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Biochemistry

Digestion des protéines, Ultrafiltration et chromatographie d’Exclusion afin d’optimiser l’isolement des Exosomes de sérum et de Plasma sanguin humain

Published: April 13, 2018 doi: 10.3791/57467
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1, 1
1Department of Microbiology, Immunology and Pathology, Colorado State University, 2Department of Biological Sciences, Eck Institute for Global Health, University of Notre Dame

Summary

Nous présentons ici un protocole visant à purifier les exosomes de plasma et de sérum réduit co purification de protéines sanguines non-exosomal. Le protocole optimisé inclut l’ultrafiltration, le traitement de la protéase et chromatographie d’exclusion. Améliorée de purification des exosomes des analyses en aval avantages, y compris la quantification plus précise des vésicules et la caractérisation de la protéomique.

Abstract

Exosomes, un type de nanovesicle libéré de tous les types de cellules, peuvent être isolées de tout fluide corporel. Le contenu des exosomes, y compris les protéines et les ARN, est unique dans les cellules d'où ils proviennent et peuvent être utilisés comme indicateurs de maladie. Plusieurs protocoles communs de l’enrichissement, y compris ultracentrifugation, rendement exosomes chargés de contaminants de protéines solubles. Plus précisément, nous avons constaté que les protéines les plus abondantes dans le sang souvent co purifient avec exosomes et peuvent confondre des études protéomiques en aval, contrecarrer l’identification des candidats de biomarqueurs de faible abondance. Autre sujet de préoccupation est reproducibilité de dosage protéique exosome en raison de la représentation incompatible des concentrations de protéines non-exosomal. Le protocole détaillé ici a été développé pour éliminer les protéines non-exosomal qui purifient conjointement avec les exosomes, ajout de rigueur pour le processus de purification exosome. Cinq méthodes ont été comparées à l’aide de paires de plasma sanguin et le sérum de cinq donateurs. L’analyse en utilisant des nanoparticules, suivi, analyse et dosage de la protéine acide bicinchoninic micro a révélé qu’un protocole combiné utilisant la chromatographie d’exclusion de l’ultrafiltration et la taille ont donné l’enrichissement vésicule optimale et l’enlèvement de protéines solubles. Western Blot a été utilisée pour vérifier que les protéines de sang abondantes attendues, notamment l’albumine et apolipoprotéines, étaient épuisés.

Introduction

Exosomes sont nanovesicles (allant de 30 nm à 150 nm) publié par presque toutes les cellules dans le corps humain pour faciliter la communication de cellule-cellule traite1,2. Fait intéressant, la composition des exosomes change suivant les cellules d’origine ainsi que l’état de santé de l’individuel3,4,5. En outre, les exosomes peuvent être extraites de plusieurs fluides biologiques tels que : salive, l’urine et de sang2. Grâce à ces caractéristiques, exosomes sont considérés comme une bonne source de biomarqueurs de la maladie. Malheureusement, il n’y a aucune méthode standard pour l’isolement des exosomes. Certains laboratoires considèrent centrifugation plusieurs étapes, avec une dernière étape à grande vitesse à 100 000 x g utilisant des gradients de densité comme la méthode de l’étalon-or pour l’isolement de l’exosome. Toutefois, des études récentes ont montré qu’ultracentrifugation induit agrégation des exosomes avec protéines solubles et autres exosomes, en plus d’affecter l’intégrité de l’exosome, qui risquent d’entraver les applications en aval6,7 . Autres méthodes courantes d’isolement de l’exosome comprennent, mais ne se limitent pas à : précipitation par commercial polyéthylène glycol (PEG) base réactifs, ultrafiltration centrifuge et chromatographie d’exclusion stérique (SEC). Les réactifs commerciaux utilisant des polymères de polyéthylène glycol (PEG) enrichissent les exosomes en obligeant à précipiter et former une boulette. Limites à l’aide de ce polymère sont contamination résiduelle PEG polymère et une abondance de protéines solubles non-exosomal dans le produit final. Ultrafiltration utilise centrifugation pour purifier et concentrer les vésicules à l’aide d’une membrane de cellulose ; exosomes sont conservés au-dessus du filtre, tandis que les plus petites impuretés et autres protéines traversent la membrane7,8. Tout comme les autres méthodes, ultrafiltration centrifuge a une capacité limitée pour purifier les exosomes en raison du maintien de niveaux élevés de protéines non-exosomal, y compris les agrégats et les complexes protéiques. Enfin, purification SEC utilise une résine poreuse pour séparer les molécules selon la taille. SEC a montré des résultats prometteurs, surmontant la plupart des problèmes expérimentés avec d’autres méthodes en capturant la majorité des protéines contaminant et en préservant l’intégrité exosomal, étant donné que l’isolement est fondé sur la gravité ou de systèmes dépressionnaires7, 9. Toutefois, l’isolement Co de protéines plus gros agrégats et les lipoprotéines10 pendant SEC affecte la pureté de la préparation de l’exosome final. Alors que certaines méthodes ont été testées pour la purification de l’exosome de surnageants de culture de cellules et plasma7ou seulement plasma9,11, il n’y a aucune information sur la performance des méthodes comparant directement le sang plasma et sérum de la même personne.

Ici, nous nous concentrons sur la purification du sang exosomes en comparant une variété de flux de travail pour déterminer si les techniques d’enrichissement de vésicules sont traduisibles entre le sérum et le plasma. Nanoparticules, suivi, analyse et tache occidentale ont été utilisées pour quantifier les différences dans la composition de concentration, la pureté et protéine exosome dans les produits finaux. La dernière méthode, détaillée dans le présent protocole, augmente le nombre de vésicules et réduit les niveaux de protéines non-exosomal. Ce qui est important, une réduction drastique des protéines co précipitants communes dont l’albumine et apolipoprotéines est démontrée. La grande abondance de ces deux protéines dans le sang et la fréquence à laquelle ils purifient conjointement avec exosomes causes des incohérences entre les échantillons « purifiés », les analyses en aval de l’inclinaison. Ce protocole comprend l’utilisation d’une résine SEC disponible dans le commerce ; la résine est composée de perles poreux dans lequel protéines inférieures à 700 kDa peuvent entrer dans les perles. Une fois à l’intérieur, les protéines sont retenus par un ligand octylamine. L’éluat est composé de molécules supérieure à 700 kDa12et les exosomes. En outre, afin de réduire les agrégats de protéines et apolipoprotéines qui se soustraire de piégeage de la perle, nous incluons une étape de digestion de protéase dans le workflow. Actuellement, il n’y a aucune technique unique capable de maximiser l’exosome rendement tout en réduisant les co purification de protéines non-exosomal. Cette étude montre qu’un protocole de purification qui combine un prétraitement de digestion de protéase avec plusieurs méthodes de récupération et la purification peut être utilisé pour augmenter le rendement exosome et la pureté du sérum de sang et de plasma.

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Protocol

Ce travail a été déterminé à ne pas être recherche sujet humain lors de l’examen initial de Colorado State University Institutional Review Board (IRB), comme tous les échantillons humains ont été obtenus sous forme d’échantillons anonymes de la Banque de tissus biologiques Bioreclamation IVT et ont été recueillis en vertu de protocoles approuvée de la CISR.

1. préparation de l’échantillon brut (Plasma ou sérum) par granulation plus grandes vésicules et débris cellulaires

Remarque : Mesures de sécurité : plasma, le sérum et autres liquides biologiques sont des matières biologiques dangereuses et doivent être manipulés avec soin, tout en portant la base équipement de protection individuelle, y compris les gants et blouse de laboratoire. Il est fortement recommandé que les échantillons biologiques sont traités dans une biosécurité armoire ; Si ce n’est pas disponible, l’utilisation de lunettes de protection est recommandée.

  1. Equilibrer un sérum ou un échantillon de plasma en plaçant le tube dans des conditions non-secouant dans un réfrigérateur à 4 ° C durant la nuit (de soit -20 ou l’entreposage de-80 ° C).
  2. Aliquote 250 µL de l’échantillon dans un tube à microcentrifugation à l’aide d’une pipette 1 000 µL.
  3. Centrifuger l’échantillon à 18 000 x g pendant 30 min à 4 ° C.
  4. À l’aide d’une pipette de 200 µL, retirer 200 µL du liquide surnageant défriché et ajoutez-le à un nouveau tube de microcentrifuge. Évitez toute matière granulé tout en transférant le liquide surnageant. Jeter les matériaux granulé.
  5. Quantifier la teneur en protéines de l’échantillon par dosage de l’acide (BCA) bicinchoninic, à l’aide du protocole par le fabricant. Pour effectuer le test, diluer l’échantillon 01:50 dans 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Analyser chaque échantillon en double exemplaire.
    Remarque : Utiliser 1 x PBS dans tout le protocole, sauf indication contraire. En moyenne, 200 µL de sérum clarifié ou plasma (après 18 000 x g) rapportera 15 mg de protéines totales. Autres types d’échantillons, avec une teneur en protéines inférieure ou supérieure, peuvent exiger des dilutions de BCA supplémentaires.
  6. Aliquote 10 mg de l’échantillon dans un nouveau tube de microcentrifuge. La concentration obtenue à l’étape 1.5 permet de calculer le volume correspondant d’échantillon. Portion de l’échantillon à l’aide d’une pipette de 200 µL.
    Remarque : Il est recommandé de stocker l’échantillon restant à-80 ° C. Utilisation de l’échantillon dans différents tubes à 10 mg par tube d’éviter les gel-dégel plusieurs cycles à l’avenir aliquote.

2. la digestion des protéines sanguines Non-exosomal

Remarque : L’étape de digestion est conçue pour réduire les protéines non-exosomal qui peuvent purifier conjointement avec les exosomes. Si conservation des protéines de surface exosome est requise pour les analyses en aval, il devrait être tenu compte du fait que cette étape est susceptible d’interférer avec cette analyse. La détection de l’exosomal CD63, une protéine de surface-exposé tétraspanines, n’était pas significativement négativement touchée par ce processus.

  1. Préparer la solution de protéinase K à une concentration de 500 µg/mL dans du PBS. Ajouter la quantité correspondante de protéinase K dans un tube à fond conique. Puis ajouter de la mémoire tampon et vortexer pendant 30 s, 3 fois à température ambiante.
  2. Ajouter 50 µL de solution de protéinase K à l’aliquote d’échantillon de 10 mg et mélanger doucement en pipettant également, et descendre à l’aide d’une pipette µL 200.
  3. Incuber les échantillons à 37 ° C au bain-marie pendant 30 min. Place le tube dans un portoir de flotteur et éviter une immersion complète du tube dans le bain d’eau pour éviter les éventuelles "fuites".
  4. Transférer l’échantillon et portoir flottant à un bain-marie à 60 ° C pendant 10 min, pour inactiver la protéinase K.

3. retrait de petites protéines et des Peptides par Ultrafiltration centrifugeuse

  1. Rincer un dispositif d’ultrafiltration contenant 100 kDa poids moléculaire limite (MWCO) filtre avec préalable de PBS à utiliser. Ce faire ajouter 500 µL de PBS au filtre, à l’aide d’une pipette 1 000 µL. Faites tourner l’appareil à 3 700 x g pendant 5 min. Jetez toute rétentat restant ainsi que l’éluat.
    Remarque : La capacité du volume de l’appareil d’ultrafiltration échantillon doit être de 0,5 et 4 mL pour s’assurer que le volume de l’échantillon réduit final de 50 µL est réalisable.
  2. Prenez l’exemple de l’étape 2.4 et augmenter le volume de 500 µL en ajoutant des PBS. Déposer l’échantillon dans le dispositif d’ultrafiltration rincés au préalable.
    Remarque : En moyenne, le volume de l’échantillon de l’étape 2.4 est 185 µL (120 à 150 µL de l’échantillon et 50 µL de solution de protéinase K).
  3. Placer le dispositif d’ultrafiltration dans une centrifugeuse de paillasse angle fixe à 3 700 x g à 4 ° C jusqu'à ce que l’échantillon a réduire à un volume de 50 µL.
    Mise en garde : Lors de l’utilisation de dispositifs d’ultrafiltration avec l’arrêt de mort volume, il faut pour éviter la dessiccation complète, de la membrane filtrante durant les étapes de centrifugation.
  4. Ajouter 500 µL de PBS directement dans la membrane filtrante et la pipette de monter et descendre 5 fois. Centrifuger comme à l’étape 3.3. Effectuez cette étape de lavage 3 fois au total.
  5. Transférer le rétentat final 50 µL dans un nouveau tube de microcentrifuge.
  6. Rincer le filtre membrane avec 200 µL PBS, pipetage de haut en bas 10 fois et transférer le lavage dans le tube de l’étape 3.5.
  7. Placez le porte-filtre dans la position inverse dans un nouveau tube. Exécuter une rotation inverse la récupération pendant 5 min à 2 000 x g pour récupérer l’échantillon restant de la membrane. Piscine l’échantillon avec l’exemple de l’étape 3.5.

4. la purification des vésicules par chromatographie d’Exclusion (s)

  1. Ajouter 850 µL de solution aqueuse de SEC, avec des perles ayant un MWCO de 700 kDa, dans une colonne de flux de gravité vide, plafonnés à l’aide d’une pipette 1 000 µL. Placer les colonnes dans un format rack approprié muni d’un plateau d’égouttement.
  2. Déboucher le bas de la colonne et laisser le drain liquide pendant 5 min. Une fois égouttées, ajouter 10 mL de PBS pour laver la résine. Laisser 20 min pour le lavage s’écouler de la colonne.
  3. Placer le concentré, protéinase K traitées échantillon de l’étape 3.5 dans un tube conique de 15 mL et augmenter le volume de l’échantillon de 5 mL ajouter PBS avec une pipette sérologique. Mélanger le tube doucement en balançant pendant 1 min et ensuite appliquer lentement l’échantillon à la colonne préparée à l’étape 4.2 avec une pipette sérologique.
    Remarque : Une fois le cap de la colonne est supprimée, l’échantillon va s’écouler par le biais de la résine par gravité ; l’échantillon de 5 mL transitera complètement la colonne en 10 min.
  4. Recueillir le débit à travers dans un nouveau tube conique de 15 mL.
  5. À l’aide d’une pipette sérologique, appliquer le matériel collecté à la résine de nouveau pour enlever tout matériel restant inférieure à 700 kDa.
  6. Recueillir le débit à travers dans un nouveau tube conique de 15 mL. Laver la résine deux fois ajoutant 1 mL de PBS. Recueillir le débit à travers dans le tube de l’étape 4.5 ; le volume final total sera d’environ 7 mL.
    Remarque : Après l’étape 4.6, l’échantillon sera dilué environ 35 fois depuis le volume de l’échantillon original ; les étapes suivantes vont réduire le volume et concentrer l’échantillon de l’exosome purifiée.

5. la concentration des Exosomes purifiée et Quantification des protéines totales

  1. Rincer un dispositif d’ultrafiltration avec un filtre MWCO 3 kDa avant de PBS d’utiliser, comme indiqué au point 3.1.
  2. Ajouter l’exemple de l’étape 4.6 dans le dispositif d’ultrafiltration et centrifuger dans un rotor oscillant-seau à 3 700 x g à 4 ° C. Mémoire tampon va passer à travers le filtre et peut être mis au rebut. Conservera les exosomes concentré au-dessus du filtre. Centrifuger l’échantillon jusqu'à ce que le volume au-dessus du filtre (rétentat) est réduit à 200 µL.
  3. Transférer le rétentat dans un nouveau tube de microcentrifuge.
  4. Rincer le filtre membrane avec 200 µL PBS en pipettant également sur la membrane de 10 fois et transférer le lavage dans le tube de l’étape 5.3. Ceci permettra la collecte d’un échantillon de l’exosome résiduelle.
  5. Apportez volume jusqu'à 500 µL de l’échantillon en ajoutant des PBS. La composition de pipetage lentement monter et descendre de 10 fois.
    Remarque : Le protocole peut être suspendu ici. Échantillons doivent être conservés à 4 ° C durant la nuit ou à-20 /-80 ° C pour l’entreposage à long terme.
  6. Quantifier la teneur en protéines de l’échantillon par dosage de la BCA, en utilisant le protocole par le fabricant. Diluer l’échantillon 01:10 et 01:50 dans du PBS. Exécuter chaque échantillon en double exemplaire.
    Remarque : À partir de 10 mg de protéines de sérum ou de plasma, le rendement de protéine totale dans les exosomes purifiées de point 5.6 est, en moyenne, 150 µg. dilutions supplémentaires peuvent être nécessaires si les échantillons autres que le sérum ou le plasma sont utilisés ; rendement peut varier avec le type d’échantillon.

6. quantification et dimensionnement des Exosomes de nanoparticules suivi d’analyse (NTA)

  1. Ajouter 5 µg d’exosomes purifiée (tel que quantifié dans 5.6) à 1 mL de PBS et vortexer pendant 15 s sur vitesse moyenne-basse.
    1. Placer l’échantillon dans une seringue de 1 mL. Le cas échéant, définir la seringue dans une pompe à seringue automatique définie à injecter l’échantillon de l’exosome dilué à raison de 30 µL/min.
    2. Effectuer des mesures de NTA en utilisant les paramètres de capture vidéo : écran gain de niveau 3-4 et appareil photo de 12-13.
    3. Définir le script d’analyse à exécuter trois répétitions techniques pendant au moins 30 s en utilisant un débit constant pour chaque répétition. Pour l’analyse, définissez le seuil de capture à 5.
      Remarque : Informations sur l’utilisation de la seringue automatique et paramètres de capture vidéo sont disponibles dans la référence13. Paramètres de capture et d’analyse pour le NTA doivent être respectées dans les trois différents échantillons pour assurer la comparabilité.

7. détermination de la réduction de la protéine Soluble

  1. Ajouter 1 à 10 µg d’exosomes purifiée au tampon échantillon SDS et effectuer sur gel de polyacrylamide (PAGE) en utilisant un Gel de Bis-Tris de 4 à 12 % dans 1 SDD x MES tampon pendant 35 min à 200 V. transfert résolu des protéines à une membrane de nitrocellulose 0,2 µm en appliquant une tension o f 50 V pour 1 à 1,5 h. analyse par western blot Perform pour évaluer la présence d’albumine, apolipoprotéines A et B et le marqueur de l’exosome CD 63 suivant des méthodologies standard.
    Remarque : Protocoles complets pour les méthodes 7.1 se trouvent dans la référence14; plus précisément, SP007 : exécutant des gels de polyacrylamide et SP011 : Protocole de transfert de Western.
  2. Séparer les 10 µg d’exosomes purifiée à l’aide de PAGE comme au point 7.1 et tacher les bandes de protéines à l’aide de colorant bleu de coomassie, suivant les recommandations standards, pour visualiser les variations protéiques et réduction entre les échantillons.
    Remarque : Plus de détails concernant le protocole de transfert western spécifiques aux CD63 sont décrits par Diaz et al. 15

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Representative Results

Les données présentées ci-dessous ont été obtenues en utilisant des échantillons de sérum et le plasma de cinq donneurs de sang en bonne santé. Pour déterminer les effets de chaque étape du traitement, cinq variantes du protocole présenté ont été réalisés, et suppression de protéine récupération et non-exosome exosome ont été comparés. Les méthodes d’essai inclus : 1) SEC 700 kDa + Ultrafiltration 3 kDa ; 2) ultrafiltration 100 kDa ; 3) protéinase K + Ultrafiltration 100 kDa ; 4) SEC 700 kDa + Ultrafiltration 100 kDa et 5) protéinase K + Ultrafiltration 100 kDa + SEC 700 kDa, Ultrafiltration 3 kDa.

Collectivement, toutes les méthodes impliquant SEC 700 kDa (1, 4 et 5) produisent un nombre significativement plus élevé de vésicules par microgramme de protéine dans les deux types d’échantillon, le sérum et plasma (Figure 1 a-B). Cependant, la méthode 5 généré un nombre significativement plus élevé de vésicules par microgramme de plasma par rapport au sérum (Figure 1). À l’inverse, la concentration de protéines dans des échantillons de l’exosome purifiée était significativement plus faible tout en utilisant les méthodes de base kDa SEC 700 (1, 4 et 5). Aller simple ANOVA et de Tukey tests de comparaisons multiples ont montré que la concentration de la protéine finale après méthodes 2 et 3 ont été significativement plus élevées que la concentration de la protéine finale après les méthodes 1, 4 et 5 (p < 0,001). Les différences étaient conformes à l’aide de sérum ou plasma, cependant, avec la méthode 1, la concentration de la protéine finale des exosomes purifiée était significativement plus élevée (test t, p < 0,05) lors de l’utilisation de sérum (Figure 2 a). Pour évaluer la distribution des protéines des exosomes purifiée par les cinq méthodes différentes, 10 µg d’échantillon de chaque méthode ont été incorporées dans une PAGE et teinté avec un colorant bleu de coomassie. Les résultats suggèrent que la majorité de la protéine présente dans les exosomes « purifié » de méthodes 2 et 3 était albumine signifié par la bande forte ~ 65 kDa (Figure 2 b).

L’étape suivante était de confirmer l’augmentation dans la pureté des exosomes isolé basé sur la présence de l’albumine, la protéine la plus abondante dans le sang. Le processus d’ultrafiltration a montré une forte concentration d’albumine dans la fraction d’exosomal qui a été partiellement compensée par le prétraitement de l’échantillon avec la protéinase K (Figure 3 a, voies S et P). L’inclusion de SEC 700 kDa dans le processus de diminution de la quantité d’albumine (Figure 3 a, voies P1/S1 et P4/S4) mais la combinaison SEC 700 kDa, protéinase K, et ultrafiltration a montré la suppression plus efficace de l’albumine d’exosomes purifiée ( Figure 3 a, lane P5/S5). Des études récentes ont montré que les apolipoprotéines sont également souvent co isolés au cours de l’exosome purification10,16. Plus précisément, ApoB, qui est présent dans les lipoprotéines de faible densité, s’est avéré être très concentrées dans les exosomes purifiés du sang humain10. Par conséquent, nous avons évalué l’isolement co des lipoprotéines ApoB et ApoA-1. Méthodes de l’ultracentrifugation et la combinaison de l’Ultracentrifugation et SEC 700 kDa a montré une quantité semblable de l’ApoB par rapport à la quantité détectée dans le sérum et le plasma par western blot (Figure 3 b, voies S1/P1, P2/S2 et P4/S4 ; Figures complémentaires 1/2). Fait intéressant, l’ajout de protéinase K a entraîné la dégradation complète de l’ApoB de la purifié de l’échantillon (Figure 3 b, voies P3/S3 et P5/S5). De même, ApoA-1, la composante protéique majeur de lipoprotéines de haute densité dans le plasma humain, a été réduite de toutes les méthodes impliquant SEC 700 kDa ou protéinase K (Figure 3). Bien que, un peu comme l’albumine, l’ultrafiltration MWCO 100 à elle seule n’a pas pu réduire considérablement la quantité de co purification d’ApoA-1.

Enfin, pour déterminer l’effet de la protéinase K exposés à la membrane externe des exosomes des protéines, nous avons évalué la présence de le tétraspanines de CD63, une protéine caractéristique des exosomes. Une analyse des transferts Western a montré que la protéine n’est pas seulement décelable dans les méthodes utilisant la protéinase K (Figure 3D, voies P3/S3 et P5/S5), mais les bandes de CD63 par la méthode 5 avaient un signal plus intense (Figure 3D, voies P5/S5). Cette constatation suggère méthode 5 donne une concentration plus élevée des exosomes ou l’augmentation de la liaison anticorps CD63 due à la diminution des agrégats de protéines associées à la surface de l’exosome.

Figure 1
Figure 1 : Rendement Exosome de plasma et le sérum après cinq méthodes de purification différent. (A) Concentration des exosomes obtenue du plasma (n = 5). (B) Concentration des exosomes obtenue du sérum (n = 5). ()C) Comparaison entre les chiffres des exosomes par microgramme de protéines provenant de 5 ensembles appariés de plasma et le sérum. Numéros sur la représentent de l’axe des abscisses chaque méthode utilisée, 1 = SEC 700 kDa + Ultrafiltration 3 kDa ; 2 = ultrafiltration 100 kDa ; 3 = protéinase K + Ultrafiltration 100 kDa ; 4 = SEC 700 kDa + Ultrafiltration 100 kDa et 5 = protéinase K + Ultrafiltration 100 kDa + SEC 700 kDa, Ultrafiltration 3 kDa. En A et B, les différences ont été calculés par ANOVA à et Tukey de tests de comparaisons multiples. En C, différence entre sérum et plasma par méthode ont été calculées en test t. p < 0,05 ; Barres d’erreur : 95 % intervalle de confiance. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Rendement de protéine dans les exosomes purifiées de plasma et le sérum à l’aide de cinq méthodes différentes. (A) Comparaison du rendement protéines totales dans les exosomes purifiées provenant de sérum et le plasma (n = 5). (B) l’image représentative d’une coloration de coomassie de 10 µg de purifiée exosomes résolus par SDS-PAGE ; n = 1, jumelé le sérum et le plasma. Chiffres sur la figure représentent chaque méthode, 1 = SEC 700 kDa + Ultrafiltration 3 kDa ; 2 = ultrafiltration 100 kDa ; 3 = protéinase K + Ultrafiltration 100 kDa ; 4 = SEC 700 kDa + Ultrafiltration 100 kDa et 5 = protéinase K + Ultrafiltration 100 kDa + SEC 700 kDa, Ultrafiltration 3 kDa. A, les différences entre le plasma et les échantillons de sérum provenant ont été calculées en t-test. p < 0,05. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Réduction des contaminants normales des exosomes isolées du sang humain et de la stabilité de la protéine de hallmark CD63. Evaluation de la tache occidentale de : (A) albumine, 1 µg par voie de circulation ; (B) l’apolipoprotéine B, 1 µg par voie de circulation ; et (C) l’apolipoprotéine A1, 10 µg par voie de circulation ; (D) CD63, 1 µg par voie de circulation. L = échelle ; S = sérum brut ; P = plasma brut. Exosome purifiée : purification en utilisant 5 méthodes différentes. Chiffres sur la figure représentent chaque méthode, 1 = SEC 700 kDa + Ultrafiltration 3 kDa ; 2 = ultrafiltration 100 kDa ; 3 = protéinase K + Ultrafiltration 100 kDa ; 4 = SEC 700 kDa + Ultrafiltration 100 kDa et 5 = protéinase K + Ultrafiltration 100 kDa + SEC 700 kDa, Ultrafiltration 3 kDa. Résultats représentatifs des paire sérum et plasma d’un patient ; les tendances étaient uniformes entre les échantillons de donneurs. Chargement de la protéine modifiée par tache ; normalisation reposait sur la détermination de la BCA de la concentration de l’échantillon total. Charge des protéines totales par voie de circulation a été spécifié pour chaque tache. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Supplémentaire Figure 1: Original sous couverture végétale western blots de la Figure 3. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Supplémentaires Figure 2: quantification de la densité de l’albumine, ApoB, ApoA-1 et CD63 bandes de Figure 3; ImageJ logiciel a été utilisé. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Une méthode optimisée pour augmenter la pureté et le rendement des exosomes de sang augmentera la capacité à la mienne avec précision les vésicules extracellulaires comme source de biomarqueurs pour plusieurs maladies. Les méthodes standard actuellement utilisés pour isoler les exosomes, plus précisément, ultracentrifugation et les méthodes de précipitation, ont plusieurs inconvénients dont exosome agrégation et enrobage de protéines solubles7,17, 18. Sinon, l’utilisation de s a montré une amélioration significative dans l’isolement de l’exosome, protégeant les exosomes d’une agrégation et l’amélioration de l’élimination des contaminants communs non-exosomal protéines9,11,18 , 19. Toutefois, apolipoprotéines10grandes vésicules et agrégats de protéines, notamment l’albumine, sont souvent isolés conjointement avec les exosomes, si SEC seul est utilisé. Deux critiques les étapes à l’aide du protocole présenté à surmonter les deux dernières limitations mentionnées. Tout d’abord, la centrifugation de l’échantillon de sérum ou de plasma à 18 000 x précipités g la plupart des plus grandes vésicules présentes dans l’échantillon. Deuxièmement, le traitement préalable des échantillons de sérum ou de plasma avec la protéinase K, une sérine protéase avec spécificité large20, est essentiels pour réduire la quantité de l’albumine et les apolipoprotéines a-1 et B associé les exosomes durant la purification. Nous avons combiné l’utilisation de la protéinase K avec une étape d’ultrafiltration à l’aide d’une membrane avec un MWCO de 100 kDa pour éluer partiellement les petites protéines et des peptides, et puis nous avons adapté à l’utilisation d’une résine SEC avec un MWCO de 700 kDa pour effacer plus petits peptides/protéines de la exosomes. Cette résine, initialement optimisée pour isoler le virus, capture les grosses protéines et/ou complexes sous 700 kDa. Le principe de l’isolement de cette résine SEC permet une récupération douce de l’exosomes, étant donné que le débit de l’échantillon par le biais de la résine est entraîné par gravité. Cela permet de moins l’agrégation et l’intégrité conservée des exosomes, surmonter deux des principales limites des méthodes axées sur l’ultracentrifugation. Enfin, il a été démontré par Beauvais et al. que la dilution du plasma avant traitement SEC améliore l’exosome récupération21. Dans ce protocole, nous avons inclus une étape de dilution avant SEC pour augmenter le temps de contact de l’échantillon avec de la résine.

Une limitation importante du protocole présenté est la potentielle digestion des protéines dans la membrane d’exosomal par le traitement de protéinase K. Cela peut nuire à des expériences en aval si les protéines de la membrane de surface exposée sont requis pour les analyses en aval, y compris la tache occidentale, ELISA, ou cytométrie en flux. Vérifier partiellement l’effet de la protéinase K sur les protéines de la membrane associée, nous avons analysé les échantillons traités protéase pour la présence de CD63, une protéine tétraspanines, qui est normalement présente dans les exosomes. Ces résultats ont montré que l’utilisation de protéinase K avec les conditions décrites de temps de digestion et de la concentration n’entraînait pas de dégradation significative de CD63. Toutefois, une évaluation plus poussée de la stabilité des protéines associées aux membranes fondée sur des intérêts spécifiques de recherche sera nécessaire.

En conclusion, le protocole présenté offre plusieurs avantages par rapport aux méthodes existantes actuelles. Chaque étape incluse dans le protocole a montré dans des études indépendantes pour être bénéfique pour la pureté de l’exosomes : enrobage de grandes vésicules, sérum ou dilution du plasma et s Additionally, comme mentionné ci-dessus, une étape de digestion de protéinase a été ajoutée pour supprimer apolipoprotéines et agrégats de protéines, mais aussi une concentration étape à la fin du processus de purification qui profite au rendement et stabilité de l’exosome. Enfin, le présent protocole peut être facilement adapté pour isoler les exosomes de plus grands échantillons de volume comme l’urine ou les surnageants de culture de cellules.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Cette recherche a été financée par des fonds internes de la CSU (à KMD), ATCC contrat #2016-0550-0002 (un contrat de sous-traitance de NIAID HHSN272201600013C) et la Fondation Bill et Melinda Gates (OPP1039688) (à KMD/NKG). Nous remercions l’expérience de recherche NSF pour les étudiants de premier cycle (REU) summer program à la Colorado State University pour un soutien supplémentaire.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nanosight Malvern NS300
Benchtop microcentrifuge  Thermo Legend Mico21
Benchtop centrifuge  Beckman Coulter Allegra 6R
Waterbath  Benchmark B2000-4
Microplate reader BIOTEK Epoch
Pierce BCA Protein Assay Kit THERMO 23227
Micro BCA Protein Assay Kit THERMO 23235
Phosphate buffered saline Corning 21-040-CV
96 well plate Corning 15705-066
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane EMD-Millipore UFC510096
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units EMD-Millipore UFC800324
Capto Core 700 GE Healthcare 17548103
Poly-Prep Chromatography Columns BIORAD 7311550
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels THERMO NP0323BOX
Nitrocellulose Membrane, Roll, 0.2 µm BIORAD 1620112
Proteinase K, Tritirachium album EMD-Millipore 539480
SimplyBlue SafeStain THERMO LC6065
SIGMAFAST BCIP/NBT Millipore-SIGMA B5655
4-Chloro-1-naphthol Millipore-SIGMA C6788
Anti-CD63 Antibody (rabbit anti-human) with goat anti-rabbit HRP secondary antibody SYSTEM BIOSCIENCES EXOAB-CD63A-1 Primary and secondary antibodies
ALB Antibody (F-10) SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. sc-271605 Primary antibody
apoB Antibody (C1.4) SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. sc-13538 Primary antibody
apoA-I Antibody (B-10) SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. sc-376818 Primary antibody

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References

  1. Stoorvogel, W., Kleijmeer, M. J., Geuze, H. J., Raposo, G. The biogenesis and functions of exosomes. Traffic. 3 (5), 321-330 (2002).
  2. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).
  3. Schorey, J. S., Harding, C. V. Extracellular vesicles and infectious diseases: new complexity to an old story. J Clin Invest. 126 (4), 1181-1189 (2016).
  4. Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. Exosome platform for diagnosis and monitoring of traumatic brain injury. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 369 (1652), (2014).
  5. Nilsson, J., et al. Prostate cancer-derived urine exosomes: a novel approach to biomarkers for prostate cancer. Br J Cancer. 100 (10), 1603-1607 (2009).
  6. Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 4, 29509 (2015).
  7. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031 (2015).
  8. Vergauwen, G., et al. Confounding factors of ultrafiltration and protein analysis in extracellular vesicle research. Scientific Reports. 7 (1), 2704 (2017).
  9. Welton, J. L., Webber, J. P., Botos, L. A., Jones, M., Clayton, A. Ready-made chromatography columns for extracellular vesicle isolation from plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27269 (2015).
  10. Sódar, B. W., et al. Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection. Sci Rep. 6, 24316 (2016).
  11. de Menezes-Neto, A., et al. Size-exclusion chromatography as a stand-alone methodology identifies novel markers in mass spectrometry analyses of plasma-derived vesicles from healthy individuals. J Extracell Vesicles. 4, 27378 (2015).
  12. Corso, G., et al. Reproducible and scalable purification of extracellular vesicles using combined bind-elute and size exclusion chromatography. Scientific Reports. 7 (1), 11561 (2017).
  13. Nanosight Ltd. NanoSight NTA 2.1 Analytical Software, Operating Manual. , Available from: http://nanobio.physics.ucsb.edu/pdfs/equipment/Nanosight%20NTA2.1%20software%20manual.pdf (2010).
  14. Dobos, K. Production Manuals & SOPs. , Available from: http://csu-cvmbs.colostate.edu/academics/mip/research/Pages/dobos-lab-production-manuals-sops.aspx (2017).
  15. Diaz, G., Wolfe, L. M., Kruh-Garcia, N. A., Dobos, K. M. Changes in the Membrane-Associated Proteins of Exosomes Released from Human Macrophages after Mycobacterium tuberculosis Infection. Sci Rep. 6, 37975 (2016).
  16. Yuana, Y., Levels, J., Grootemaat, A., Sturk, A., Nieuwland, R. Co-isolation of extracellular vesicles and high-density lipoproteins using density gradient ultracentrifugation. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
  17. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3 Unit 3.22 (2006).
  18. Muller, L., Hong, C. S., Stolz, D. B., Watkins, S. C., Whiteside, T. L. Isolation of biologically-active exosomes from human plasma. J Immunol Methods. 411, 55-65 (2014).
  19. Böing, A. N., et al. Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
  20. Sweeney, P. J., Walker, J. M. Proteinase K (EC 3.4.21.14). Methods Mol Biol. 16, 305-311 (1993).
  21. Baranyai, T., et al. Isolation of Exosomes from Blood Plasma: Qualitative and Quantitative Comparison of Ultracentrifugation and Size Exclusion Chromatography Methods. PLoS One. 10 (12), e0145686 (2015).

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Biochimie numéro 134 Exosomes taille des nanoparticules de chromatographie Ultrafiltration Exclusion suivi analyse biomarqueur protéomique
Digestion des protéines, Ultrafiltration et chromatographie d’Exclusion afin d’optimiser l’isolement des Exosomes de sérum et de Plasma sanguin humain
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