Summary
Her presenterer vi en protokoll for å utvikle en i vivo kreft modellen med ark celleteknologi. Slik modell kan være svært nyttig for vurdering av anticancer therapeutics.
Abstract
En i vivo dyremodell som etterligner menneskelige kreft kan ha ulike programmer som leverer betydelige klinisk informasjon. For tiden brukte teknikker for utvikling av i vivo kreft modeller har betydelig begrensninger. Derfor i denne studien ønsker vi å implementere celleteknologi ark for å utvikle en i vivo kreft modell. Leverkreft (HCC) er utviklet i naken rotter ved hjelp av cellen ark opprettet fra HCC cellen linje celler. Kreft cellen arkene genereres gjennom intracellulær vedheft og dannelsen av en lagdelt struktur, kontrollert av den ekstracellulære matrisen. Dette gir HCC ark transplantasjon i leveren og etablering av en svulst-bærende dyr modell innen en måned. I tillegg er rollen mesenchymal stamceller (MSC) i utviklingen av denne kreft modellen undersøkt. I tillegg til HCC cellen linje arket, opprettes en annen to cellen ark: arket HCC celler og benmarg MSCs (BMMSCs) og et ark med HCC celler og navlestreng MSCs (UCMSCs). Ark som har en kombinasjon av både HCC celler og MSCs finnes også produsere en svulst-bærende dyr. Men tillegg av MSCs reduserer størrelsen på dannet svulsten, og denne virkning på tumor utvikling avhengig av brukte MSCs' kilde. Dette indikerer at en celle ark av visse MSC subtyper kunne benyttes i svulst styring og kontroll.
Introduction
HCC er en primær kreft i leveren som er betydelig forbundet med en dårlig prognose. Årlig, nesten en halv million nye pasienter er diagnostisert med HCC, som representerer 85% av leveren kreft pasienter over hele verden1. Hepatocarcinogenesis er ikke en enkelt-skjema sykdom; Det er snarere en samling av sykdommer som har ulike histopathological funksjoner og genetiske og genomisk variasjon, i tillegg til variert prognostiske resultater1. Derfor er de største utfordringene i utviklingen av en effektiv terapeutisk strategi for HCC begrenset kunnskap om HCC biologi og mangelen på en passende eksperimentelle dyr modell som kan bidra til å forstå denne komplekse sykdommen. En i vivo dyremodell som etterligner menneskelige kreft er nødvendig for å velge kandidat gener og identifisere Prognostisk/forutsigende markører innblandet i kreft induksjon, samt for å undersøke ulike faktorer som kan påvirke kreft svar til terapeutisk agenter.
In vitro er kreft fortsatt forbundet med store begrensninger. Dette er skyldes at kreftcellene mister mange av deres i vivo funksjoner når vedlikeholdt i kultur. Endringene som skjer til celler i vitro resultat fra fraværet av hele vev fysiologi i ex vivo omgivelser. Kreft celle til celle interaksjon (stromal, immunsystemet, blodkar, epithelial, etc.) i svulst microenvironment reflekterer sterkt kreft celle egenskaper2. Svulst-microenvironment kan endre kreft cellen genet/protein uttrykk og fenotypiske egenskaper, i tillegg til angiogenetic og metastatisk potensial. Todimensjonal (2D) i vitro kultur systemet mangler også en egnet vev matrise, som er nødvendig å regulere svulst progresjon. Derfor, på grunn av disse begrensningene i vivo modeller skal alltid benyttes for å støtte de foreløpige funnene i vitro modeller. I denne studien bruker vi ark celleteknologi til å utvikle en i vivo dyremodell som kaster den fullstendig biologisk prosessen underliggende HCC.
Mer enn et tiår siden, etablert Okano's laboratory en ny metode for tissue engineering basert på celle ark teknologi3. Denne teknikken utnytter en thermo-responsive kultur plast for å tillate reversibel celle vedheft/avdeling ved å kontrollere at overflaten hydrophobicity. Denne metoden tillater en skånsom høsting av kultivert celler i et intakt tredimensjonale (3D) format (i.e.,cell ark), med en godt bevart ekstracellulær matrix (ECM) og celle-til-celle interaksjoner. Cellen ark teknikken krever precoating kultur retter med en temperatur-responsive polymer poly(N-isopropylacrylamide) (PIPA er), som er kommersielt tilgjengelig og klar til bruk. En temperatur under 20 ° C, PIPA er polymerer blir hydrert og løses i vandige løsninger, mens ved en høyere temperatur (37 ° C), polymerer blir dehydrert og forvandle en grumset utløse. Polymer inneholder hydrofile amid kjeder og hydrofobe siden kjeder (isopropyl grupper). Ved høye temperaturer, er den Brownsk bevegelsen molekylene intensivert, mens en lav temperatur, molekylene i vannet rundt isopropyl gruppene for hydrert struktur og gruppene av hydrofobe isopropyl samle på grunn av hydrofobe interaksjoner. Derfor hele kjeden av polymer samler og precipitates4.
Presentert studien, er denne teknikken ansatt å utvikle en HCC dyremodell bruker tre ulike celle ark. Det første arket ansatt består av HCC cellen linje celler, mens de to andre arkene består av en kombinasjon av HCC cellen linje celler og MSCs fra to ulike kilder: benmarg MSCs (BMMSCs) og navlestreng MSCs (UCMSCs). MSCs er ikke-blodkreft stromal celler som kan skille intocell derivater av mesenchymal linjen, inkludert adipocytter, osteocytes, chondrocytes og myocytter5. Grunnen til at vi bruker disse cellene når du oppretter kreft cellen arket er inkonsekvent rapportering på effekten av MSCs på kreft. Det har blitt foreslått at MSCs kan ha to forskjellige fenotyper: "MSC1", en proinflammatory fenotype, og "MSC2", en suppressive fenotypen6. MSCs uttrykke toll-like reseptorer (TLRs). TLR4 fylling av MSCs øker deres utskillelsen av proinflammatory faktorer, mens TLR3 grunning øker deres utskillelsen av suppressive faktorer6. En i vitro studie av disse to fenotyper rapporterte at en co kultur av MSC1 med kreftcelle linjer dempes kreft cellevekst, mens MSC2 co kulturen hadde motsatt effekt7. Dette impliserer at MSCs kan være Pro kreft eller anticancer, avhengig av deres fenotypen. Derfor i tillegg utvikler HCC dyr modellen med ark celleteknologi, ønsker vi å utforske effekten av MSC transplantasjoner på tumor utvikling, og om bruker disse cellene vil øke eller redusere utviklingen av denne modellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen følger retningslinjene som dyr pleie av kong Saud universitetets etiske komité. Kirurgiske prosedyrer, bedøvelse og andre medikamenter brukt på dyr er godkjent av kong Saud universitetets etiske komité. Alle eksperimentelle arbeidet utføres av kvalifiserte personell.
1. celle ark konstruksjon
- Pels kultur rettene (3,5 cm temperatur-responsive kultur retter) med ufortynnet fosterets bovin serum (FBS) og sørge for å dekke alle overflaten av fatet.
Merk: Dette trinnet er viktig for brøkdel av cellen arket siden den støtter vekst av celler i en monolayer og forhindrer cellen aggregering. - Inkuber retter for 24 h på 37 ° C i en fuktet atmosfære som inneholder 5% CO2 og 95% luft.
- Fjern de overskytende FBS fra belagt retter og la rettene tørke ved romtemperatur (RT) for minst 1 time.
- Forberede tre celle suspensjoner: 1 x 106 HepG2 celler, 1 x 106 HepG2 celler med BMMSCs og 1 x 106 HepG2 celler med UCMSCs (i forholdet 4:1 både BMMSCs og UCMSCs).
- Ætt aktuelle cellen suspensjon til hver merket rett.
- Avbryte alle cellene i DMEM kultur medium med 10% FBS og 1% penicillin/streptomycin.
- Inkuber cellene på 37 ° C i en fuktet atmosfære som inneholder 5% CO2 og 95% luft.
2. celle ark avdeling
- 100% celle samløpet, tar oppvasken av 37 ° C inkubator.
- Inkuber HepG2 celle ark parabolen 1t på RT, mens rugende den HepG2/BMMSC og HepG2/UCMSC celle ark retter for 30-40 min ved 20 ° C i en fuktet atmosfære som inneholder 5% CO2 og 95% luft.
Merk: Cellen arket laget av bare HepG2 er skjør; redusere temperaturen til 20 ° C fører til skader strukturen i arket.
3. ytelsen til den kirurgiske prosedyren
Merk: Under inkubasjon tiden for cellen ark brøkdel, begynn dyr.
-
Instruksjoner for utarbeidelse av området kirurgi
- Gjennomføre alle kirurgiske prosedyrer i et sterilt eget område i laboratoriet, som hette, laminær strømning regjering eller en steril kirurgi rommet. Kontroller at alle overflater av området kirurgi er ikke-porøs, forseglet, holdbare og sanitizable.
- Bruk riktig verneutstyr, inkludert scrubs, hansker, ansiktsmasker og hodet og skoovertrekk.
- Bruk kirurgiske verktøy som er rene og sterilisert (via autoklavering, mettet stammen under høyt trykk) i begynnelsen av operasjonen.
- Endre hansker mellom rotter.
-
Utarbeidelse av dyret for kirurgi
- Bruk 8 - 12 uke-gamle naken rotter.
- Opprette injiserbare anestesi for rotter.
- For å forberede anestesi løsningen, ketamin-xylazine, bland 2 mL av Ketamin, 1 mL av xylazine (i en konsentrasjon på 20 mg/mL) og 1 mL steril fysiologiske saltoppløsning (f.eks, 0,9% natriumklorid) i et sterilt 10-mL serum samling hetteglass og riste godt før Bruk.
- Hvis du vil bruke anestesi, injisere 0,2 mL ketamin-xylazine løsningen per 100 g av kroppsvekt av rotte intraperitoneally.
Merk: Den totale dosen av løsningen er 100 mg/kg av ketamin og 10 mg/kg av xylazine.
- Fjerne synlige støv/rusk fra kirurgiske området.
- Sjekk dybden på anestesi ved å teste den pedal uttak refleks (fot pad klemme på begge bakben feet).
Merk: Hvis foten pad klemme fører et svar, gjenta en dose av 0,05 mL/100 g (ca hver 30 min), så recheck bedøvende dybden. - Desinfiser området kirurgi med en to-trinns av povidon-jod/isopropanol.
- Dekk rotte med et sterilt drapere å unngå forurensning av innsnitt.
- Injisere rotter subcutaneously med buprenorfin (0,01 - 0,05 mg/kg)8 før innsnitt.
- Bruke sterilt skalpell, lage en 7 - til 10-cm klipp mellom hud og underliggende musklene å avsløre leveren.
- Atskilt mage muskler fra huden med flate bak kanten av skalpell.
- Nøye stikke den linea alba ved hjelp av en skalpell og utvide kuttet med skarp saks.
4. cellen ark transplantasjon
Merk: Cellen ark transplantasjon utføres på leveren.
- Samle celle arket fra kultur parabolen.
- Forsiktig Tapp kultur rett over benken koble arket overflaten.
- Skille celle arket fra i dish overflaten ved skraping kanten av arket i en halvsirkel med et sterilt pipette tips.
- Forsiktig fjerne hele mediet fra kultur parabolen.
- Arket er intakt uten skade; ellers kan det ikke være brukes (figur 1).
Merk: Den resulterende ark kan registreres direkte i øyet.
- Forberede en steril membran (filter papir) å høste celle arket fra parabolen.
- Først suge membranen med vanlig saltvann. Deretter Fjern overflødig saltkildene med en steril bomull pute.
- Plass våt membranen over cellen arket, mens du unngår bretter og luftbobler mellom membranen og celle arket.
- Legg noen dråper normal saline over membranen og celle arket å samle dem lettere.
Merk: For å unngå å bryte celle arket, ikke bruke kaldt saltvann og løfte membranen og celle arket med tang. - La membranen i noen sekunder for å sikre at cellen arket er riktig koblet til membranen, og deretter samle det.
- Forberede leveren cellen ark transplantasjon.
- Kontroller at leveren overflaten er tørt ved forsiktig å tappe det med en steril bomull pute.
- Bruker sterilt tang, plasser membranen med cellen arket over en enkelt flik av rottes leveren.
- Legge noen dråper av sterilt saltvann og bruke et lett trykk på membranen koble celle arket fra den.
- Vent 5 min før nøye membranen.
Merk: Dette gjøres for å sikre celle arket er riktig knyttet til leveren. - Til slutt lukke underliggende musklene og huden snitt med 5-0 nylon sømmer.
- Desinfiser kirurgi området med povidon-jod.
Merk: Figur 2 viser et diagram over cellen ark transplantasjon prosedyren på leveren av rotte naken.
5. etter operasjonen omsorg
- Umiddelbart etter kirurgi, huset rotte individuelt for å unngå kannibalisme eller kvelning, og overvåke den regelmessig (minst hver 15 min) til det er bevisst og fullt ambulant.
- Deretter vurdere rotter daglig for 5-14 d, minst 5 d post-operatively, for å sikre at det er ingen komplikasjoner. Under daglige vurdering, kontroller av følgende.
- Såret er lukket, og bildet er intakt, uten å være svært tett.
- Det er ingen tegn på infeksjon i snitt området, som varme, overdreven hevelse eller purulent utslipp.
- Det er ingen tegn assosiert med smerte, som redusert mat og vann inntak, vekttap, dehydrering, hud Notting eller rask og åpen munn pusting. Kontrollere moderat til alvorlig etter operasjonen smerte, eventuelt injisere rotter subcutaneously med buprenorfin (0,01 - 0,05 mg/kg) enhver 6-8 h9 minimum 48-72 h postoperatively.
6. analyse av transplantert området
- En måned etter transplantasjon, scarifice rotta og samle transplantert området for histologiske og immunohistochemical analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tumorigenicity av transplantert celle ark i rotter:
En måned etter transplantasjon, har alle transplantert celle ark i rotter lever utviklet svulster (Figur 3). Den gjennomsnittlige størrelsen på utviklet tumorer fra HepG2 og HepG2/BMMSC HepG2/UCMSC celle ark var 4,5 cm, 4 cm og 2,5 cm, henholdsvis10.
Histologiske analyse av leveren vev:
Hematoxylin og Eosin (H & E) flekker av ikke-transplanted rotter viste lever med hepatocytter ordnet i plater som anastomose med hverandre, og kjerner var runde, med ett eller to fremtredende nucleoli. Derimot delene svulst samlet viste kantene av levedyktig betent og nekrose subkutan hepatocytter, med uregelmessig kjernefysiske konturer og fjern degenerasjon (Figur 4).
Figur 1: fabrikasjon av cellen arket med en 3,5 cm temperatur-responsive kultur parabol. (A) dette panelet viser et skadet celle ark uegnet for transplantasjon. (B) dette panelet viser en intakt celle ark, klar for transplantasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Celle ark transplantasjon prosedyre i naken rotter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Svulst utviklet på en rottes lever etter en måned av cellen ark transplantasjon. Svulsten ble generert fra (A) en HepG2 celle ark (størrelse: 4,5 cm), (B) en HepG2 og BMMSC celle ark (størrelse: 4 cm), og (C) en HepG2 og UCMSC celle (størrelse: 2,5 cm). De blå sirklene viser svulst området. Dette tallet er endret fra tidligere publisert arbeid10. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Histologiske analyse av en rottes leveren. H & E farging av en rottes lever, fire uker etter cellen ark transplantasjon. (A) dette panelet viser normalt rotte leveren celler. (B) dette panelet viser leveren morfologi etter kreft celler transplantasjon. Svarte pilen viser lever kreft, de grønne pilene viser normal hepatocytter, den blå pilen viser betent celler og oransje pilen viser nekrotisk HCC celler. Skala stolper angir 20 X forstørrelse. Dette tallet er endret fra tidligere publisert arbeid10. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En omfattende mengde forskning er dedikert til å utvikle en tilstrekkelig i vivo prekliniske dyremodell som ligner kreft hos mennesker. For tiden innebære de store tilnærmingene brukt til å opprette kreft dyremodeller genteknologi og cellen transplantasjon11. Genmodifiserte dyr modeller er gode verktøy for identifikasjon og validering av målet gener, samt forstå molekylære mekanismer underliggende narkotikainduserte toksisitet. Men er denne modellen forbundet med noen begrensninger; for eksempel resultere endring av et gitt gen ikke alltid i den etterlengtede fenotype12. Cellen transplantasjon tilnærmingen er mer vanlig å indusere kreft i dyr, og det innebærer injeksjon av kreft cellen suspensjon. Likevel, dette enkelt og praktisk tilnærming har sine egne ulemper. Vil generere en celle suspensjon, brukes en enzymatisk fordøyelsen skritt å høste kreftceller. Dette resulterer i tap av noen av vedheft proteiner, noe som vil redusere engraftment effektiviteten av transplantert cellene. Derfor er det ingen garanti for at transplantert kreftcellene vil danne kreft vev, for ikke å nevne vanskeligheten av kontroll av størrelsen av indusert svulsten. I tillegg har denne tilnærmingen en alvorlig ulempe, som er rask overgang av transplantert kreftceller i blodsirkulasjonen eller celle engraftment i ikke-målrettede organer13.
Romanen celle ark teknologien ble utviklet for å overvinne disse ulempene. Suzuki et al. 14 har opprettet kolon, lever og bukspyttkjertel svulst-bærende dyr med metoden kreft cellen ark transplantasjon. Når sammenlignet med svulster generert via metoden kreft cellen transplantasjon, var disse svulstene større og mer stabil. Implantering av en liten tumor vev i et dyr å indusere en svulst er svært avhengig av bruken av en transplantasjon metode som ikke krever en enzymatisk fordøyelsen trinn. Proteolytiske enzymer skade ekstracellulære matriser, som påvirker celle til celle interaksjon. Ark celleteknologi seirer denne begrensningen ved å bruke en invasiv høsting metode, slik at samlingen av en intakt monolayer celle ark, sammen med sine tilknyttede ekstracellulær matrix og vekstfaktorer15. Ark celleteknologi kan også langsiktig engraftment16,17. Dette er av stor verdi i i vivo studier, der cellene skal kunne engraft til vertens vev for hele vevets livet17. Dessuten, aktivert denne teknikken utviklingen av en ny metode for tissue engineering, uten bruk av biologisk nedbrytbart stillaser3,15. Likevel, denne tilnærmingen fortsatt har noen begrensninger. Når du bruker celle ark teknikken, kan den sentrale delen av podet vev muligens blitt necrotic hvis graftet er for stor. Derimot reduseres suksessen sjanse for transplantasjon hvis graftet er for liten. I tillegg for å kontrollere påfølgende veksten av svulsten, må størrelsen på transplanterte vevet være ensartet over alle eksperimentene. Transplantable vev er begrenset til 2 mm3 som følge av induksjon av nekrose på grunn av dårlig oksygen miljø18.
I denne studien, ble en HCC dyremodell opprettet ved hjelp av stillaset-fri transplantasjon av cellen ark. Tre typer celle ark ble transplantert til rotter lever: en celle ark HCC celle linje celler, en celle ark HCC linje celler og BMSCs og en celle ark HCC linje celler og UCMSCs. Transplantasjon av alle tre celle ark var tilstrekkelig til å indusere svulster i mottakerens rotter. Imidlertid ble det bemerket at å legge MSCs til arket redusert størrelsen på dannet tumorer. Dette indikerer at MSCs brukes, spesielt UCMSCs, har en negativ effekt på tumor utvikling. For å konkludere, tilbyr kreft cellen ark transplantasjon effektiv metode for å opprette en dyremodell med solide svulster. Har slike i vivo modeller kan føre kritiske klinisk informasjon med betydelig programmer. I tillegg, som tydelig tumor størrelse reduksjon, begrense UCMSCs tumor utvikling og overføring. Dette indikerer at noen MSC undertyper kan brukes i en celle tilnærming for behandling av kreft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke ansatte i eksperimentell kirurgi og dyr laboratorium ved College of Medicine, King Saud University, for deres samarbeid og støtte-spesielt Hussain Almukhayzim og Hisham Aloudah. Forfatterne vil også erkjenner medieteamet ved King Saud bin Abdul-Aziz University for å forberede visuelle materiale, spesielt Muath bin Ghannam og Abdulwahab Alsulami.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| FBS | Gibco/Invitrogen | 10270106 | |
| DMEM high glucose | Sigma | D5671-500ML | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technology | 15070063 | |
| Sterile physiologic saline | Sigma | S0817-1GA | |
| Human HepG2 cell line | ATCC, USA | HB-8065 | |
| Human bone marrow MSCs cell line | PromoCell, USA | C-12974 | |
| human umbilical cord tissue MSCs | PromoCell, USA | C-12971 | |
| Ketamine 50% | Rompun, Bayer | ||
| Xylazine 2% | Rompun | 23076-35-9 | |
| Alphadine® solution. | Riyadh Pharma | LBL0816 | |
| Disposables: | |||
| 15mL Polypropylene High Clarity PP Centrifuge Tube | Falcon | 352097 | |
| 3.5 cm sterile UpCell culture dishes with the filter paper (membrane) | Sigma | 174904-1CS | |
| 100-1000 µl Pipette Tips | Sigma | CLS4868-1000EA | |
| Basic Procedure Drape | Thermofisher | PMD5293.0 | |
| Equipment | |||
| Plus pipette, variable volume | Eppendorf® Research® | Z683779-1EA | |
| Tissue culture incubator 37 °C, 5% CO2 | Any brand | ||
| Biological safety cabinet | Any brand | ||
| Tissue culture incubator 20 °C, 5% CO2 | Any brand | ||
| Sterile surgical tools and nude rats: | |||
| Forceps | |||
| Scissors | |||
| scalpel | |||
| Nylon Suture 5-0 | Accutome | AB-3854S | Monofilament, Lancet |
| 1 ml Tuberculin Syringes | Fisher Scientific | 14-826-88 | |
| Nude rats | Charles river |
References
- Marra, M., et al. Molecular targets and oxidative stress biomarkers in hepatocellular carcinoma: an overview. Journal of Translational Medicine. 9, 171 (2011).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
- Kushida, A., et al. Decrease in culture temperature releases monolayer endothelial cell sheets together with deposited fibronectin matrix from temperature-responsive culture surfaces. Journal of Biomedical Materials Research. 45 (4), 355-362 (1999).
- Okano, T., Yamada, N., Sakai, H., Sakurai, Y. A novel recovery system for cultured cells using plasma-treated polystyrene dishes grafted with poly (N-isopropylacrylamide). Journal of Biomedical Materials Research Part A. 27 (10), 1243-1251 (1993).
- Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).
- Waterman, R. S., Tomchuck, S. L., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. A new mesenchymal stem cell (MSC) paradigm: polarization into a pro-inflammatory MSC1 or an Immunosuppressive MSC2 phenotype. PLoS One. 5 (4), e10088 (2010).
- Waterman, R. S., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. Mesenchymal stem cell 1 (MSC1)-based therapy attenuates tumor growth whereas MSC2-treatment promotes tumor growth and metastasis. PLoS One. 7 (9), e45590 (2012).
- Curtin, L. I., et al. Evaluation of buprenorphine in a postoperative pain model in rats. Comparative Medicine. 59 (1), 60-71 (2009).
- Nowland, M. H. Guidelines on Anesthesia and Analgesia in Rats - ULAM Guidelines and SOPs - Michigan Medicine Confluence. , https://wiki.med.umich.edu/display/ULAMGSOP/Guidelines+on+Anesthesia+and+Analgesia+in+Rats (2017).
- Alshareeda, A. T., Sakaguchi, K., Abumaree, M., Mohd Zin, N. K., Shimizu, T. The potential of cell sheet technique on the development of hepatocellular carcinoma in rat models. PLoS One. 12 (8), e0184004 (2017).
- Russo, J., Russo, I. H. Atlas and histologic classification of tumors of the rat mammary gland. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (2), 187-200 (2000).
- Lin, J. H. Applications and limitations of genetically modified mouse models in drug discovery and development. Current Drug Metabolism. 9 (5), 419-438 (2008).
- Driscoll, J. S. The preclinical new drug research program of the National Cancer Institute. Cancer Treatment Reports. 68 (1), 63-76 (1984).
- Suzuki, R., Aruga, A., Kobayashi, H., Yamato, M., Yamamoto, M. Development of a novel in vivo cancer model using cell sheet engineering. Anticancer Research. 34 (9), 4747-4754 (2014).
- Chen, G., et al. Application of the cell sheet technique in tissue engineering. Biomedical Reports. 3 (6), 749-757 (2015).
- Matsuura, K., Haraguchi, Y., Shimizu, T., Okano, T. Cell sheet transplantation for heart tissue repair. Journal of Controlled Release. 169 (3), 336-340 (2013).
- Matsuura, K., Shimizu, T., Okano, T. Toward the development of bioengineered human three-dimensional vascularized cardiac tissue using cell sheet technology. International Heart Journal. 55 (1), 1-7 (2014).
- Folkman, J. What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent? Journal of the National Cancer Institute. 82 (1), 4-6 (1990).
