Summary
نحن نقدم استئصال الثدي الجذري ونموذج سرطان الثدي مورين أورثوتوبيك مع تقنية الإضاءة الحيوية لتقدير عبء الورم لمحاكاة تطور سرطان الثدي البشرية.
Abstract
ماوس المجراة في نماذج لتقييم تطور سرطان الثدي ضرورية لبحوث السرطان، بما في ذلك التطورات العقاقير السريري. ومع ذلك، يتم حذف معظم التفاصيل العملية والتقنية عادة في نشر المخطوطات التي، لذلك، يجعل من تحدي إعادة إنتاج النماذج، وبخاصة عندما تنطوي على التقنيات الجراحية. تسمح تكنولوجيا الإضاءة الحيوية لتقييم كميات صغيرة من الخلايا السرطانية حتى عندما لا يكون وجود ورم محسوس. استخدام التعبير عن لوسيفراس الخلايا السرطانية، نقوم بإنشاء تقنية تطعيم أورثوتوبيك سرطان الثدي بنسبة توموريجينيسيس عالية. ورم خبيث في الرئة ويتم تقييم استخدام أسلوب السابقين فيفو . ثم، نحن، وضع نموذج استئصال الثدي بمعدل تكرار منخفض محلية لتقييم عبء الورم المنتشر. هنا، يصف لنا، بالتفصيل، التقنيات الجراحية لزرع أورثوتوبيك واستئصال الثدي لسرطان الثدي بنسبة توموريجينيسيس عالية ومعدلات تكرار المحلية منخفضة، على التوالي، لتحسين كفاءة نموذج سرطان الثدي.
Introduction
نماذج حيوانية تلعب دوراً رئيسيا في أبحاث السرطان. عندما ثبت فرضية في المختبر، فإنه ينبغي اختبار المجراة لتقييم أهميتها السريرية. وتطور سرطان خبيث يتم التقاطها غالباً أفضل من النماذج الحيوانية مقارنة بنماذج في المختبر، ومن الضروري لاختبار دواء جديد في نموذج حيوان كدراسة الإكلينيكية للمخدرات التنمية1،2. بيد أن التفاصيل التقنية للتجارب على الحيوانات غالباً ما ليست وصفاً جيدا في المواد المنشورة، ويجعلها صعبة استخراج النموذج بنجاح. في الواقع، ذهب المؤلفون الذين قاموا بتأسيس هذه النماذج التطعيم واستئصال الثدي أورثوتوبيك من خلال عمليات طويلة وصارمة من التجربة والخطأ. دراسة معدل نجاح tumorigenesis بعد تلقيح خلايا السرطان هو أحد العوامل الرئيسية تحديد مدى نجاح وكفاءة الحيوان3. خط الخلية والعدد من الخلايا لتطعيم وتلقيح الموقع والسلالة من الفئران، كلها عوامل هامة. فمن المعروف جيدا أن هناك اختلافات كبيرة في نتائج التجارب على الحيوانات بسبب الفروق الفردية، مقارنة بتقنيات في المختبر. ولذلك، باستخدام نموذج راسخة مع تقنية قياسية من المهم الحصول على نتائج مستقرة، لتحسين الكفاءة التجارب على الحيوانات، وتجنب نتائج مضللة.
وتقدم هذه الورقة تقنيات راسخة4 لتوليد نماذج الماوس أورثوتوبيك واستئصال سرطان الثدي. تهدف هذه الأساليب 1) تحاكي تطور سرطان الثدي البشرية ودورات العلاج، و 2) لإجراء تجارب في المجراة مع قدر أكبر من الكفاءة ومعدلات نجاح أعلى مقارنة بتقنيات استئصال الثدي أو تطعيم سرطان الثدي الأخرى. في تلقيح خلايا السرطان أورثوتوبيك، لمحاكاة تطور سرطان الثدي البشرية، نختار اللوحة #2 الدهون الثديية كموقع لتطعيم، الذي يقع في الصدر. وفي معظم الدراسات، يتم تلقيح خلايا سرطان الثدي تحت الجلد5. هذا الأسلوب لا يتطلب عملية جراحية، وهكذا، بسيط ومباشر. ومع ذلك، المكروية تحت الجلد يختلف تماما عن المكروية الغدة الثديية، الذي يؤدي إلى تطور سرطان مختلفة وملامح الجزيئية حتى6،7. استخدام بعض الدراسات الغدة الثديية #4، الذي يقع في البطن، كما موقع تطعيم6. لكن منذ #4 الغدد الثديية الموجودة في البطن، هو النمط المنتشر الأكثر شيوعاً سرطاني البريتوني7، الذي يحدث مع أقل من 10 في المائة من سرطان الثدي المنتشر8. سرطان الثدي التي تولدها هذه التقنية المقدمة هنا، في الغدة الثديية #2، مستطير للرئة، وواحد من المواقع المنتشر من سرطان الثدي الأكثر شيوعاً9.
مع هذا الأسلوب، الهدف أيضا لتحقيق معدل أعلى tumorigenesis مع تقلب حجم الورم أقل مقارنة بغيرها من تقنيات التطعيم سرطان الثدي. للقيام بذلك، يتم تلقيح خلايا السرطان قد علقت في خليط بروتين هلامية تحت الرؤية المباشرة من خلال شق جدار صدر أمامي متوسط. ينتج هذا الأسلوب بمعدل توموريجينيسيس عالية مع أقل تغير في حجم الورم والشكل مقارنة بالحقن تحت الجلد أو غير الجراحية، كما ذكر سابقا3،7.
ونحن أيضا إدخال تقنية استئصال الثدي جذري ماوس الذي هو مستأصل أورثوتوبيك الثدي الورم مع الأنسجة المحيطة به والعقد الليمفاوية إبطي. في الإعداد السريرية، هو مستوى الرعاية لمرضى سرطان الثدي مرض خبيث البعيدة دون استئصال الثدي10،11. قبل عملية استئصال الثدي، يتم مسح الانبثاث العقدة الليمفاوية إبطي بالتصوير والحارس خزعة العقدة الليمفاوية. إذا لم يكن هناك أي دليل على وجود ورم خبيث إبطي العقدة الليمفاوية، ثم يعالج المريض باستئصال الثدي التام أو الجزئي، الذي تم حذف استئصال العقدة الليمفاوية إبطي. استئصال الثدي التام تقنية للالتئام سرطان الثدي مع أنسجة الثدي كله كتلة، بينما يتم استئصال الثدي الجزئي الالتئام سرطان الثدي مع هامش المحيطة بأنسجة الثدي الطبيعية فقط، وبالتالي المحافظة على أنسجة الثدي الطبيعية المتبقية في المريض. ومع ذلك، تتطلب المرضى الذين الحفاظ على بقاء أنسجة الثدي الطبيعية بعد عملية استئصال الثدي جزئي العلاج الإشعاعي بعد الجراحة لتجنب تكرار المحلية10. المرضى الذين يعانون من ورم خبيث إبطي العقدة الليمفاوية القيام باستئصال الثدي الجذري الذي يزيل سرطان الثدي مع عادي جميع الثدي الليمفاوية الابطية والأنسجة، وغزت الأنسجة أون الكتلة10،11. في طراز الماوس، مراقبة للإشعاع إبطي العقدة الليمفاوية خبيث و/أو مرحلة ما بعد المنطوق ليس معقولاً أو ممكناً. وهكذا، فنحن نستخدم تقنية استئصال الثدي الجذري لتجنب الانبثاث العقدة الليمفاوية المحلية أو إبطي.
سرطان الخلية التطعيم عن طريق الوريد الذيل هو الأكثر شيوعاً الرئة ورم خبيث الماوس نموذج12، ما يسمى "ورم خبيث التجريبية". هذا النموذج من السهل أن تولد ولا تتطلب عملية جراحية؛ ومع ذلك، لا تقليد تطور سرطان الثدي البشرية مما قد يتسبب في سلوك المرض المنتشر مختلفة. من أجل محاكاة دورة علاج سرطان الثدي البشرية حيث غالباً ما يحدث بعد استئصال الثدي ورم خبيث، تتم إزالة الورم الرئيسي بعد تلقيح خلايا السرطان أورثوتوبيك. هذا الأسلوب تنتج أقل تكرار المحلية مقارنة باستئصال ورم بسيط، كما ذكر سابقا13، وهو مفيد لرواية المداواة، الدراسات الإكلينيكية، ودراسات أبحاث سرطان الثدي المنتشر. وتطبق الأساليب الموصوفة هنا لمعظم تجارب نموذجية أورثوتوبيك سرطان الثدي. ومع ذلك، من المهم أن تنظر أن خليط البروتين هلامية يمكن أن تؤثر المكروية والجراحة يمكن أن تؤثر على الاستجابة المناعية الإجهاد/14. ولذلك ينبغي تدرك إمكانات عوامل الالتباس المحققين يدرسون المكروية و/أو الاستجابة المناعية الإجهاد/.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم الحصول على الموافقة من روزويل بارك سرطان مركز المؤسسية الحيوان الرعاية الشاملة واستخدام اللجنة لجميع التجارب.
ملاحظة: يتم الحصول على تسعة إلى اثني عشر أسبوعا من العمر الإناث بالب/ج الفئران. وتستخدم الخلايا 4T1-luc2، ماوس غدية الثديية خلية خط المستمدة من بالب/ج الفئران التي تم إجراء هندسة عكسية للتعبير عن لوسيفراس،. تستزرع هذه الخلايا في المتوسط 1640 معهد ميموريال بارك في روزويل (ربمي) مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS).
1-إعداد الصكوك
- ذوبان الجليد خليط بروتين هلامية مجمدة (مثلاً، ماتريجيل) على الجليد في غطاء زراعة الأنسجة.
- تنظيف والاوتوكلاف مجموعتين من الأدوات الجراحية (ميكروديسيكتيون المقص والملقط أدسون حامل إبرة) قبل الجراحة. إعداد معقمة 5-0 خيوط الحرير والجاف المعقمات (عند التخطيط للعمليات الجراحية المسلسل).
- مقطع شعر الصدر الأوسط الفئران باستخدام ماكينة ومارك الفئران لتحديد الهوية باللكم الإذن قبل وقت الجراحة.
-
إعداد جدول الإجراءات، التي يمكن استخدامها فورا للعملية.
- انتشار جهاز pad ماصة وإصلاح الزوايا مع الشريط وإصلاح المخروطات التخدير مع الشريط، وضع المعقمات والمطهرات (الكلورهكسيدين واليود الإيثانول 75%) بجوار مساحة التشغيل ووضع الفئران في عملية النظام.
2-إعداد الخلايا (بالنسبة للفئران 10)
ملاحظة: يجب تلقيح الخلايا ضمن ح 1 بعد يجري فصل من الطبق لتجنب بقاء الخلية انخفض. على وجه التحديد، ينبغي أن مختلطة تعليق خلية في خليط البروتين هلامية خلال 15 دقيقة بعد فصل الخلايا من طبق للحفاظ على قدرتها على البقاء.
- الثقافة الخلايا 4T1-luc2، وخط خلية غدية الثديية ماوس معربا عن لوسيفراس، في وسائل الإعلام RPMI 1640 مع 10% FBS في حاضنة هوميديفيد عند 37 درجة مئوية في شركة 5%2.
- تغسل الخلايا ملتصقة 4T1-luc2 في صحن 10 سم مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) باستخدام ماصة مصلية من 10 مل. إضافة 1 مل من 0.25% التربسين استخدام ماصة P1000، وثم احتضان العينة في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. ثم قم بإضافة 4 مل وسائط النمو (1640 RPMI مع 10% FBS) استخدام 5 مل مصلية "الماصة؛" ونقل تعليق خلية إلى أنبوب مخروطي 15 مل في غطاء زراعة الأنسجة. الطرد المركزي بتعليق خلية في 180 x ز لمدة 5 دقائق.
- نضح المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في 2 مل من برنامج تلفزيوني؛ بعد ذلك، عد الخلايا باستخدام في هيموسيتوميتير.
- تعليق 2 × 106 4T1-luc2 الخلايا في 40 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني الباردة (درجة الحموضة 7.4، 4 درجة مئوية) في هود زراعة الأنسجة.
- يخلط تعليق خلية 40 ميكروليتر ميكروليتر 360 من خليط البروتين هلامية في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل على الجليد في هود زراعة الأنسجة.
ملاحظة: أن تركيز النهائي 1 × 10520 ميكروليتر (PBS 1:9: خليط البروتين هلامية). لنموذج أورثوتوبيك (لا استئصال الثدي)، استخدمت 1 × 10420 ميكروليتر من تركيز النهائي، لتجنب الوصول إلى معايير القتل الرحيم (ورم حجم > 2 سم) خلال أسبوعين.
3-سرطان الخلية تلقيح
- وضعت الفئران في قاعة تحريض التخدير مع تدفق الأوكسجين isoflurane و 0.2 لتر في الدقيقة 2-4% حتى الفئران التنفس بهدوء (2-3 دقيقة).
- أمسك الماوس وحقن البوبرينورفين 0.05 مغ/كغ على الكتف تحت الجلد.
- تأكيد التخدير الكافي بعدم وجود رد فعل لقرصة أخمص القدمين. إدراج الآنف الماوس في الحفرة قناع الماوس، والذي يسمح للتخدير استنشاق مع إيسوفلوراني 2-4% وتدفق الأوكسجين 2 لتر في الدقيقة المرفقة إلى وحدة اسطوانة فحم.
- تقييد أطرافهم الماوس استخدام الشريط مختبر وتعقيم الجلد باستخدام الإيثانول 75%، باستخدام مسحات القطن الكلورهيكسيدين واليود.
- جعل شق جلد 5 ملم في منتصف جدار الصدر الأمامي استخدام مقص ميكروديسيكشن العقيمة، رفع الجانب الأيمن الجلد بجوار الشق وفصل الجلد من جدار الصدر باستخدام المقص، وثم، عكس الجلد لفضح الحق #2 لوحة الدهون الثديية.
- حقن 20 ميكروليتر من تعليق خلية السرطان باستخدام حقنه الأنسولين 1 مل بإبرة ز 28.5 في لوحة الدهون تحت الرؤية المباشرة من خلال الجرح بعناية.
ملاحظة: الإبرة يمر الجرح، لا الجلد. تبقى عقد الإبرة في لوح الدهون 5 s قبل أن يسحب بها، مما يتيح وقتاً لخليط البروتين هلامية ترسيخ. - إغلاق شقوق الجلد بخياطة، استخدام خيوط عقيمة 5-0 غير-قابلة للامتصاص.
- بعد الجراحة، وإرجاع الحيوانات إلى قفص نظيف ورصد لهم حتى أنهم استعادوا وتتحرك بحرية (بعد ~ 1 – 2 دقيقة). إذا لم يظهر حيوان بصحة جيدة خلال 24 ساعة من عملية جراحية، إدارة البوبرينورفين (0.2 مغ/كغ).
- إزالة خيوط تحت التخدير (راجع الخطوة 3.1) د 7 بعد الجراحة.
4-استئصال الثدي
ملاحظة: توقيت استئصال الثدي مهم جداً. إذا كان يتم ذلك في وقت مبكر جداً، لم يحدث ورم خبيث في الرئة. إذا كان يتم ذلك في وقت متأخر جداً، غزت الورم الابتدائي الأوعية الدموية الكبرى، التي تجعل من استئصال الأورام كاملة تحديا. وهكذا، تم اختبار نقاط زمنية متعددة لاستئصال الثدي لتحديد النقطة الزمنية التي أنتجت التوازن المناسب في انتظار ورم خبيث قبل بتر أصبحت صعبة جداً. بعد القيام بذلك في ما يزيد على 50 الماوس التجارب، اتضح أن استئصال الثدي في 8 أيام بعد تلقيح خلايا السرطان (أو عندما يصل حجم الورم إلى 5 ملم) كان المثل الأعلى الوقت نقطة تحقيق توازن بين13.
- تخدير ماوس مع إيسوفلوراني 2-4 ٪ استنشاقه وحقن البوبرينورفين (انظر الخطوات 3.1 و 3.2).
- كبح جماح الماوس وتعقيم الجلد (راجع الخطوة 3، 4).
- جعل شق جلد مم 5 مم 2 إلى اليسار من الندبة الجراحية التي تم إجراؤها في تلقيح خلايا السرطان الأولى، استخدام مقص ميكروديسيكشن. تمديد الشق نحو الجذر من فوريليمب لإزالة الورم، والجلد بما في ذلك الندبة الجراحية، والآفة على اتصال الورم، فضلا عن حوض إبطي العقدة الليمفاوية فيه معظم الوقت لا تظهر العقدة الليمفاوية موجودة في الوقت ماستيكت omy13. تأكد من عدم تلف الوريد الابطي.
- إغلاق عيوب الجلد بخياطة، استخدام خيوط غير الامتصاص العقيمة 5-0 في شكل "Y".
- هي نفسها كما في الخطوة 3، 8، العودة الماوس إلى القفص نظيفة ومراقبة حتى أنهم استعادوا.
- إزالة خيوط تحت التخدير (راجع الخطوة 3.1) 7 أيام بعد الجراحة.
5-طرحه الكمي للورم الرئيسي (التطعيم أورثوتوبيك دون استئصال الثدي) أو ورم خبيث في الرئة (استئصال الثدي نموذج)
ملاحظة: لتحديد مقدار العبء الورم الرئيسي، هو الإضاءة الحيوية قياس 2 × مدة أسبوع اعتبارا من اليوم بعد التطعيم أورثوتوبيك. للرئة ورم خبيث الكمي، هو الإضاءة الحيوية قياس 2 × مدة أسبوع اعتبارا من اليوم التالي استئصال الثدي.
- حل لوسيفرين د في الفوسفات مخزنة المالحة دولبيكو (دببس) إلى تركيز نهائي 15 ملغ/مل في غطاء زراعة الأنسجة. اليكووت فالي ميكروسينتريفوجي محمية من الضوء 1.5 مل أنابيب. مخزن الحل المخفف في-80 درجة مئوية.
ملاحظة: ماوس ز 20، مطلوب 200 ميليلتر من لوسيفرين د المخفف. - افتح برنامج أخذ الصور، ثم انقر فوق تهيئة.
ملاحظة: يستغرق حوالي 15 دقيقة لتبرد جهاز اقتران (CCD). عندما يصل اتفاقية مكافحة التصحر إلى درجة الحرارة المحددة، يتغير لون شريط درجة الحرارة من اللون الأحمر إلى الأخضر. - تخدير الفئران مع إيسوفلوراني 2-4% في غرفة مخصصة التعريفي قبل التصوير (راجع الخطوة 3.1).
- وزن الفئران.
- ضخ 150 مغ/كغ لوسيفرين د إينترابيريتونيلي عند نقطة منتصف البطن، باستخدام إبرة ز 28.5.
- تناسب كل الماوس مع مخروط الآنف داخل نظام التصوير في موقف ضعيف (مكان كحد أقصى خمسة فئران في نفس الوقت). المحافظة على التخدير في إيسوفلوراني 1%-3% (في الأكسجين 100%) عن طريق المخروطات أثناء التصوير.
-
قم بالتقاط صورة كل 5 دقيقة للكشف عن الإضاءة الحيوية الذروة لمدة 50 دقيقة (أو حتى الإضاءة الحيوية ذروة مؤكدة).
- حدد التﻷلؤ السيارات، Binning متوسط، و مجال الرؤية د.
- انقر فوق الحصول التقاط الصورة.
- تعود الفئران إلى cage(s) بهم ورصد لهم حتى أنهم استعادوا (راجع الخطوة 3، 8).
6-الرئة ورم خبيث عبء التحديد الكمي بتصوير السابقين فيفو
ملاحظة: الرئة ورم خبيث الكمي قابل للتطبيق لتلقيح أورثوتوبيك سواء مع أو دون استئصال الثدي نماذج. في النموذج، واستئصال الثدي هو اختيار السابقين فيفو التصوير أو بقاء المراقبة، تبعاً للغرض. في نموذج التطعيم (بدون استئصال الثدي) أورثوتوبيك، تنتج معظم الحالات معايير القتل الرحيم حجم الورم الرئيسي (> 2 سم) حوالي 21 يوما بعد التلقيح.
- التحديد الكمي لآفات الرئة المنتشر بعد تلقيح خلايا السرطان بالسابقين فيفو تصوير 21 يوما.
- تخدير الفئران مع إيسوفلوراني 2-4% في غرفة مخصصة التعريفي (راجع الخطوة 3.1).
- وزن الفئران.
- ضخ 150 مغ/كغ لوسيفرين د إينترابيريتونيلي (راجع الخطوة 5، 6).
- Euthanize الفئران بسرطان عنق الرحم التفكك، 15 دقيقة بعد الحقن.
- فتح البطن بقطع الجلد والصفاق في منتصف البطن، باستخدام منحنى مايو كلينيك المقص. تمديد شق إلى اليمين واليسار على حد سواء. سحب الكبد مع الملقط حتى يتم تصور الحجاب الحاجز؛ وبعد ذلك، قطع الحجاب الحاجز.
- باستخدام مقص مايو كلينيك المنحنية، قطع الأضلاع ثنائية من كاوداد (الأضلاع 12) إلى سيفالاد (أضلاعه الأولى) كشف الرئتين عن طريق التقليب جدار الصدر الأمامي.
- تحديد المريء والصدر، الذي يبدو وكأنه سلك توصيل الرئتين للعمود الفقري، وعن طريق رفع الرئتين باستخدام الملقط، وبعد ذلك، قطع المريء باستخدام مقص ميكروديسيكتيون.
- رفع الثنائية في الرئتين والقلب باستخدام الملقط (تطبيق الجر سحب لأسفل، باتجاه سيفالاد إلى كاوداد)، وثم قطع القصبة الهوائية وسفن كبيرة إلى قمة الرئة في سيفالاد، باستخدام مقص ميكروديسيكشن.
ملاحظة: وهذا يسمح لعزل الرئة والقلب من الجسم. - إزالة القلب من الرئة باستخدام مقص ميكروديسيكشن.
- وضع الرئتين 10 سم طبق بيتري.
- التقاط الصورة الإضاءة الحيوية (راجع الخطوات 5.7.1 و 5.7.2) 5 دقائق بعد القتل الرحيم (20 دقيقة بعد حقن لوسيفرين).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
غرض طراز أورثوتوبيك لمحاكاة تطور السرطان البشري (أي، نمو الورم الرئيسي تليها الانبثاث العقدة الليمفاوية والرئة ثم البعيدة ورم خبيث)15. بعد تلقيح خلايا السرطان، هو كمياً الإضاءة الحيوية بصورة منتظمة (مرتين إلى ثلاث مرات/الأسبوع) (الشكل 1A). الإضاءة الحيوية في الرئتين أعمق وأصغر من الآفة الأولية. الإضاءة الحيوية تعكس بشكل رئيسي عبء الورم الرئيسي في الفئران يعيش3 (الشكل 1 باء و جيم 1). كما تم قياس حجم الورم بالقياس الفرجار. وقدرت حجم الورم باستخدام المعادلة التالية: الحجم = (طول) × (العرض)22 (الشكل 1). التحديد الكمي لعبء الورم بالإضاءة الحيوية وقياس قدمه ذات الورنيّة أظهرت اتجاهات مماثلة في النتائج التمثيلية (الشكل 1 باء و دال 1)؛ ومع ذلك، واجهنا في بعض الأحيان التناقضات. ونحن نفترض أن التحديد الكمي لعبء الورم الرئيسي استخدام الإضاءة الحيوية أكثر دقة مقارنة بقياس حجم الورم بقدمه ذات الورنيّة عندما يكون حجم الورم أقل من 1.5 سم. لأنه يعكس قابلة للتطبيق يمكن اكتشاف الخلايا السرطانية، حتى يمكن الكشف عن عدد صغير من الخلايا بالإضاءة الحيوية، والخلايا السرطانية فقط داخل الورم، بما في ذلك عدم التسلل إلى الخلايا المناعية أو المحيطة بالخلايا اللحمية3. هذا النموذج مفيدة في تقييم فعالية الانحدار الورم بوساطة العقاقير المضادة للسرطان والاستجابات المناعية3،،من716. يمكن أيضا قياس عبء الورم الانبثاث الرئة ب السابقين فيفو التصوير في هذا النموذج (الشكل 1E)؛ بيد أن الحد هو أنه يجب أن euthanized الفئران لقياس عبء الورم المنتشر.
والغرض من هذا النموذج استئصال الثدي هو 1) إنتاج مستوى العلاج والرعاية لسرطان الثدي البشرية، وهو الاستئصال الجراحي ل الورم الرئيسي17، و 2) تسمح للتقدير الكمي المسلسل من عبء الورم المنتشر المجراة. هذا النموذج مفيدة بشكل خاص في الدراسة السريرية لتطوير المداواة رواية13. كما تم نشرها في السابق، مثبط Src، AZD0530، التي أظهرت فعاليتها في نموذج الفئران الإكلينيكية ولكن فشل في تجارب سريرية لعلاج سرطان الثدي، أظهرت كفاءة في الآفة الأولية استخدام التطعيم أورثوتوبيك دون استئصال الثدي ولكن لا في الرئة ورم خبيث استخدام نموذج استئصال الثدي المعروضة هنا. على الرغم من أن العقاقير المضادة للسرطان (مثلاً، أنثراسيكلينيس) تستخدم أحياناً في البشر كعلاج نيوادجوفانت لعلاج أورام الثدي الأولية، الغالبية العظمى من الأدوية تستخدم كعلاج adjuvant حيث يتم إعطاء العقاقير بعد الجراحة الحد من خطر تكرار علاج السرطان لا يمكن الكشف عنها سريرياً أو كعلاج الملطفة للسرطان المنتشر1،،من718. وهكذا، أنشئ هذا النموذج استئصال الثدي، الذي يحاكي عملية المعاملة الإنسانية11.
ثمانية أيام بعد تلقيح خلايا السرطان، الورم الرئيسي جراحيا إزالة (الشكل 2). لاختبار أي من بلغت المخدرات لآفات المنتشر، ينبغي أن تدار بعد استئصال الثدي. هذا النموذج يسمح للرئة آفة المتنقل الكمي، فضلا عن التحديد الكمي آفة المتنقل في الجسم كله، ما دام عبء الورم المنتشر الإضاءة الحيوية القابلة للاكتشاف استخدام التصوير المجراة. معدل تكرار المحلية جدار الصدر الأمامي منخفض جداً. وكان معدل تكرار المحلية في تجربتنا، أقل من 5% في التجارب الفئران أكثر من 50. ومع ذلك، إذا تجاوز الإضاءة الحيوية بعد العملية الجراحية يوم 1 1.00 e + 06 الفوتونات (10 x أكبر من غيرهم من الأفراد)، هناك إمكانية عالية ل الورم المتبقية المحلية13. إذا كان هناك بقايا الخلايا السرطانية الحالية، يظهر وجود ورم محسوس خلال أسبوعين. عندما يكون هناك ورم محلي في متبقية، الإضاءة الحيوية تعكس بشكل رئيسي أن تكرار المحلية بدلاً من أية آفات المنتشر. المحلية الأورام المتبقية من المعروف أن تتصرف بشكل مختلف جداً عن19من الانبثاث البعيدة؛ وبالتالي، تلك الحيوانات مع تكرار المحلية (< % 5 في تجربتنا) ينبغي استبعادها من أي إجراء مزيد من التحليل. كما يسمح هذا النموذج استئصال الثدي للورم النقيلي المسلسل عبء الرصد دون الحاجة إلى euthanize الحيوانات. وعلاوة على ذلك، يمكن تأكيد هذا الرصد طرحه بالسابقين فيفو الرئة ورم خبيث الكمي. بدلاً من قياس الانبثاث الرئة بالسابقين فيفو التصوير، وبالتالي الحاجة إلى euthanize الحيوانات، ويمكن أيضا رصد بقاء الفئران بعد العلاج الجراحي كنقطة نهاية سريرية قابل لترجمة (الشكل 2D). أنه ليس هناك أي الآفة الأولية، الفئران لا تفي بمعايير الورم القتل الرحيم التي تعرف عموما بحسب حجم ورم > 2 سم أو تقرح الورم الرئيسي. في هذا النموذج استئصال الثدي 4T1، توفي جميع الفئران في غضون 60 يوما من تلقيح خلايا السرطان بسبب ورم خبيث.
رقم 1: نظرة عامة على الطراز أورثوتوبيك دون استئصال الثدي. (أ) هذا الفريق يظهر نموذج مسار وقت أورثوتوبيك استخدام نموذج سينجينيك 4T1. (ب) هذا الفريق يوضح الإضاءة الحيوية الجسم كله من طراز أورثوتوبيك التي تعكس بشكل رئيسي الورم الرئيسي. شريط خطأ يشير إلى الخطأ المعياري للوسط (n = 10). (ج) هذا الفريق يظهر الصور المسلسل من الإضاءة الحيوية في الجسم كله (من نفس الماوس). يشير شريط مقياس 1 سم. (د) يظهر هذا الفريق حجم الورم الفعلي للفريق ب، يقاس بالفرجار. شريط خطأ يشير إلى الخطأ المعياري للوسط (n = 10). (ه) هذا الفريق يظهر الرئة السابقين فيفو الصور الإضاءة الحيوية أورثوتوبيك 10 نموذج الفئران (n = 10). يشير شريط مقياس 1 سم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: نظرة عامة حول نموذج استئصال الثدي. (أ) هذا الفريق يظهر نموذج مسار وقت استئصال الثدي بعد زرع سينجينيك أورثوتوبيك 4T1. يشير شريط مقياس 1 سم. (ب) هذا الفريق يوضح الإضاءة الحيوية الجسم كله نموذج استئصال الثدي، والتي تعكس بشكل رئيسي آفة المتنقل. شريط خطأ يشير إلى الخطأ المعياري للوسط (n = 10). (ج) هذا الفريق يظهر الصور المسلسل من الإضاءة الحيوية في الجسم كله (من نفس الماوس). الاستفادة من السابقين فيفو التصوير، وأكد أن الإشارات من ورم خبيث في الرئة، وأكد عدم تكرار المحلية بتصوير كامل الجسم بعد إزالة الرئة. مقياس بار = 1 سم. (د) هذا المنحنى بقاء يظهر كابلان-ماير الفريق نموذج استئصال الثدي دون أي العلاج من تعاطي المخدرات. وقد euthanized الفئران عندما وصلوا إلى معايير القتل الرحيم بأي حالة مرضية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في العقد الماضي، ونحن إنشاء نماذج سرطان مورين متعددة، بما في ذلك الثدي سرطان نماذج3،7،،من1316،،من2021. سابقا، أثبتنا أن الثدي سرطان الخلية أورثوتوبيك التطعيم في أنسجة الغدة الثديية تحت الرؤية المباشرة ينتج ورم أكبر مع تغير حجم أقل مقارنة بحقن الخلايا حول الحلمة دون شق جراحي7 . تم تحسين هذا النموذج عند باستخدام تعليق خلية في خليط بروتين هلامية. كانت جولة مع أقل تقلب الأشكال الورم الناتجة عن الخلايا بروتين هلامية علقت خليط، بينما تلك التي تولدها الخلايا أوقفت برنامج تلفزيوني كانت متناثرة في الغدة الثديية3.
ونحن كذلك التحقق من أن الأورام المتولدة عن طريقة غرس أورثوتوبيك الجراحية المقدمة هنا عالية وأعرب عن الجينات شبكات التفاعل التي هامة في تطور السرطان مقارنة مع تلك التي تم إنشاؤها بواسطة غير الجراحية أو تحت الجلد حقن7. هذه النتائج تعني أن هذا النموذج يحاكي سرطان الثدي البشرية أفضل بالمقارنة مع أورثوتوبيك غير الجراحية أو غرس تحت الجلد7. كما أثبتنا أن هذا النموذج مناسبة لتقييم الانحدار المناعي بوساطة من سرطان الثدي باستخدام الرفض allogenic3. ومع ذلك، يمكن أيضا أن يسبب شق الجلد التهاب حول الورم14. ولذلك، اعتماداً على الفرضية القائلة باختباره من قبل المحقق، من المهم النظر في التهاب كعامل التباس ممكن.
خلاف neoadjuvant الإعداد، تدار الغالبية العظمى من العلاجات الجهازية بعد الورم الثدي الأساسي هو إزالتها جراحيا11. وحتى الآن، تقييم غالبية الدراسات الإكلينيكية لتطوير العقاقير الجديدة استجابة المخدرات في الورم الرئيسي، ولكن ليس في1،الآفات المنتشر18. هذا التناقض بين النماذج الحيوانية والبشرية العلاج مهم للتشكيل الجانبي للجينات للآفات المنتشر تختلف اختلافاً كبيرا عن تلك الآفة الأولية22، الذي تترتب عليه آثار هامة بيولوجيا السرطان والعلاج ، لا سيما في عصر العلاج المستهدفة22. ولذلك، ينبغي تقييم فعالية الدواء لعلاج adjuvant في الآفات المنتشر، ليس فقط في الورم الرئيسي. علينا التحقق من توقيت تشكيل الانبثاث العقدة الليمفاوية والرئة بعد التلقيح أورثوتوبيك، الاستفادة من ال 4T1 سرطان الثدي أورثوتوبيك النموذجي16. كما أثبتنا أن استئصال الورم الرئيسي تحسين البقاء على قيد الحياة في سرطان الثدي المنتشر استخدام نموذج استئصال الثدي23. وهكذا، حاولنا إقامة نموذج استئصال الثدي بعد زرع خلايا السرطان أورثوتوبيك. ومع ذلك، أنفق وقتاً طويلاً إنشاء هذا النموذج تكرار المحلية منخفضة. لأنه يتم حقن الخلايا السرطانية عن طريق الشق الجراحي، تهاجر الخلايا السرطانية بسهولة داخل الجرح. وبالإضافة إلى ذلك، الخلايا السرطانية غزو الأنسجة في اتصال مباشر مع الورم، مثل المحيطة عضلات جدار الصدر والجلد. الخلايا السرطانية أيضا السرطاني إلى الغدد الليمفاوية الإبطين دون تشكيل كتلة إبطي مرئية في وقت استئصال الثدي. حين إزالة الورم قد يكون أسلوب أسهل، القيام بذلك غير قابل للنقل لاستئصال الثدي في علاج سرطان الثدي كما أنه يسبب تكرار المحلية13. وهكذا، أنشئ هذا "نموذج استئصال الثدي الجذري" بغية إزالة جميع الخلايا السرطانية من جدار الصدر الأمامي وحوض إبطي العقدة الليمفاوية، كما هو موضح في الشكل 2. أكدنا الرئة ورم خبيث بالانسجة والرئة السابقين فيفو التصوير، وكان هناك لا مثال ساطع الآفة موجودة بتصوير كامل الجسم بعد إزالة الرئة. وفي هذا النموذج أورثوتوبيك 4T1، السرطاني الخلايا السرطانية في نهاية المطاف إلى الرئتين، وفي جميع الحالات في غضون 21 يوما. بيد أن توقيت خبيث يعتمد على حجم الورم الرئيسي؛ وبالتالي، أقل حجم الورم الرئيسي المهم تقلب لرصد الورم الرئيسي ليس فقط ولكن أيضا عبء الورم المنتشر. باستخدام خليط البروتين هلامية، يمكن التقليل من تباين حجم الورم. ومع ذلك، يمكن أن يؤثر على خليط البروتين هلامية وورم المكروية. ولذلك، ينبغي النظر في احتمال الخلط العوامل المرتبطة باستخدام خليط البروتين هلامية، اعتماداً على فرضية المحقق.
استخدام هذه التقنيات والإعراب عن لوسيفراس الخلايا السرطانية تسمح للورم العبء الكمي مع أقل خطأ القياس، حتى في أورام غير واضح. هناك نظامان مراسل، طرحه ونيون، تصور أن الإشارات في الحيوانات الحية. في حين أفيد أن إشارة الإضاءة الحيوية والأسفار يمكن مشرق بما يكفي للقياس الكمي، عند إشارة الهدف منخفضة جداً، إشارة الخلفية من الأسفار أعلى، مما يقلل من دقة التحليل. وفي المقابل، تم الكشف عن الإضاءة الحيوية بدقة أكبر في إشارة أقل مع أقل تدخل الخلفية24. وبناء على ذلك، تفضل معظم المحققين استخدام نظم الإضاءة الحيوية مراسل في العيش والتجارب الحيوانية24،25. ومع ذلك، ورم العبء الكمي بالإضاءة الحيوية لها حدودها. تلميع الخلايا معربا عن لوسيفراس عندما يصل لوسيفرين الخلايا السرطانية قبل التروية القلبية الوعائية26. إذا كان الآفة منطقة نقص و/أو هيبوبيرفوسيون، لا يتم تسليم لوسيفرين إلى الخلايا ويمكن، بعد ذلك، قياس قيمة الإضاءة الحيوية أن تكون أقل من عبء الورم الفعلية. والواقع أننا شهدنا الكمي الإضاءة الحيوية غير مناسبة عندما بلغ حجم الورم أكثر من 1.5 سم. ونحن نفترض أن من سبب وصف التاكسج و/أو شرط هيبوبيرفوسيد. وهكذا، عندما يصل الورم إلى حجم ملموس، عبء الورم كمياً بالإضاءة الحيوية وقياس قدمه ذات الورنيّة. قيداً هاما الإضاءة الحيوية الكمي للنظر هو الفراء الأسود من الفئران. حتى بعد إزالة الفراء، هناك تصبغ في الجلد27. بينما يمكن اكتشاف الإضاءة الحيوية وكمياً في الفئران مع الفراء الأسود، انخفض و، ولذلك، من المهم مقارنة الفئران من نفس لون الفراء إلى بعضها البعض بغية الحد من آثار لون الفراء التباس على القياس الكمي طرحه. ويوفر استخدام الخلايا لوسيفراس-الإعراب عن بعض طرائق الدراسة فريدة من نوعها. على سبيل المثال، يمكن استخدام لوسيفراس سيكريتابل للورم العبء الكمي بقياس الدم أو البول الإضاءة الحيوية28. في النموذج الذي قدم هنا، الورم مباشرة العبء الكمي للخلايا السرطانية قادرة على البقاء في الحيوانات الحية مع لوسيفراس غير سيكريتابلي بسيطة وواضحة، التي لا تتطلب جمع عينات من الدم أو البول.
مشابهة للنماذج التي عرضت هنا، إنتاج أكثر كفاءة التجربة الحيوانية التي تنتج بمعدل نجاح أعلى من توموريجينيسيس مع أقل تقلب هو المفتاح لإثبات النتائج. في النموذج الحالي، مرة محقق وقد تعلمت هذه التقنية، فمن السهل تحقيق معدل توموريجينيسيس 100%. ونحن أيضا حققت معدلات توموريجينيسيس أعلى خلاف النماذج التي ادخلنا؛ بالإضافة إلى ذلك، أنشأنا نموذج أورثوتوبيك سرطان القولون الاستفادة من تعليق خلية في خليط بروتين هلامية، جنبا إلى جنب مع تقنية الإضاءة الحيوية لتقدير العبء الورم21. وفي الختام، يوفر الطراز الحيوانية المعروضة هنا نموذج موريني مناسب إجراء دراسة سرطان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
هذا العمل كان يدعمها المعاهد الوطنية للصحة منحة منحة R01CA160688 وسوزان زاي-مؤسسة كومن المحقق بدأت البحوث (IIR12222224) للفئران ك. ت. الصور الإضاءة الحيوية التي تم الحصول عليها من مورد مشترك "متعدية التصوير المورد المشترك" في روزويل بارك مركز السرطان الشامل، الذي تدعمه "منحة دعم مركز السرطان" (P30CA01656)، ومنح "الأجهزة المشتركة" (S10OD016450).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro Dissection Scissors | Roboz | RS-5983 | For cancer cell inoculation and masstectomy |
| Adson Forceps | Roboz | RS-5233 | For cancer cell inoculation and masstectomy |
| Needle Holder | Roboz | RS-7830 | For cancer cell inoculation and masstectomy |
| Mayo | Roboz | RS-6873 | For ex vivo |
| 5-0 silk sutures | Look | 774B | For cancer cell inoculation and masstectomy |
| Dry sterilant (Germinator 500) | Braintree Scientific | GER 5287-120V | For cancer cell inoculation and masstectomy |
| Clipper | Wahl | 9908-717 | For cancer cell inoculation and masstectomy |
| Matrigel | Corning | 354234 | For cancer cell inoculation |
| D-Luciferin, potassium salt | GOLD-Bio | LUCK-1K | For bioluminescence quantification |
| Roswell Park Memorial Insitute 1640 | Gibco | 11875093 | For cell culture |
| Fetal Bovine Serub | Gibco | 10437028 | For cell culture |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | For cell culture |
References
- Rashid, O. M., Takabe, K. Animal models for exploring the pharmacokinetics of breast cancer therapies. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 11 (2), 221-230 (2015).
- Schuh, J. C. Trials, tribulations, and trends in tumor modeling in mice. Toxicologic Pathology. 32, 53-66 (2004).
- Katsuta, E., et al. Modified breast cancer model for preclinical immunotherapy studies. Journal of Surgical Research. 204 (2), 467-474 (2016).
- Sidell, D. R., et al. Composite mandibulectomy: a novel animal model. Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 146 (6), 932-937 (2012).
- Ewens, A., Mihich, E., Ehrke, M. J. Distant metastasis from subcutaneously grown E0771 medullary breast adenocarcinoma. Anticancer Research. 25, 3905-3915 (2005).
- Kocaturk, B., Versteeg, H. H. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth. Journal of Visualized Experiments. (96), e51967 (2015).
- Rashid, O. M., et al. An improved syngeneic orthotopic murine model of human breast cancer progression. Breast Cancer Research and Treatment. 147 (3), 501-512 (2014).
- Bertozzi, S., et al. Prevalence, risk factors, and prognosis of peritoneal metastasis from breast cancer. SpringerPlus. 4, 688 (2015).
- Kennecke, H., et al. Metastatic behavior of breast cancer subtypes. Journal of Clinical Oncology. 28 (20), 3271-3277 (2010).
- Valero, M. G., Golshan, M. Management of the Axilla in Early Breast Cancer. Cancer Treatment and Research. 173, 39-52 (2018).
- National Comprehensive Cancer Network. Breast Cancer, NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology. , Available from: https://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/breast.pdf (2018).
- Versteeg, H. H., et al. Inhibition of tissue factor signaling suppresses tumor growth. Blood. 111 (1), 190-199 (2008).
- Katsuta, E., Rashid, O. M., Takabe, K. Murine breast cancer mastectomy model that predicts patient outcomes for drug development. Journal of Surgical Research. 219, 310-318 (2017).
- Veenhof, A. A., et al. Surgical stress response and postoperative immune function after laparoscopy or open surgery with fast track or standard perioperative care: a randomized trial. Annals of Surgery. 255 (2), 216-221 (2012).
- Wei, S., Siegal, G. P. Surviving at a distant site: The organotropism of metastatic breast cancer. Seminars in Diagnostic Pathology. 35 (2), 108-111 (2018).
- Nagahashi, M., et al. Sphingosine-1-phosphate produced by sphingosine kinase 1 promotes breast cancer progression by stimulating angiogenesis and lymphangiogenesis. Cancer Research. 72 (3), 726-735 (2012).
- Jones, C., Lancaster, R. Evolution of Operative Technique for Mastectomy. Surgical Clinics of North America. 98 (4), 835-844 (2018).
- Rashid, O. M., Maurente, D., Takabe, K. A Systematic Approach to Preclinical Trials in Metastatic Breast Cancer. Chemotherapy (Los Angeles). 5 (3), (2016).
- Ramaswamy, S., Ross, K. N., Lander, E. S., Golub, T. R. A molecular signature of metastasis in primary solid tumors. Nature Genetics. 33 (1), 49-54 (2003).
- Aoki, H., et al. Murine model of long-term obstructive jaundice. Journal of Surgical Research. 206 (1), 118-125 (2016).
- Terracina, K. P., et al. Development of a metastatic murine colon cancer model. Journal of Surgical Research. 199 (1), 106-114 (2015).
- Rashid, O. M., et al. Is tail vein injection a relevant breast cancer lung metastasis model? Journal of Thoracic Disease. 5 (4), 385-392 (2013).
- Rashid, O. M., et al. Resection of the primary tumor improves survival in metastatic breast cancer by reducing overall tumor burden. Surgery. 153 (6), 771-778 (2013).
- Troy, T., Jekic-McMullen, D., Sambucetti, L., Rice, B. Quantitative comparison of the sensitivity of detection of fluorescent and bioluminescent reporters in animal models. Molecular Imaging. 3 (1), 9-23 (2004).
- Adams, S. T. Jr, Miller, S. C. Beyond D-luciferin: expanding the scope of bioluminescence imaging in vivo. Current Opinion in Chemical Biology. 21, 112-120 (2014).
- Close, D. M., Xu, T., Sayler, G. S., Ripp, S. In vivo bioluminescent imaging (BLI): noninvasive visualization and interrogation of biological processes in living animals. Sensors (Basel). 11 (1), 180-206 (2011).
- Chen, H., Thorne, S. H. Practical Methods for Molecular In Vivo Optical Imaging. Current Protocols in Cytometry. 59 (1224), (2012).
- Wurdinger, T., et al. A secreted luciferase for ex vivo monitoring of in vivo processes. Nature Methods. 5 (2), 171-173 (2008).
- Aoki, H., et al. Host sphingosine kinase 1 worsens pancreatic cancer peritoneal carcinomatosis. Journal of Surgical Research. 205 (2), 510-517 (2016).
