Summary
Murine orthotopic 유 방 암 모델 및 과격 한 유 방 절제술 모델 인간의 유방암 암 진행을 모방 하기 위해 종양 부담 척도를 생물 발광 기술을 소개 합니다.
Abstract
유 방 암 진행을 평가 하기 위해 vivo에서 마우스 모델 연구, 전 임상 약물 개발을 포함 한 필수적입니다. 그러나, 실용적이 고 기술적인 내용의 대다수는, 그러므로, 도전 수술 기법을 포함 하는 경우에 특히, 모델을 재현 하는 출판된 원고에 일반적으로 생략 됩니다. 생물 발광 기술 종양은 만져 서 하는 경우에 적은 양의 암 세포의 평가 대 한 수 있습니다. 암 세포 luciferase 표현에 활용 하 여, 우리 높은 tumorigenesis 속도와 유 방 암 orthotopic 접종 기법을 설정 합니다. 폐 전이 비보 전 기술을 활용 하 여 평가 됩니다. 우리, 그럼, 전이성 종양 부담을 평가 하기 위해 낮은 로컬 재발 률과 유 방 절제술 모델을 설정 합니다. 여기, 우리, 자세히 설명, orthotopic 주입 및 높은 tumorigenesis 속도와 낮은 로컬 되풀이 요금, 유방암을 위한 유 방 절제술의 수술 기법 각각, 유 방 암 모델 효율을 향상 시킨다.
Introduction
동물 모델 연구에 핵심 역할을 한다. 가설을 생체 외에서 입증 하는 때 그것의 임상 관련성을 평가 하는 vivo에서 시험 되어야 한다. 암 진행과 전이 종종 더 나은 잡혀 체 외 모델에 비해 동물 모델 그리고 약물 개발1,2에 대 한 전 임상 연구로 동물 모델에서 신약을 테스트 것이 필수적입니다. 그러나, 동물 실험의 기술적인 세부 사항은 종종 모델을 성공적으로 재현에 도전 하는 게시 된 기사에서 잘 기술 된다. 사실, 이러한 orthotopic 접종 및 절제술 모델 설립 저자는 시행 착오의 길고 엄격한 과정을 통해 갔다. Tumorigenesis 후 암 세포 접종 중 하나 이며 성공 여부를 결정 하는 주요 인 동물의 효율성의 연구3. 셀 라인 및 세포 접종, 접종 사이트 및 쥐의 긴장의 수는 모두 중요 한 요소. 그것은 잘 알려진 체 외 기법에 비해 개별 차이 동물 실험의 결과에 큰 변화는. 따라서, 표준 기술로 잘 설립 모델을 사용 하 여 안정적인 결과, 동물 실험의 효율성을 개선 하 고 잘못 된 결과 피하기 위해 중요 하다.
이 종이 잘 설립 기법4 유 방 암 orthotopic 및 절제술 마우스 모델을 생성 하를 제공 합니다. 이 방법의 목표 1) 인간의 유방암 암 진행 및 치료 과정을 모방 하 고 2) 더 큰 효율성과 다른 유 방 암 접종 또는 유 방 절제술 기법에 비해 높은 성공률 생체 조건 실험을 실시 하. Orthotopic 암 세포 접종에서 인간의 유방암 암 진행, 모방을 우리 선택 #2 유 방 지방 패드 접종 사이트로, 가슴에 있는. 연구의 대부분에서는, 유 방 암 세포는 피하 주사는5. 이 기술은 수술을 요구 하지 않는다 그리고, 따라서, 그것은 간단 하 고 간단. 그러나, 피하 microenvironment 다른 암 진행에도 분자 프로 파일6,7결과 유선 microenvironment에서 매우 다르다. 일부 연구는 복 부에 있는 #4 유선을 사용 하 여 접종 사이트6. 그러나, #4 유 방 동맥은 복 부에 위치 하 고 있습니다, 가장 일반적인 전이성 패턴 이므로 복 수7, 전이성 유방암 암8의 10% 미만으로 발생 하는. 유 방 암 #2 유선에 여기 제시 하는 기술에 의해 생성 된 가장 일반적인 유 방 암 전이성 사이트9중 폐에 metastasizes.
이 기술은 목표와 다른 유 방 암 접종 기법에 비해 최소한의 종양 크기 변화 더 높은 tumorigenesis 속도 달성 하기 위해 이기도 합니다. 이렇게 하려면 암 세포는 젤라틴 단백질 혼합물에 중간 앞쪽 가슴 벽 절 개를 통해 직접 비전 주사 됩니다. 이 기술은 종양 크기와 모양이 이전에 보고 된3,7피하 또는 비-외과 주사에 비해 적은 변동성으로 높은 tumorigenesis 속도 생성 합니다.
우리는 또한 orthotopic 유 방 종양 주변 조직 및 겨드랑이 림프절 절제는 마우스 급진적 절제술 기법을 소개 합니다. 임상 설정에서 먼 전이 질병 없이 유방암 환자에 대 한 치료의 표준 유 방 절제술10,11이다. 유 방 절제술, 전에 겨드랑이 림프절 전이 이미징 및 센 티 넬 림프절 생 검에 의해 조사 했다. 겨드랑이 림프절 전이의 증거가 있는 경우에, 환자는 전체 또는 부분 유 방 절제술, 겨드랑이 림프절 절제를 생략 하면 다음 처리 됩니다. 총 유 방 절제술은 일괄적, 전체 유 방 조직으로 유방암 resect 기술 부분 유 방 절제술은 정상 유 방 조직만, 주변의 여백으로 유방암 resect 반면 나머지 정상 유 방 조직에 따라서 보존은 환자입니다. 그러나, 부분 유 방 절제술 후 남아 있는 정상적인 유 방 조직을 유지 하는 환자10현지 재발 피하기 위해 수술 후 방사선 치료를 필요 합니다. 겨드랑이 림프절 전이 수행 모든 정상으로 유방암을 제거 하는 과격 한 유 방 절제술 환자 조직과 겨드랑이 림프절을 유 방 하 고 조직 en 블록10,11을 침공. 마우스 모델에서 겨드랑이 림프절 전이 및 수술 후 방사선에 대 한 감시가 아니다 합리적인 또는 가능한. 따라서, 우리는 로컬 또는 겨드랑이 림프절 전이 피하기 위해 과격 한 유 방 절제술 기법을 이용 한다.
꼬리 정 맥을 통해 암 세포 접종은 가장 일반적인 폐 전이 마우스 모델12, 소위 "실험적인 전이". 이 모델 생성 하기 쉽습니다와 수술; 필요 하지 않습니다. 그러나, 그것은 결과가 발생할 수 있습니다 다른 전이성 질병을 인간의 유방암 암 진행을 모방 하지 않습니다. 전이 종종 유 방 절제술 후 발생 하는 인간의 유방암 암 치료 과정을 모방 하기 위해 기본 종양 orthotopic 암 세포 접종 후 제거 됩니다. 이 기술은 이전에 보고 된13, 간단한 종양 절제술에 비해 적은 지역 되풀이 생성 하 고 새로운 치료제, 임상 연구, 그리고 전이성 유 방 암 연구 연구에 대 한 유용. 여기서 설명 대부분 유 방 암 orthotopic 모델 실험에 대 한 적용 됩니다. 그러나, 그것은 젤라틴 단백질 혼합물은 microenvironment에 영향을 미칠 수 있습니다 수술 스트레스/면역 응답14에 영향을 미칠 수 있습니다 고려 하는 것이 중요. 따라서, 조사자는 microenvironment / 스트레스/면역 응답을 공부 하 고 잠재적인 혼동 요인의 알고 있어야 합니다.
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Protocol
로스웰 파크 종합 암 센터 기관 동물 관리 및 사용 위원회에서 승인을 얻은 모든 실험에 대 한.
참고: 12 주 오래 된 여성 BALB/c 마우스 9 얻을 수 있습니다. 4T1 luc2 셀, 마우스 유 방 선 암 세포 라인 BALB/c 마우스에서 파생 된 표현 luciferase 하도록 설계 되었습니다 사용 됩니다. 이러한 세포 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 로스웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 1640 매체에 교양.
1입니다. 악기의 준비
- 조직 문화 후드에 얼음에 냉동된 젤라틴 단백질 혼합물 (예를들면, Matrigel)를 녹여.
- 깨끗 하 고 압력솥 2 수술 전에 수술 악기 (기정, Adson 집게가 위와 바늘 홀더)의 세트. 멸 균된 5-0 비단 봉합 준비 하 고 (때 직렬 수술은 계획 되는) sterilant를 건조.
- 클립은 클리퍼를 사용 하 여 마우스의 중간 가슴 털 고 펀칭 수술 전 귀 여 식별에 대 한 마우스를 표시 합니다.
-
작업에 즉시 사용할 수 있는 프로시저 테이블을 준비 합니다.
- 흡수 성 패드를 확산 하 고 테이프로 모서리를 수정, 운영 공간 옆에 있는 테이프, sterilant 및 살 균 제 (액체, 요오드, 및 75% 에탄올)을 넣어 마 취 코 콘을 수정 작업 순서에 쥐를 놓습니다.
2. (10 쥐)에 대 한 셀의 준비
참고: 셀을 감소 세포 생존 능력을 피하기 위해 접시에서 분리 되 고 후 1 시간 이내 주사 한다. 특히, 세포 현 탁 액 15 분 이내 젤라틴 단백질 혼합물으로 그들의 생존을 유지 하기 위해 접시에서 세포를 분리 후 혼합 한다.
- 문화 4T1 luc2 셀 마우스 유 방 선 암 셀 라인 표현 luciferase RPMI 1640 미디어 10%에서 5% CO2에서 37 ° C에서 습도 인큐베이터에서 FBS.
- 워시와 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 10 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 10 cm 접시에 부착 4T1 luc2 셀. P1000 피 펫을 사용 하 여 0.25 %trypsin 1 mL을 추가 하 고, 다음, 5 분 동안 37 ° C에서 샘플을 품 어. 그런 다음, 성장 미디어의 4 개 mL를 추가 (RPMI-1640 10 %FBS) 5 mL 혈 청 학적인를 사용 하 여 플라스틱 및 조직 문화 후드에 15 mL 원뿔 튜브에 세포 현 탁 액을 전송. 180 x g 5 분 동안에 세포 현 탁 액 원심
- 발음은 상쾌한 고 2 ml PBS;의 셀 resuspend 그런 다음는 hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.
- 조직 문화 후드에 차가운 PBS (pH 7.4, 4 ° C)의 40 μ 2 x 106 4T1 luc2 셀을 일시 중단 합니다.
- 조직 문화 후드에 얼음에 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 젤라틴 단백질 혼합물의 360 μ와 40 μ 세포 현 탁 액을 섞는다.
참고: 최종 농도 1 x 105/20 μ (1:9 PBS: 젤라틴 단백질 혼합물). Orthotopic 모델 (절제술), 1 x 104/20 μ 최종 농도의 2 주 안에 안락사 기준 (종양 크기 > 2 c m)를 도달 하는 피하기 위해, 사용 되었다.
3. 암 세포 접종
- 생쥐는 침착 하 게 숨을 쉴 때까지 2-4 %isoflurane 및 0.2 L/min 산소 흐름 마 취 유도 실에서 쥐를 넣어 (2-3 분).
- 마우스를 파악 하 고 그것의 어깨에 0.05 mg/kg buprenorphine를 피하 주사.
- 발가락 핀치에 반응의 부족으로 적절 한 마 취를 확인 합니다. 2-4 %isoflurane 숯 용기 단위에 연결 된 2 L/min 산소 흐름 inhalational 마 취 수 있는 마우스 마스크의 구멍으로 마우스의 코를 삽입 합니다.
- 랩 테이프를 사용 하 여 마우스의 사지를 구속 하 고 액체, 요오드, 면봉을 사용 하 여 75% 에탄올을 사용 하 여 피부를 소독.
- 메 마른 서가 위, 오른쪽 절 개 옆 피부 고 피부는가 위를 사용 하 여 가슴 벽에서 분리 하 고 다음, 오른쪽 #2 노출 피부 반전 리프트를 이용 하 여 앞쪽 가슴 벽 중간에 5mm 피부 절 개를 하 게 유 방 지방 패드입니다.
- 신중 하 게 20 μ 28.5 G 바늘으로 상처를 통해 직접적인 비전 아래 지방 패드에 1 mL 인슐린 주사기를 사용 하 여 암 세포 현 탁 액의 주사.
참고: 바늘 없는 피부 상처를 통해 간다. 공고히 젤라틴 단백질 혼합물에 대 한 시간을 수 있는 계속 당기는 그것을 밖으로, 5 s 이전에 대 한 지방 패드에 바늘을 들고. - 살 균 5-0 비 흡수 봉합을 사용 하 여 바느질, 여 피부 절 개를 닫습니다.
- 수술 후, 깨끗 한 케이지를 동물을 반환 하 고 그들은 회복 하 고 자유롭게 이동 하는 때까지 그들을 모니터링 (후 ~ 1-2 분). 동물 건강 수술의 24 시간 이내에 표시 되지 않으면, buprenorphine (0.2 mg/kg)를 관리 합니다.
- 마 취 봉합을 제거 (단계 3.1 참조)는 수술 후 7 d.
4입니다. 유 방 절제술
참고: 유 방 절제술의 타이밍은 매우 중요 하다. 너무 일찍 완료 되 면 폐 전이 발생 하지 않습니다. 너무 늦게 완료 되 면 기본 종양 주요 혈관, 완전 한 종양 절제를 도전 할을 침공 했다. 따라서, 여러 시간 점 어떤 시간 포인트 제작 전에 절제 된 너무 도전적인 전이 대 한 대기에 적절 한 균형을 결정 하는 유 방 절제술에 대 한 테스트 되었습니다. 이렇게 50 마우스 실험에서 그것은 암 세포 접종 후 8 일에 유 방 절제 (또는 종양 크기 5 m m를 도달 하는 때)는 이상적인 시연 했다13균형을 달성 하기 위해 포인트를 시간.
- 2-4% 흡입 isoflurane와 마우스 anesthetize 및 buprenorphine 주사 (3.1, 3.2 단계 참조).
- 마우스를 억제 하 고 피부를 소독 (단계 3.4 참조).
- 서가 위를 사용 하 여 초기 암 세포 접종에서 외과 흉터에서 왼쪽에 5mm 피부 절 개를 2 mm를 확인 합니다. 종양 제거 forelimb의 루트 쪽으로 절 개를 확장, 피부 등 수술 흉터, 겨드랑이 림프절 분 지로 서 종양, 연락 병 변에서 대부분의 시간 아니 보이는 림프 노드는 mastect의 시간에 존재 omy13. 겨드랑이 정 맥 손상 되었는지 확인 합니다.
- "Y"의 형태로 살 균 5-0 비 흡수 봉합을 사용 하 여 바느질, 여 피부 결함을 닫습니다.
- 단계, 3.8에서와 같이 그들이 복구 될 때까지 깨끗 한 케이지 및 모니터에 마우스를 반환 합니다.
- 마 취 봉합을 제거 (단계 3.1 참조) 수술 후 7 일.
5. 발광 부 량 기본 종양 (유 방 절제술 없이 Orthotopic 접종) 또는 폐 전이 (유 방 절제술 모델)
참고: 기본 종양 부담 정량화는 생물 발광 측정된 2x orthotopic 접종 후 하루에서 일주일입니다. 폐 전이 정량화는 생물 발광 측정된 2x는 유 방 절제술 후 하루에서 일주일입니다.
- Dulbecco의 인산 염 버퍼 식 염 수 (DPBS) 조직 문화 후드에서 15 mg/mL의 최종 농도에서 D-소를 용 해. 1.5 mL 빛 차폐 microcentrifuge로 튜브 aliquot 합니다. -80 ° c.에 희석된 솔루션 저장
참고: 20 g 마우스 희석된 D-소의 200 µ L가 필요 합니다. - 이미징 소프트웨어를 열고 초기화를 클릭 합니다.
참고: 그것은 충전-결합 소자 (CCD)을 약 15 분 걸립니다. CCD에서 설정된 온도 도달 하면 온도 바의 색 빨강에서 녹색으로 바뀝니다. - Anesthetize 영상 전에 전용된 유도 실에서 2-4 %isoflurane 쥐 (단계 3.1 참조).
- 쥐의 무게.
- D-소 28.5 G의 바늘을 사용 하 여 중간 복 부 지점에서 intraperitoneally 150mg/kg을 주사.
- 코 콘 부정사 위치 (장소 최대 동시에 5 쥐)에 이미징 시스템 내부의 각 마우스에 맞게. 코 콘을 통해 이미징 동안 1%-3% (100% 산소)에서 isoflurane에 마 취를 유지 합니다.
-
50 분 (또는 확인된 피크 생물 발광) 피크 생물 발광을 감지 하는 이미지를 마다 5 분을 캡처하십시오.
- 자동, 매체, Binning 및 필드의 보기 D로 발광 을 선택 합니다.
- 취득 은 이미지를 클릭 하십시오.
- 그들의 cage(s)에 쥐를 반환 하 고 그들은 (단계 3.8 참조) 회복 될 때까지 그들을 감시.
6. 폐 전이 종양 부담 정량화 Ex Vivo 영상으로
참고: 폐 전이 정량화 orthotopic 접종 모두와 함께 유 방 절제술 모델 없이 적용 됩니다. 유 방 절제술 모델에서 ex vivo 영상 또는 생존 관찰 목적에 따라, 선택 됩니다. Orthotopic 접종 (절제술) 없이 모델에서 대부분의 경우 기본 종양 크기 안락사 기준 (> 2 cm) 접종 후 약 21 일 생산.
- Ex vivo 영상에 의해 암 세포 접종 후 21 일 폐 전이성 병 변 계량.
- Anesthetize 전용된 유도 실에서 2-4 %isoflurane 쥐 (단계 3.1 참조).
- 쥐의 무게.
- Intraperitoneally D 소 150 mg/kg을 주사 (단계 5.6 참조).
- 자 궁 탈, 주사 후 15 분 여 쥐를 안락사.
- 곡선된 메이 요가 위를 사용 하 여 중간 복 부에 피부와 복을 절단 하 여 복 부를 엽니다. 오른쪽과 왼쪽 모두에 절 개를 확장 합니다. 횡 경 막의 시각 이다; 때까지 집게와 함께 간 밖으로 끌어 그런 다음에 횡 경 막 잘라.
- Caudad에서 양측 갈비뼈를 잘라 곡선된 메이 요가 위를 사용 하 여 (제 12 늑 골)에 cephalad 앞쪽 가슴 벽을 대칭 이동 하 여 폐를 폭로 (1 골).
- 집게를 사용 하 여 폐를 해제 하 여 척추, 폐를 연결 코드 처럼 보이는 흉부 식도 식별 하 고, 그러면 서가 위를 사용 하 여 식도 잘라.
- 양측 폐와 심장 집게 (견인 잡아당기는의 방향에 cephalad에 caudad 적용)을 사용 하 고, 다음, 기관 및 주요 혈관에서 폐 꼭대기 잘라 리프트는 cephalad, 서가 위를 사용 하 여.
참고: 폐 및 심장 신체에서의 격리에 대 한 수 있습니다. - 서가 위를 사용 하 여 폐에서 심 혼을 제거 합니다.
- 10 cm 배양 접시에에서 폐를 넣어.
- 생물 발광 이미지를 캡처 (5.7.1 및 5.7.2 단계 참조) 안락사 (소 주사 후 20 분) 후 5 분.
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Representative Results
Orthotopic 모델의 목적은 인간의 암 진행 (즉, 림프절 전이 및 다음 먼 폐 전이 기본 종양의 성장)을 모방 하는15. 암 세포 접종 후는 생물 발광은 정기적으로 계량 (2 3 시간 / 주) (그림 1A). 폐에서 생물 발광 기본 병 변 보다 작은 깊은입니다. 생물 발광은 주로 라이브 마우스3 (그림 1B 및 1 C) 기본 종양 부담을 반영합니다. 종양 크기 또한 캘리퍼스 측정 하 여 측정 했다. 종양 볼륨 다음 수식을 사용 하 여 추정 되었다: 볼륨 = (길이) x (폭)2/2 (그림 1D). 생물 발광 및 캘리퍼스 측정 하 여 종양의 부 량 대표 결과 (그림 1B 및 1 D);에 비슷한 경향을 보였다 그러나, 우리는 때로는 불일치를 발생 했습니다. 우리는 생물 발광을 이용 하 여 기본 종양 부담 측정은 더 정확한 종양 크기가 1.5 cm 미만 때 캘리퍼스에 의해 종양 크기 측정에 비해 가정 합니다. 실행 가능한 반영 하기 때문에 암 세포, 심지어 세포의 작은 수는 생물 발광에 의해 검출 될 수 있다 고만 암 세포 종양, 면역 세포를 침투 또는 stromal 세포3를 둘러싼 내부 감지할 수 있습니다. 이 모델은 종양 회귀 항 암 약물 및 면역 반응3,,716에 의해 중재의 효능 평가에 유용 합니다. 폐 전이 종양 부담 또한 비보 전 이 모델 (그림 1E); 이미징 하 여 측정할 수 있습니다. 그러나, 한계는 전이성 종양 부담을 계량 하는 마우스를 안락사 해야 합니다.
유 방 절제술 모델의 목적은 1) 기본 종양17의 외과 제거는 인간 유방암의 치료 치료의 표준 재현 고 2) 전이성 종양 짐의 직렬 정량화 vivo에서. 이 모델은 새로운 치료제13의 개발의 전 임상 연구에 특히 유용 합니다. 이전에 게시, Src 억제제, AZD0530는 전 임상 마우스 모델에서 효능을 보여주지만 유방암 치료에 대 한 임상 시험에서 실패를 보여주면서 효능 기본 병 변 절제술 없이 orthotopic 접종 활용에 하지 폐 전이 절제술 모델 활용에서 여기를 제시 했다. 항 암 약물 (예를 들어, anthracyclines)는 때때로 치료에 사용 인간 neoadjuvant 요법으로 기본 유 방 종양, 약물의 대부분은으로 사용 보조 치료 약물에 의해 재발의 위험을 줄이기 위해 수술 후 주어진는 어디 임상적으로 발견할 수 없는 암 치료 또는 전이성 암1,7,18에 대 한 완화 치료로. 따라서,이 유 방 절제술 모델 설립 되었다, 어떤 인간의 치료 과정11모방.
암 세포 접종 후 8 일 1 차 종양은 수술로 제거 (그림 2). 전이성 병 변에 대 한 약물 신진대사를 테스트 하려면 그것은 유 방 절제술 후 관리 한다. 전이성 종양 부담은 vivo에서 화상 진 찰을 이용 하 여 감지 생물 발광이이 모델은 폐 전이성 병 변 부 량, 전신 전이성 병 변 정량화에 대 수 있습니다. 앞쪽 가슴 벽 현지 재발 률은 매우 낮다. 우리의 경험에서는, 현지 재발 률 50 쥐 실험에서 5% 미만 이었다. 그러나, 수술 후 하루 1 생물 발광 1.00E + 06 광자 (다른 개인 보다 더 큰 배)를 초과 하면 로컬 잔여 종양13의 높은 가능성이 있다. 현재 남은 암 세포는, 만져 서 종양 2 주 이내에 나타납니다. 현지 잔류 종양이 있을 때, 어떤 전이성 병 변 보다는 오히려 그 지역 되풀이 주로 생물 발광에 반영 한다. 현지 잔류 종양 먼 전이19; 보다 매우 다르게 행동으로 알려져 있습니다. 현지 재발을 따라서, 그 동물 (< 우리의 경험에의 하면 5%) 추가 분석에서 제외 해야 합니다. 이 유 방 절제술 모델 또한 직렬 전이성 종양 부담 동물 안락사 하지 않고 모니터링에 대 한 수 있습니다. 또한, 같은 발광 모니터링 확인할 수 있습니다 의해 vivo 폐 전이 부 량 전. Ex vivo 영상, 따라서 동물을 안락사 데 여 폐 전이 측정 하는 대신 수술 치료 후 마우스 생존 또한 번역 임상 끝점 (그림 2D)으로 모니터링할 수 있습니다. 쥐의 종양 크기로 일반적으로 정의 되는 안락사 종양 기준에 부합 수 없습니다 없음 기본 병 변 이므로 > 2 cm 또는 1 차 종양의 궤. 이 4T1 절제술 모델에 모든 쥐 때문에 전이 암 세포 접종 후 60 일 이내에 죽 었 다.
그림 1: 유 방 절제술 없이 orthotopic 모델의 개요. (A)이이 패널 표시는 orthotopic의 시간 과정 모델 4T1 syngeneic 모델을 활용 합니다. (B)이이 패널 orthotopic 모델을 주로 반영 하는 1 차 종양의 전체 바디 생물 발광을 보여줍니다. 오차 막대는 뜻의 표준 오류를 나타냅니다 (n = 10). (C)이이 패널 (동일한 마우스)의 전신 생물 발광의 직렬 이미지를 보여줍니다. 눈금 막대가 나타냅니다 1 cm. (D)이이 패널 패널 B, 캘리퍼스로 측정의 실제 종양 크기를 표시 오차 막대는 뜻의 표준 오류를 나타냅니다 (n = 10). (E)이이 패널 비보 전 폐 10 orthotopic 모델 마우스의 생물 발광 이미지 표시 (n = 10). 눈금 막대 나타냅니다 1 cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 유 방 절제술 모델의 개요. (A)이이 패널 표시는 유 방 절제술의 시간 과정 모델 4T1 orthotopic syngeneic 주입 후 합니다. 눈금 막대는 1 cm. (B)이이 패널 표시 주로 반영 하는 전이성 병 변 절제술 모델의 전신 생물 발광을 나타냅니다. 오차 막대는 뜻의 표준 오류를 나타냅니다 (n = 10). (C)이이 패널 (동일한 마우스)의 전신 생물 발광의 직렬 이미지를 보여줍니다. Ex vivo 영상 활용 하 여, 확인 되었다 신호 했다 폐 전이에서 그리고 아무 로컬 되풀이 폐 제거 후 전신 영상에 의해 확인 되었다. 눈금 막대 = 1 cm. (D) 약물 치료 없이 유 방 절제술 모델의 패널 쇼 카 플 란-마이어 생존 곡선. 그들은 어떤 병 적인 상태와 안락사 기준에 도달 하면 마우스 안락사 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
지난 10 년 동안 우리가 유 방 암 모델3,7,13,,1620,21을 포함 한 여러 murine 암 모델을 수립 되었습니다. 이전에 우리가 직접 비전 유선 조직에 유 방 암 세포 orthotopic 접종7 수술 절 개 없이 젖꼭지 주위 세포 주입에 비해 적은 크기 가변성 더 큰 종양을 제작 시연 . 이 모델에는 젤라틴 단백질 혼합물에 세포 현 탁 액을 이용 하 여 향상 되었습니다. 혼합물을 일시 중단 하는 젤라틴 단백질 세포에 의해 생성 된 종양의 더 적은 가변성 라운드, 그 PBS 정지 세포에 의해 생성 하는 반면 유선3에 흩어져 있었다.
우리는 더 높은 여기에 제시 된 수술 orthotopic 이식 메서드에 의해 생성 된 종양 유전자의 상호 작용 네트워크는 비-외과 또는 피하에 의해 생성 된에 비해 암 진행에 중요 한 표현 확인 사출7. 이러한 연구 결과이 모델 인간의 유방암 수술 비 orthotopic 또는 피하 주입7에 비해 더 나은 모방을 의미. 우리는 또한이 모델 allogenic 거부3를 사용 하 여 유방암의 면역 중재 회귀 평가에 적합 하다는 설명 했다. 그러나, 피부 절 개 종양14주위 염증을 일으킬 수 있습니다. 따라서, 조사자에 의해 시험 하는 가설에 따라 염증 가능한 혼동 요인으로 고려 하는 중요 하다.
설정 neoadjuvant 이외의 전신 요법의 대부분 기본 유 방 종양은 수술로 제거 된11후 관리 됩니다. 날짜 하려면, 새로운 신약 개발에 대 한 전 임상 연구의 대부분 마약 응답 기본 종양, 전이성 병 변1,18에 평가 합니다. 전이성 병 변의 유전자 프로 파일은 크게 다른 기본 병 변22, 암 생물학과 치료에 대 한 중요 한 의미를가지고 있기 때문에 동물 모델 및 인간 치료가이 차이가 중요 하다 타겟된 치료22의 시대에 특히. 따라서, 보조 치료에 대 한 약물의 효능은 단순히 기본 종양에에서 전이성 병 변에서 평가 되어야 한다. Orthotopic 접종 후 림프절과 폐 전이 형성의 타이밍 4T1 유 방 암 orthotopic 모델16를 이용 하 여 확인 합니다. 우리는 또한 기본 종양의 절제술 유 방 절제술 모델23를 활용 하 여 전이성 유방암에서 생존 향상을 설명 했다. 따라서, 우리 orthotopic 암 세포 이식 후 유 방 절제술 모델을 구축 하려고 했다. 그러나, 오랜 시간이 낮은 로컬 재발 모델 확립 투입 됐다. 때문에 수술 절 개를 통해 암 세포를 주입, 암 세포는 쉽게 상처로 마이그레이션합니다. 또한, 암 세포 조직 종양 주변 가슴 벽 근육, 피부 등으로 직접 접촉에 침공. 또한 암 세포는 유 방 절제술의 시간에서 보이는 액 질량을 형성 하지 않고 겨드랑이 림프절에 전이. 종양을 제거 하는 것은 쉽게 기술 있을 수 있습니다, 하 고 그래서 아니다 유방암 치료에서 유 방 절제술을 번역 그것은 현지 재발13발생. 따라서,이 "과격 한 유 방 절제술 모델"은 그림 2에 설명 된 대로 앞쪽 흉 벽, 겨드랑이 림프절 분 지에서 모든 암 세포를 제거 하기 위해 설립 되었다. 우리 조직학 및 생체 내 이미징, 전 폐, 폐 전이 확인 하 고 아무 빛나는 병 변 폐 제거 후 전신 영상으로 제공 했다. 이 4T1 orthotopic 모델에서 암 세포는 결국 21 일 이내 모든 경우에 폐에 전이. 그러나, 전이의 타이밍; 기본 종양 크기에 따라 달라 집니다. 따라서, 1 차 종양 크기 변화는 기본 종양 뿐 아니라 전이성 종양 부담 모니터링에 대 한 중요 한. 젤라틴 단백질 혼합물을 사용 하 여 종양 크기 변화를 최소화할 수 있습니다. 그러나, 젤라틴 단백질 혼합 종양 microenvironment에 영향을 또한 수 있습니다. 따라서, 젤라틴 단백질 혼합물 사용과 관련 된 요소를 혼동 가능성이 고려 되어야 한다, 탐정의 가설에 따라.
이러한 기술과 luciferase 표현 암 세포 종양 부담 정량화 만져 서 비 종양에도 적은 측정 오류에 대 한 허용을 활용. 두 기자 시스템, 발광, 형광, 생체 신호를 시각화 하기 위해 있다. 생물 발광 및 형광 신호를 정량화, 대상 신호는 매우 낮은 때 수 보고 되었다, 그러나 형광의 배경 신호는 더 높은, 분석 결과의 정확성을 감소 시키는. 대조적으로, 생물 발광 적은 배경 간섭24낮은 신호에 더 중대 한 정확도 함께 검색 됩니다. 대부분 조사 라이브에서 생물 발광 기자 시스템을 사용 하 여 선호 하는 따라, 동물 실험24,25. 그러나, 생물 발광에 의해 종양 부담 정량화는 한계가 있다. Luciferase 표현 셀 소 심장 혈관 관류26에 의해 암 세포에 도달 하면 빛 날. 병 변은 hypoxia hypoperfusion의 영역, 소 세포에 배달 되지 않습니다 하 고 생물 발광 값 다음, 실제 종양 부담 보다 낮게 측정 될 수. 종양 크기가 1.5 cm 이상 도달 하는 때 실제로, 우리 부적절 한 생물 발광 부 량을 경험 했다. 우리는 설명 때문 임을 가정 hypoxic 또는 hypoperfused 조건. 따라서, 종양이 만져 서 크기에 도달 하면 종양 부담 생물 발광 및 캘리퍼스 측정 하 여 정량. 고려해 야 할 생물 발광 정량화의 중요 한 제한 마우스의 검은 모피 이다. 모피, 제거 후에 피부27에 착 색이 있다. 생물 발광 감지 하 고 검은 모피와 쥐에 계량 수, 그것은 줄 고 따라서, 그것은 발광 정량화에 모피 색상의 혼란 효과 줄이기 위해 서로 같은 모피 색상의 마우스를 비교 하는 것이 중요. Luciferase 표현 세포 사용 연구에 대 한 몇 가지 독특한 형식 제공 됩니다. 예를 들어 secretable luciferase 측정 혈액 또는 소변 생물 발광28종양 부담 정량화에 대 한 사용할 수 있습니다. 제시 하는 모델에 여기, 비 secretable luciferase와 살아있는 동물에 가능한 암 세포의 직접 종양 부담 정량화 간단 고 간단, 어떤 혈액 또는 소변 샘플을 수집 필요 하지 않습니다.
더의 생산, 여기 소개한 모델과 유사한 더 적은 가변성 tumorigenesis의 높은 성공률을 생산 하 여 효율적인 동물 실험 연구 결과 증명 하기 위해 열쇠입니다. 현재 모델에서 한 탐정 기술을, 배웠다 면 쉽습니다 100 %tumorigenesis 속도 달성 하기 위해. 우리는 또한 우리가; 도입 모델 이외의 높은 tumorigenesis 속도 달성 게다가, 우리는 생물 발광 기술 종양 부담21척도를 함께 젤라틴 단백질 혼합물에 세포 현 탁 액을 이용 하 여 결 장 암 orthotopic 모델 설립. 결론적으로, 여기에 제시 된 동물 모델을 암 연구 수행에 적합 한 murine 모델을 제공 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품 K.T. 마우스 생물 발광 이미지 공유 리소스 로스웰 파크 변환 영상 공유 리소스에 의해 취득 되었다 NIH 그랜트 R01CA160688와 수잔 G. 코 멘 재단 조사 시작 연구 그랜트 (IIR12222224)에 의해 지원 되었다 종합 암 센터, 암 센터 지원 그랜트 (P30CA01656)과 공유 계측 그랜트 (S10OD016450)에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro Dissection Scissors | Roboz | RS-5983 | For cancer cell inoculation and masstectomy |
| Adson Forceps | Roboz | RS-5233 | For cancer cell inoculation and masstectomy |
| Needle Holder | Roboz | RS-7830 | For cancer cell inoculation and masstectomy |
| Mayo | Roboz | RS-6873 | For ex vivo |
| 5-0 silk sutures | Look | 774B | For cancer cell inoculation and masstectomy |
| Dry sterilant (Germinator 500) | Braintree Scientific | GER 5287-120V | For cancer cell inoculation and masstectomy |
| Clipper | Wahl | 9908-717 | For cancer cell inoculation and masstectomy |
| Matrigel | Corning | 354234 | For cancer cell inoculation |
| D-Luciferin, potassium salt | GOLD-Bio | LUCK-1K | For bioluminescence quantification |
| Roswell Park Memorial Insitute 1640 | Gibco | 11875093 | For cell culture |
| Fetal Bovine Serub | Gibco | 10437028 | For cell culture |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | For cell culture |
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