Summary
Microdialysis in vivo אפשרה אוסף של מולקולות נוכח נוזל בין-תאי המוח (הקרן) מבעלי ער, להתנהג בחופשיות. על מנת לנתח מולקולות גדולות יחסית של הקרן הלאומית למדע, המאמר הנוכחי מתמקד במיוחד בפרוטוקול microdialysis באמצעות רגשים עם משקל מולקולרי גבוה לחתוך את הממברנות.
Abstract
In vivo microdialysis היא טכניקה חזקה כדי לאסוף את הקרן מבעלי ער, מתנהג באופן חופשי המבוסס על עיקרון דיאליזה. בעוד microdialysis היא שיטה ותיקה המודד מולקולות קטנות יחסית, כולל חומצות אמינו או נוירוטרנסמיטורים, לאחרונה שהשתמשו בה להעריך גם את הדינמיקה של מולקולות גדולות יותר של הקרן באמצעות רגשים עם משקל מולקולרי גבוה לחתוך ממברנות. בעת שימוש כזה הגששים, microdialysis יש לפעול במצב שכיבות למשוך כדי למנוע לחץ שהצטברו בתוך הגששים. מאמר זה מספק צעד אחר צעד פרוטוקולים כולל ניתוח stereotaxic וכיצד להגדיר קווים microdialysis לאסוף חלבונים מן הקרן. במהלך microdialysis, סמים יכול להינתן או מערכתית או על ידי אינפוזיה ישירה לתוך הקרן. Microdialysis הפוכה היא טכניקה להחדיר ישירות תרכובות לתוך הקרן. הכללת תרופות במאגר זלוף microdialysis מאפשר להם מפוזרת לתוך הקרן באמצעות הגששים תוך איסוף בו זמנית הקרן. על ידי מדידת חלבון טאו כדוגמה, המחבר מציג כמה רמות שלה השתנו בעת פעילות. עצבית מגרה על-ידי microdialysis ההפוך של picrotoxin. היתרונות והמגבלות של microdialysis מתוארים יחד עם הבקשה המורחבת על ידי שילוב של שיטות אחרות ויוו .
Introduction
הקרן כוללת 15-20% נפח המוח הכולל, מציע microenvironment קריטי עבור אותות, ולהזמנת המצע פסולת סיווג1. לכן, היכולת של איסוף הקרן מבעלי חיים יספקו יותר השלכות על תהליכים ביולוגיים שונים, כמו גם מנגנון המחלה. Microdialysis in vivo הוא אחד מהשיטות הדגימה לכמת חוץ-תאי המולקולות של הקרן מ ער, בחופשיות חיות ו ובכך משמשת כלי שימושי2,בשדה מחקר מדעי המוח3. בשיטה זו, microdialysis הגששים עם ממברנות semipermeable מוכנס במוח, perfused עם מאגר זלוף קצב זרימה איטית יחסית (0.1-5 µL/min). במהלך זה זלוף, חוץ-תאי המולקולות של הקרן פסיבי לפזר לתוך המכשיר על פי מעבר הצבע ריכוז ולאסוף כמו dialysate. למרות מאמר זה מתמקד בשיטת מדגם הקרן במוח, העיקרון והן השיטה ניתן להחיל לאיברים אחרים על-ידי שינוי המתאים במידת הצורך.
Microdialysis הועסק לראשונה בשנות ה-60 המוקדמות, ומאז ואז היא בשימוש נרחב כדי לאסוף את מולקולות קטנות כולל חומצות אמינו או עצביים במוח. עם זאת, לאחרונה הזמינות המסחרית של הגששים microdialysis עם משקל גבוה-מולקולרי לחתוך ממברנות (kDa-3 100 מד א) האריך היישום שלה יחסית גדול יותר חלבונים ב- ISF כמו גם4,5,6 ,7. המחקרים באמצעות רגשים אלו הוביל הממצא הזה חלבונים כגון טאו או α-synuclein זה זמן נחשבו בלעדי cytoplasmic נוכחות גם הן מבחינה פיזיולוגית ב- ISF-4,-5,-8.
אחד הקשיים בעזרת microdialysis הגששים גדול לחתוך ממברנות (בדרך כלל מעל 1,000 kDa) היא כי הם רגישים יותר אולטראפילטרציה אובדן נוזלים עקב הלחץ הפנימי שמצטבר את הגששים. הגששים Microdialysis המשמש כאן יש מבנה ייחודי כדי להימנע מבעיה זו. הלחץ לא יבנה בשל מבנה זה, ובכך microdialysis עם הגששים אלה צריך להיות מופעל במצב "push-pull" באמצעות מזרק משאבה כדי perfuse את הגששים (= דחיפה), משאבה סחרור/רולר כדי לאסוף את מגיע dialysate מהשפך בדיקה (= משיכה) 9 (למרות שצריך לדחוף ולמשוך משאבות, בעקבות לחץ ביטול חורים פתח ב הגששים, המערכת טכנית רק מונעת על ידי משיכה המשאבה). מאמר זה מתחיל עם הניתוח stereotaxic של השרשה בצינורית מדריך, מאמר זה מתאר כיצד להגדיר קווים microdialysis כדי לאסוף הקרן באמצעות microdialysis הגששים עם 1,000 kDa ניתוק ממברנות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
מחקרים שנעשו בבעלי חיים כל היו נבדקו ואושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה בוגר בית הספר לרפואה של אוניברסיטת טוקיו.
1. מראש הליך כירורגי
- לפני תחילת הניתוח, למחוק את הכל עם 70% אתנול כדי לשמור על תנאים סטריליים. תמיכה תרמי באמצעות כרית החימום מומלץ.
- עזים ומתנגד העכברים בזריקה בקרום הבטן של קלוראל-הידרייט (400 מ"ג/ק"ג). לאשר ההרדמה על-ידי ביצוע קמצוץ הבוהן. מומלץ להשתמש meloxicam SR אינדוקציה, הבופרנורפין עם החלמתם ההצעה לפחות 24 שעות.
- לגלח את השיער עם בטלוויזיה כירורגי. לתקן את עכבר עכבר, חולדה neonatal מתאם באמצעות מלחציים האף וברים של האוזן.
הערה: חיוני כדי לוודא את הראש העכבר מאובטחת בשלב זה, לא זזה side-by-side. - הוטרינר משחה למרוח את העיניים כדי למנוע יובש תחת הרדמה.
2. stereotaxic לניתוח ההשתלה בצינורית מדריך
- הגדר את העכבר ואת מתאם עכברוש neonatal על המנגנון stereotaxic. לעשות חתך sagittally על העור על פני הגולגולת באמצעות אזמל. נגב את הדם ואת רקמת חיבור על הגולגולת באמצעות מקלון צמר גפן לח.
- לקבוע את הקואורדינטה עבור אזור המוח עניין באמצעות המוח אטלס. לפני תחילת המדידות, ודא את קו האמצע הוא ישר המקדחה שניתן יהיה להעביר A-P של להישאר על התפר קו האמצע כל הזמן.
הערה: מאמר זה משתמש הקואורדינטה (A / p: -3.1 מ. מ., M/l:-2.5 מ מ, יח/v:-1.2 מ מ, 12 מעלות) כדי להתמקד ההיפוקמפוס האחורי. - הגולגולת רמה A-P
- צרף תרגיל על תחמן של מסגרת stereotaxic. הנמך את התרגיל עד בעדינות שייגע למדא והקלטה של קואורדינטות הגחון שלו. חזור על הליך זה עבור bregma.
הערה: כאשר הגולגולת היא החלקה, המידה האנכית של bregma שווה לזה של למדא. אם לא, שנה את הגובה של האף קלאמפ בהתאם. אחרי הגולגולת מקבל החלקה, לתעד את הקואורדינטה הקדמי/אחוריים, לרוחב של bregma.
- צרף תרגיל על תחמן של מסגרת stereotaxic. הנמך את התרגיל עד בעדינות שייגע למדא והקלטה של קואורדינטות הגחון שלו. חזור על הליך זה עבור bregma.
- רמת הגולגולת משמאל לימין
- להעביר את התרגיל bregma הקואורדינטה (A / p: -3.1 מ. מ., M/l: +2.0 מ מ), להוריד את התרגיל בגולגולת ולהקליט את האנכית. לאחר מכן חזור על הליך זה עבור הקואורדינטה (A / p: -3.1 מ. מ., M/l:-2.0 מ מ).
הערה: אם הגולגולת הוא ומחבל אנכי של שתי נקודות קו מקביל מן האמצע שהמדידות שווה. אם לא, שנה את הגובה של פסי האוזן.
- להעביר את התרגיל bregma הקואורדינטה (A / p: -3.1 מ. מ., M/l: +2.0 מ מ), להוריד את התרגיל בגולגולת ולהקליט את האנכית. לאחר מכן חזור על הליך זה עבור הקואורדינטה (A / p: -3.1 מ. מ., M/l:-2.0 מ מ).
- לקדוח חור burr בקפידה-הקואורדינטה היעד (A / p: -3.1 מ. מ., M/l:-2.5 מ מ) כדי להשתיל בצינורית מדריך. אם הקוטר של חור burr אינו גדול מספיק עבור ההשתלה בצינורית מדריך, נקדח חור נוסף החופפים עם החלק הראשון. נקדח חור נוסף על עצם הקודקוד הימני (בצד contralateral) ולהוסיף בורג העצם, אשר מסייע לאבטח שיניים מלט ב 1.10 (ראה איור 1B).
- לחתוך חתיכה נעילה סיבובית מן הצד האחורי של מכסה של שפופרת צנטרפוגה 1.5 mL על ידי סכין גילוח ולעשות 'כתר '. הכתר הזה משמש כדי למנוע מלט שיניים מריחה על העור. למקם אותו על הגולגולת כך נקבים שנעשו בשלב 2.5 להישאר בתוך המעגל (ראה איור 1).
- כוונן אסיפה stereotaxic על ידי הצבת בצינורית מדריך על זרוע קצרה יותר של מתאם stereotaxic ' להדק אותו באמצעות אגוז cap. הגדר את הזרוע יותר של מתאם stereotaxic המלחציים אלקטרודה. לצרף אותו על manipulator של המנגנון stereotaxic (ראה איור 1 א').
- לסובב את מכלול stereotax D-V על הזרוע מניפולטור ב- 12 מעלות (ראה איור 1B). להעביר את הצינורית מדריך החור burr ב 1.6. הכנס את הצינורית מדריך לאט לתוך המוח על ידי הורדתו מאת 1.2 מ מ.
הערה: הזווית של המכשיר הוא ספציפי בהיפוקמפוס; אזורים אחרים עשויים לדרוש בכלל זוויות אחרות או אין זווית. התייעץ עם אטלס של המוח עבור קואורדינטות מדויקות. לייבש את פני השטח של הגולגולת, כי אם לא הבטון לא ידבק מלט כובע יכול להפוך יצאה ממקומה - הוסף את הבטון שיניים בתוך הכתר כדי כיסוי מלא בשני מתכת חלק את הצינורית מדריך, הבורג עצם מספיק כדי להבטיח להם. החל מלט שיניים נוספים אם יש חלק של הגולגולת חשוף.
- המתן עד מלט שיניים. זה יבש לחלוטין (~ 12-20 דקות). הסר את מתאם stereotaxic המלחציים אלקטרודה. להסיר את האגוז קאפ, להחליף את מתאם stereotaxic בדיקה דמה והדקו האגוז cap.
- שחרר את לחצן העכבר של המנגנון stereotaxic, בית העכבר לבד לכלוב נפרד.
הערה: העכבר אסור להשאיר ללא השגחה עד זה שהכרתו מספיק כדי לשמור על recumbency בחזה ובצלעות. בדוק את העכבר מדי יום עד היום של microdialysis. העכבר מקבל NSAIDs כגון carprofen אם נראה שזה כואב. מחכה שבועיים הכרחי ללימודי שינה העכבר habituates הסביבה החדשה10, אך סוגים אחרים של מחקרים עשוי לדרוש תקופות התאוששות קצר יותר (למשל, 1-2 ימים).
3. Microdialysis ההתקנה
- בדיקת איכות של הגששים: מילוי מזרק חד פעמיות 1 מ"ל עם מים מזוקקים לחבר אותו לשקע (יציאה קצרות יותר) של בדיקה באמצעות צינור byton. מכסה את חורי אוורור עם האצבעות, את הבוכנה מזרק בעדינות כדי לצקת מים על החללית. בדוק את המים מופיע מן הים בדיקה ויש אין נזילה על-פני קרום microdialysis.
- הפעלה של הגששים: להטביע את הממברנות של החללית אתנול (70-100%) לשתי שניות. לאחר מכן, להשרות מים מזוקקים לתוך המכשיר שוב עם מזרק שוב.
- הכנת מאגר זלוף: כדי למנוע הידבקות של מולקולות יעד דקים, להוסיף BSA על ידי דילול פתרון BSA 30% 4% עם נוזל מוחי שדרתי מלאכותי (1.3 מ'מ CaCl2, 1.2 מ מ MgSO4, 3 מ מ אשלגן כלורי, 0.4 מ מ ח'2PO4, 25 מ מ NaHCO3 , 122 מ מ NaCl, pH = 7.35), אשר תתאם אלקטרוליט ריכוז ב- CSF, מיד לפני השימוש. לסנן את המאגר זלוף דרך יחידת מסנן מזרק עם גודל הנקבוביות מיקרומטר 0.1.
הערה: 4% BSA משפרת את שחזור שנשארת חלבונים אך קשות יכול להגביל את המסירה של תרכובות, במיוחד עבור תרכובות בעלות BSA-מחייבת גבוהה. זהו אחד היתרונות של שימוש ריכוז נמוך יותר של BSA (כגון 0.15%) מסוימים מופעים3. שימו לב: BSA יכול לצבור בקלות רבה כאשר נסער על ידי מערבולת או מערבבים בצלחת. אגרגטים אלה יכולים להיסתם הגששים או קרום נקבוביות. נקוט זהירות בעת הכנת פתרון BSA כדי להגביל את מצבור - להכין שני קווים נפרדים עבור כניסת ו אאוטלט (ראה באיור 1C) וחבר שני הקווים עם מחט חיבור. ממלאים מזרק חד פעמיות mL 3 מלא זלוף מאגר וחבר אותו עם סיום כניסת הצנרת באמצעות מחט בלנט-end. למלא את הצנרור כולו עם מאגר זלוף על-ידי הפעלת המשאבה מזרק.
- לעצור את משאבת מזרק והחלף את המחט חיבור בין כניסת קו וקו עודפים בדיקה microdialysis מופעל משלב 3.3 (ראה איור 1C). לפני החלפת הזה, לשים כובע אגוז על החללית.
- לטעון את צינור רולר לאורך צינור עודפים על המשאבה רולר. התחל את משאבת מזרק ב- µL 10/דקה ואז המשאבה רולר בקצב הזרימה מעט איטי יותר (9.5-9.8 µL/דקה). הקפד להסיר את כל הבועות אוויר בתוך הצנרת כולה, העלולים להשפיע על ההתאוששות כאשר הם מזינים את המכשיר.
- עזים ומתנגד העכבר משלב 1.12 באותו אופן כמו שלב 1.2. שים את הקולר העכבר מסביב לצוואר. להסיר את הכובע אגוז לווין דמה, לאט להוסיף בדיקה microdialysis 3.4 דרך הצינורית מדריך והדקו האגוז cap.
- המקום עכבר בכלוב מחובר חינם-המעבר מערכת בעלת הקשר העכבר עם הצווארון. להמשיך לרוץ גם משאבת מזרק וגם משאבת רולר קצב זרימה שצוין בשלב 3.5 לפחות שעה.
הערה: כדי להשיג אוסף הקרן מבעלי ער, מאמר זה משתמש מערכת חינם-המעבר, איפה הכלוב עצמו מגיב לתנועת של חיה כדי למנוע tubings פיתול. לחלופין, הזמינות מחברות שונות נוזלי סביבול יכול גם לשמש. - עצור רולר לשאוב תחילה ולאחר מכן את משאבת מזרק. הגדר את קצב הזרימה הרצויה. הפעל המזרק משאבת 20% מהר יותר מאשר המשאבה רולר.
הערה: למשל, אם אתה מפעיל ב- µL 1/דקה, להפעיל את משאבת מזרק 1.2 קצב הזרימה אופטימלית µL לדקה צריך להיות נחוש מדעית עבור כל מולקולה. - איסוף דגימות הקרן: מקום חופשי סוף שקע אבובים על האספן שבר בקירור.
הערה: נפח דגימה המתאים משתנה בהתאם מבחני המשמש לניתוח. - לאחר סיום הניסוי, להסיר את המכשיר. (עזים ומתנגד העכבר לפי הצורך.) להתמודד עם העכבר שחזור באותו האופן כמו שלב 2.11. לנתח את הקרן שנאספו על ידי שיטות כגון hplc, קורס או אליסה.
- כדי לשטוף את הצנרת כולה לאחר microdialysis, התחבר כניסת, tubings שקע שוב על-ידי החלפת המכשיר עם החיבור מחט לרוץ אקונומיקה מדוללת את הצנרת כולה ואת ואז לשטוף את זה עם מים. יבש ואחסן אותו לשימוש חוזר.
הערה: סוגים אחרים של tubings מקובלים, אולם, BSA במאגר זלוף יכולים להיסתם דקים בקוטר קטן, ובכך tubings אלה נחשבים לשימוש יחיד. Tubings יכול להיות משוחק או סתומות לאחר מספר שימושים, אז ודא כי קצב הזרימה עקבי בכל פעם לפני השימוש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי לעורר או לעכב פעילות. עצבית הפוכה microdialysis11,12,13, picrotoxin, אנטגוניסט GABAA או טטרודוטוקסין, שימשו חוסם ערוץ Na+ . הוכח, כי שחרור טאו הוא מגורה על ידי הגדלת פעילות. עצבית13,14. בקנה אחד עם אלו תצפיות הקודם, כאשר 50 מיקרומטר picrotoxin (PTX) היה מנוהל באמצעות microdialysis הפוכה (ראה דיון לפרטים נוספים) בעכברים C57B6/J ער גדל רמות נמדדת אליסה לעומת הרכב שליטה (דימתיל סולפוקסיד) (טאו אנדוגני של הקרן הלאומית למדע איור 2).
איור 1: הגדרת ניתוח והקמת microdialysis מעגלים. (א) להגדיר אסיפה stereotaxic להשתלה מדריך באמצעות אגוז קאפ, מתאם stereotaxic בצינורית מדריך. (B) Stereotaxic לניתוח כדי להשתיל בצינורית מדריך. הצינורית מדריך נוסף המוח ב-12 מעלות ביחס אנכי. (ג) בניית של צינורות כניסת ו של אבובים עודפים. כניסת קו מורכב של 70 ס"מ FEP אבובים (JF-70) ומורכבת הקו עודפים JF-70, הצינור רולר ו- 1/2 צינורות FEP. המחטים חיבור משמשים עבור כל חיבור. (ד) ברגע הצנרת כולה מלאה מאגר זלוף, לעצור את המשאבה והחלף את המחט חיבור בין כניסת קו וקו עודפים החוקרת שהופעלה microdialysis. ודא כי חבר את הקצה של כניסת צינורות ליציאת כניסת של בדיקה (זמן יציאה) ולהתחבר לסוף צינור עודפים עם שקע הנמל של בדיקה (יציאה קצרה יותר). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: נציג נתונים מציג שינויים טאו הקרן על picrotoxin הפוך microdialysis. Picrotoxin (PTX, 50 מיקרומטר) או דימתיל סולפוקסיד נשלחו לתוך ההיפוקמפוס של עכברים C57B6/J ויה microdialysis הפוך. Picrotoxin גדלה במהירות הקרן טאו אנדוגני רמות רמות הבסיס שלה (קרי, הריכוזים טאו הממוצע במהלך 3 שעות לפני PTX המינהל) לעומת טיפול דימתיל סולפוקסיד. הנתונים מוצג mean±SEM, n = 3 עבור דימתיל סולפוקסיד, n = 4 עבור PTX. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Microdialysis עם משקל מולקולרי גבוה לחתוך ממברנות להפעלה על-ידי מצב מו-דו, וכך זה קריטי כי קצב הזרימה הוא מדויק וקבוע. אי-הדיוק את שיעורי זרימת יכול להיות הגורם של דור בועות אוויר, חוסר עקביות הריכוז לדוגמה. אם הזרם הוא לא עקבי, בדוק את כל חיבורי עבור דליפה. אם הבעיה עדיין נמשכת, ייתכן צורך להתחיל מחדש עם המחקרים החדשים וכל tubings.
הגששים Microdilaysis הם perfused באופן רציף על-ידי המאגר זלוף. לכן, אין מספיק זמן עבור מולקולות חוץ-תאית להגיע שיווי משקל מלא במאגר זלוף. כתוצאה מכך, ריכוז dialysate הוא הרבה יותר הריכוז שלו בפועל ב- ISF נמוך. כדי לאמוד את הריכוז האמיתי של המולקולות של הקרן הלאומית למדע, שיטה זרימת אפס הוא לעתים קרובות משמש3,5,15. שיטה זו מודדת הריכוז על ידי שינוי קצב הזרימה. יש הופכי בין בין הריכוז קצב הזרימה. לכן, הריכוז של מולקולות היעד יכול להיקבע על ידי חיוץ העקומה המעריכית לחזור התיאורטי זרימת אפס, אשר מייצג את שחזור מושלם של המולקולות. אולם, ההחלמה יכול להיות מושפע על ידי גורמים שונים, ביניהם אינטראקציה עם ממברנות או hydrophobicity של מולקולות או אינטראקציה עם חלבונים אחרים, אחד צריך לזכור כי הריכוז באפס תיאורטי ייתכן לא בהכרח המקבילה שלה ריכוז נכון ב- ISF.
ההכנסה בדיקה גורמת פגיעה מקומית חריפה במוח. מתוך כך, השברים במספר הראשון יכללו בדרך כלל ניתוח נוסף. למעשה, רמות חלבון טאו הקרן ההיפוקמפוס אינם יציבים בשעה 9-15 הראשונה סביר כי הפגיעה חריפה גורם לשחרור שאינם ספציפיים של טאו לתוך הקרן (תצפית שלא פורסמו של המחבר). התאוששות לאחר בדיקה ההכנסה פגיעה משתנה מיעד ליעד. לימודי טייס צריכה להתבצע כדי לקבוע מתי לכל מטרה מגיע לדרגה מצב יציב כדי לקבוע מתי צריך להיות מנותח דגימות. החלטה זו קובעת את "נקודת ההתחלה" לדיגום microdialysis. נקודת קצה עבור הדגימה היא כאשר המטרה היא כבר לא באיזה מצב יציב (בדרך כלל 3-5 ימים לאחר microdialysis בדיקה השרשה; לא מדריך השרשה). ההתחלה והסיום עבור כל מטרה צריך להיקבע מדעית על ידי כל מעבדה עבור כל מטרה.
Microdialysis שימושית במיוחד בשילוב עם הטיפול בתרופה. סמים יכולים להיות מנוהל מערכתית או ישירות שאנרגית הקרן. Microdialysis הפוכה היא אחת השיטות שבה ישירות בהזרקות תרכובות קטן דרך הגששים. דיאליזה מתרחש דו-directionally. לכן, הכללת תרופות במאגר זלוף מאפשרת דיפוזיה שלה למרות microdialysis רגשים הרקמה שמסביב. שיטה זו אפשרה הממשל המקומי של מתחם קטן ואיסוף סימולטני של הקרן. Microdialysis הפוכה היא פחות פולשנית בהשוואה זריקה לחץ דרך הצינורית ולתחזק יותר מתמיד ריכוז סמים באזור היעד.
לפני תחילת microdialysis הפוכה, נפח פנימי של אבובים כולו צריך להילקח בחשבון כדי לחשב את התזמון של טיפול וגבייה מדגם. לדוגמה, נפח פנימי של אבובים כל שימוש במאמר זה הוא 91.5 µL (עיין את הטבלה של חומרים עבור אחסון פנימי של כל צינורות). לכן, כאשר קצב הזרימה µL 1.0/min, זה לוקח דקות 91.5 עבור מאגר זלוף המכילים תרופות כדי להגיע האספן שבר. מצד שני, כאשר תרופות נמסרות מערכתית, יש לשקול את הנפח הפנימי של הצנרת אאוטלט (56.5 µL במקרה זה).
In vivo שיטת microdialysis מציע כמה יתרונות על פני שיטות אחרות. לדוגמה, בזמן סביר homogenates המוח מורכב של חלבונים תאיים והן חוץ-תאית, microdialysis במיוחד אוספת חלבונים חוץ-תאי של הקרן. שנית, מכשיר בדיקה microdialysis יחיד יכול לאסוף הקרן בנקודות זמן שונות של אותה חיה. אפשרות לנרמל את היעד ריכוז בכל מדגם כתוכנית בסיסית %. זה מווסת את ריכוז מוחלט בין בעלי חיים כדי שניתן יהיה להשוות הבדלים יחסיים. זה מגביר את כוחו של מחקר, בדרך כלל מפחית את מספר בעלי חיים לצורך ניסוי בהשוואת היחסי הבדלי רמות החלבון בעקבות ניהול/מניפולציה לסמים. לעומת זאת, המגבלה העיקרית של microdialysis היא ההגבלה על הגודל של מולקולת המטרה.
Microdialysis יכול להיות משולב עם טכניקות אחרות ויוו . לדוגמה, ביצוע microdialysis ב regulatable העכברים הטרנסגניים יכולים להעריך ויוו מחזור של חלבון המטרה16. השילוב עם EEG, מדידה שימש למדידת פעילות חשמלית במוח במהלך הפוך microdialysis11. Optogenetics זמין מניפולציה של הפעילות העצבית במוח בזמן בו זמנית איסוף הקרן17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחבר אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי ' מענק הסיוע למחקר מדעי בתחומים חדשניים (חלבון להזדקנות המוח, דמנציה Control)(15H01552) MEXT, מענק הסיוע עבור צעירים מדענים (B) (16K 20969). המחבר תודה ד ר דוד מ הולצמן, ד ר ג'ון ר' Cirrito על עצות טכניות במהלך הפיתוח של שיטה זו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| The Univentor 820 Microsampler | Univentor | 8303002 | Refrigerated fraction collector |
| Syringe pump | KD scientific | KDS-101 | |
| Roller pump | Eicom microdialysis | ERP-10 | |
| Raturn Stand-Alone System | BASi | MD-1409 | Free-moving system |
| Dual species cage kit | BASi | CX-1600 | |
| AtmosLM Microdialysis probe (shaft length 8 mm, membrane length 2 mm) | Eicom microdialysis | PEP-8-02 | Shaft length for a probe, a guide, a dumy probe and a stereotaxic adaptor should be identical. |
| Microdialysis guide (shaft length 8 mm) | Eicom microdialysis | PEG-8 | |
| Microdialysis dummy probe (shaft length 8 mm) | Eicom microdialysis | PED-8 | |
| Bone screw | BASi | MD-1310 | |
| Super bond C&B set | Sunmedical | Dental cement | |
| Small animal Stereotaxic Instrument with digital display console | Kopf | Model 940 | Stereotaxic apparatus |
| Mouse and neonatal rat adaptor | Stoelting | 51625 | |
| Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse Stereotaxic | Stoelting | 51648 | |
| Albumin solution from bovine serum | Sigma | A7284-50ML | 30% BSA solution |
| FEP tubing (70 cm) | Eicom microdialysis | JF-10-70 | Internal volume = 0.5 µL/cm |
| Teflon tubing (50 cm) | Eicom microdialysis | JT-10-50 | Internal volume = 0.08 µL/cm |
| Byton tube | Eicom microdialysis | JB-30 | |
| Intramedic luer stab adaptor 23G | BD | 427565 | Blunt end needle |
| Roller tube | Eicom microdialysis | RT-5S | Internal volume = 4 µL |
| Cap nut | Eicom microdialysis | AC-5 | |
| 0.25 mL microcentrifuge tube with cap | QSP | 503-Q | Tubes for fraction collector |
| Sterotaxic adaptor (shaft length 8 mm) | Eicom microdialysis | PESG-8 | |
| Connection needle | Eicom microdialysis | RTJ | |
| Mouse animal collar | BASi | MD-1365 | |
| High Speed Rotary Micromotor kit | FOREDOM | K.1070 | Drill |
| Picrotoxin | Sigma | P1675 | |
| Screw driver for bone screws | |||
| Scalpel | |||
| Cotton swab | |||
| Surgical clipper |
References
- Lei, Y., Han, H., Yuan, F., Javeed, A., Zhao, Y. The brain interstitial system: Anatomy, modeling, in vivo measurement, and applications. Progress in Neurobiology. 157, 230-246 (2017).
- Kushikata, T., Hirota, K.
- Cirrito, J. R., et al. In vivo assessment of brain interstitial fluid with microdialysis reveals plaque-associated changes in amyloid-beta metabolism and half-life. The Journal of Neuroscience. 23 (26), 8844-8853 (2003).
- Emmanouilidou, E., et al. Assessment of α-synuclein secretion in mouse and human brain parenchyma. PLoS One. 6 (7), 1-9 (2011).
- Yamada, K., et al. In vivo microdialysis reveals age-dependent decrease of brain interstitial fluid tau levels in P301S human tau transgenic mice. The Journal of Neuroscience. 31 (37), 13110-13117 (2011).
- Ulrich, J. D., et al. In vivo measurement of apolipoprotein E from the brain interstitial fluid using microdialysis. Molecular Neurodegeneration. 8 (1), 13 (2013).
- Emmanouilidou, E., et al. GABA transmission via ATP-dependent K+ channels regulates α-synuclein secretion in mouse striatum. Brain. 139 (3), 871-890 (2016).
- Takeda, S., et al. Seed-competent high-molecular-weight tau species accumulates in the cerebrospinal fluid of Alzheimer's disease mouse model and human patients. Annals of Neurology. 80 (3), 355-367 (2016).
- Yamada, K. In vivo Microdialysis of brain interstitial fluid for the determination of extracellular tau levels. Methods in Molecular Biology. 1523, 285-296 (2017).
- Kang, J. -E., et al. Amyloid-β dynamics are regulated by orexin and the sleep-wake cycle. Science. 326 (November), 1005-1008 (2009).
- Cirrito, J. R., et al. Synaptic activity regulates interstitial fluid amyloid-beta levels in vivo. Neuron. 48 (6), 913-922 (2005).
- Bero, A. W., et al. Neuronal activity regulates the regional vulnerability to amyloid-β deposition. Nature Neuroscience. 14 (6), 750-756 (2011).
- Yamada, K., et al. Neuronal activity regulates extracellular tau in vivo. Journal of Experimental Medicine. 211 (3), 387-393 (2014).
- Pooler, A. M., Phillips, E. C., Lau, D. H. W., Noble, W., Hanger, D. P. Physiological release of endogenous tau is stimulated by neuronal activity. EMBO Reports. 14 (4), 389-394 (2013).
- Castellano, J. M., et al. Human apoE isoforms differentially regulate brain amyloid-β peptide clearance. Science Translational Medicine. 3 (89), 89ra57 (2011).
- Yamada, K., et al. Analysis of in vivo turnover of tau in a mouse model of tauopathy. Molecular Neurodegeneration. 10 (1), 55 (2015).
- Taylor, H., et al. Investigating local and long-range neuronal network dynamics by simultaneous optogenetics, reverse microdialysis and silicon probe recordings in vivo. Journal of Neuroscience Methods. 235, 83-91 (2014).
