome 격리에 대 한 표준 방법으로 밀도 그라디언트를 사용 하 여 100000 x g에서 최종 고속 단계 다단계 원심 분리를 고려 합니다. 그러나, 최근 연구는 ultracentrifugation exosomes 수용 성 단백질 및 exosome 무결성, 다운스트림 응용 프로그램6,7 방해 수 있습니다 둘 다에 영향을 미치는 이외에 다른 exosomes의 유도 . Exosome 고립의 다른 일반적인 방법 포함, 하지만 제한 되지 않는다: 상업적인 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG)에 의해 강 수 기반으로 시 약, 원심 외, 크기 배제 크로마토그래피 (SEC). 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG) 고분자를 사용 하 여 상업용 시 약 그들 침전 한 펠 릿을 형성 하 여 exosomes을 풍부. 이 폴리머를 사용 하 여 제한 잔여 말뚝 폴리머와 최종 제품에 수용 성 비 exosomal 단백질의 풍부한 오염 있습니다. 한 원심 하 정화 하 고 셀 룰 로스 막;를 사용 하 여 소포를 집중 활용 exosomes는 필터 위에 작은 불순물 및 다른 단백질 막7,8을 통과 하는 동안 유지 됩니다. 다른 방법 처럼 원심 한 정화 exosomes의 비 exosomal 단백질, 단백질 복합물 및 집계를 포함 하 여 높은 수준의 보존 때문에 제한 된 용량을 하고있다. 마지막으로, 초 정화 분자 크기 별로 분리를 다공성 수 지를 사용 합니다. 초 오염 물질 단백질의 대부분을 캡처하고 중력 또는 저압 시스템7,를 기반으로 하는 고립 exosomal 무결성을 보존 하 여 다른 방법으로 경험이 문제의 대부분을 극복 하는 유망한 결과 보이고 있다 9. 그러나, 초 동안 더 큰 단백질 집계 및 단백질10 의 공동 격리 최종 exosome 준비의 순수성을 영향을 줍니다. 몇 가지 방법이 세포 문화 supernatants 및 플라즈마7, 또는 플라즈마9,11exosome 정화에 대 한 테스트 되었습니다, 혈액을 직접 비교 하는 방법의 성능에 대 한 정보는 플라즈마와 같은 개인에서 혈 청
여기, 우리는 다양 한 소포 농축 기술 플라즈마와 세럼 사이 번역 확인 하려면 워크플로 비교 하 여 exosomes 혈액의 정화에 초점. 나노 분석 및 서쪽 오 점 추적 exosome 농도, 순도, 단백질 구성 최종 제품에서의 차이 척도를 사용 했다. 마지막 방법은,이 프로토콜에 대 한 자세한 소포 번호를 증가 하 고 비 exosomal 단백질 수준을 감소 시킨다. 중요 한 것은, 일반적인 공동 계기 단백질 알 부 민 및 apolipoproteins 등의 급격 한 감소는 보여 줍니다. 피 고는 그들은 공동 정화 exosomes와 다운스트림 분석 기울이기 "순화" 샘플 간의 원인 불일치 하는 주파수에이 두 가지 단백질의 높은 풍부. 이 프로토콜은 상업적으로 사용할 수 있는 초 수 지;의 사용을 포함 수 지는 다공성 구슬 단백질 700 kDa 보다 작은 구슬을 입력할 수 있습니다 구성 된다. 한 번 안쪽으로, 단백질 octylamine 리간드에 의해 유지 됩니다. Exosomes와 700 kDa12보다 큰 분자는 eluate 구성 됩니다. 또한, 단백질 집계 및 구슬 트랩을 피하기 위해 apolipoproteins을 줄이기 위해 우리는 워크플로의 효소 소화 단계는. 현재, 공동 정화 비 exosomal 단백질을 줄이면서 exosome 수익률을 극대화 할 수 없는 하나의 기술이입니다. 이 연구는 여러 복구 및 정화 방법 효소 소화 전처리를 결합 하는 정화 프로토콜 exosome 수율 및 순도 혈액 혈 청 및 혈장에서 증가 사용할 수 있습니다 보여줍니다.
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Protocol
이 작품을 결정 했다 하지 인간의 주제 연구 초기 검토에서 콜로라도 주립 대학의 기관 검토 위원회 (IRB), 모든 인간의 샘플 Bioreclamation IVT biorepository에서 취소 확인 된 견본으로 가져온 고 했다 IRB 승인 프로토콜에서 수집.
1. 산 큰 소포 및 세포질 파편에 의해 원유 샘플 (플라스마 또는 혈 청)의 준비
참고: 안전 고려 사항: 플라스마, 혈 청, 그리고 다른 생물 학적 체액 유해 재료 이며 장갑 및 실험실 외 투를 포함 하 여 기본적인 개인 보호 장비를 착용 하는 동안 특별 한 관리와 처리 해야 합니다. 생물 학적 샘플 biosafety 내각;에서 처리 되는 것이 좋습니다. 그렇지 않다면, 눈 보호를 사용 하 여 것이 좋습니다.
- 4 ° C 냉장고에 하룻밤 떨고 비 조건에서 튜브를 배치 하 여 혈 청 또는 혈장 샘플을 equilibrate (중-20에서 또는-80 ° C).
- Aliquot 250 µ L 1000 µ L 피 펫을 사용 하 여 microcentrifuge 튜브에 샘플의.
- 4 ° c.에 30 분 18000 x g에서 샘플을 원심
- 200 µ L 피 펫을 사용 하 여, 허가 상쾌한의 200 µ L을 제거 하 고 새로운 microcentrifuge 튜브에 추가. 상쾌한 전송 하는 동안 수송과 자료를 하지 마십시오. 수송과 자료를 삭제 합니다.
- Bicinchoninic 산 (BCA) 분석 결과, 제조 업체의 프로토콜을 사용 하 여 샘플의 단백질 함량을 계량. 분석 결과 수행 하려면 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 1의 1:50 샘플을 희석. 중복에서 각 샘플을 테스트 합니다.
참고: 프로토콜에 걸쳐 1 x PBS를 사용 하 여 달리 명시 하지 않는 한. 평균적으로, 명백 하 게 혈 청 또는 플라스마 (18000 x g) 후의 200 µ L 총 단백질의 15 mg을 얻을 것입니다. 낮은 또는 높은 단백질 콘텐츠, 다른 샘플 형식 추가 BCA 희석 해야 합니다. - 새로운 microcentrifuge 관으로 샘플의 aliquot 10 밀리 그램. 1.5 단계에서 얻은 농도 사용 하 여 계산 하는 샘플의 해당 볼륨. 약 200 µ L 피 펫을 사용 하 여 샘플 수입니다.
참고: -80 ° c.에 나머지 샘플을 저장 하는 것이 좋습니다. Aliquot 샘플을 피하기 위해 여러 동결-해 동 주기 미래에 튜브 당 10 마그네슘에 다른 튜브에 사용 합니다.
2. 비 exosomal 혈액 단백질의 소화
참고: 소화 단계는 exosomes와 공동 정화 수 있는 비 exosomal 단백질을 줄이기 위해 설계 되었습니다. 보존 exosome 표면 단백질의 다운스트림 분석에 필요한 경우이 단계는이 분석을 방해 하는 고려 사항으로 취해야 한다. Exosomal CD63, 표면 노출 tetraspanin 단백질의 검출은이 과정에 의해 크게 부정적인 영향을 하지.
- PBS에서 500 µ g/mL의 농도에서 가수분해 K 솔루션을 준비 합니다. 원뿔 튜브에 가수분해 K의 해당 금액을 추가 합니다. 그런 다음 버퍼와 30에 대 한 소용돌이 추가 s, 실 온에서 3 배.
- Aliquot 10 mg 샘플을 가수분해 K 솔루션의 50 µ L을 추가 하 고 200 µ L 피 펫을 사용 하 여 위아래로 pipetting으로 부드럽게 혼합.
- 플 로트 튜브 랙에서 튜브 30 분 장소에 대 한 물 목욕에서 37 ° C에서 샘플을 품 어 하 고 잠재적인 누설을 피하기 위해 물 목욕에서 튜브의 완전 한 침수를 방지.
- 가수분해 K. 비활성화를 샘플 및 부동 튜브 랙 10 분 동안 60 ° C 물 목욕을 전송
3. 작은 단백질 및 펩 티 드 원심 분리기 외에 의해의 제거
- 린스 사용 하기 전에 PBS와 100 kDa 분자량 컷오프 (MWCO) 필터를 포함 한 장치. PBS의 500 µ L 1000 µ L 피 펫을 사용 하 여 필터를 추가 하 여 이렇게 합니다. eluate 뿐만 아니라 모든 나머지 retentate 5 분 삭제에 대 한 3700 x g에 장치를 회전 합니다.
참고: 한 장치 샘플 볼륨 용량 0.5 mL-4 mL 50 µ L의 최종 감소 샘플 볼륨 달성 되도록 해야 합니다. - 2.4 단계에서 샘플 하 고 PBS를 추가 하 여 500 µ L 볼륨을 증가. 미리 씻어 서 한 장치에 샘플을 플라스틱.
참고: 평균, 샘플 볼륨 단계 2.4에서에서 185 µ L (120 ~ 150 µ L의 샘플 및 가수분해 K 솔루션의 50 µ L)입니다. - 샘플은 50 µ L의 볼륨을 줄일 때까지 4 ° C에서 3700 x g에서 고정 각도 벤치탑 원심 분리기에서 한 장치를 놓습니다.
주의: 죽은 중지 한 장치를 사용할 때 볼륨을 주의 해야 합니다 원심 분리 단계 필터 멤브레인의 완전 한 건조를 피하기 위해. - 직접 필터 막 5 번 위아래로 피 펫에 PBS의 500 µ L를 추가 합니다. 3.3 단계에서 원심. 이 세척 단계 총 3 번을 수행 합니다.
- 새로운 microcentrifuge 튜브에 최종 50 µ L retentate를 전송 합니다.
- 200 µ L PBS, 10 번, 위아래로 pipetting으로 필터 막 헹 구 고 단계 3.5에서에서 튜브를 세척을 전송.
- 새로운 튜브에서 역 위치에 필터 홀더를 배치 합니다. 2000 x g 막에서 나머지 샘플을 검색에 5 분에 대 한 역방향 회전 복구를 실행 합니다. 수영장 단계 3.5에서에서 샘플 샘플.
4. 소포 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 정화
- 구슬 1000 µ L 피 펫을 사용 하 여 빈, 출장 중력 흐름 열에 700 kDa의 MWCO 데 초 슬러리의 850 µ L를 추가 합니다. 적절 한 랙 똑 트레이 장착 크기에 열을 배치 합니다.
- 칼럼의 하단을 벗기다 하 고 5 분 동안 액체 드레인. 일단 물기, 수 지를 세척 하는 PBS의 10 mL를 추가 합니다. 허용 열에서 세척에 대 일 분.
- 집중 배치, 가수분해 K 15 mL 원뿔 튜브에 3.5 단계에서 샘플을 처리 하 고 5 ml 혈 청 학적인 피 펫으로 PBS를 추가 샘플 볼륨을 증가. 1 분 동안 흔들어 하 여 튜브를 부드럽게 혼합 하 고 천천히 단계 4.2 혈 청 학적인 피 펫에서에서 준비 하는 열에 샘플을 적용.
참고: 열의 모자가 제거 되 면 샘플은 통과 수 지 중력; 5 mL 샘플 10 분에 열을 통해 완전히 흐름 것입니다. - 새로운 15 mL 원뿔 튜브에서를 통해 흐름을 수집 합니다.
- 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여, 수집 된 자료 700 kDa 아래 남아 있는 자료를 제거 하려면 다시 수 지 적용 됩니다.
- 새로운 15 mL 원뿔 튜브에서를 통해 흐름을 수집 합니다. PBS의 1 mL를 두 번 추가 하는 수 지를 세척. 4.5; 단계에서 튜브를 통해 흐름을 수집 총 마지막 볼륨 7 mL 대략 있을 것입니다.
참고: 4.6 단계, 후 샘플 것입니다 희석 약 35 번에서 원래 샘플 볼륨; 다음 단계는 볼륨 하 정화 exosome 샘플을 집중 하십시오.
5. 정화 Exosomes와 부 총 단백질 량의 농도
- 3.1 단계에서 설명한 대로 3 kDa MWCO 필터 적용 장치 사용, PBS 전에 린스 합니다.
- 한 장치 및 4 ° c.에 3700 x g에서 진동 물통 회전자에 원심 분리기 샘플 단계 4.6에서 추가 버퍼는 필터를 통과 하 고 삭제 될 수 있습니다. 집중된 exosomes 필터 위에 유지 됩니다. 샘플을 원심 필터 (retentate) 위에 볼륨 200 µ L로 감소 될 때까지.
- 새로운 microcentrifuge 튜브에는 retentate를 전송.
- 10 번 막에 pipetting으로 200 µ L PBS 가진 필터 멤브레인을 헹 구 고 단계 5.3에서에서 튜브를 세척을 전송. 이것은 어떤 잔여 exosome 샘플의 컬렉션에 대 한 허용.
- PBS를 추가 하 여 500 µ L 최대 샘플 볼륨을 가져와. 10 번 위아래로 천천히 pipetting으로 혼합.
참고: 프로토콜 여기 일시 중지 될 수 있습니다. 샘플 4 ° C 하룻밤 사이에 또는 긴 기간 저장을 위해-20/80 ° C에서 저장 되어야 한다. - BCA 분석 결과, 제조 업체의 프로토콜을 사용 하 여 샘플의 단백질 함량을 계량. 예제 1시 10분과 1:50 PBS에 희석. 중복에서 각 샘플을 실행 합니다.
참고: 혈 청 또는 플라스마의 총 단백질의 10mg에서 시작 해 서, 단계 5.6에서에서 순화 exosomes에 총 단백질 수확량은, 평균, 150 µ g. 추가 희석 해야 경우 혈 청 또는 혈장 샘플 사용 됩니다; yield 샘플 유형으로 달라질 수 있습니다.
6. 정량화 및 나노 분석 (NTA)를 추적 하 여 Exosomes의 크기 조정
- 추가 정화 exosomes의 5 µ g (5.6에서 계량) 1 mL의 PBS와 15에 대 한 소용돌이를 낮은 중간 속도에 s.
- 1 mL 일회용 주사기에 샘플을 놓습니다. 가능한 경우, 희석된 exosome 샘플 30 µ L/min의 속도로 주입을 설정 하는 자동 주사기 펌프에 주사기를 설정 합니다.
- NTA 측정 비디오 캡처 설정을 사용 하 여 수행: 12-13의 3-4 및 카메라 레벨의 이득 화면.
- 30의 최소 3 기술 복제를 실행 하려면 분석 스크립트 정의 지속적인 흐름을 사용 하 여 모든 복제에 대 한 s. 분석을 위해 5에서 캡처 임계값을 설정 합니다.
참고: 비디오 캡처에 대 한 설정과 자동 주사기의 사용에 관한 세부 기준13사용할 수 있습니다. 주권에 대 한 캡처 및 분석 설정을 comparability을 보장 하기 위해 다른 샘플에서 일치 해야 합니다.
7입니다. 수용 성 단백질 감소의 결정
- SDS 샘플 버퍼에 순화 exosomes의 1-10 µ g을 추가 하 고 수행 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (페이지) 4-12% 두번째-트리 스 젤을 사용 하 여 1 x MES SDS 200에서 35 분에 대 한 버퍼를 실행에 V. 전송 전압 o를 적용 하 여 니트로 0.2 µ m 막 단백질을 해결 f 50 V 1-1.5 헤 알 부 민, apolipoproteins A 및 B, exosome 마커 CD 63의 존재를 평가 하기 위해 수행 서쪽 오 점 분석을 위한 표준 방법론에 따라.
참고: 7.1에서 메서드에 대 한 전체 프로토콜 참조14;에서 찾을 수 있습니다. 특히, SP007: polyacrylamide 젤 및 SP011의 실행: 서쪽 오 점 프로토콜. - 7.1 단계 에서처럼 페이지를 사용 하 여 순화 exosomes의 10 µ g 하 고 얼룩 단백질 밴드 coomassie 염료를 사용 하 여 단백질 변형 및 샘플 간의 감소를 시각화 하기 위해 다음과 같은 표준 권장 합니다.
참고: 서쪽 오 점 CD63에 대 한 프로토콜에 대 한 자세한 내용은 디아즈 외에 의해 설명 되어 있습니다. 15
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Representative Results
아래 데이터는 5 명의 건강 한 혈액 기증자 로부터 쌍된 플라스마와 혈 청 샘플을 사용 하 여 얻은 했다. 그리고 각 처리 단계에의 효과 확인 하려면 제시 프로토콜의 5 개의 변형 수행 했다, exosome 복구 및 비 exosome 단백질 제거 비교 했다. 포함 된 메서드 trialed: 1) SEC 700 kDa + 외 3 kDa; 2) 한 100 kDa; 3) 가수분해 K + 외 100 kDa; 4) 초 700 kDa + 외 100 kDa, 및 5) 성분을 K + 외 100 kDa + 초 700 kDa 외 3 kDa.
샨 다, 초 700 kDa (1, 4, 및 5)를 포함 하는 모든 방법 샘플, 혈 청, 그리고 플라즈마 (그림 1A-B)의 두 종류에서 단백질의 그램 당 vesicles의 상당히 높은 수 생산. 그러나, 방법 5 세럼 (그림 1C)에 비해 플라즈마의 그램 당 vesicles의 상당히 높은 번호를 생성. 반대로, 순화 exosome 샘플의 단백질 농도 초 700 kDa 기반 방법 (1, 4, 및 5)를 사용 하는 동안 상당히 낮은 했다. 일방통행 ANOVA와 Tukey의 다중 비교 테스트 보여준 최종 단백질 농도 후 방법 2 및 3 방법 1, 4, 및 5 후 최종 단백질 농도 보다 크게 높았다 (p < 0.001). 그러나 차이점은 플라스마 또는 혈 청을 사용 하 여 일관 된,, 방법 1 순화 exosomes의 최종 단백질 농도 상당히 높은 (t-검정, p < 0.05) 세럼 (그림 2A)을 사용 하는 경우. 다른 5 개의 방법에 의해 순화 exosomes의 단백질 분포를 평가 하려면 각 방법에서 샘플의 10 µ g 페이지에서 해결 되었고 coomassie 염료와 스테인드. 결과 방법 2와 3에서에서 "순화 exosomes"에 있는 단백질의 대부분은 알 부 민 (그림 2B) 강한 밴드 ~ 65 kDa의 의미 것이 좋습니다.
다음 단계는 알 부 민, 혈액에 있는 가장 풍부한 단백질의 존재에 따라 격리 된 exosomes의 순수성에 증가 확인 했다. 적용 과정 (그림 3A, S 및 P 레인) 성분 K와 샘플 미리 치료 하 여 부분적으로 감소 되었다 exosomal 분수에 표시 된 알 부 민 농도 보였다. 과정에서 초 700 kDa의 포함 초 700 kDa, 가수분해 K, 및 알 부 민 정화 exosomes ( 에서에서의 가장 효율적인 제거를 보여 한 조합 이지만 알 부 민 (그림 3A, P1/s 1과 s p 4/4 차선)의 양을 감소 그림 3A, 레인 P5/S5). 최근 연구 결과 apolipoproteins는 또한 일반적으로 공동 격리 exosome 정화10,16동안 나타났습니다. 특히, ApoB에에서 존재 하는 저밀도 지 단백질, 인간의 피10에서 순화 exosomes에 매우 집중 될 발견 됐다. 따라서, 우리는 단백질 ApoB와 ApoA-1의 공동 격리 평가. Ultracentrifugation 메서드 및 Ultracentrifugation 및 초 700 kDa의 조합을 보여준 서쪽 오 점 (그림 3B, 레인 s 1 P1/P2/S2, 그리고 P4/S4;에 의해 혈 청 및 혈장에서 감지 하는 금액에 비해 ApoB의 비슷한 금액 보충 수치 1/2)입니다. 흥미롭게도, 가수분해 K의 추가 순화 샘플 (그림 3B, 레인 P3/S3 및 P5/S5)에서 ApoB의 완전 한 파괴 귀착되는. 마찬가지로, 인간의 플라즈마의 고밀도 지 단백질의 주요 단백질 구성 요소 ApoA 1 초 700 kDa 또는 가수분해 K (그림 3C)와 관련 된 모든 방법으로 감소 되었다. 비록, 알 부 민 처럼, 자체에 100 MWCO 외 공동 ApoA-1 정화의 양을 크게 줄일 수 아니었다.
마지막으로, 단백질 exosomes의 외부 막에 노출에 가수분해 K의 효과 확인 하려면 우리는 CD63 tetraspanin, exosomes의 각 인 단백질의 존재를 평가. 서쪽 오 점 분석 단백질만 성분을 K (그림 3D, 레인 P3/S3 및 P5/S5)를 사용 하 여 방법에서 감지 되지 않았습니다 하지만 방법 5를 사용 하 여 CD63에 대 한 밴드 했다 더 강한 신호 (그림 3D, 레인 P5/S5)을 보여주었다. 이 이는 exosomes의 높은 농도 또는 CD63 항 체 바인딩 exosome 표면와 관련 된 단백질의 감소 때문에의 증가 생성 하는 방법 5을 제안 합니다.
그림 1 : 플라즈마와 5 개의 다른 정화 방법 후 혈 청에서 Exosome 항복. Exosomes의 (A) 농도 플라즈마에서 얻은 (n = 5). Exosomes의 (B) 농도 혈 청에서 얻은 (n = 5). (C) 플라즈마의 5 쌍이 된 세트에서 단백질의 그램 당 exosomes의 숫자와 혈 청의 비교. 숫자 x 축 대표 하는 각 방법 사용, 1 = 초 700 kDa + 외 3 kDa; 2 외 100 kDa; = 3 = 가수분해 K + 외 100 kDa; 4 초 700 kDa + 외 100 kDa, 5 = = 가수분해 K + 외 100 kDa + 초 700 kDa 외 3 kDa. A와 B, Tukey의 다중 비교 테스트와 차이점 일방통행 ANOVA로 계산 했다. C, 혈 청 및 플라즈마 방법 당 차이 t-검정으로 계산 했다. p < 0.05; 오차 막대: 95% 신뢰 구간. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 플라즈마와 5 개의 다른 메서드를 사용 하 여 혈 청에서 순화 exosomes에 단백질 수확량. (A) 비교 순화 exosomes에는 총 단백질의 혈장 및 혈 청에서 얻은 (n = 5). SDS 페이지; 해결 순화 exosomes의 10 µ g의 coomassie 얼룩의 대표 그림 (B) n = 1, 쌍 플라즈마 및 혈 청. 그림에서 숫자는 각 메서드를 나타내는 1 초 700 kDa + 외 3 kDa; = 2 외 100 kDa; = 3 = 가수분해 K + 외 100 kDa; 4 초 700 kDa + 외 100 kDa, 5 = = 가수분해 K + 외 100 kDa + 초 700 kDa 외 3 kDa. A에서 플라스마와 혈 청에서 파생 된 샘플 간의 차이 t-검정으로 계산 했다. p < 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : Exosomes 특징 단백질 CD63의 안정성과 인간의 혈액에서 고립의 일반적인 오염 물질의 감소. 서쪽 오 점 평가: (A) 알 부 민, 레인; 당 1 µ g (B) Apolipoprotein B, 레인; 당 1 µ g 그리고 (C) Apolipoprotein A1, 레인; 당 10 µ g (D) CD63, 레인 당 1 µ g L = 사다리; S = 조 혈 청; P = 원유 플라즈마. 순화 exosome: 5 가지 방법을 사용 하 여 정화. 그림에서 숫자는 각 메서드를 나타내는 1 = 초 700 kDa + 외 3 kDa; 2 외 100 kDa; = 3 = 가수분해 K + 외 100 kDa; 4 초 700 kDa + 외 100 kDa, 5 = = 가수분해 K + 외 100 kDa + 초 700 kDa 외 3 kDa. 쌍된 혈 청 및 한 환자;의 플라즈마에서 대표적인 결과 동향은 기증자 샘플 사이 일관 했다. 단백질 로딩 달라 오 점; 정규화는 총 샘플 농도의 BCA 결정에 근거 했다. 레인 당 총 단백질 부하 각 오 점을 위해 지정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 그림 1: 원래 서양 uncropped 지우고 그림3에서. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 그림 2: 알 부 민, ApoB, ApoA-1 및 그림 3;에서 CD63 밴드의 밀도 정량화 ImageJ 소프트웨어 사용 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
순도 및 혈액에서 exosomes의 수확량을 증가 하는 최적화 된 방법 정확 하 게 여러 가지 질병에 대 한 생체의 원천으로 extracellular 소포 내 능력을 증가할 것 이다. 표준 방법 현재 exosomes, 특히, 분리 하는 데 사용 ultracentrifugation과 강 수 방법, exosome 집계 및 수용 성 단백질7,,17판 몇 가지 단점이 있다 18. 또는, SEC의 사용 exosome 격리, 집계에서 exosomes를 보호 하 고 일반적인 오염 물질 비 exosomal 단백질9,,1118 의 제거 향상에 상당한 개선을 나타났습니다. , 그러나 19., apolipoproteins10, 큰 소포 및 단백질 집계, 알 부 민를 포함 하 여 종종 공동 격리 됩니다 exosomes와 초 혼자 사용 하는 경우. 2 중요 한 단계 마지막 두 언급 한 한계 극복에 제시 프로토콜 지원 합니다. 먼저, 큰 소포의 대부분 샘플에 존재 하는 g 침전 x 18000에 플라스마 또는 혈 청 샘플의 원심 분리. 둘째, 가수분해 K, 광범위 한 특이성20, 떠들고 protease와 혈 청 또는 혈장 샘플의 전처리는 알 부 민 및는 apolipoproteins의 양을 줄이기 위해 중요 한 a-1와 B 정화 동안에 exosomes와 관련 된. 우리 100 kDa의 MWCO 있는 막 사용 하 여 부분적으로 elute 작은 단백질 및 펩 티 드, 한 단계 K 성분을 사용 하 여 결합 되 고 다음 우리를 더 작은 펩 티 드/단백질에서 700 kDa의 MWCO와 초 수 지를 사용 하 여 적응은 exosomes입니다. 이 수 지, 원래 바이러스 격리에 대 한 최적화 된 나머지 큰 단백질 또는 단지 700 kDa에서 캡처합니다. 이 초 수 지의 절연의 원리 때문에 수 지를 통해 샘플의 흐름은 중력에 의해 구동, exosomes의 부드러운 복구를 수 있습니다. 적은 집계 및 2 ultracentrifugation 기반 방법의 주요 한계를 극복 하는 exosomes의 유지 무결성에 대 한 수 있습니다. 마지막으로, Baranyai 그 외 여러분 에 의해 입증 되었다 그 초 처리 하기 전에 플라즈마의 희석 exosome 복구21을 향상 시킵니다. 이 프로토콜에서 우리 초 샘플 수 지와의 접촉 시간을 증가 하기 전에 희석 단계를 포함 했다.
제시 프로토콜의 중요 한 제한 가수분해 K 처리에 의해 exosomal 막에 있는 단백질의 잠재적인 소화입니다. 이 표면에 노출 된 막 단백질 다운스트림 분석 서쪽 오 점, ELISA를 포함 하 여 필요한 경우 다운스트림 실험을 손상 하거나 cytometry 흐름 수 있습니다. 막 관련 단백질에 가수분해 K의 효과 부분적으로 테스트 하려면 우리는 CD63, exosomes에 일반적으로 존재 하는 tetraspanin 단백질의 존재에 대 한 효소 처리 샘플 분석. 이러한 결과 소화 시간과 농도의 설명 조건 K 성분 사용 하 여 중요 한 CD63 저하에 지도 하지 않았다 보여주었다. 그러나, 특정 연구 분야에 따라 막 관련 단백질 안정성의 추가 평가 해야 합니다.
결론적으로, 제시 프로토콜 현재 기존 방법에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 프로토콜에 포함 된 각 단계는 exosomes의 순수성에 대 한 도움이 될 독립적인 연구에 나타났습니다: 성분을 소화 단계 제거 포함 했다 더 큰 소포, 혈 청 또는 플라스마 희석, 그리고 초. 또한의 산 위에서 언급 한 대로, 농도 뿐만 아니라 apolipoproteins와 단백질 집계 exosome 안정성과 수율 혜택 정화 과정의 끝에 단계. 마지막으로,이 프로토콜은 소변 같은 큰 볼륨 샘플에서 exosomes 격리 또는 문화 supernatants 셀을 쉽게 적용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 연구는 (KMD/NKG)에 CSU (KMD)를, ATCC 계약 #2016-0550-0002 (NIAID HHSN272201600013C의 하청), 그리고 법안과 멜 린다 게이츠 재단 (OPP1039688)에서 내부 자금에 의해 지원 되었다. 우리는 추가 지원에 대 한 콜로라도 주립 대학에서 학부생 (소장) 여름 프로그램에 대 한 NSF 연구 경험 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nanosight | Malvern | NS300 | |
| Benchtop microcentrifuge | Thermo | Legend Mico21 | |
| Benchtop centrifuge | Beckman Coulter | Allegra 6R | |
| Waterbath | Benchmark | B2000-4 | |
| Microplate reader | BIOTEK | Epoch | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | THERMO | 23227 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | THERMO | 23235 | |
| Phosphate buffered saline | Corning | 21-040-CV | |
| 96 well plate | Corning | 15705-066 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane | EMD-Millipore | UFC510096 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units | EMD-Millipore | UFC800324 | |
| Capto Core 700 | GE Healthcare | 17548103 | |
| Poly-Prep Chromatography Columns | BIORAD | 7311550 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | THERMO | NP0323BOX | |
| Nitrocellulose Membrane, Roll, 0.2 µm | BIORAD | 1620112 | |
| Proteinase K, Tritirachium album | EMD-Millipore | 539480 | |
| SimplyBlue SafeStain | THERMO | LC6065 | |
| SIGMAFAST BCIP/NBT | Millipore-SIGMA | B5655 | |
| 4-Chloro-1-naphthol | Millipore-SIGMA | C6788 | |
| Anti-CD63 Antibody (rabbit anti-human) with goat anti-rabbit HRP secondary antibody | SYSTEM BIOSCIENCES | EXOAB-CD63A-1 | Primary and secondary antibodies |
| ALB Antibody (F-10) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-271605 | Primary antibody |
| apoB Antibody (C1.4) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-13538 | Primary antibody |
| apoA-I Antibody (B-10) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-376818 | Primary antibody |
References
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