Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para desenvolver um modelo câncer in vivo usando a tecnologia de célula de folha. Tal modelo poderia ser muito útil para a avaliação da terapêutica antineoplásica.
Abstract
Em vivo modelo animal que imita o câncer humano poderia ter vários aplicativos que oferecem informação clínica significativa. As técnicas atualmente utilizadas para o desenvolvimento de modelos de câncer na vivo tem limitações consideráveis. Portanto, neste estudo, pretendemos implementar tecnologia de folha de célula para desenvolver um modelo de câncer na vivo . Carcinoma hepatocelular (HCC) é desenvolvido com sucesso em ratos nus usando folhas de célula criadas a partir de células de linha celular HCC. Os lençóis de células de câncer são gerados através de adesão intracelular e a formação de uma estrutura estratificada, controlada pela matriz extracelular. Isto permite o transplante de folha do HCC para o fígado e a criação de um modelo animal de tumor-rolamento dentro de um mês. Além disso, o papel das células-tronco mesenquimais (MSC) no desenvolvimento deste modelo de câncer é investigado. Além da folha de linha celular HCC, outro folhas de duas células são criadas: uma folha de células HCC e medula óssea MSCs (BMMSCs) e uma folha de células HCC e cordão umbilical MSCs (UCMSCs). Folhas com uma combinação de células HCC e MSCs também são capazes de produzir um animal de tumor-rolamento. No entanto, a adição de MSCs reduz o tamanho do tumor formado, e esse efeito adverso sobre o desenvolvimento do tumor varia de acordo com fonte do MSCs usados. Isto indica que uma folha de células de determinados subtipos MSC poderia ser utilizada no controle e gerenciamento do tumor.
Introduction
HCC é um câncer primário do fígado que está significativamente associado um mau prognóstico. Anualmente, quase meio milhão novos pacientes são diagnosticados com HCC, representando 85% dos pacientes de câncer de fígado em todo o mundo1. Hepatocarcinogenesis não é uma doença de forma única; pelo contrário, é uma coleção de doenças que têm diferentes características histopatológicas e variabilidade genética e genômica, além de variados prognóstico resultados1. Portanto, os principais desafios no desenvolvimento de uma estratégia terapêutica eficaz para HCC são o limitado conhecimento da biologia HCC e a falta de um modelo animal experimental apropriado que pode ajudar a entender esta doença complexa. Em vivo modelo animal que imita o câncer humano é necessário para seleção de genes candidatos e identificar marcadores prognóstico/preditivo implicados na indução de câncer, bem como para a investigação de diferentes fatores que podem afetar respostas de câncer de agentes terapêuticos.
Estudos in vitro do câncer estão ainda associados com maiores limitações. Isto é devido ao fato de que as células cancerosas perdem muitas das suas características na vivo , quando mantidas em cultura. As mudanças que ocorrem em células em vitro resultado da ausência de fisiologia do tecido inteiro num cenário ex vivo . Interação de célula para célula de câncer (do estroma, imune, vascularização, epitelial, etc.) dentro do microambiente do tumor reflete muito sobre câncer célula características2. O microambiente do tumor pode alterar a expressão de gene/proteína de células de câncer e características fenotípicas, além de angiogenetic e potencial metastático. O sistema de cultura bidimensional (2D) em vitro também carece de uma matriz de tecido apropriado, o que é necessária regulamentar a progressão do tumor. Assim, devido a essas limitações, modelos em vivo devem sempre ser utilizados para apoiar as conclusões preliminares dos modelos em vitro . Neste estudo, nós usamos a tecnologia de folha de célula para desenvolver no vivo modelo animal que elucida o completo processo biológico subjacente HCC.
Mais de uma década atrás, laboratório do Okano estabeleceu um novo método de engenharia de tecidos, com base na célula folha tecnologia3. Esta técnica utiliza um plástico de cultura thermo-responsivo para permitir a aderência de célula reversível/destacamento controlando a hidrofobicidade de superfície. Este método permite uma suave colheita de culturas de células de formato um intacto tridimensional (3D) (folha i.e.,cell), com uma cuidada da matriz extracelular (ECM) e interações de célula para célula. A técnica de folha célula requer o precoating de pratos de cultura com uma temperatura-responsivo polímero poly(N-isopropylacrylamide) (sou de PIPA), que é comercialmente disponível e pronto para uso. A uma temperatura abaixo de 20 ° C, polímeros PIPA estou tornam-se hidratado e dissolve-se em soluções aquosas, Considerando que, a uma temperatura mais elevada (37 ° C), os polímeros tornar-se desidratado e transformam em um precipitado turvo. O polímero contém cadeias hidrofílicas de Amida e cadeias laterais hidrofóbicas (grupos de isopropil). Em altas temperaturas, o movimento browniano das moléculas de água se intensifica, Considerando que, em uma baixa temperatura, as moléculas de água circundantes isopropílico grupos do colapso da estrutura hidratado e os grupos hidrofóbico isopropílico agregar por causa de interações hidrofóbicas. Portanto, toda a cadeia do polímero agrega e precipita-se4.
No estudo apresentado, esta técnica é empregada para desenvolver um modelo animal de HCC, usando três folhas de célula diferente. A primeira folha de empregados é composto HCC célula linha células apenas, enquanto as outras duas folhas consistem em uma combinação de células de linha celular HCC e MSCs de duas fontes diferentes: MSCs da medula óssea (BMMSCs) e cordão umbilical MSCs (UCMSCs). MSCs são células do estroma não-hematopoiéticas que são capazes de diferenciar intocell derivados da linhagem mesenquimal, incluindo adipócitos, osteócitos, condrócitos e miócitos5. A razão pela qual que empregamos essas células, ao criar a camada de células de câncer é o relatórios inconsistentes sobre o efeito do MSCs em cânceres. Tem sido sugerido que o MSCs podem ter dois fenótipos distintos: "MSC1", um fenótipo de proinflammatory e "MSC2", um fenótipo imunossupressoras6. MSCs expressam receptores toll-like (TLRs). TLR4 escorva do MSCs aumenta sua secreção de fatores de proinflammatory, Considerando que o TLR3 escorva aumenta sua secreção de fatores imunossupressores6. Um estudo em vitro destes dois fenótipos relatou que uma cultura co de MSC1 com linhas de células de câncer atenuado o crescimento de células de câncer, enquanto MSC2 co-cultura teve o efeito oposto7. Isto implica que MSCs podem ser pro-câncer ou anticâncer, dependendo de seu fenótipo. Assim, além de desenvolver o modelo animal de HCC, usando a tecnologia de célula de folha, queremos explorar o efeito da MSC transplantes no desenvolvimento do tumor, e se usar essas células irão aumentar ou reduzir o desenvolvimento deste modelo.
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Protocol
O protocolo segue as diretrizes de cuidados com animais do Comité de ética da Universidade Rei Saud. Procedimentos cirúrgicos, anestésicos e outros medicamentos utilizados em animais são aprovados pelo Comitê de ética da Universidade Rei Saud. Todo o trabalho experimental é executado por pessoal adequadamente treinado.
1. célula folha construção
- Revestir os pratos de cultura (pratos de cultura responsiva a temperatura de 3,5 cm) com soro bovino fetal não diluído (FBS) e certifique-se de cobrir toda a superfície do prato.
Nota: Este passo é importante para o destacamento da camada de células, uma vez que suporta o crescimento das células em uma monocamada e impede a agregação de célula. - Incube os pratos por 24 h a 37 ° C numa atmosfera contendo 5% de CO2 e 95% ar umidificada.
- Retire o excesso FBS os pratos revestidos e permitir que os pratos secar à temperatura ambiente (RT) pelo menos 1 h.
- Preparar as suspensões de três celulares: 1 x 106 HepG2 células, 1 x 106 HepG2 células com BMMSCs e 1 x 106 HepG2 células com UCMSCs (em uma proporção de 4:1 para BMMSCs e UCMSCs).
- A suspensão de célula apropriada para cada prato rotulado de semente.
- Suspenda todas as células em cultura DMEM suplementado com 10% FBS e 1% penicilina/estreptomicina.
- Incube as células a 37 ° C numa atmosfera contendo 5% de CO2 e 95% ar umidificada.
2. célula folha de desprendimento
- Na confluência de célula de 100%, se os pratos da incubadora a 37 ° C.
- Incube o prato de folha de célula HepG2 por 1h no RT, ao mesmo tempo incubando o HepG2/BMMSC e pratos de folha de célula HepG2/UCMSC por 30-40 min, a 20 ° C numa atmosfera contendo 5% de CO2 e 95% ar umidificada.
Nota: A camada de células feita a partir apenas de HepG2 é frágil; reduzindo a temperatura a 20 ° C provoca danos à estrutura da folha.
3. desempenho do procedimento cirúrgico
Nota: Durante o tempo de incubação para o destacamento de folha do celular, inicie o tratamento de animais.
-
Instruções para a preparação da área de cirurgia
- Realizar todos os procedimentos cirúrgicos em uma área estéril separada dentro do laboratório, como um capuz, fluxo laminar ou uma sala de cirurgia asséptica. Certifique-se de que todas as superfícies da área de cirurgia são não-poroso, selado, durável e sanitizable.
- Use equipamento de proteção adequado, incluindo avental, luvas, máscaras e cabeça e sapato cobre.
- Uso cirúrgico ferramentas que são limpo e esterilizado (através de autoclavagem; haste saturada sob alta pressão) no início da cirurgia.
- Mudar as luvas entre ratos.
-
Preparação do animal para a cirurgia
- Use ratos nus de 8 a 12 semanas de idade.
- Crie a anestesia injetável para ratos.
- Para preparar a solução de anestesia, xilazina-cetamina, misture 2 mL de cetamina, 1 mL de xilazina (em uma concentração de 20 mg/mL) e 1 mL de salina fisiológica estéril (por exemplo, 0,9% de cloreto de sódio) em um frasco de coleta estéril 10 mL de soro e agite bem antes de Use.
- Para aplicar anestesia, injete intraperitonealmente 0,2 mL da solução de xilazina-cetamina por 100 gramas de peso do corpo do rato.
Nota: A dose total da solução é de 100 mg/kg de ketamina e 10 mg/kg de xilazina.
- Remova sujeira/sujidade visível do local cirúrgico.
- Verifique a profundidade da anestesia por testar o reflexo de retirada de pedal (pitada de almofada de pé sobre as duas patas traseiras).
Nota: A pitada de almofada do pé provoca uma resposta, repetir na dose de 0,05 mL/100 g (aproximadamente a cada 30 min), se volte a verificar a profundidade anestésica. - Desinfete a área de cirurgia com uma esfoliação de dois estágios por povidone-iodo/isopropanol.
- Cobrir o rato com um pano estéril para evitar a contaminação da incisão.
- Injetar os ratos por via subcutânea com buprenorfina (0,01 - 0,05 mg/kg)8 antes de fazer a incisão.
- Usando um bisturi estéril, fazer um 7 para 10-cm corte entre a pele e os músculos subjacentes para expor o fígado.
- Separe o músculo abdominal da pele com a parte traseira lisa borda do bisturi.
- Cuidadosamente a esfaquear o linea alba usando um bisturi e estender o corte com tesoura afiada.
4. célula folha transplante
Nota: O transplante de células folha é realizado no fígado.
- Recolha a camada de células da placa de cultura.
- Bata levemente o prato de cultura sobre o banco para retirar a folha de sua superfície.
- Separe a camada de células da superfície do prato raspando a borda da folha em um meio círculo, usando a ponta da pipeta estéril.
- Suavemente retire o meio inteiro o prato de cultura.
- Garantir que a folha está intacta, sem nenhum dano; caso contrário, não pode ser usado (Figura 1).
Nota: As folhas resultantes podem ser detectadas diretamente pelo olho.
- Prepare uma membrana esterilizada (papel de filtro) para colher a folha célula do prato.
- Primeiro, embeba a membrana com solução salina normal. Em seguida, retire o soro em excesso com uma almofada de algodão estéril.
- Coloque a membrana molhada sobre a camada de células, evitando dobras e bolhas de ar entre a membrana e a camada de células.
- Adicione algumas gotas de solução salina sobre a membrana e a camada de células para coletá-los mais fácil.
Nota: Para evitar quebrar a camada de células, não utilize soro fisiológico frio e levantar a membrana e a camada de células com fórceps. - Embora a membrana por alguns segundos garantir que a camada de células é bem presas à membrana e depois cobrá-lo.
- Prepare o fígado para transplante de células folha.
- Certifique-se que a superfície do fígado é seca tocando-o suavemente com uma almofada de algodão estéril.
- Usando a pinça estéril, coloque a membrana com a camada de células sobre um único lóbulo do fígado do rato.
- Adicione algumas gotas de solução salina estéril e aplique uma ligeira pressão à membrana para separar a camada de células dele.
- Espere 5 minutos antes de remover cuidadosamente a membrana.
Nota: Isto é feito para garantir que a camada de células está bem colocada para o fígado. - Finalmente, fechar os músculos subjacentes e a pele incisões com suturas de nylon 5-0.
- Desinfete a área de cirurgia com iodo-povidona.
Nota: A Figura 2 mostra um diagrama do processo de transplante de células folha no fígado de rato nude.
5. cuidados pós-operatório de
- Imediatamente após a cirurgia, o rato individualmente para evitar canibalismo ou asfixia de casa e monitorá-lo regularmente (pelo menos a cada 15 min) até que seja consciente e totalmente ambulant.
- Em seguida, avalie os ratos diariamente por 5-14 d, pelo menos 5 d no período pós-operatório, para garantir que não há nenhuma complicação. Durante a avaliação diária, certifique-se do seguir.
- A ferida é fechada, e as suturas estão intactas, sem ser excessivamente apertado.
- Não há sinais de infecção no local da incisão, tais como calor, excessiva descarga purulenta ou inchaço.
- Não há sinais associados com dor, tais como o reduzido consumo de comida e água, perda de peso, desidratação, pele acampar ou respiração rápida e aberto. Para controle de moderada a severa dor depois da cirurgia, se for o caso, injete os ratos por via subcutânea com buprenorfina (0,01 - 0,05 mg/kg) cada 6-8 h9 por um período mínimo de 48 a 72 h no pós-operatório.
6. análise da área transplantada
- Um mês após o transplante, scarifice o rato e recolher a área transplantada para histológica e análise imuno-histoquímica.
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Representative Results
Tumorigenicidade de lençóis de células transplantadas em ratos:
Um mês após o transplante, todas as folhas de célula transplantado em fígados de ratos desenvolveram tumores (Figura 3). O tamanho médio dos tumores desenvolvidos de HepG2, HepG2/BMMSC e folhas de célula HepG2/UCMSC foram 4,5 cm, 4 cm e 2,5 cm, respectivamente,10.
Análise histológica de tecidos de fígado:
Hematoxilina e eosina (H & E) coloração de ratos transplantados não mostrou fígados com hepatócitos dispostos em placas que se anastomosam com os outros, e os núcleos eram redondos, com um ou dois nucléolos proeminentes. Em contraste, as seções de tumor coletadas mostraram bordas de viáveis hepatócitos subcutâneos inflamados e necróticos, com contornos nucleares irregulares e limpar degeneração (Figura 4).
Figura 1: fabricação de uma camada de células usando um prato de cultura responsiva a temperatura de 3,5 cm. (A), este painel mostra uma camada de células danificadas não são adequadas para transplante. (B), este painel mostra uma folha de célula intacto, pronta para o transplante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Célula procedimento de transplante de folha em ratos nus. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Tumor desenvolvido no fígado de ratos após um mês de transplante de células folha. O tumor foi gerado a partir da camada de células (A), um HepG2 (tamanho: 4,5 cm), (B) uma célula HepG2 e BMMSC folha (tamanho: 4 cm) e (C) uma célula HepG2 e UCMSC folha (tamanho: 2,5 cm). Os círculos azuis mostram a área do tumor. Esta figura foi modificada de trabalho anteriormente publicado10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Análise histológica do fígado de um rato. H & E mancha de fígado de ratos, quatro semanas após o transplante de células folha. Células de fígado de ratos (A), este painel mostra normal. (B), este painel mostra a morfologia hepática após transplante de células de câncer. A seta preta indica câncer hepático, as setas verdes indicam hepatócitos normais, a seta azul indica células inflamadas e a seta laranja indica necróticas células HCC. As barras de escala indicam ampliação de 20 X. Esta figura foi modificada de trabalho anteriormente publicado10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Uma extensa quantidade de pesquisa é dedicada ao desenvolvimento de um adequada na vivo pré-clínicos modelo animal que se assemelha a cânceres humanos. Atualmente, as principais abordagens usadas para criar modelos animais câncer envolvem engenharia genética e células de transplantação11. Modelos de animais geneticamente modificados são boas ferramentas para a identificação e validação de genes-alvo, bem como compreender os mecanismos moleculares subjacentes a toxicidade induzida por drogas. No entanto, este modelo está associado com algumas limitações; por exemplo, a modificação de um determinado gene não sempre resulta no fenótipo antecipado12. A abordagem de transplante de células é mais comumente usada para induzir câncer em animais, e envolve a injeção de suspensão de células de câncer. No entanto, esta abordagem simples e conveniente tem suas próprias desvantagens. Para gerar uma suspensão de células, uma etapa de digestão enzimática será usada para colher as células cancerosas. Isto resulta na perda de algumas das proteínas de adesão, o que reduzirão a eficiência da enxertia das células transplantadas. Portanto, não há nenhuma garantia de que as células cancerosas transplantado irão formar tecidos cancerosos, sem mencionar a dificuldade de controlar o tamanho do tumor induzido. Além disso, esta abordagem tem outra desvantagem séria, que é a transição rápida de células de câncer transplantado para a circulação sanguínea ou enxertia de células em órgãos não específico13.
A tecnologia de folha de célula romance foi desenvolvida para superar estas desvantagens. Suzuki et al . 14 ter criado com êxito, cólon, fígado e pâncreas tumor-rolamento animais usando o método de transplante de folha de célula de câncer. Quando comparado com tumores gerados via o método de transplante de células de câncer, estes tumores eram maiores e mais estável. A implantação de um tecido pequeno tumor em um animal para induzir um tumor é altamente dependente do uso de um método de transplante que não requer uma etapa de digestão enzimática. Enzimas proteolíticas danificar matrizes extracelulares, que afeta a interação célula a célula. Tecnologia de célula de folha supera essa limitação do uso de um método de colheita invasivo, permitindo a recolha de uma camada de células monocamada intacta, juntamente com seu associado de matriz e fatores de crescimento extracelular15. Tecnologia de célula de folha permite também a longo prazo enxertia16,17. Isto é de grande valor em estudos em vivo , onde as células devem ser capazes de engraft no tecido do hospedeiro durante todo o período de vida17 do tecido. Além disso, esta técnica permitiu o desenvolvimento de um novo método de engenharia de tecidos, sem a utilização de andaimes biodegradável3,15. No entanto, essa abordagem ainda tem algumas limitações. Ao usar a técnica de folha de célula, a parte central do tecido enxertado pode possivelmente tornar-se necrótico se o enxerto é muito grande. Por outro lado, a chance de sucesso do transplante pode ser reduzida se o enxerto é muito pequeno. Além disso, a fim de controlar o crescimento subsequente do tumor, o tamanho do tecido transplantado deve ser uniforme em todos os experimentos. O tamanho do tecido para transplante é limitado a 2 mm3 como resultado a indução de necrose devido a pobre oxigênio ambiente18.
Neste estudo, um modelo animal de HCC foi criado com êxito usando o transplante livre de andaime de folhas de célula. Três tipos de folhas de célula foram transplantados para fígados dos ratos: uma camada de células de HCC células da linha de células, uma camada de células de HCC células de linha e BMSCs de células e uma camada de células de HCC celular células de linha e UCMSCs. O transplante de todas as folhas de três células foi suficiente para induzir tumores em ratos de destinatário. No entanto, observou-se que adicionar MSCs à folha reduziu o tamanho dos tumores formados. Isso indica que o MSCs usados, especialmente UCMSCs, tem um efeito adverso sobre o desenvolvimento do tumor. Para concluir, o transplante de células da folha de câncer oferece um método eficiente para criar um modelo animal com tumores sólidos. Ter tais modelos na vivo poderia resultar em informações clínicas críticas com aplicações consideráveis. Além disso, como aparente por meio da redução de tamanho do tumor, UCMSCs limitar a propagação e desenvolvimento do tumor. Isso indica que alguns subtipos MSC podem ser usados em uma abordagem baseada em célula para o tratamento de câncer.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores gostaria de agradecer a equipe de Cirurgia Experimental e laboratório de Animal da faculdade de medicina, rei Saud Universidade, pela sua cooperação e apoio-especialmente Hussain Almukhayzim e Hisham Aloudah. Os autores também gostaria de reconhecer a equipe de mídia da rei Saud bin Abdul-Aziz University para preparar o visual material-especialmente Muath bin Ghannam e Abdulwahab Alsulami.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| FBS | Gibco/Invitrogen | 10270106 | |
| DMEM high glucose | Sigma | D5671-500ML | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technology | 15070063 | |
| Sterile physiologic saline | Sigma | S0817-1GA | |
| Human HepG2 cell line | ATCC, USA | HB-8065 | |
| Human bone marrow MSCs cell line | PromoCell, USA | C-12974 | |
| human umbilical cord tissue MSCs | PromoCell, USA | C-12971 | |
| Ketamine 50% | Rompun, Bayer | ||
| Xylazine 2% | Rompun | 23076-35-9 | |
| Alphadine® solution. | Riyadh Pharma | LBL0816 | |
| Disposables: | |||
| 15mL Polypropylene High Clarity PP Centrifuge Tube | Falcon | 352097 | |
| 3.5 cm sterile UpCell culture dishes with the filter paper (membrane) | Sigma | 174904-1CS | |
| 100-1000 µl Pipette Tips | Sigma | CLS4868-1000EA | |
| Basic Procedure Drape | Thermofisher | PMD5293.0 | |
| Equipment | |||
| Plus pipette, variable volume | Eppendorf® Research® | Z683779-1EA | |
| Tissue culture incubator 37 °C, 5% CO2 | Any brand | ||
| Biological safety cabinet | Any brand | ||
| Tissue culture incubator 20 °C, 5% CO2 | Any brand | ||
| Sterile surgical tools and nude rats: | |||
| Forceps | |||
| Scissors | |||
| scalpel | |||
| Nylon Suture 5-0 | Accutome | AB-3854S | Monofilament, Lancet |
| 1 ml Tuberculin Syringes | Fisher Scientific | 14-826-88 | |
| Nude rats | Charles river |
References
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