Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att utveckla en i vivo cancer modell använder ark cellteknologi. En sådan modell kan vara mycket användbart för utvärdering av cancer therapeutics.
Abstract
En i vivo djurmodell som härmar mänskliga cancer kan ha olika program som ger betydande klinisk information. De närvarande används teknikerna för utveckling av in-vivo cancer modeller har betydande begränsningar. Därför i denna studie vill vi genomföra cell ark teknik för att utveckla en modell för i vivo cancer. Hepatocellulär cancer (HCC) är framgångsrikt utvecklat i naken råtta använda cell ark skapas från HCC cell linje celler. De cancer cell arken genereras via intracellulära vidhäftning och bildandet av en skiktad struktur, kontrolleras av extracellulärmatrix. Detta möjliggör HCC ark transplantationen i levern och skapandet av en tumör-bärande djur modell inom en månad. Dessutom utreds rollen av mesenkymala stamceller (MSC) i utvecklingen av denna cancer modell. Utöver bladet HCC cell linje, en annan två cell ark skapas: en ark av HCC celler och benmärgen MSCs (BMMSCs) och ett blad av HCC celler och navelsträngen MSCs (UCMSCs). Blad som har en kombination av både HCC celler och MSCs är också kan producera en tumör-bärande djur. Men tillägg av MSCs minskar storleken på bildade tumören, och denna negativa effekt på tumörutveckling varierar beroende på den använda MSCs' källa. Detta indikerar att en cellagret som gjorts av vissa MSC undertyper kunde utnyttjas i tumör förvaltning och kontroll.
Introduction
HCC är en primär cancer i levern som är signifikant associerad med dålig prognos. Årligen, nästan en halv miljon nya patienter diagnosen HCC, vilket motsvarar 85% av levercancer patienter världen över1. Hepatocarcinogenesis är inte en enda-form sjukdom; snarare är det en samling av sjukdomar som har olika histopatologiska funktioner och genetiska och genomisk variation, förutom att varierade prognostiska utfall1. De huvudsakliga utmaningarna i utvecklingen av en effektiv terapeutisk strategi för HCC är därför begränsad kunskap om HCC biologi och bristen på en lämplig experimentell djurmodell som kan hjälpa till att förstå detta komplexa sjukdomar. En i vivo djurmodell som härmar mänskliga cancer är nödvändigt för att välja kandidatgener och identifiera prognostiska/prediktiva markörer inblandade i cancer induktion, liksom för att undersöka olika faktorer som kan påverka cancer Svaren till terapeutiska medel.
In vitro cancer studier är fortfarande associerade med stora begränsningar. Detta är på grund av att cancerceller förlorar många av deras in-vivo funktioner när underhålls i kultur. De förändringar som sker till celler in vitro- resultat från avsaknad av hela vävnad fysiologi i en ex vivo -miljö. Cancer cell till cell interaktion (stromaceller, immun, kärlsystemet, epitelial, etc.) inom den tumör mikromiljö reflekterar kraftigt cancer cell egenskaper2. Den tumör mikromiljö kunde ändra cancer cell genen och protein uttryck och fenotypiska egenskaper, förutom angiogenetic och metastatisk potential. Tvådimensionell (2D) i vitro kultur systemet saknar också en lämplig matris, som är nödvändigt att reglera tumör progression. På grund av dessa begränsningar bör således i vivo modeller alltid utnyttjas för att stödja de preliminära resultaten av in vitro- modeller. I denna studie använder vi cell ark teknik för att utveckla en i vivo djurmodell som belyser den fullständiga biologiska processen underliggande HCC.
Mer än ett decennium sedan, etablerat Okanos laboratorium en ny metod för vävnadsteknik baserat på cell ark teknik3. Denna teknik använder tredjeparts en thermo-lyhörd kultur plast för att tillåta reversibel cell adhesion/avlossning genom att kontrollera den ytan vattenavvisande egenskaper. Denna metod tillåter en skonsam skörd av odlade celler i ett intakt tredimensionell (3-D) format (i.e.,cell ark), med en välskött extracellulär matrix (ECM) och cell-till-cell interaktioner. Cell ark tekniken kräver precoating kulturen rätter med en temperatur-känslig polymer poly(N-isopropylacrylamide) (PIPA är), vilket är kommersiellt tillgänglig och redo för användning. Vid en temperatur under 20 ° C, PIPA är polymerer blir återfuktad och lös i vattenlösningar, vid en högre temperatur (37 ° C), polymerer bli uttorkad och omvandla till en grumlig fällning. Polymeren innehåller hydrofil amide kedjor och hydrofoba sida kedjor (isopropyl grupper). Vid höga temperaturer intensifieras den Brownian rörelsen av vattenmolekylerna, medan, låg temperatur, molekylerna i vattnet kring isopropyl grupperna av fördelningen, hydrerad struktur och grupperna av hydrofoba isopropyl aggregera på grund av hydrofoba interaktioner. Därför hela kedjan av polymeren aggregat och påskyndar4.
I studien presenteras, är denna teknik anställd för att utveckla en HCC djurmodell använder tre olika cell ark. Det första arket anställd består av HCC cell linje celler endast, medan de andra två bladen består av en kombination av HCC cell linje celler och MSCs från två olika källor: benmärg MSCs (BMMSCs) och navelsträngen MSCs (UCMSCs). MSCs är icke-hematopoetiska stromaceller som klarar av att differentiera intocell derivat av mesenkymala härstamning, inklusive adipocyter, osteocyter, kondrocyter och myocyter5. Anledningen till att vi använder dessa celler när du skapar cancer cell arket är inkonsekvent rapportering om effekten av MSCs på cancer. Det har föreslagits att MSCs kan ha två distinkta fenotyper: ”MSC1”, en proinflammatoriska fenotyp, och ”MSC2”, en immunsuppressiv fenotyp6. MSCs express toll-liknande receptorer (TLR). TLR4 priming av MSCs ökar sin utsöndring av proinflammatoriska faktorer, medan TLR3 priming ökar sin utsöndring av immunosuppressiva faktorer6. En in vitro- studie av dessa två fenotyper rapporterade att en samtidig kultur av MSC1 med cancer cellinjer försvagade cancer celltillväxt, medan MSC2 samtidig kultur hade den motsatta effekt7. Detta ifrågasätter att MSCs kan vara antingen Pro cancer eller cancer, beroende på deras fenotyp. Således, förutom att utveckla HCC djur modellen använder ark cellteknologi, vi vill utforska effekten av MSC transplantationer på tumörutveckling, och om du använder dessa celler kommer att öka eller minska utvecklingen av denna modell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollet följer djurvård riktlinjer King Saud Universitys etiska kommittén. Kirurgiska ingrepp, anestetika och andra mediciner som används på djur är godkända av King Saud Universitys etiska kommitté. Alla experimentellt arbete utförs av lämpligt utbildad personal.
1. cell blad konstruktion
- Päls av kultur rätter (3.5-cm temperatur-lyhörd kultur rätter) med outspädd fetalt bovint serum (FBS) och se till att omfatta alla ytan av skålen.
Obs: Detta steg är viktigt för avskildheten av cellagret eftersom det stöder tillväxten av cellerna i en enskiktslager och förhindrar cell aggregering. - Inkubera rätter för 24 h vid 37 ° C i en fuktad atmosfär som innehåller 5% CO2 och 95% luft.
- Avlägsna överflödigt FBS från de belagda rätterna och låt rätter att torka vid rumstemperatur (RT) för minst 1 h.
- Förbereda de tre cellsuspensioner: 1 x 106 HepG2 celler, 1 x 106 HepG2 celler med BMMSCs och 1 x 106 HepG2 celler med UCMSCs (i förhållandet 4:1 för både BMMSCs och UCMSCs).
- Utsäde lämpliga cellsuspensionen till varje märkt maträtt.
- Upphäva alla celler i DMEM odlingsmedium kompletteras med 10% FBS och 1% penicillin/streptomycin.
- Inkubera cellerna vid 37 ° C i en fuktad atmosfär som innehåller 5% CO2 och 95% luft.
2. cellen kalkylblad lösgörande
- Vid 100% cell confluence, tar rätterna ur 37 ° C inkubatorn.
- Inkubera HepG2 cell ark skålen för 1 h på RT, medan ruvning på HepG2/BMMSC och HepG2/UCMSC cell ark rätter för 30-40 min vid 20 ° C i en fuktad atmosfär som innehåller 5% CO2 och 95% luft.
Obs: Cellagret tillverkad av endast HepG2 är bräcklig; minska temperaturen till 20 ° C orsakar skador till strukturera av arket.
3. utförande av det kirurgiska ingreppet
Obs: Under inkubationstiden för cell ark avskildheten, börjar det animaliska förfarandet.
-
Instruktioner för beredning av området kirurgi
- Genomföra alla kirurgiska ingrepp i en steril separat område inom laboratoriet, såsom en huva, laminär skåp eller en aseptisk kirurgi rum. Se till att alla ytor av området kirurgi är icke-porösa, förseglade, tålig och sanitizable.
- Bär lämplig skyddsutrustning, inklusive scrubs, handskar, cyklop och huvud och sko överdrag.
- Använda kirurgiska verktyg som är rena och steriliserade (via autoklavering; mättade stem under högt tryck) i början av operationen.
- Ändra handskar mellan råttor.
-
Beredning av djuret för kirurgi
- Använd 8 - till 12-vecka-gammal naken råtta.
- Skapa injicerbara anestesi för råtta.
- För att förbereda anestesi lösningen, ketamin-xylazin, blanda 2 mL av ketamin, xylazin (vid en koncentration på 20 mg/mL) 1 mL och 1 mL steril fysiologisk koksaltlösning (t.ex., 0,9% natriumklorid) i en steril 10-mL serum samling injektionsflaska och skaka väl före använda.
- Tillämpa anestesi genom att injicera 0,2 mL ketamin-xylazin lösning per 100 g kroppsvikt råttans intraperitonealt.
Obs: Den totala dosen av lösningen är 100 mg/kg av ketamin och 10 mg/kg av xylazin.
- Ta bort synlig smuts/skräp från operationssåret.
- Kontrollera djup anestesi genom att testa pedal tillbakadragande reflexen (foten pad nypa på båda fötterna).
Obs: Om foten pad nypa orsakar en reaktion, upprepa med en dos av 0,05 mL/100 g (ungefär varje 30 min) och sedan dubbelgranska bedövningsmedel djupet. - Desinficera området kirurgi med en tvåstegs skrubb povidon-jod/isopropanol.
- Täcka råtta med en steril draperi att undvika kontaminering av snittet.
- Injicera råttorna subkutant med buprenorfin (0,01 - 0,05 mg/kg)8 innan snittet.
- Med en steril skalpell, göra en 7 till 10-cm skär mellan skinn och underliggande muskler för att exponera levern.
- Separera magmuskelstation från huden med platt bakre kanten av skalpell.
- Försiktigt hugg den linea alba med en skalpell och utöka skär med vass sax.
4. stamcellstransplantation ark
Obs: Ark stamcellstransplantation utförs på levern.
- Samla in cellagret från kultur skålen.
- Knacka försiktigt på kultur skålen över bänken att lossa bladet från dess yta.
- Separata cellagret från skålens yta genom att skrapa av kanten av arket i en halv cirkel med hjälp av en steril pipettspetsen.
- Ta försiktigt bort hela mediet från kultur skålen.
- Se till att bladet är intakt utan skador; Annars, det kan inte vara används (figur 1).
Obs: De resulterande ark kan upptäckas direkt av ögat.
- Förbereda ett sterilt membran (filterpapper) att skörda cellagret från skålen.
- Först, Blötlägg membranet med fysiologisk koksaltlösning. Ta sedan bort den överflödiga saltlösning med en steril bomullspad.
- Placera den våta membranen över cellagret, samtidigt undvika veck och luftbubblor mellan membranet och cellagret.
- Tillsätt några droppar fysiologisk koksaltlösning över membranet och cellagret att samla dem lättare.
Obs: För att undvika att bryta cellagret, Använd inte kallt saline och lyfta membranet och cellagret med pincett. - Lämna membranet i några sekunder för att säkerställa att cellagret är korrekt ansluten till membranet, och sedan samla det.
- Förbereda levern för ark stamcellstransplantation.
- Kontrollera att levern ytan är torr genom att knacka det med en steril bomullspad.
- Använd steril pincett, placera membranet med cellagret över en enstaka LOB av råttans levern.
- Tillsätt några droppar av steril koksaltlösning och tillämpa ett lätt tryck på membranet att lösgöra cellagret från den.
- Vänta 5 min innan du försiktigt tar bort membranet.
Obs: Detta görs för att säkerställa cellagret är korrekt ansluten till levern. - Slutligen, stänga de underliggande musklerna och hud snitt med 5-0 nylon suturer.
- Desinficera området kirurgi med povidonjod.
Obs: Figur 2 visar ett diagram över det cell ark transplantation förfarandet på levern på en naken råtta.
5. efter operationen vård
- Direkt efter operationen, hus råtta individuellt för att undvika kannibalism eller kvävning, och övervaka det regelbundet (minst var 15 min) tills det är medveten och fullt rörlig.
- Sedan bedöma råttorna dagligen för 5-14 d, minst 5 d postoperativt, för att säkerställa att det finns inga komplikationer. Under daglig bedömningen gör du följande.
- Såret är stängt och suturerna är intakt, utan att vara för snäv.
- Det finns inga tecken på infektion i snitt webbplatsen, till exempel värme, överdriven svullnad eller purulent ansvarsfrihet.
- Det finns inga tecken som är förknippad med smärta, såsom minskad mat och vattenförbrukning, viktminskning, uttorkning, huden tält eller snabb och öppen munandning. Att styra måttlig till svår smärta som efter operationen, om någon, injicera råttorna subkutant med buprenorfin (0,01 - 0,05 mg/kg) varje 6-8 h9 för minst 48-72 h postoperativt.
6. analys av det transplanterade området
- En månad efter transplantationen, scarifice råtta och samla det transplanterade området för histologiska och immunhistokemisk analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tumorigenicitetsprov transplanterade Cell ark i råttor:
En månad efter transplantationen, har alla transplanterade cell ark i råttornas lever utvecklat tumörer (figur 3). Den genomsnittliga storleken på de utveckla tumörerna från HepG2, HepG2/BMMSC och HepG2/UCMSC cell lakan var 4,5 cm, 4 cm och 2,5 cm, respektive10.
Histologisk analys av levern vävnader:
Hematoxylin och Eosin (H & E) färgning av icke-transplanterade råttor visade lever med hepatocyter ordnade i plattor som anastomose med varandra, och atomkärnor var runda, med en eller två framträdande nukleolerna. Däremot den tumör avsnitt samlas in visade kanterna på livskraftiga inflammerad och nekrotisk subkutan hepatocyter, med oregelbundna nukleära konturer och rensa degeneration (figur 4).
Figur 1: tillverkning av en cell bladet med en 3,5 cm temperatur-lyhörd kultur maträtt. (A) denna panel visar en skadad cellagret inte lämpar sig för transplantation. (B) denna panel visar en intakt cellagret, redo för transplantation. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Cell ark transplantation förfarande i naken råtta. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Tumör utvecklat på en råttas lever efter en månad av ark celltransplantation. Tumören genererades från (A), en HepG2 cellagret (storlek: 4,5 cm), (B), en HepG2 och BMMSC cell ark (storlek: 4 cm), och (C), en HepG2 och UCMSC cell ark (storlek: 2,5 cm). De blå cirklarna visar området tumör. Denna siffra har ändrats från tidigare publicerade arbete10. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Histologisk analys av en råttas levern. H & E färgning av en råttas levern, fyra veckor efter stamcellstransplantation ark. (A) denna panel visar normal råtta levern celler. (B) denna panel visar lever morfologi efter cancer celler transplantation. Den svarta pilen indikerar nedsatt cancer, de gröna pilarna visar normala hepatocyter, den blå pilen visar inflammerade celler och den orange pilen anger nekrotisk HCC celler. Skala staplarna visar 20 X förstoring. Denna siffra har ändrats från tidigare publicerade arbete10. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En omfattande mängd forskning är dedikerade till att utveckla en adekvat i vivo prekliniska djurmodell som liknar mänskliga cancerformer. För närvarande innebär de stora strategier som används för att skapa cancer djurmodeller genteknik och cell transplantation11. Genetiskt modifierade djurmodeller är bra verktyg för identifiering och validering av målgener, samt förstå de molekylära mekanismerna bakom läkemedelsinducerad toxicitet. Denna modell är dock associerade med vissa begränsningar. ändring av en viss gen leder exempelvis inte alltid i den förvänta fenotyp12. Metoden cell transplantation är mer vanligt förekommande att inducera cancer i djur, och det innebär injektion av cancer cellsuspension. Ändå, detta enkelt och bekvämt tillvägagångssätt har sina egna nackdelar. Generera en cellsuspension, används en enzymatisk nedbrytning steg att skörda cancercellerna. Detta resulterar i förlust av några av vidhäftning proteiner, vilket kommer att minska engraftment effektiviteten av de transplanterade cellerna. Därför finns det ingen garanti att transplanterade cancercellerna bildar cancervävnader, för att inte nämna svårigheten att kontrollera storleken på inducerade tumören. Detta tillvägagångssätt har dessutom en annan allvarlig nackdel, som är transplanterade cancerceller snabb övergång till den blodcirkulationen eller cell engraftment in icke öronmärkt organ13.
Roman cell ark tekniken utvecklades för att övervinna dessa nackdelar. Suzuki et al. 14 har skapat kolon, levern och bukspottkörteln tumör-bärande djur med metoden cancer cell ark transplantation. Vid jämförelse med tumörer som genereras via metoden cancer cell transplantation, var dessa tumörer större och stabilare. Implantation av en liten tumörvävnad i djuret att inducera en tumör är starkt beroende av användningen av en transplantation-metod som inte kräver en enzymatisk nedbrytning steg. Proteolytiska enzymer skada extracellulära matriser, som påverkar cell till cell i samspel. Cell ark teknik övervinner denna begränsning av metoden en invasiv skörd, att låta insamlingen av en intakt enskiktslager cellagret, tillsammans med dess associerade extracellulära matrix och tillväxtfaktorer15. Cell ark teknik möjliggör också långsiktiga engraftment16,17. Detta är av stort värde i in-vivo studier, där cellerna måste kunna engraft till värdens vävnad för hela perioden av vävnadens liv17. Dessutom, möjliggjort denna teknik utvecklingen av en ny metod för vävnadsteknik, utan användning av biologiskt nedbrytbara ställningar3,15. Detta tillvägagångssätt har dock fortfarande några begränsningar. När du använder cell ark tekniken, kan den centrala delen av den ympade vävnaden möjligen bli nekrotisk om transplantatet är för stor. Omvänt, framgång chansen av transplantation kan minskas om transplantatet är för liten. Dessutom, för att styra den efterföljande tillväxten av tumören, måste storleken på den transplanterade vävnaden vara enhetlig över alla experiment. Storleken på transplanterbara vävnaden är begränsad till 2 mm3 till följd av induktion av nekros på grund av den dåliga syre miljö18.
I denna studie skapats en HCC djurmodell har med hjälp av byggnadsställning-fri transplantation av cell ark. Tre typer av cell blad transplanterade i råttornas lever: en cell ark HCC cell linje celler, en cell ark HCC cell linje celler och BMSCs och en cellagret i HCC cell linje celler och UCMSCs. Transplantation av alla tre cell blad var tillräcklig för att inducera tumörer i mottagarens råttor. Dock noteras att lägga till MSCs på arket minskat storleken på bildas tumörer. Detta indikerar att de MSCs används, särskilt UCMSCs, har en negativ effekt på tumörutveckling. Avslutningsvis, erbjuder cancer cell ark transplantation en effektiv metod för att skapa en djurmodell med solida tumörer. Att ha sådana in-vivo -modeller kan leda till kritiska klinisk information med betydande program. Dessutom som framgår av tumör storleksminskning, begränsa UCMSCs tumörutveckling och förökning. Detta indikerar att vissa MSC undertyper kan användas i en cell-baserad strategi för behandling av cancer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka personalen av experimentell kirurgi och djur laboratorium vid College of Medicine, King Saud University, för deras samarbete och stöd-särskilt Hussain Almukhayzim och Hisham Aloudah. Författarna vill även berömma media teamet på King Saud bin Abdul-Aziz University för att förbereda visuellt material-särskilt Muath bin Ghannam och Abdulwahab Alsulami.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| FBS | Gibco/Invitrogen | 10270106 | |
| DMEM high glucose | Sigma | D5671-500ML | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technology | 15070063 | |
| Sterile physiologic saline | Sigma | S0817-1GA | |
| Human HepG2 cell line | ATCC, USA | HB-8065 | |
| Human bone marrow MSCs cell line | PromoCell, USA | C-12974 | |
| human umbilical cord tissue MSCs | PromoCell, USA | C-12971 | |
| Ketamine 50% | Rompun, Bayer | ||
| Xylazine 2% | Rompun | 23076-35-9 | |
| Alphadine® solution. | Riyadh Pharma | LBL0816 | |
| Disposables: | |||
| 15mL Polypropylene High Clarity PP Centrifuge Tube | Falcon | 352097 | |
| 3.5 cm sterile UpCell culture dishes with the filter paper (membrane) | Sigma | 174904-1CS | |
| 100-1000 µl Pipette Tips | Sigma | CLS4868-1000EA | |
| Basic Procedure Drape | Thermofisher | PMD5293.0 | |
| Equipment | |||
| Plus pipette, variable volume | Eppendorf® Research® | Z683779-1EA | |
| Tissue culture incubator 37 °C, 5% CO2 | Any brand | ||
| Biological safety cabinet | Any brand | ||
| Tissue culture incubator 20 °C, 5% CO2 | Any brand | ||
| Sterile surgical tools and nude rats: | |||
| Forceps | |||
| Scissors | |||
| scalpel | |||
| Nylon Suture 5-0 | Accutome | AB-3854S | Monofilament, Lancet |
| 1 ml Tuberculin Syringes | Fisher Scientific | 14-826-88 | |
| Nude rats | Charles river |
References
- Marra, M., et al. Molecular targets and oxidative stress biomarkers in hepatocellular carcinoma: an overview. Journal of Translational Medicine. 9, 171 (2011).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
- Kushida, A., et al. Decrease in culture temperature releases monolayer endothelial cell sheets together with deposited fibronectin matrix from temperature-responsive culture surfaces. Journal of Biomedical Materials Research. 45 (4), 355-362 (1999).
- Okano, T., Yamada, N., Sakai, H., Sakurai, Y. A novel recovery system for cultured cells using plasma-treated polystyrene dishes grafted with poly (N-isopropylacrylamide). Journal of Biomedical Materials Research Part A. 27 (10), 1243-1251 (1993).
- Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).
- Waterman, R. S., Tomchuck, S. L., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. A new mesenchymal stem cell (MSC) paradigm: polarization into a pro-inflammatory MSC1 or an Immunosuppressive MSC2 phenotype. PLoS One. 5 (4), e10088 (2010).
- Waterman, R. S., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. Mesenchymal stem cell 1 (MSC1)-based therapy attenuates tumor growth whereas MSC2-treatment promotes tumor growth and metastasis. PLoS One. 7 (9), e45590 (2012).
- Curtin, L. I., et al. Evaluation of buprenorphine in a postoperative pain model in rats. Comparative Medicine. 59 (1), 60-71 (2009).
- Nowland, M. H. Guidelines on Anesthesia and Analgesia in Rats - ULAM Guidelines and SOPs - Michigan Medicine Confluence. , https://wiki.med.umich.edu/display/ULAMGSOP/Guidelines+on+Anesthesia+and+Analgesia+in+Rats (2017).
- Alshareeda, A. T., Sakaguchi, K., Abumaree, M., Mohd Zin, N. K., Shimizu, T. The potential of cell sheet technique on the development of hepatocellular carcinoma in rat models. PLoS One. 12 (8), e0184004 (2017).
- Russo, J., Russo, I. H. Atlas and histologic classification of tumors of the rat mammary gland. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (2), 187-200 (2000).
- Lin, J. H. Applications and limitations of genetically modified mouse models in drug discovery and development. Current Drug Metabolism. 9 (5), 419-438 (2008).
- Driscoll, J. S. The preclinical new drug research program of the National Cancer Institute. Cancer Treatment Reports. 68 (1), 63-76 (1984).
- Suzuki, R., Aruga, A., Kobayashi, H., Yamato, M., Yamamoto, M. Development of a novel in vivo cancer model using cell sheet engineering. Anticancer Research. 34 (9), 4747-4754 (2014).
- Chen, G., et al. Application of the cell sheet technique in tissue engineering. Biomedical Reports. 3 (6), 749-757 (2015).
- Matsuura, K., Haraguchi, Y., Shimizu, T., Okano, T. Cell sheet transplantation for heart tissue repair. Journal of Controlled Release. 169 (3), 336-340 (2013).
- Matsuura, K., Shimizu, T., Okano, T. Toward the development of bioengineered human three-dimensional vascularized cardiac tissue using cell sheet technology. International Heart Journal. 55 (1), 1-7 (2014).
- Folkman, J. What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent? Journal of the National Cancer Institute. 82 (1), 4-6 (1990).
