Summary
Na vivo microdialysis permitiu a coleção de moléculas presentes no líquido intersticial do cérebro (ISF) de animais acordados, se comportando livremente. Para analisar moléculas relativamente grandes no ISF, o atual artigo enfoca especificamente o protocolo microdialysis usando sondas com alto peso molecular, cortar as membranas.
Abstract
Na vivo microdialysis é uma técnica poderosa para coletar ISF de animais acordados, livremente-comportando-se com base em um princípio de diálise. Enquanto microdialysis é um método estabelecido que mede relativamente pequenas moléculas incluindo aminoácidos ou neurotransmissores, ela tem sido usada recentemente para avaliar também a dinâmica de moléculas maiores em ISF usando sondas com alto peso molecular, cortar membranas. Ao usar tais sondas, microdialysis tem de ser executado em um modo de encaixe para evitar pressão acumulada dentro as sondas. Este artigo fornece protocolos passo a passo, incluindo cirurgia estereotáxica e como configurar microdialysis linhas para coletar as proteínas do ISF. Durante microdialysis, medicamentos podem ser administrados sistemicamente ou por infusão direta no ISF. Microdialysis reversa é uma técnica para infundir diretamente compostos no ISF. Inclusão de drogas no buffer de perfusão microdialysis permite que eles se espalham ISF através de sondas, recolhendo simultaneamente ISF. Medindo a proteína tau, por exemplo, o autor mostra como seus níveis são alterados mediante estimulante atividade neuronal por microdialysis reversa de Picrotoxina. Vantagens e limitações do microdialysis são descritas juntamente com o aplicativo estendido pela combinação de outros métodos na vivo .
Introduction
ISF é composto por 15-20% do volume total do cérebro e oferece um microambiente crítica para a transdução de sinal, transporte de substrato e afastamento de resíduos1. Portanto, a capacidade de coletar ISF de animais vivos proporcionará maiores implicações para diversos processos biológicos, bem como o mecanismo da doença. Na vivo microdialysis é um dos poucos métodos que a amostra e quantificar extracelulares moléculas do ISF de acordado, movimentando-se livremente os animais e, assim, serve como uma ferramenta útil na neurociência pesquisa campo2,3. Neste método, microdialysis sondas com membrana semipermeável são inseridas no cérebro e perfundidas com perfusão na taxa de fluxo relativamente lento (0.1-5 µ l/min). Durante esta perfusão, moléculas extracelulares em ISF passivamente a sonda de acordo com o gradiente de concentração se espalham e recolher como um dialisato. Embora este artigo centra-se sobre o método a amostra ISF no cérebro, tanto o princípio e o método podem ser aplicados a outros órgãos por modificação apropriada se necessário.
Microdialysis primeiro foi empregado na década de 1960 e desde então ela tem sido extensivamente usada para coletar pequenas moléculas incluindo aminoácidos ou neurotransmissores no cérebro. No entanto, recente disponibilidade comercial do microdialysis sondas com alto peso molecular cortar membranas (100 kDa-3 MDa) estendeu sua aplicação às proteínas relativamente maiores no ISF, bem4,5,6 ,7. Os estudos usando estas sondas levou à constatação que proteínas como tau ou α-synuclein que há muito se julgava ser exclusivo citoplasmático também são fisiologicamente presente no ISF4,5,8.
Uma das dificuldades usando sondas microdialysis com grande corte de membranas (normalmente mais de 1.000 kDa) é que eles são mais suscetíveis à perda de líquidos ultrafiltração, devido à pressão interna acumulada nas sondas. Microdialysis sondas usadas aqui tem uma estrutura única para evitar esse problema. A pressão não irá ser construída devido a essa estrutura, assim microdialysis com estas sondas deve ser operado em um modo de "push-pull" usando uma bomba de seringa para perfundir as sondas (= impulso) e uma rolo/peristáltica para coletar a vinda do fluído da tomada da sonda (= puxar) 9 (embora precisa de push e pull de bombas, devido à pressão, cancelando os orifícios de ventilação, presente nas sondas, o sistema é tecnicamente apenas impulsionado pela bomba puxar). Este artigo começa com a cirurgia estereotáxica de uma implantação de cânula guia e descreve como criar linhas microdialysis para coletar ISF através das sondas microdialysis com 1.000 membranas de Cut-off de kDa.
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Protocol
Todos os estudos em animais foram revistos e aprovados pelo Comitê de uso da pós-graduação da faculdade de medicina da Universidade de Tóquio e institucional Cuidado Animal.
1. pré-cirúrgico
- Antes de iniciar a cirurgia, limpe tudo com etanol a 70% para manter condições estéreis. Recomenda-se apoio térmico usando uma almofada de aquecimento.
- Anestesia os ratos por injeção intraperitoneal de hidrato de cloral (400 mg/kg). Confirme anesthetization realizando uma pitada de dedo do pé. Recomenda-se o uso de meloxicam SR na indução e buprenorfina após a tentativa de recuperação pelo menos 24 h.
- Raspe o cabelo com uma tesoura cirúrgica. Conserte um mouse no mouse e adaptador de rato neonatal usando barras de orelha e uma pinça de nariz.
Nota: É fundamental para garantir que essa cabeça de rato é protegida nesta fase e não se move side-by-side. - Aplica o vet pomada nos olhos para evitar ressecamento enquanto sob anestesia.
2. estereotáxica cirurgia para implantação de cânula guia
- Defina o rato e o rato neonatal adaptador sobre o aparelho estereotáxica. Fazer uma incisão essas na pele sobre o crânio com um bisturi. Limpe o sangue e o tecido conjuntivo no crânio usando um cotonete úmido.
- Determine a coordenada para a região do cérebro de interesse usando o atlas do cérebro. Antes de iniciar as medições, certifique-se que na linha média é em linha reta para que a broca pode ser movido A-P e permanecem, na sutura mediana, o tempo todo.
Nota: Este artigo usa a coordenada (A / p:-3,10 mm, M/l:-2,50 mm, D/v:-1,20 mm, 12 graus) para direcionar o hipocampo posterior. - Crânio de nível A-P
- Anexe uma broca em um manipulador de armação estereotáxica. Baixe a broca até que toca suavemente lambda e gravar seu coordenar ventral. Repita este procedimento para bregma.
Nota: Quando o crânio é nivelado, a medida vertical do bregma é igual do lambda. Se não, ajuste de altura do grampo do nariz em conformidade. Depois que o crânio fica nivelado, grave a coordenada anterior/posterior, lateral do bregma.
- Anexe uma broca em um manipulador de armação estereotáxica. Baixe a broca até que toca suavemente lambda e gravar seu coordenar ventral. Repita este procedimento para bregma.
- Nível crânio esquerda-direita
- Mova a broca de bregma para a coordenada (A / p:-3,10 mm, M/l: +2,0 mm), reduzir a perfuração no crânio e gravar a coordenada vertical. Em seguida, repita este procedimento para a coordenada (A / p:-3,10 mm, M/l:-2,00 mm).
Nota: Se o crânio é nivelado, estas medições verticais de dois pontos equidistantes da linha média são iguais. Caso contrário, ajuste a altura das barras de orelha.
- Mova a broca de bregma para a coordenada (A / p:-3,10 mm, M/l: +2,0 mm), reduzir a perfuração no crânio e gravar a coordenada vertical. Em seguida, repita este procedimento para a coordenada (A / p:-3,10 mm, M/l:-2,00 mm).
- Faça um furo de rebarba cuidadosamente na coordenada alvo (A / p:-3,10 mm, M/l:-2,50 mm) para implantar uma cânula guia. Se o diâmetro de um orifício de trépano não é grande o suficiente para uma implantação de cânula guia, faça outro furo que se sobrepõe com o primeiro. Faça outro furo no osso parietal direito (lado contralateral) e inserir um parafuso ósseo, que ajuda a proteger o cimento dental em 1.10 (ver figura 1B).
- Cortar uma peça de fixação circular da parte traseira da tampa do tubo de centrífuga 1,5 mL por uma lâmina de barbear e fazer uma 'coroa '. Esta coroa é usada para evitar cimento dental propagação à pele. Coloque-o no crânio para que a trepanação feita na etapa 2.5 fique dentro do círculo (ver Figura 1).
- Criar uma assembleia estereotáxica, colocando uma cânula guia no braço mais curto de um adaptador estereotáxica e fixá-la usando uma porca. Defina o braço mais comprido do adaptador estereotáxica no grampo do eletrodo. Anexá-lo sobre a manipulação do aparato estereotáxica (ver figura 1A).
- Rode o conjunto de stereotax de D-V no braço manipulador por 12 graus (ver figura 1B). Mova a cânula guia para o orifício de trépano feito em 1.6. Inserir a cânula guia lentamente o cérebro por abaixá-la por 1,2 mm.
Nota: O ângulo da sonda é específico para o hipocampo; outras regiões podem exigir outros ângulos ou nenhum ângulo em tudo. Consulte um atlas do cérebro para as coordenadas precisas. Secar a superfície do crânio, porque se não o cimento não furará e tampão de cimento pode tornar-se desalojado. - Adicione o cimento dental dentro da coroa para cobrir totalmente as duas parte metálica da cânula do guia e do parafuso ósseo suficiente para fixá-los. Aplique o cimento dental adicional se houver uma parte do crânio exposta.
- Espere até cimento dental está completamente seco (~ 12 / 20 min). Remova o adaptador estereotáxica da braçadeira do eletrodo. Remova a porca e substituir o adaptador estereotáxica com uma sonda de manequim e aperte a porca.
- Solte o mouse do aparelho estereotáxica e o mouse sozinho em uma gaiola individual de casa.
Nota: O mouse não deve ser deixado sem supervisão até que recuperou a consciência suficiente para manter a prostração esternal. Verificar o mouse diariamente até o dia do microdialysis. O rato recebe AINEs como carprofeno se parece estar com dor. À espera 2 semanas é necessária para estudos do sono para que o mouse habitua-se ao novo ambiente de10, mas outros tipos de estudos podem exigir períodos de recuperação mais curtos (por exemplo, 1-2 dias).
3. Microdialysis Setup
- Verificação da qualidade das sondas: Encha uma seringa descartável 1ml com água destilada e conectá-lo à tomada (porto mais curto) de uma sonda usando um tubo de byton. Cubra os orifícios de ventilação com os dedos e pressione o êmbolo da seringa com cuidado para infundir água à sonda. Verifique a água aparece de entrada da sonda e não há nenhum vazamento na superfície de uma membrana microdialysis.
- Ativação de sondas: submergir as membranas de uma sonda no álcool etílico (70-100%) por dois segundos. Em seguida, infundi água destilada na sonda novamente com uma seringa novamente.
- Preparação do buffer de perfusão: a fim de evitar a adesão de moléculas-alvo para as tubulações, adicionar BSA por diluir a solução de BSA de 30% para 4% com CSF artificial (1,3 mM CaCl2, 1,2 mM de MgSO4, 3 mM KCl, 0,4 mM KH2PO4, 25mm NaHCO3 , 122 mM NaCl, pH = 7,35), que corresponde a concentração de eletrólito no CSF, imediatamente antes da utilização. Filtre o buffer de perfusão através de uma unidade de filtro de seringa com tamanho de poro 0.1 µm.
Nota: BSA 4% melhora a recuperação para furar as proteínas mas pode limitar severamente a entrega de compostos, especialmente para compostos com BSA-Associação de alta. Esta é uma vantagem de usar a menor concentração de BSA (tais como 0,15%) em certas instâncias,3. Observe que BSA pode agregar muito facilmente quando agitado pela placa de vórtice ou agitação. Estes agregados podem entupir sondas ou poros da membrana. Tenha cuidado ao preparar uma solução de BSA para limitar esta agregação - Preparar duas linhas separadas para entrada e saída (ver Figura 1) e conectar as duas linhas com uma agulha de conexão. Encher uma seringa descartável 3ml preenchida com buffer de perfusão e conectá-lo com o fim da entrada da tubulação usando uma agulha sem corte-extremidade. Encha o tubo inteiro com buffer de perfusão executando a bomba de seringa.
- Parar a bomba de seringa e substituir a agulha de conexão entre a linha de entrada e saída linha com uma sonda microdialysis registrados da etapa 3.3 (ver Figura 1). Antes esta substituição, coloque a porca a sonda.
- Monte o tubo do rolo na tubulação de saída sobre a bomba de roletes. Começa a bomba de seringa em 10 µ l/min e, em seguida, a bomba de roletes na taxa de fluxo um pouco mais lenta (9.5-9,8 µ l/min). Certifique-se de remover todas as bolhas de ar na tubulação de todo, que pode influenciar a recuperação quando eles entram a sonda.
- Anestesia o mouse da etapa 1.12 da mesma forma como na etapa 1.2. Coloque a coleira do mouse ao redor de seu pescoço. Remova a porca e a sonda fictícia e lentamente inserir uma sonda microdialysis de 3.4 através da cânula de guia e aperte a porca.
- Lugar o rato na gaiola conectado a um sistema de movimentação livre e baraço o mouse com o colar. Continuará operando tanto a bomba de seringa e a bomba de roletes com a taxa de fluxo indicado no passo 3.5 pelo menos 1 h.
Nota: Para obter a coleção de ISF de animais acordados, este artigo usa um sistema de movimentação livre, onde a gaiola em si responde ao movimento do animal para impedir a torção de tubulações. Como alternativa, disponível a partir de várias empresas líquida gira pode ser usada também. - Parar o cilindro de bomba primeiro e, em seguida, a bomba de seringa. Defina a taxa de fluxo desejada. Execute a seringa da bomba 20% mais rápido do que a bomba de roletes.
Nota: por exemplo, se você executar em 1 µ l/min, operar a bomba de seringa de 1.2 µ l/min. taxa de fluxo ideal deve ser determinada empiricamente, para cada molécula. - Coletando amostras ISF: colocar a extremidade livre do tubo de saída no coletor de fração refrigerados.
Nota: Volume de amostra adequada varia de acordo com os ensaios utilizados para análise. - Após a conclusão do experimento, retire a sonda. (Anestesiar o mouse conforme necessário.) Lidar com recuperação de rato da mesma forma como na etapa 2.11. Analise o ISF coletado por métodos tais como HPLC ou ELISA.
- Para lavar o tubo inteiro após microdialysis, conectar a entrada e tubulações da tomada novamente, substituindo a sonda com a conexão da agulha e corrercom a água sanitária diluída na tubulação de todo e em seguida nivelá-lo com água. Secar e armazená-lo para uso repetido.
Nota: Outros tipos de tubulações são aceitáveis, no entanto, BSA no buffer de perfusão pode obstruir as tubulações com diâmetro pequeno, assim, essas tubulações são consideradas como de uso único. As tubulações podem ser desgastadas ou obstruídos após várias utilizações, certifique-se que a taxa de fluxo é consistente toda vez antes de usar.
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Representative Results
Para estimular ou inibir a atividade neuronal em reverso microdialysis11,12,13, Picrotoxina, antagonista dos receptores GABAA ou tetrodotoxina, bloqueador de canal de at+ têm sido utilizados. Ficou demonstrado que a liberação de tau é estimulada pelo aumento da atividade neuronal13,14. Consistente com estas observações anteriores, quando 50 Picrotoxina µM (PTX) foi administrado através do microdialysis reversa (veja a discussão para mais detalhes) em ratos de C57B6/J acordados aumentaram tau endógena de ISF níveis medidos por ELISA em relação ao veículo (de controle (DMSO) A Figura 2).
Figura 1: configuração de cirurgia e a construção de circuitos microdialysis. (A) criar uma assembleia estereotáxica para uma implantação de guia usando uma porca, um adaptador estereotáxica e uma cânula guia. (B) cirurgia estereotáxica para implante uma cânula guia. A cânula guia é inserida no cérebro a 12 graus em relação a vertical. (C) construção de uma tubulação de entrada e um tubo de saída. Linha de entrada consiste de 70cm FEP tubulação (JF-70) e o tubo de descarga consiste em JF-70 e o tubo do rolo e 1/2 da tubulação do FEP. As agulhas de conexão são usadas para cada conexão. (D) uma vez que o tubo inteiro é preenchido com buffer de perfusão, parar a bomba e substituir a agulha de conexão entre a linha de entrada e saída linha com uma sonda microdialysis ativado. Certifique-se de conectar a extremidade do tubo de entrada para a porta de entrada de uma sonda (porta maior) e ligue a extremidade do tubo de saída com abertura de saída de uma sonda (porto mais curto). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: dados representativos, apresentando alterações de tau ISF em cima Picrotoxina inverter microdialysis. Picrotoxina (PTX, 50 µM) ou DMSO foram entregues em hipocampo de ratos C57B6/J através do microdialysis reversa. Picrotoxina rapidamente aumento dos níveis de tau endógena de ISF de seus níveis basais (i.e., as concentrações de tau média durante 3 h antes da administração de PTX) em relação ao tratamento de DMSO. Dados são mostrados como mean±SEM, n = 3 para DMSO, n = 4 para PTX. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Microdialysis com alto peso molecular, cortar as membranas tem que ser operado por um modo de encaixe, assim, é fundamental que a taxa de fluxo é precisa e constante. A imprecisão nas taxas de fluxo pode ser a causa da geração de bolhas de ar e inconsistência da concentração da amostra. Se o fluxo é inconsistente, verifique todas as conexões para detecção de fugas. Se o problema persistir, pode ser necessário para re-iniciar com tubulações e novas sondas.
Microdilaysis sondas continuamente são perfundidas pelo buffer da perfusão. Portanto, não há tempo suficiente para moléculas extracelulares alcançar um equilíbrio completo no buffer de perfusão. Como consequência, a concentração no dialisato é muito menor do que sua concentração real no ISF. A fim de estimar a concentração de moléculas no ISF, um método de fluxo zero é muitas vezes usado3,5,15. Este método mede a concentração, alterando a taxa de fluxo. Há uma relação inversa entre a concentração e a taxa de fluxo. Portanto, a concentração de moléculas-alvo pode ser determinada por extrapolação da curva exponencial para o teórico o fluxo zero, o que representa a perfeita recuperação das moléculas. No entanto, a recuperação pode ser influenciada por vários fatores, tais como interação com membranas ou hidrofobicidade das moléculas ou interação com outras proteínas, e que deve ter em mente que a concentração no teórico zero pode não ser necessariamente equivalente à sua verdadeira concentração no ISF.
Uma inserção de sonda provoca lesão local aguda no cérebro. Dessa razão, as primeiras várias fracções excluem-se normalmente de uma análise mais aprofundada. Na verdade, os níveis de proteína tau ISF no hipocampo não são estáveis na primeira hora 9-15 provavelmente porque a lesão aguda provoca liberação não específica de tau em ISF (observação de inéditos do autor). Recuperação após a lesão de inserção de sonda varia de destino para destino. Estudos-piloto devem ser realizados para determinar quando cada alvo atinge um nível de estado estacionário para determinar quando as amostras devem ser analisadas. Isto determina o "ponto inicial" para amostragem do microdialysis. Um ponto de extremidade para amostragem é quando o alvo não está em estado estacionário (geralmente 3-5 dias após microdialysis sonda implantação; não guia Implantação). Início e fim para cada destino devem ser determinadas empiricamente por cada laboratório para cada destino.
Microdialysis é especialmente útil quando combinado com o tratamento medicamentoso. Drogas podem ser administradas sistemicamente ou directamente infundidas ISF. Microdialysis reversa é um método que infunde diretamente pequenos compostos através de sondas. Diálise ocorre bidirecionalmente. Portanto, inclusão de drogas no buffer de perfusão permite sua difusão embora microdialysis sondas para o tecido circundante. Este método permitiu a administração local da pequena colecção composta e simultânea de ISF. Microdialysis reversa é menos invasivo em comparação com uma injeção de pressão através da cânula e pode manter mais constante concentração de drogas na área alvo.
Antes de iniciar o microdialysis inversa, o volume interno de toda tubulação deverá ter em conta para calcular o tempo de tratamento e coleta de amostra. Por exemplo, o volume interno de toda tubulação usada neste artigo é 91,5 µ l (consulte a Tabela de materiais para o volume interno de cada tubo). Portanto, quando a taxa de fluxo é 1,0 µ l/min, leva 91,5 min para a reserva de perfusão contendo drogas para alcançar o coletor de fração. Por outro lado, quando drogas são entregues sistemicamente, o volume interno do tubo de saída (56,5 µ l neste caso) deve ser considerado.
Na vivo microdialysis método oferece diversas vantagens sobre outras técnicas. Por exemplo, enquanto o cérebro homogenates prováveis consistem de proteínas extracelulares e intracelulares, microdialysis coleta especificamente proteínas extracellular do ISF. Em segundo lugar, uma sonda microdialysis único pode coletar ISF nos pontos de tempo diferentes do mesmo animal. Concentração de destino em cada amostra pode ser normalizada para uma linha de base %. Isso normaliza a concentração absoluta entre animais então diferenças relativas podem ser comparadas. Isto aumenta o poder de um estudo e normalmente reduz o número de animais necessário para uma experiência ao comparar diferenças relativas em níveis de proteína após a administração de drogas/manipulação. Por outro lado, a limitação principal do microdialysis é a restrição do tamanho da molécula alvo.
Microdialysis pode ser combinada com outras técnicas na vivo . Por exemplo, realizar microdialysis em ratos transgénicos impulso pode estimar em vivo volume de negócios de proteína alvo16. A combinação com a medição de EEG,, foi usada para medir a atividade elétrica durante reversa microdialysis11. E optogenetics permitiu a manipulação da atividade neuronal no cérebro enquanto simultaneamente coleta ISF17.
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Disclosures
O autor não tem nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela ' subsídio para a investigação científica em áreas inovadoras (cérebro proteína envelhecimento e demência Control)(15H01552) do MEXT e subsídio para jovens cientistas (B) (16K 20969). O autor agradece Dr. David M. Holtzman e Dr. John R. Cirrito para os conselhos técnicos durante o desenvolvimento deste método.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| The Univentor 820 Microsampler | Univentor | 8303002 | Refrigerated fraction collector |
| Syringe pump | KD scientific | KDS-101 | |
| Roller pump | Eicom microdialysis | ERP-10 | |
| Raturn Stand-Alone System | BASi | MD-1409 | Free-moving system |
| Dual species cage kit | BASi | CX-1600 | |
| AtmosLM Microdialysis probe (shaft length 8 mm, membrane length 2 mm) | Eicom microdialysis | PEP-8-02 | Shaft length for a probe, a guide, a dumy probe and a stereotaxic adaptor should be identical. |
| Microdialysis guide (shaft length 8 mm) | Eicom microdialysis | PEG-8 | |
| Microdialysis dummy probe (shaft length 8 mm) | Eicom microdialysis | PED-8 | |
| Bone screw | BASi | MD-1310 | |
| Super bond C&B set | Sunmedical | Dental cement | |
| Small animal Stereotaxic Instrument with digital display console | Kopf | Model 940 | Stereotaxic apparatus |
| Mouse and neonatal rat adaptor | Stoelting | 51625 | |
| Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse Stereotaxic | Stoelting | 51648 | |
| Albumin solution from bovine serum | Sigma | A7284-50ML | 30% BSA solution |
| FEP tubing (70 cm) | Eicom microdialysis | JF-10-70 | Internal volume = 0.5 µL/cm |
| Teflon tubing (50 cm) | Eicom microdialysis | JT-10-50 | Internal volume = 0.08 µL/cm |
| Byton tube | Eicom microdialysis | JB-30 | |
| Intramedic luer stab adaptor 23G | BD | 427565 | Blunt end needle |
| Roller tube | Eicom microdialysis | RT-5S | Internal volume = 4 µL |
| Cap nut | Eicom microdialysis | AC-5 | |
| 0.25 mL microcentrifuge tube with cap | QSP | 503-Q | Tubes for fraction collector |
| Sterotaxic adaptor (shaft length 8 mm) | Eicom microdialysis | PESG-8 | |
| Connection needle | Eicom microdialysis | RTJ | |
| Mouse animal collar | BASi | MD-1365 | |
| High Speed Rotary Micromotor kit | FOREDOM | K.1070 | Drill |
| Picrotoxin | Sigma | P1675 | |
| Screw driver for bone screws | |||
| Scalpel | |||
| Cotton swab | |||
| Surgical clipper |
References
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