Summary
Qui, presentiamo un protocollo per purificare gli esosomi da siero con ridotta co-purificazione non-exosomal di proteine del sangue e del plasma. Il protocollo ottimizzato include ultrafiltrazione, trattamento con proteasi e cromatografia di esclusione di formato. Una maggiore purificazione di esosomi analisi a valle di vantaggi, tra cui più accurata quantificazione delle vescicole e caratterizzazione proteomica.
Abstract
Esosomi, un tipo di nanovesicle rilasciato da tutti i tipi di cellule, possono essere isolati da qualsiasi fluido corporeo. Il contenuto di esosomi, tra cui proteine ed RNA, è univoco per le cellule da cui essi sono derivati e può essere utilizzati come indicatori della malattia. Diversi protocolli comuni di arricchimento, tra cui ultracentrifugazione, resa di esosomi caricati di contaminanti di proteina solubile. In particolare, abbiamo trovato che le proteine più abbondanti all'interno del sangue spesso co-purificano con esosomi e possono confondere studi di proteomica a valle, vanificando l'identificazione dei candidati biomarcatore abbondanza bassa. Di ulteriore preoccupazione è irriproducibilità di quantificazione della proteina esosomi grazie alla rappresentazione incoerente dei livelli della proteina non-exosomal. Il protocollo dettagliato qui è stato sviluppato per rimuovere le proteine non-exosomal che co-purificano con esosomi, aggiunta di rigore per il processo di purificazione di esosomi. Cinque metodi sono stati confrontati usando accoppiato al plasma di sangue e siero da cinque donatori. Analisi usando nanoparticle tracking analysis e analisi della proteina acido bicinconinico micro ha rivelato che un protocollo combinato che utilizza cromatografia di esclusione di ultrafiltrazione e dimensione ha prodotto l'arricchimento della vescicola ottimale e la rimozione di proteina solubile. Macchiarsi occidentale è stato utilizzato per verificare che le proteine del sangue abbondanti attesi, tra cui l'albumina e apolipoproteine, sono state vuotate.
Introduction
Gli esosomi sono nanovesicles (che variano nel formato da 30 nm a 150 nm) rilasciato da quasi tutte le cellule nel corpo umano per facilitare la comunicazione cellula--cellula elabora1,2. È interessante notare che, la composizione degli esosomi cambia a seconda le celle di origine, nonché lo stato di salute dei singoli3,4,5. Inoltre, esosomi possono essere Estratto da diversi fluidi biologici come: saliva, urina e sangue2. A causa di queste caratteristiche, gli esosomi sono considerati una buona fonte di biomarker di malattia. Purtroppo, non esiste alcun metodo standard per l'isolamento di esosomi. Alcuni laboratori considerano centrifugazione multifasico, con un passaggio ad alta velocità finale a 100.000 x g usando le pendenze di densità come il metodo gold standard per l'isolamento di esosomi. Tuttavia, recenti studi hanno dimostrato che ultracentrifugazione induce l'aggregazione di esosomi con proteine solubili e altri esosomi, oltre ad interessare l'integrità di esosomi, entrambi i quali possono ostacolare applicazioni a valle6,7 . Altri metodi comuni di esosomi isolamento includono, ma non sono limitati a: precipitazione da commerciale polietilenglicole (PEG) base di reagenti, ultrafiltrazione centrifuga e cromatografia di esclusione dimensionale (SEC). I reagenti commerciali utilizzando polimeri di polietilene glicole (spina) arricchiscono esosomi causando loro di precipitare e formare una pallina. Limitazioni di utilizzo di questo polimero sono contaminazione con residui PEG polimero e un'abbondanza di proteine solubili non-exosomal nel prodotto finale. Ultrafiltrazione utilizza centrifugazione per purificare e concentrare le vescicole utilizzando una membrana di cellulosa; esosomi vengono mantenuti sopra il filtro, mentre le più piccole impurità e altre proteine passano attraverso la membrana7,8. Proprio come altri metodi, ultrafiltrazione centrifuga ha una capacità limitata per purificare gli esosomi a causa della ritenzione di alti livelli di proteine non-exosomal, tra cui aggregati e complessi proteici. Infine, purificazione SEC utilizza resina porosa per separare le molecole di dimensioni. SEC ha mostrato risultati promettenti, superando la maggior parte dei problemi con esperienza con altri metodi catturando la maggior parte delle proteine contaminanti e preservando l'integrità del exosomal, poiché l'isolamento è basato sulla gravità o sistemi a bassa pressione7, 9. Tuttavia, la co-isolamento di proteine più grandi aggregati e lipoproteine10 durante il SEC colpisce la purezza della preparazione finale esosomi. Mentre alcuni metodi sono stati testati per la purificazione di esosomi da surnatanti della cultura delle cellule e del plasma7o solo al plasma9,11, non c'è alcuna informazione circa le prestazioni dei metodi direttamente a confronto sangue plasma e siero dallo stesso individuo.
Qui, ci concentriamo sulla purificazione del sangue esosomi confrontando una serie di flussi di lavoro per determinare se tecniche di arricchimento della vescicola sono traducibili tra plasma e siero. Nanoparticle tracking analysis e western blot sono stati usati per quantificare le differenze nella composizione di concentrazione, purezza e proteina di esosomi nei prodotti finali. Il metodo finale, dettagliato nel presente protocollo, aumenta i numeri della vescicola e riduce i livelli di proteina non-exosomal. D'importanza, è dimostrata una drastica riduzione delle proteine co-precipitazione comuni tra cui albumina e apolipoproteine. All'abbondanza di queste due proteine nel sangue e la frequenza alla quale essi co-purificare con esosomi cause incoerenze tra i campioni "purificati", inclinare le analisi a valle. Questo protocollo prevede l'utilizzo di una resina SEC disponibile in commercio; la resina è composto dei branelli porosi in cui proteine inferiore a 700 kDa possono inserire le perline. Una volta all'interno, le proteine vengono mantenute da un ligando octylamine. L'eluato è composto di esosomi e molecole più grandi di 700 kDa12. Inoltre, al fine di ridurre gli aggregati proteici e apolipoproteine che eludere intrappolamento della perla, includiamo una fase di digestione della proteasi del flusso di lavoro. Attualmente, non esiste nessuna tecnica da sola in grado di massimizzare la resa di esosomi riducendo proteine non-exosomal co-purificante. Questo studio indica che un protocollo di purificazione che combina un pretrattamento di digestione della proteasi con più metodi di recupero e purificazione può essere utilizzato per aumentare la resa di esosomi e purezza da siero del sangue e del plasma.
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Protocol
Quest'opera è stata determinata non deve essere la ricerca del soggetto umano all'esame iniziale dagli di Colorado State University Institutional Review Board (IRB), come tutti i campioni umani sono stati ottenuti come campioni de-identificati dal biorepository Bioreclamation IVT e sono stati raccolti sotto protocolli IRB approvato.
1. preparazione del campione grezzo (Plasma o siero) di cubettatura più grandi vescicole e detriti cellulari
Nota: Considerazione di sicurezza: plasma, siero e altri fluidi biologici sono materiali a rischio biologico e deve essere maneggiati con cura speciale, mentre indossa base dispositivi di protezione individuale, compresi i guanti e camice da laboratorio. È altamente raccomandato che i campioni biologici sono trattati in una cappa di biosicurezza; Se non disponibile, è consigliato l'uso di protezioni per gli occhi.
- Equilibrare un siero o un campione di plasma inserendo il tubo in condizioni di non-agitazione in un frigorifero a 4 ° C durante la notte (da o -20 o stoccaggio di-80 ° C).
- Aliquotare e 250 µ l del campione in una provetta da microcentrifuga utilizzando una pipetta di 1.000 µ l.
- Centrifugare il campione a 18.000 x g per 30 min a 4 ° C.
- Utilizzando una pipetta 200 µ l, 200 µ l del surnatante eliminato di rimuovere e aggiungerlo ad un nuovo tubo del microcentrifuge. Evitare qualsiasi materiale pellettato durante il trasferimento il supernatante. Scartare il materiale pellettato.
- Quantificare il contenuto proteico del campione dall'analisi di bicinconinico acido (BCA), utilizzando il protocollo del produttore. Per eseguire il test, è necessario diluire il campione 01:50 in 1x tampone fosfato salino (PBS). Test di ciascun campione in duplicato.
Nota: Se non diversamente specificato, utilizzare 1X PBS in tutto il protocollo. In media, 200 µ l di chiarificato siero o plasma (dopo 18.000 x g) resa di 15 mg di proteine totali. Altri tipi di campione, con contenuto proteico inferiore o superiore, possono richiedere ulteriori diluizioni di BCA. - Aliquotare 10 mg di campione in una provetta da microcentrifuga nuovo. Utilizzare la concentrazione ottenuta al passaggio 1.5 per calcolare il corrispondente volume di campione. Aliquota del campione usando una pipetta 200 µ l.
Nota: Si raccomanda di conservare il campione rimanente a-80 ° C. Aliquota del campione in diversi tubi a 10 mg per tubo per evitare il gelo-disgelo più cicli in futuro utilizzare.
2. la digestione delle proteine del sangue Non-exosomal
Nota: La fase di digestione è progettata per ridurre le proteine non-exosomal che possono co-purificare con esosomi. Se la conservazione delle proteine di superficie esosomi è necessaria per le analisi a valle, dovrebbe essere preso in considerazione che questo passaggio ha il potenziale di interferire con questa analisi. La rilevazione di exosomal CD63, una proteina di superficie-esposta studi, non era stata influenzata significativamente negativamente da questo processo.
- Preparare la proteinasi K soluzione ad una concentrazione di 500 µ g/mL in PBS. Aggiungere la quantità corrispondente di proteinasi K in una provetta conica. Aggiungere quindi il buffer e vortexare per 30 s, 3 x a temperatura ambiente.
- Aggiungere 50 µ l di soluzione di proteinasi K nell'esempio 10 mg aliquota e mescolare dolcemente pipettando su e giù usando una pipetta a 200 µ l.
- Incubare il campione a 37 ° C a bagnomaria per 30 min. posto il tubo in una cremagliera del tubo galleggiante ed evitare la completa immersione del tubo nel bagno d'acqua per evitare potenziali perdite.
- Trasferire il campione e la cremagliera del tubo galleggiante a bagnomaria a 60 ° C per 10 min, per inattivare la proteinasi K.
3. rimozione di piccole proteine e peptidi mediante ultrafiltrazione centrifuga
- Sciacquare contenente 100 filtro cut-off (MWCO) di peso molecolare di kDa prima di PBS di utilizzare un dispositivo di ultrafiltrazione. Questo scopo, aggiungere 500 µ l di PBS per il filtro, utilizzando una pipetta di 1.000 µ l. Girare il dispositivo a 3.700 x g per 5 min, scartare qualsiasi retentato rimanente, come pure l'eluato.
Nota: La capacità del volume di campione del dispositivo ultrafiltrazione deve essere 0,5 mL - 4 mL per assicurarsi che il volume del campione ridotto finale di 50 µ l è realizzabile. - Prelevare il campione dal punto 2.4 e aumentare il volume a 500 µ l con l'aggiunta di PBS. Dispensare il campione nel dispositivo pre-risciacquata ultrafiltrazione.
Nota: In media, il volume del campione dal passaggio 2.4 è 185 µ l (120-150 µ l di campione e 50 µ l di soluzione di proteinasi K). - Posizionare il dispositivo di ultrafiltrazione in una centrifuga da banco ad angolo fisso a 3.700 x g a 4 ° C fino a quando il campione è ridurre ad un volume di 50 µ l.
Attenzione: Quando si utilizzano dispositivi di ultrafiltrazione con arresto volume, si deve prestare attenzione per evitare il completo essiccamento della membrana del filtro durante le fasi di centrifugazione. - Aggiungere 500 µ l di PBS direttamente nel filtro a membrana e pipetta su e giù per 5 volte. Centrifugare come descritto al punto 3.3. Eseguire questo passaggio di lavaggio un totale di 3 volte.
- Trasferire il retentato finale 50 µ l in un nuovo tubo del microcentrifuge.
- Sciacquare il filtro a membrana con 200 µ l di PBS, pipettaggio su e giù per 10 volte e trasferire il lavaggio nella provetta da passo 3.5.
- Inserire il portafiltro nella posizione inversa in un nuovo tubo. Eseguire un ripristino di inversione di rotazione per 5 min a 2.000 x g per recuperare il campione rimanente dalla membrana. Piscina il campione con il campione dal punto 3.5.
4. purificazione delle vescicole di cromatografia di esclusione di formato (SEC)
- Aggiungere 850 µ l di liquami SEC, con perline avendo una MWCO di kDa 700, in una colonna di flusso di vuoto, con un massimo di gravità usando una pipetta di 1.000 µ l. Posizionare le colonne in un formato rack appropriato dotato di un gocciolatoio.
- Stappare la parte inferiore della colonna e lasciare che lo scarico liquido per 5 min. Una volta scolati, aggiungere 10 mL di PBS per lavare la resina. Consentire 20 min per il lavaggio drenare dalla colonna.
- Posizionare il concentrato, proteinasi K trattato campione da passo 3.5 in una provetta conica da 15 mL e aumentare il volume del campione a 5 mL di PBS di aggiungere con una pipetta sierologica. Mescolare delicatamente il tubo da dondolo per 1 min e poi lentamente applicare il campione alla colonna preparata al punto 4.2 con una pipetta sierologica.
Nota: Una volta rimosso il tappo della colonna, il campione fluirà attraverso la resina per gravità; L'esempio 5 mL fluirà completamente attraverso la colonna in 10 min. - Raccogliere il flusso attraverso in una nuova provetta conica da 15 mL.
- Utilizzando una pipetta sierologica, applicare il materiale raccolto per la resina nuovamente per rimuovere qualsiasi materiale restante sotto 700 kDa.
- Raccogliere il flusso attraverso in una nuova provetta conica da 15 mL. Lavare la resina due volte aggiungendo 1 mL di PBS. Raccogliere il flusso attraverso il tubo dal punto 4.5; il volume finale totale sarà di circa 7 mL.
Nota: Dopo passo 4.6, il campione sarà diluito circa 35 volte dal volume del campione originale; la seguente procedura verrà ridurre il volume e concentrare il campione di esosomi purificata.
5. concentrazione di esosomi purificati e quantificazione di proteine totali
- Sciacquare un dispositivo di ultrafiltrazione con un filtro MWCO 3 kDa prima di PBS di utilizzare, come descritto al punto 3.1.
- Aggiungere l'esempio dal passaggio 4.6 al dispositivo di ultrafiltrazione e centrifuga in un rotore basculante a 3.700 x g a 4 ° C. Tampone passa attraverso il filtro e possa essere scartate. Concentrato di esosomi verranno mantenuti sopra il filtro. Centrifugare il campione fino a quando il volume sopra il filtro (retentato) è ridotto a 200 µ l.
- Trasferire il retentato ad un nuovo tubo del microcentrifuge.
- Sciacquare il filtro a membrana con 200 µ l PBS pipettando sopra la membrana 10 volte e trasferire il lavaggio del tubo dal punto 5.3. Questo permetterà per la raccolta di un campione di esosomi residua.
- Portare il volume di campione fino a 500 µ l con l'aggiunta di PBS. Mescolare lentamente pipettando su e giù per 10 volte.
Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui. I campioni devono essere conservati a 4 ° C durante la notte o a-20 /-80 ° C per la conservazione a lungo termine. - Quantificare il contenuto proteico del campione dall'analisi di BCA, utilizzando il protocollo del produttore. Diluire il campione 01:10 e 01:50 in PBS. Eseguire ogni campione in duplicato.
Nota: A partire da 10 mg di proteine totali del siero o del plasma, la proteina totale resa in esosomi purificati dal passaggio 5.6 è, in media, 150 µ g. ulteriori diluizioni possono essere necessari se vengono utilizzati campioni diversi da siero o plasma; la resa può variare con tipo di campione.
6. quantificazione e dimensionamento degli esosomi di Nanoparticle Tracking Analysis (NTA)
- Aggiungere 5 µ g di esosomi purificati (come quantificato in 5.6) a 1 mL di PBS e agitare con vortex per 15 s su medio-bassa velocità.
- Il campione viene posto in una siringa monouso da 1 mL. Se disponibile, è possibile impostare la siringa in una pompa a siringa automatica impostata di iniettare il campione diluito esosomi a una velocità di 30 µ l/min.
- Eseguire misurazioni NTA utilizzando impostazioni di acquisizione video: schermo guadagno del livello 3-4 e fotocamera di 12-13.
- Definire lo script per l'analisi eseguire tre replicati tecnici per un minimo di 30 s usando un flusso costante per ogni replica. Per l'analisi, impostare la soglia di cattura alle 5.
Nota: Dettagli per quanto riguarda l'uso della siringa automatica e le impostazioni per l'acquisizione video sono disponibili nel riferimento13. Impostazioni di acquisizione e analisi per NTA devono essere coerente in diversi campioni per assicurare la comparabilità.
7. determinazione della riduzione della proteina solubile
- Aggiungere µ g di 1-10 di esosomi purificati a tampone campione SDS ed eseguire l'elettroforesi su gel di poliacrilamide (pagina) utilizzando un Gel di Bis-Tris di 4-12% in 1 x MES SDS in esecuzione buffer per 35 min a 200 V. Transfer risolti proteine ad una membrana di nitrocellulosa 0,2 µm applicando una tensione o f 50 V per 1-1.5 h. eseguire l'analisi western blot per valutare la presenza di albumina, apolipoproteine A e B e il marcatore di esosomi CD 63 seguendo metodologie standard.
Nota: Protocolli di completo per i metodi 7.1 si trovano riferimento14; in particolare, SP007: esecuzione del gel di poliacrilammide e SP011: protocollo occidentale della macchia. - Separare i 10 µ g di esosomi purificati utilizzando la pagina come descritto al punto 7.1 e macchia le bande proteiche utilizzando colorante coomassie, seguenti raccomandazioni standard, per visualizzare la variazione di proteina e riduzione tra i campioni.
Nota: Ulteriori dettagli riguardanti il protocollo per le macchie occidentali specifici di CD63 sono descritti da Diaz et al. 15
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Representative Results
I dati presentati di seguito sono stati ottenuti utilizzando campioni appaiati di siero e plasma da cinque donatori sani. Per determinare gli effetti di ogni fase di lavorazione, sono state effettuate cinque varianti del protocollo presentato, e rimozione di proteine di recupero e non-esosomi esosomi sono stati confrontati. I metodi sperimentati inclusi: 1) SEC 700 kDa + ultrafiltrazione 3 kDa; 2) ultrafiltrazione 100 kDa; 3) proteinasi K + ultrafiltrazione 100 kDa; 4) SEC kDa 700 + ultrafiltrazione 100 kDa e 5) proteinasi K + 700 SEC kDa + kDa 100 di ultrafiltrazione ultrafiltrazione 3 kDa.
Collettivamente, tutti i metodi che coinvolgono kDa 700 SEC (1, 4 e 5) prodotto un numero significativamente maggiore di vescicole per microgrammo della proteina in entrambi i tipi di campione, siero e plasma (Figura 1A-B). Tuttavia, il metodo 5 generato un numero significativamente maggiore di vescicole per microgrammo del plasma rispetto al siero (Figura 1). Al contrario, la concentrazione di proteine in campioni di esosomi purificata era significativamente più bassa mentre usando i metodi di base di kDa 700 SEC (1, 4 e 5). One-way ANOVA e di Tukey più test di confronto hanno evidenziato che la concentrazione nella proteina finale dopo metodi 2 e 3 erano significativamente che la concentrazione nella proteina finale dopo i metodi 1, 4 e 5 (p < 0,001). Le differenze erano costanti con plasma o siero, tuttavia, con il metodo 1 la concentrazione finale di proteine purificate esosomi era significativamente più alta (t-test, p < 0,05) quando si utilizza il siero (Figura 2A). Per valutare la distribuzione della proteina purificata esosomi dai cinque metodi diversi, 10 µ g di campione da ogni metodo sono stati risolti in una pagina e macchiato con colorante coomassie. I risultati indicano che la maggior parte delle proteine presenti in "gli esosomi purificati" da metodi 2 e 3 era albumina significato la forte banda ~ 65 kDa (Figura 2B).
Il passo successivo era quello di confermare l'aumento nella purezza degli esosomi isolati basati sulla presenza di albumina, la proteina più abbondante nel sangue. Il processo di ultrafiltrazione hanno mostrato una notevole concentrazione di albumina nella frazione di exosomal che è stato parzialmente ridotto di pre-trattamento del campione con proteinasi K (Figura 3A, corsie S e P). L'inclusione di kDa 700 SEC nel processo ha fatto diminuire la quantità di albumina (Figura 3A, corsie P1/S1 e P4/S4) ma la combinazione di kDa 700 SEC, proteinasi K e ultrafiltrazione ha mostrato la rimozione più efficiente di albumina da esosomi purificati ( Figura 3A, lane P5/S5). Recenti studi hanno dimostrato che apolipoproteine sono anche comunemente co-isolate durante esosomi purificazione10,16. In particolare, ApoB, che è presente in lipoproteine di densità bassa, è stato trovato per essere altamente concentrato in esosomi purificati dal sangue umano10. Di conseguenza, abbiamo valutato il co-isolamento delle lipoproteine ApoB e ApoA-1. Metodi di ultracentrifugazione e la combinazione di kDa ultracentrifugazione e 700 SEC ha mostrato una simile quantità di ApoB rispetto all'importo rilevato nel siero e nel plasma mediante western blot (Figura 3B, corsie P1/S1, S2/P2 e P4/S4; Figure supplementari 1/2). Interessante, l'aggiunta di proteinasi K ha provocato la degradazione completa di ApoB dal campione purificato (Figura 3B, corsie S3/P3 e P5/S5). Similmente, ApoA-1, la componente proteica principale delle lipoproteine ad alta densità nel plasma umano, è stata ridotta da tutti i metodi che coinvolgono sia kDa 700 SEC o proteinasi K (Figura 3). Anche se, come l'albumina, l'ultrafiltrazione MWCO 100 sul proprio è stato in grado di ridurre significativamente la quantità di co-purificante ApoA-1.
Infine, per determinare l'effetto di proteinasi K sulle proteine esposte alla membrana esterna degli esosomi, abbiamo valutato la presenza di studi di CD63, una proteina di segno distintivo degli esosomi. Un'analisi di Western blot ha mostrato che la proteina non solo era rilevabile in metodi con proteinasi K (Figura 3D, corsie S3/P3 e P5/S5), ma le bande per CD63 utilizzando il metodo 5 avevano un segnale più intenso (Figura 3D, corsie P5/S5). Ciò che trova suggerisce Metodo 5 produce sia una maggiore concentrazione di esosomi o l'aumento di CD63 anticorpo che lega a causa della diminuzione degli aggregati della proteina associata alla superficie di esosomi.
Figura 1 : Esosomi resa dal plasma e siero dopo cinque metodi di purificazione diverso. (A) concentrazione di esosomi ottenuti da plasma (n = 5). (B) concentrazione di esosomi ottenuta dal siero (n = 5). (C) confronto tra i numeri di esosomi per microgrammo di proteina da 5 set accoppiati di plasma e siero. I numeri rappresentano l'asse x ogni metodo utilizzato, 1 = 700 SEC kDa + ultrafiltrazione 3 kDa; 2 = kDa 100 di ultrafiltrazione; 3 = proteinasi K + ultrafiltrazione 100 kDa; 4 = 700 SEC kDa + ultrafiltrazione 100 kDa e 5 = proteinasi K + 700 SEC kDa + kDa 100 di ultrafiltrazione ultrafiltrazione 3 kDa. In A e B, sono state calcolate le differenze di One-way ANOVA e Tukey di test i confronti multipli. In C, differenze tra siero e plasma con il metodo sono state calcolate da t-test. p < 0,05; Barre di errore: 95% intervallo di confidenza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Rendimento di proteina in esosomi purificati dal plasma e siero utilizzando cinque diversi metodi. (A) confronto tra il rendimento di proteina totale negli esosomi purificati ottenuto da plasma e siero (n = 5). (B) immagine rappresentativa di una colorazione di coomassie di 10 µ g di esosomi purificati risolti mediante SDS-PAGE; n = 1, accoppiato al plasma e siero. Numeri in figura rappresentano ogni metodo, 1 = 700 SEC kDa + ultrafiltrazione 3 kDa; 2 = kDa 100 di ultrafiltrazione; 3 = proteinasi K + ultrafiltrazione 100 kDa; 4 = 700 SEC kDa + ultrafiltrazione 100 kDa e 5 = proteinasi K + 700 SEC kDa + kDa 100 di ultrafiltrazione ultrafiltrazione 3 kDa. A, le differenze tra plasma e campioni del siero sono state calcolate da t-test. p < 0.05. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Riduzione dei contaminanti normali di esosomi isolati da sangue umano e stabilità della proteina hallmark CD63. Valutazione di macchia occidentale di: (A) albumina, 1 µ g per corsia; (B) dell'apolipoproteina B, 1 µ g per corsia; e (C) apolipoproteina A1, 10 µ g per corsia; (D) CD63, 1 µ g per corsia. L = Ladder; S = siero grezzo; P = grezzo del plasma. Esosomi purificata: usando 5 diversi metodi di purificazione. Numeri in figura rappresentano ogni metodo, 1 = 700 SEC kDa + ultrafiltrazione 3 kDa; 2 = kDa 100 di ultrafiltrazione; 3 = proteinasi K + ultrafiltrazione 100 kDa; 4 = 700 SEC kDa + ultrafiltrazione 100 kDa e 5 = proteinasi K + 700 SEC kDa + kDa 100 di ultrafiltrazione ultrafiltrazione 3 kDa. Risultati rappresentativi dal accoppiati del siero e plasma di un paziente; le tendenze erano coerenti tra campioni di donatori. Caricamento di proteina varia dalla macchia; normalizzazione è stato basato sulla determinazione di BCA della concentrazione del campione totale. Proteina totale carico per corsia è stato specificato per ogni macchia. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Complementare Figura 1: originale non tagliata western blots dalla Figura 3. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Complementare Figura 2: quantificazione di densità di albumina, ApoB, ApoA-1 e bande di CD63 da Figura 3; Il software ImageJ è stato utilizzato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Un metodo ottimizzato per aumentare la purezza e la resa degli esosomi da sangue aumenterà la capacità di miniera con precisione le vescicole extracellulari come fonte di biomarcatori per parecchie malattie. I metodi standard attualmente utilizzate per isolare gli esosomi, in particolare, ultracentrifugazione e metodi di precipitazione, hanno diversi svantaggi tra cui aggregazione esosomi e cubettatura di proteine solubili7,17, 18. In alternativa, l'uso di SEC ha mostrato un miglioramento significativo in esosomi isolamento, proteggendo gli esosomi da aggregazione e migliorare la rimozione dell'agente inquinante comune non-exosomal proteine9,11,18 , 19. Tuttavia, apolipoproteine10, più grandi vescicole e aggregati di proteine, tra cui l'albumina, spesso sono co-isolati con esosomi, se viene utilizzato SEC da solo. Due critiche passi dell'aiuto di protocollo presentato nel superare le ultime due limitazioni menzionate. Prima di tutto, la centrifugazione del campione del plasma o siero a 18.000 x precipitati g la maggior parte delle vescicole più grandi presenti nel campione. In secondo luogo, il pretrattamento dei campioni di siero o plasma con proteinasi K, una proteasi della serina con specificità larga20, è fondamentale per ridurre la quantità di albumina e le apolipoproteine a-1 e B associata con gli esosomi durante la purificazione. Abbiamo combinato l'uso di proteinasi K con un passo di ultrafiltrazione utilizzando una membrana con un MWCO di 100 kDa per eluire parzialmente piccole proteine e peptidi, e quindi ci siamo adattati all'utilizzo di una resina SEC con una MWCO di kDa 700 per cancellare ulteriori più piccoli peptidi e proteine dalla esosomi. Questa resina, originariamente ottimizzata per l'isolamento del virus, cattura rimanente grandi proteine e/o complessi sotto 700 kDa. Il principio di isolamento di questa resina SEC consente un recupero delicato di esosomi, poiché il flusso del campione attraverso la resina è guidato dalla forza di gravità. Questo permette meno aggregazione e l'integrità mantenuto di esosomi, superare due dei grossi limiti dei metodi basati su ultracentrifugazione. Infine, è stato dimostrato da Bueno et al. che la diluizione del plasma prima dell'elaborazione SEC migliora esosomi recupero21. In questo protocollo, abbiamo incluso un passaggio di diluizione prima SEC per aumentare il tempo di contatto del campione con la resina.
Una limitazione importante del protocollo presentato è la potenziale digestione delle proteine nella membrana exosomal dal trattamento di proteinasi K. Questo può compromettere gli esperimenti a valle in caso di proteine di membrana di superficie-esposta sono necessari per le analisi a valle, tra cui il western blot, ELISA, o citometria a flusso. Per parzialmente testare l'effetto di proteinasi K su proteine di membrana associata, abbiamo analizzato i campioni di proteasi-trattati per la presenza di CD63, una proteina di studi, che è normalmente presente in esosomi. Questi risultati hanno mostrato che uso di proteinasi K con le condizioni descritte del tempo di digestione e concentrazione non ha condotto a degradazione significativa di CD63. Tuttavia, ulteriore valutazione della stabilità di una proteina di membrana-collegato basato su specifici interessi di ricerca sarà richiesta.
In conclusione, il protocollo presentato offre diversi vantaggi rispetto ai metodi attuali esistenti. Ogni passo incluso nel protocollo ha dimostrato in studi indipendenti per essere benefico per la purezza degli esosomi: Cubettatura di più grandi vescicole, siero o plasma diluizione e Additionally SEC., come accennato in precedenza, una fase di digestione della proteinasi è stato inclusa per rimuovere apolipoproteine e aggregati proteici, nonché una concentrazione passo alla fine del processo di purificazione che i benefici di rendimento e stabilità di esosomi. Infine, questo protocollo può essere facilmente adattato per isolare gli esosomi dai più grandi campioni di volume come urina o surnatanti di cella.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata sostenuta da fondi interni da CSU (di KMD), ATCC contratto n. 2016-0550-0002 (un subappalto di NIAID HHSN272201600013C) e The Bill e Melinda Gates Foundation (OPP1039688) (a KMD/NKG). Ringraziamo l'esperienza di ricerca NSF per programma estivo di laureandi (REU) presso la Colorado State University per ulteriore supporto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nanosight | Malvern | NS300 | |
| Benchtop microcentrifuge | Thermo | Legend Mico21 | |
| Benchtop centrifuge | Beckman Coulter | Allegra 6R | |
| Waterbath | Benchmark | B2000-4 | |
| Microplate reader | BIOTEK | Epoch | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | THERMO | 23227 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | THERMO | 23235 | |
| Phosphate buffered saline | Corning | 21-040-CV | |
| 96 well plate | Corning | 15705-066 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane | EMD-Millipore | UFC510096 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units | EMD-Millipore | UFC800324 | |
| Capto Core 700 | GE Healthcare | 17548103 | |
| Poly-Prep Chromatography Columns | BIORAD | 7311550 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | THERMO | NP0323BOX | |
| Nitrocellulose Membrane, Roll, 0.2 µm | BIORAD | 1620112 | |
| Proteinase K, Tritirachium album | EMD-Millipore | 539480 | |
| SimplyBlue SafeStain | THERMO | LC6065 | |
| SIGMAFAST BCIP/NBT | Millipore-SIGMA | B5655 | |
| 4-Chloro-1-naphthol | Millipore-SIGMA | C6788 | |
| Anti-CD63 Antibody (rabbit anti-human) with goat anti-rabbit HRP secondary antibody | SYSTEM BIOSCIENCES | EXOAB-CD63A-1 | Primary and secondary antibodies |
| ALB Antibody (F-10) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-271605 | Primary antibody |
| apoB Antibody (C1.4) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-13538 | Primary antibody |
| apoA-I Antibody (B-10) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-376818 | Primary antibody |
References
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