Summary
На здоровье диких рыб может использоваться в качестве показателя состояния водных экосистем. Оценки на основе патанатомия рыбы здоровья обеспечивают документации видимых повреждений или нарушений, данные, используемые для расчета индексов состояния, а также возможность собрать тканей для микроскопической оценке, экспрессии генов и других более глубокий анализ.
Abstract
Антропогенное влияние увеличение питательных веществ и химических загрязнений, изменения среды обитания и изменения климата, могут иметь значительные последствия для популяций рыб. Неблагоприятные эффекты мониторинга, используя Биомаркеры от Организменное на молекулярном уровне, может использоваться для оценки совокупного воздействия на рыб и других организмов. Здоровье рыб применяется во всем мире как индикатор состояния водных экосистем. Оценка здоровья на основе патанатомия рыбы предоставляет данные о видимые аномалии и поражения, паразитов, состояние и organosomatic индексов. Это можно сравнить сайта, сезона и пола, а также височно, документ изменения с течением времени. Рассчитать индекс здоровья рыб для более количественной оценки серьезности могут назначаться различные замечания. Недостатком оценки на основе патанатомия является, что он основан на визуальных наблюдений и состояние факторов, которые не так чувствительны, как ткани и внутриклеточных биомаркеров для Сублетальное воздействие. Кроме того это редко можно выявить причины и факторы риска, связанные с наблюдаемыми отклонениями. Так например поднял поражения или «опухолью» на плавники, губ или поверхности тела может быть новообразования. Однако это также может быть ответ на паразитов, хроническое воспаление или гиперплазия нормальных клеток в ответ на раздражитель. И наоборот новообразования, некоторые паразиты, других инфекционных агентов и многие изменения ткани не видны и поэтому может быть недооценена. Однако в ходе оценки на основе патанатомия, крови (плазмы), тканей для гистопатологии (микроскопических патологии), геномики и другие молекулярный анализ и отолиты для старения могут быть собраны. Эти анализы вниз по течению, вместе с геопространственного анализа, Хабитат оценок, анализ качества и загрязнения воды могут быть важное значение всеобъемлющей экосистемных оценок.
Introduction
Деятельность человека иметь многочисленные негативные последствия для водной среды. Рыбы обитают различные водоемы, которые человеческой популяции воссоздает в и часто использует в качестве источника питьевой воды и следовательно являются важными показателями состояния водной среды. Диких рыб, которые живут и воспроизводить в конкретной среде обитания подвергаются на протяжении всей их жизни на различные раздражители, включая патогены, паразиты, плохое качество воды и химических загрязнений. Тысячи химических веществ ввести наши водные пути через промышленные и бытовые сточные воды, пригородных и городских ливневых и сельскохозяйственные стоки. Эти сложные смеси химических веществ могут иметь добавки, синергетический или антагонистических эффектов на воздействию организмах1,2,3. Кроме того другие экологических стрессоров такие как повышенный низким содержанием растворенного кислорода, питательных веществ, при повышенной температуре или колебания рН может усиливать эффекты химических загрязнителей4,5. Экологических стрессоров также могут влиять на результаты инфекционных заболеваний напрямую путем увеличения числа инфекционных агентов6, повышение вирулентности оппортунистических патогенов7 или подавление иммунного ответа и болезни сопротивление в принимающей8,9,10. По этим причинам растет интерес к биологическим или неблагоприятные последствия, мониторинг11,12,13,14, используя рыбы и других водных организмов, для выявления популяций и экосистем в опасности.
Неблагоприятные эффекты контроля использует биомаркеров на различных уровнях Организации, от научные субцеллюлярные или молекулярные, чтобы идентифицировать сублетальные последствия, которые могут влиять на население и быть показателем воздействия на различные раздражители. Показатели на уровне организма включают видимые аномалии и условий. Условие индексов на основе длины и веса рассчитываются для оценки благосостояния или пригодности популяций рыб. Наиболее распространенным является Фултон состояние факторов (K) = (вес/длина3) 15. Еще одним показателем является наличие видимых отклонений. Разнообразные методы использовали в отдельных исследований и программ мониторинга для оценки, документ и оценки видимых отклонений. Оценки, основанные только на внешние нарушения, т.е. доля лиц с заболеваниями, повреждения плавников, опухоли и скелетные аномалии, является одним из метрики для индекса биотических целостности (IBI), вычисляющую сообщество здравоохранения16. Аналогичная оценка называется DELTs (уродства, эрозий, поражения, опухоли) используется также для оценки здоровья рыб сообществ17. Однако эти методы только оценить внешний визуальный аномалии и не внутренние поражения или начале сублетальных показатели.
На основе патанатомия оценки включают внешних и внутренних наблюдений и позволяют для измерения показателей дополнительное условие. Hepatosomatic индекс (печени веса и общей массы тела) также был использован как индикатор пригодности или запасы энергии15 для которого более высокое значение индекса указывает здоровых рыб. Однако ряд исследований показали, что из-за воздействия различных загрязнителей, метаболизируется в печени18,,1920происходит гипертрофия или увеличение печени размер. В этом случае более высокий индекс будет свидетельствовать о подверженности определенных химических классов. Gonadosomatic индекс (Гонада веса и общей массы тела) является другой индекс состояния направлены репродуктивного здоровья21. Замечания, сделанные в ходе оценки на основе патанатомия может использоваться для сравнения распространенность поражения отдельных типов или процент нормальных людей. Однако они могут также использоваться в более количественный здоровья оценки22,23.
Стандартизированные патанатомия оценки на основе описанных здесь может использоваться для расширения явно видны оценки несколькими способами в зависимости от вопрос(ы) ответить, опыта и других имеющихся ресурсов. Наши обычные подход является сбор биометрических данных (длина, вес, вес печени, вес Гонада), кровь на анализы сыворотки/плазмы, документ внешних и внутренних видимые аномалии, сохранения частей органов для микроскопических анализов и собирать отолиты для анализ возрастной. Оценки на основе патанатомия плюс возраст анализ и гистопатологии различных органов, позволяет для вычисления и сравнения различных индексов состояния, распространенность видимых отклонений, а также изменения микроскопических ткани, по признаку пола, возраста, местонахождения и период выборки. Для многих других анализов, включая электронной микроскопии, бактериологии, вирусологии, паразитологии и концентрации химических веществ могут быть созданы дополнительные ткани коллекции. Эти методы также могут быть частью более углубленный анализ, используемый для диагностики причины рыбы убивает24 или смертности плен рыбы25. Иллюстрируются методы сбора ткани для двух дополнительных анализов, экспрессии генов и функциональной иммунной анализы.
Protocol
Описанные здесь методы были одобрены Leetown научный центр институциональный уход животных и использования Комитетом.
1. рыба коллекция
- Соберите живой рыбы с минимальным стрессом. Использование лодки или рюкзак электролов, крюк и линии или сетей.
- Удерживайте рыбу в живой скважин или пористый контейнеров до выборки.
Примечание: Американское общество рыболовства опубликовал ряд руководств для рыб сбора, обработки и анестезии/эвтаназии26,27,28. Надевайте перчатки при обработке рыбы.
2. рыба патанатомия
-
Усыпить рыбы.
- Место рыбы в анестезии, до тех пор, пока opercular движение прекращается и рыба теряет равновесие. После еще 2 – 10 мин рыба будет быть euthanized; Однако это также зависит от вида.
Примечание: Рыба может быть euthanized ряда анестетиков (см. Таблицу материалы для наиболее часто используемых). Метод эвтаназия будет зависеть от лабораторных измерений, которые будут проводиться на тканях собраны29.
- Место рыбы в анестезии, до тех пор, пока opercular движение прекращается и рыба теряет равновесие. После еще 2 – 10 мин рыба будет быть euthanized; Однако это также зависит от вида.
-
Мера биометрических характеристик.
- Вес рыбы до ближайшего грамма.
- Измерьте длину рыбы до ближайшего миллиметра.
- Мера Общая длина от кончика рыла с рот закрыт до конца хвоста совместно сжимано.
- Измерьте вилка длина от вилки в хвост на кончике морда и Стандартная длина от кончика рыла до конца тела (начало хвост).
- Вычислите коэффициент по следующей формуле:
Коэффициент = (вес всего тела - вес Гонада) / Общая длина3.
Примечание: Вес Гонада вычитается из общего веса тела так как гонад могут существенно способствовать вес всего тела, особенно в prespawn женщина рыбы.
-
Получите образец крови.
Примечание: Крови чаще всего берутся из хвостового вен, но может также быть выведены из спинной аорты или по сердечной прокол30.- Извлечь образец периферической крови из хвостового вен иглой 22 или 23 G на 1-5 мл шприц, в зависимости от размера рыбы. Вставьте иглу предшествовавшие хвостового области ниже боковой линии (рис. 1A и 1B). Угол его вверх до поражения позвоночника и затем снять немного. Вен брюшной вышележащие позвоночника.
Примечание: Если будет производиться мазков крови или сыворотки не требуется, используется не антикоагулянта. В большинстве случаев будет сбор плазмы и, следовательно, антикоагулянт гепарин натрия, ЭДТА или литий используется для покрытия игл и шприцев и также в пробирки (например, vacutainer). - Удалите иглу и поместите в контейнер утилизации Шарпс до сдачи крови в коллекции трубку.
Примечание: Кровь может проводиться на льду, но зависящ на последующие анализы следует как можно скорее, как возможных30центрифугируют. - Если будет оцениваться ядерной аномалии или дифференциального крови, сразу же место капли крови на скольжениях микроскопа дублировать чистое стекло. Обратно в падения, который затем обращается по всей поверхности капиллярность второй слайд под углом 45°. Позвольте высохнуть31.
- Центрифуга крови в 1500 – 2500 x g 15 мин отложениях клетки. Удаление плазмы/сыворотка с стерильных передачи пипетки, аликвота в криогенных флаконов и хранить при температуре-80 ° C.
- Извлечь образец периферической крови из хвостового вен иглой 22 или 23 G на 1-5 мл шприц, в зависимости от размера рыбы. Вставьте иглу предшествовавшие хвостового области ниже боковой линии (рис. 1A и 1B). Угол его вверх до поражения позвоночника и затем снять немного. Вен брюшной вышележащие позвоночника.
Рисунок 1 : Получение крови из рыбы. (A) A недавно умерщвлены рыбы укладывается на его стороне и боковой линии расположены. (B) игольчатый — вставленной вентральный к боковой линии (стрелка), под углом вверх до тех пор, пока игла коснется позвоночника. Затем слегка снимается, и всасывания для вывести крови. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
-
Провести оценку на основе патанатомия здоровья на каждой рыбы.
Примечание: Количество публикаций, иллюстрации и описания повреждений и аномалии, доступны32,33,34,35.- Документ внешних отклонений, включая повреждения на поверхности тела и плавников (рис. 2), глаза и жабры (рис. 3), внешних паразитов, таких как пиявками (Рисунок 2D), личинки или Трематодные metacercarial кисты (Рисунок 2D, 3B) и Джилл паразитов (рис. 3D). Документ типа, расположение и размер наблюдаемые аномалии на листах данных, а также как фотографически, если это возможно.
- Откройте с помощью ножницы резки от анальной области крышечки и удаляя лоскут мышц подвергать внутренние органы брюшной полости (рис. 4A).
Примечание: Если передняя почки будут собраны для иммунной функции (см. шаг 5 ниже) или образцы, собранные для бактериологических исследований или вирусологии, поверхности внешнего тела должны быть продезинфицированы с 70% спирта и эти пробы должны быть получены до вскрытие. Если ткани используются только для визуальных наблюдений, анализа плазмы и гистопатологии стерилизации не является необходимым. - Документ внутренней аномалии (рис. 4) включая общие или фокуса обесцвечивания различных органов (рис. 4Bсостав), наличие затронутые районы (Рисунок 4E), кисты, паразитов и размер (аномалии расширен, атрофировались).
Рисунок 2 : Примеры видимых поражений наблюдается на поверхности тела и плавников рыб. (A) A маленький, слегка эродированных поражения (стрелка) на поверхности боковых тела. (B) A большой покрасневшие области (стрелка) с участием поверхности хвостового тела. (C) поднято, черный поражения (стрелки) на поверхности тела и плавников. (D) пиявок (белая стрелка) и маленькие черные пятна (черные стрелки) на ребра. Шкалы бар = 3 mm. (E) A поднят, поражения (стрелка) растения, бледно на поверхности тела. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Примеры видимых повреждений жабры и глаза рыб. (A) A бледно-области (стрелка) в хрусталике глаза. Шкалы бар = 5 mm. (B) белые кисты (белые стрелки) и маленькие черные пятна (черные стрелки), вызванные Трематодные паразитов на крышечки, охватывающих жабры (). Шкалы бар = 1 cm. (C) A бледный, эрозии в области (стрелка) на Гилл (). Шкалы бар = 5 mm. (D) Гилл, которая была удалена показаны паразитов (стрелки) придает Гилл нитей. Шкалы бар = 2 mm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Примеры патанатомия и внутренних аномалий рыб. (A) во время патанатомия является разрезать рыбу (вдоль белой стрелкой) и лоскут мышц (черная стрелка) удалены, чтобы разоблачить Гонада () и селезенки, удерживаются щипцами и ножницы. (B) пестрые печени (), семенников (b), ЖКТ, окруженный жировой жира (c) и желудка (d). Шкалы бар = 5 mm. (C) печени (а) с темно красная площадь (стрелка), яичников (b) и кишечника (c). Шкалы бар = 5 mm. (D) печени с зеленоватым обесцвеченными областях (стрелки). Шкалы бар = 1 cm. (E) пример обычного () и аномальные яичек (b) с поднятые конкреций. Шкалы бар = 1 cm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
-
Получите hepatosomatic индекс (HSI).
- Удалите печень, разорвав печеночной артерии и соединительной ткани переднего конца. Осторожно выньте во время обрезки спаек и другие соединения в кишечнике и жировой жира. Позаботьтесь, чтобы не протыкайте желчного пузыря. Вес печени.
Примечание: Некоторые рыбы, например, карповые, не имеют дискретные печени, но скорее печеночной ткани, обернутые вокруг кишечника и других органов. Для этих видов он не может быть возможно получить печени весов. - Рассчитайте hepatosomatic индекс (HSI) по формуле:
HSI = масса печени вес/всего тела
- Удалите печень, разорвав печеночной артерии и соединительной ткани переднего конца. Осторожно выньте во время обрезки спаек и другие соединения в кишечнике и жировой жира. Позаботьтесь, чтобы не протыкайте желчного пузыря. Вес печени.
-
Рассчитайте индекс gonadosomatic.
- Удаление гонады и взвесить его.
- Рассчитайте gonadosomatic индекс (GSI) по формуле:
GSI = масса тела вес/всего гонад
3. сохранить ткани для микроскопических патологии
Примечание: Количество фиксаторы, включая нейтральных буферизации формалина 10% и Z-fix, на основе формалин фиксатором с цинком, может использоваться для сохранения ткани в области. Последний является предпочтительным, если такие методы, как в situ гибридизация или пятнать флуоресцентные антитела могут быть использованы.
- Тщательно вырезать, но не вытащить образцы тканей. Держите ткани отдельных частей < размером 2 см и < для правильной фиксации толщиной 5 мм. Как правило используйте приблизительно 10 x больше фиксатор по объему, чем ткани для надлежащего сохранения. Поместите все образцы ткани из одной рыбы в тот же контейнер герметичный соответствующего размера, в зависимости от размера рыбы производится выборка.
- Место кусков каких-либо внешних отклонений в контейнере фиксирующие. Кроме того включать смежные частью нормальной ткани.
Примечание: Неправильная обработка например, сжатие или другие механические повреждения, длительного воздействия воздуха или солнечного света и замораживания может вызывать помехи. - Сократить по меньшей мере пять 3-4 мм толстые куски печени из различных регионов и место в фиксирующие контейнер. Включите нормальных и ненормальных областях, если наблюдается.
- В зависимости от размера поместите весь Гонада или из нескольких частей вдоль одной Гонада в фиксирующие контейнер.
- Место в контейнере фиксирующие или целые органы, если малые, или куски все другие органы (селезенка, передний и задний почек, жабры, сердца, кишечника и желудка). Если наблюдаются атипия тканей, сохранить прилегающих частью нормальной ткани также.
4. Удалите отолиты для анализа возраста
Примечание: Возраст может быть важной переменной в рыб болезни/рыба медицинских исследований. Хотя ряд структур, включая весы и колючки, были использованы для определения возраста, большинство исследований, сравнение структур нашли отолиты дать лучшие результаты36,37. Костистых рыб имеют три пары отолиты - lapillus, sagitta и Астерискус. Как правило отолиты сагиттальной или lapillus собираются для старения, хотя это может варьироваться от видов. Методы удаления и старения были ранее описанных38.
- Прорезать перешеек Гилл и согнуть голову назад. Полосы от мышечной и соединительной ткани вокруг нижней части округлый найти prootic буллы, поднял костлявые области.
- Оценка или вырезать с костей резцов и трещины подвергать отолиты. Их можно увидеть невооруженным глазом.
- Место отолиты в маркированных флакона или монета конверт и хранить при комнатной температуре до тех пор, пока анализируются для возраста путем подсчета кольца или приращений38. Если размещение в флаконе, откройте крышку, когда вернулся в лабораторию и позволяют тщательно высушите перед хранением.
Рисунок 5 : Удаление отолиты. (A) режется перешейка и соединительной ткани и мышцы вытягивано прочь подвергать основания позвоночника и neurospinal области. (B) кости трещины подвергать отолиты. (C) Lapillar отолиты удаляются. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
5. получить ткани для анализов иммунную функцию
Примечание: Передней почек основных гемопоэтических органа, источник из лимфоцитов и макрофагов функциональных анализов и должны быть удалены асептически, если будет культивируемых клеток для функциональных анализов, например mitogenesis, фагоцитарной и убийство способности макрофаги39,40.
- Спрей внешней поверхности рыбы с 70% этиловом спирте. Используйте стерильными ножницами, скальпель и щипцы для открытия брюшной полости и удаление передней почечной ткани, которая темно красный орган, расположенный впереди плавательный пузырь.
- Поместите образец передней почек в средствах массовой информации (например, Лейбовиц L-15) чтобы сохранить клетки живых. Однородный почек образцы с измельчителем стерильные ручных тканей (например, Tenbroeck ткани мясорубку) в одну ячейку суспензий. Держите на мокрый лед, пока не вернулся в лабораторию.
6. сохранить ткани для анализа нуклеиновых кислот
Примечание: Если течению молекулярный анализ будет проводиться, например экспрессии генов с помощью Стенограмма изобилие41 или количественного PCR42 (полимеразная цепная реакция), поместите кусочки ткани следует оценивать в соответствующей консервант ( например, RNAlater стабилизации решения) как можно скорее.
- Для сохранения РНК место два-три маленьких (2 – 3 мм) штук в соответствующие консерванта в соотношении 10:1 консервант объема тканей.
Примечание: Образцы должны быть защищены от солнечного света или избыточного тепла и перевозимых на мокрый лед. - Для сохранения ДНК место два-три небольшие кусочки ткани в 95% этаноле (10:1 этанола ткани по объему). Затем, удерживая образцы на мокрый лед и затем хранить при температуре от-20 ° C.
Representative Results
Великих озер областей озабоченности (AOC) являются географические области, которые были назначены из-за расстройства различных полезных применений. Один из выгодное использование нарушениями (БЮИ) на многих АОС является рыба опухоли или других деформаций. Для того, чтобы контроль различных БЮИ и в конечном счете AOC43для рекультивации и восстановления каждой из этих областей были потрачены миллионы долларов. Критерии для исключения опухоли рыбы, которую БУЙ отличается от государства (см. epa.ohio.gov/portals/35/lakeerie/ohio_AOC_delisting_guidance.pdf и dnr.wi.gov/topic/GreatLakes/documents/SheboyganRiverFinalReport2008.pdf); Однако как отмечено в документах, об исключении, есть требование для определения распространенности опухоли печени и в некоторых случаях опухоли кожи. Во многих случаях распространенность сравнивается с сайта ссылка не АОК.
Опухоль рыбы БУЙ оценивалась на три КСК (St. Луис реки, Милуоки реке и Шебойган реки) и сайта ссылка не AOC (Kewaunee River) на озерах Superior и Мичиган, используя оценки на основе патанатомия белые присоски (Чукучаны commersonii ), а затем микроскопических патологии кожи и ткани печени. Рыбы были собраны из Милуоки, Шебойган и Kewaunee рек в 2012 и 2013 годах44 и реки Святого Людовика в 2015 году (неопубликованные данные). Двести белые присоски были оценены из Милуоки, Kewaunee и Сент-Луисе и 193 от Sheboygan.
По определению опухоль может быть любой отек или поднял области, хотя обычно считается, что опухоль, вызванная аномальный рост ткани с атипичных клеток это доброкачественные или злокачественные новообразования. Белые присоски, собранных со всех сайтов выставлены разнообразные внешние поднял поражений, включая малые, Дискретная белые пятна, большие белые зоны, слегка приподняты слизистый поражений и растения поднял на поверхности тела и губы (рис. 6). Рыбы были взвешены и измеряется для получения состояния фактор, внешней и внутренней аномалии были задокументированы, и было собрано Гистопатология кожи и печеночной ткани.
Рисунок 6 : Поднял кожных поражений наблюдается на белые присоски от Великих озер. (A) дискретные белое пятно на поверхности тела. Шкалы бар = 5 mm. (B) слегка приподняты mucoid (стрелки) и растения поражений () на поверхности задней тела. Шкалы бар = 1 cm. (C) A большой, растения поражения на поверхности тела. Шкалы бар = 1 cm. (D) многочисленные мульти-лопастные поражений на губах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Процент рыбы с внешними опухоли или поднял бесцветные области варьировались от 15,5% в Сент-Луисе AOC 58.0% в Милуоки АОК. В целом дискретная белые пятна были наименее распространены visual поражения, а растения губы и повреждений поверхности тела были наиболее распространенным. Количество рыбы с наблюдаемыми печени конкреций был низким, от 1,5% в Kewaunee и Сент-Луисе до 2,5% в Милуоки (Таблица 1).
| Реки и год пробы | ||||
| Видимые поражения | Kewaunee 2013 | Сент-Луис 2015 | Шебойган 2012 | Милуоки-2013 |
| Дискретная белые пятна | 16 | 3 | 3.1 | 5 |
| Mucoid | 20 | 9.5 | 9.8 | 30,5 |
| Растения | 22,5 | 3 | 29,5 | 40 |
| Всего поднял кожу аномалии | 46 | 15.5 | 38.3 | 58 |
| Видимые печени конкреций | 1.5 | 1.5 | 1.6 | 2.5 |
| Общее количество рыбы с поднятой поражений. Некоторые рыбы было несколько типов нарушений. | ||||
Таблица 1: Вскрытие наблюдениям белые присоски собраны в Великих озер проблемных областей и сайта ссылка (Kewaunee River), представлены в процентах.
Визуальный осмотр может использоваться для документирования процентов рыбы с различными аномалиями. Однако, чтобы окончательно диагностировать наличие и тип неоплазии, ткани должны быть рассмотрены микроскопически (гистопатология). При микроскопическом исследовании было обнаружено, что не все поднятые поражения опухолевой. Многие из дискретных белых пятен и слизистый поражений, особенно на Kewaunee, были гиперпластические поражений, а не неоплазии (Таблица 2). Кроме того в Kewaunee и Сент-Луисе, все опухоли кожи наблюдается были доброкачественных папиллом. В Шебойгане и Милуоки папиллом и плоскоклеточный рак, опухоли кожи злокачественные, были замечены (Таблица 2).
| Реки пробы | ||||
| Тип опухоли | Kewaunee 2013 | Сент-Луис 2015 | Шебойган 2012 | Милуоки-2013 |
| Папилломы | 21 | 5.2 | 30,5 | 37,5 |
| Плоскоклеточный рак | 0 | 0 | 2.1 | 10.5 |
| Общая кожных образований | 21 | 5.2 | 32.6 | 48 |
| Желчных протоков новообразования | 2.5 | 4 | 6.2 | 9.5 |
| Печеночных клеток новообразованийb | 1 | 0 | 2.1 | 8 |
| Новообразования всего печени | 3.5 | 4 | 8.3 | 15,0c |
| Включает в себя cholangioma и холангиокарцинома | ||||
| b Включает в себя аденома печеночных клеток и рак печени | ||||
| c Некоторые рыбы имели желчных и печеночных новообразования | ||||
Таблица 2: Микроскопически проверены опухолевых поражений белые присоски собранных в Великих озер проблемных областей и сайта ссылка (Kewaunee River), представлены в процентах.
Гистопатологические анализ также определили опухоли печени, которые не были определены путем визуального наблюдения. Хотя всего лишь 1,5% рыбы, собранных от Kewaunee и Сент-Луисе конкреций видны печени (Таблица 1), 3,5% и 4,0%, соответственно, микроскопически определила новообразования (Таблица 2). Большие разницы был замечен в Шебойгане (1,6% видимой против 8,3% микроскопические) и Милуоки (2,5% видимой против 15,0% микроскопические). Микроскопическое исследование также обеспечивает дифференциацию опухолей желчных и печеночных клеток происхождения (Таблица 2) и доброкачественные и злокачественные опухоли.
Discussion
Оценки на основе патанатомия рыбы здоровья могут быть использованы на любых видов рыб, для которого следователь имеет понимание нормальный вид внешней и внутренней структуры. Использование стандартизированного подхода позволяет сравнений между сайтами и видов, а также сезонных и временных изменений в популяции. Результаты могут использоваться определить последствия, связанные с точкой и неточечные источники загрязнений и информировать Управление действиями. Он также может использоваться для отслеживания улучшений после начала действия управления. Методология может быть изменен дополнить документации визуального внешнего аномалии в различных способами. Оценки, основанные только на визуальные наблюдения, может быть нелетальных, относительно недорогой и данные могут быть получены быстро для большого числа людей. Следовательно, они могут быть полезны для произвольного или первоначальных оценок, для мониторинга изменений с течением времени или в сочетании с другими показателями. Если длина и вес рыбы измеряются при визуальных наблюдений, могут также рассчитывается коэффициент состояния. Хотя оценки основаны только на визуальное наблюдение не предоставляют информацию по делу или сопутствующих факторов риска, долгосрочные тенденции некоторых патологий кожи45 и46 биометрические параметры указали улучшения в некоторых областях связанные с улучшения качества воды.
Оценки на основе патанатомия обеспечивает дополнительную информацию как внутренних органов рассматриваются также и другие факторы состояния, такие как gonadosomatic и hepatosomatic индекс может быть рассчитана. Гёде и Бартон22 разработал метод патанатомия поля, включенных параметров крови, биометрические факторы, процент патологий и значения индекса для конкретных нарушений. Уточнение метода включены серьезности для некоторых переменных, которые разрешены для расчета индекса оценки здоровья, которые могут быть статистически сравнить23. Этот индекс оценки здоровья был использован в региональный сайт сравнения23,,4748 и в сочетании с другими биологическими показателями, включая плазмы и гистопатологические анализов в США геологическая Обследования биомониторинга экологического состояния и тенденций программа оценки потенциальных последствий воздействия загрязнения в крупных реках по всей стране49,50,51. Рыбы болезни индекс, основанный на доступном заболеваний и паразитов, видимых опухолей печени и других histopathologically обнаружено поражение печени был разработан и широко используется в Северное море, Балтийское море и Исландии. Этот показатель оказался важным инструментом как здоровье экосистемы индикатор52.
Есть некоторые критические факторы в проведении оценки на основе патанатомия на рыбу. Во-первых оценки должны проводиться на рыбу сразу же после смерти. Изменения в цвете орган и согласованности может произойти довольно быстро после смерти. Кроме того некоторые паразиты могут оставить узел вскоре после смерти. Во-вторых важно знать, что это нормально для видов, представляющих интерес. Например некоторые рыбы обычно имеют жирных и следовательно, бледный печень, в то время как для большинства видов бледно печени будет ненормальным. Важно также признать сезонные изменения, которые происходят естественно. Некоторые рыбы будет иметь изменения цвета или развивать разведения бугорков во время нереста.
Ограничения на основе патанатомия оценки как метод для оценки здоровья рыб включают неспособность 1) последовательно определить «причина» конкретные поражений и 2) определить эффекты, которые могут быть не видны невооруженным глазом. Эти недостатки могут быть преодолены с добавлением гистопатология, молекулярные или культурной идентификации возбудителей и паразитов и экспрессии генов. Например, «опухолью» поднял поражения (отек) может быть фактической неоплазии или это может быть паразитом, воспаление, отек или гиперплазия (увеличение количество нормальных клеток), вызванные воздействия химических веществ, инфекционные агенты и другие раздражители. Как показано в результатах представительных, окончательное опухоли или диагностики неоплазии требует микроскопические патологии определить поражения типа и тяжести (т.е. доброкачественные или злокачественные). Оценки опухолей белые присоски внешней «» путем визуального наблюдения переоценили распространенность, особенно на сайте ссылки. Многие из поднятых поражений не были новообразования, но скорее гиперпластические поражений. В настоящее время не известно ли эти гиперпластические поражения предварительно опухолевой. И наоборот наблюдения поднял конкреций в печени значительно недооценивается распространенность опухолей печени. Таким образом коллекция тканей для микроскопических патологии было адекватным потенциалом для исключения из списка.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась экосистем геологической службы США (Чесапикский среды и рыболовства) и программ санитарного состояния окружающей среды (загрязнители биологии) и Западная Вирджиния Департамента природных ресурсов. Названия торговых марок используются только в целях идентификации и не означает одобрения правительства США.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Folding tables | Any | ||
| Folding chairs | Any | ||
| Dissecting boards | Any | ||
| Measuring board (mm) | Any | ||
| Battery powered scale (g) for fish weight | Any | ||
| Battery powered scale (mg) for organ weights | Any | ||
| Dissecting forceps | Any | ||
| Bone cutters | Any | ||
| Scalpel and blades | Any | ||
| Disposable gloves | Any | ||
| Buckets | Any | ||
| Leak-proof Nalgene bottles (250 mL) | ThermoFischer Scientific | 02-924-5C | |
| Vacutainer tubes with sodium heparin | ThermoFischer Scientific | 02-689-6 | For blood collection |
| Disposable 3 mL syringes with 23 G needle | ThermoFischer Scientific | 14-826-11 | |
| 1 – 2 mL cryovials | Any | Used for plasma and RNAlater samples | |
| Invitrogen RNAlater Stabilization solution | ThermoFischer Scientific | AM7021 | |
| Z-Fix Formaldehyde Zinc fixative | Anatech LTD | SKU-174 | |
| Tricaine-S (MS-222) | Syndel USA | fish anesthetic | |
| Coin Envelopes | Any | for otoliths | |
| Pencils and pens | Any | ||
| 70% alcohol | Any | ||
| Data sheets | Any |
References
- Celander, M. C. Cocktail effects on biomarker responses in fish. Aquatic Toxicology. (105 Supplement), 72-77 (2011).
- Liney, K. E., et al. Health effects in fish of long-term exposure to effluents from wastewater treatment works. Environmental Health Perspectives. 114, 81-89 (2006).
- Silva, E., Rajapakse, N., Kortenkamp, A. Something from "nothing" - eight weak estrogenic chemicals combined at concentrations below NOECs produce significant mixture effects. Environmental Science & Technology. 36, 1751-1756 (2002).
- Noyes, P. D., et al. The toxicology of climate change: environmental contaminants ina warming world. Environment International. 35, 971-986 (2009).
- Witeska, M., Jezierska, B. The effect of environmental factors on metal toxicity to fish. Fresenius Environmental Bulletin. 12, 824-829 (2003).
- Wedekind, C., Gessner, M. O., Vazquez, F., Maerki, M., Steiner, D. Elevated resource availability sufficient to turn opportunistic into virulent fish pathogens. Ecology. 91, 1251-1256 (2010).
- Penttinen, R., Kinnula, H., Lipponen, A., Bamford, J. K. H., Sundberg, L. R. High nutrient concentration can induce virulence factor expression and cause higher virulence in an environmentally transmitted pathogen. Microbial Ecology. 72, 955-964 (2016).
- Bols, N. C., Brubacher, J. L., Ganassin, R. C., Lee, L. E. J. Ecotoxicology and innate immunity in fish. Developmental & Comparative Immunology. 25, 853-873 (2001).
- Dunier, M., Siwicki, A. K. Effect of pesticides and other organic pollutants in the aquatic environment on immunity of fish: a review. Fish and Shellfish Immunology. 3, 423-438 (1993).
- Milla, S., Depiereux, S., Kestemont, P. The effects of estrogenic and androgenic endocrine disruptors on the immune system of fish: a review. Ecotoxicology. 20, 305-319 (2011).
- Connon, R. E., Geist, J., Werner, I. Effect-based tools for monitoring and predicting the ecotoxicological effects of chemicals in the aquatic environment. Sensors. 12, 12741-12771 (2012).
- Eckman, D. R., et al. Biological effects-based tools for monitoring impacted surface waters in the Great Lakes: A multiagency program in support of the Great Lakes restoration initiative. Environmental Practice. 15, 409-426 (2013).
- Khan, M. Z., Law, F. C. P. Adverse effects of pesticides and related chemicals on enzyme and hormone systems of fish, amphibians and reptiles: A review. Proceedings of the Pakistan Academy of Sciences. 42, 315-323 (2005).
- Wernersson, A. S., et al. The European technical report on aquatic effect-based monitoring tools under the water framework directive. Environmental Sciences Europe. 27, (2015).
- Bolger, T., Connolly, P. L. The selection of suitable indices for the measurement and analysis of fish condition. Journal of Fish Biology. 34, 171-182 (1989).
- Karr, J. R. Biological integrity: A long-neglected aspect of water resource management. Ecological Applications. 1, 66-84 (1991).
- Sanders, R. E., Miltner, R. J., Yoder, C. O., Rankin, E. T. The use of external deformities, erosions, lesions, and tumors (DELT anomalies) in fish assemblages for characterizing aquatic resources: a case study of seven Ohio stream. Assessing the sustainability and biological integrity of water resources using fish communities. Simon, I. nT. P. , CRC Press. Florida. 225-246 (1999).
- Bervoets, L., et al. Bioaccumulation of micropollutants and biomarker responses in caged carp (Cyprinus carpio). Ecotoxicology and Environmental Safety. 72, 720-728 (2009).
- Schulte-Hermann, R. Adaptive liver growth induced by xenobiotic compounds: its nature and mechanism. Archives of Toxicology. Supplement. 2, 113-124 (1979).
- Slooff, W., van Kreijl, C. F., Baars, A. J. Relative liver weights and xenobiotic-metabolizing enzymes of fish from polluted surface waters in the Netherlands. Aquatic Toxicology. 4, 1-14 (1983).
- Brewer, S. K., Rabeni, C. F., Papoulias, D. M. Comparing histology and gonadosomatic index for determining spawning condition of small-bodied riverine fishes. Ecology of Freshwater Fish. 17, 54-58 (2003).
- Goede, R. W., Barton, B. A. Organismic indices and an autopsy-based assessment as health and condition of fish. American Fisheries Society Symposium. 8, 93-108 (1990).
- Adams, S. M., Brown, A. M., Goede, R. W. A quantitative health assessment index for rapid evaluation of fish condition in the field. Transactions of the American Fisheries Society. 122, 63-73 (1993).
- Kane, A. S., et al. Field sampling and necropsy examination of fish. Virginia journal of science. 50, 345-363 (1999).
- Yanong, R. P. E. Necropsy techniques for fish. Seminars in Avian and Exotic Pet Medicine. 12, 89-105 (2003).
- American Fisheries Society (AFS) Use of Fishes in Research Committee, American Institute of Fishery Research Biologists and the Society of Ichthyologists and Herpetologists. Guidelines for the Use of Fishes in Research. , American Fisheries Society. Bethesda, Maryland. (2004).
- Bonar, S. A., Hubert, W. A., Willis, D. W. Standard methods for sampling North American freshwater fishes. , American Fisheries Society. Bethesda, Maryland. (2009).
- Zale, A. V., Parrish, D. L., Sutton, T. M. Fisheries Techniques, third edition. , American Fisheries Society. Bethesda, Maryland. 1009 (2013).
- Neiffer, D. L., Stamper, M. A. Fish sedation, anesthesia, analgesia, and euthanasia: considerations, methods, and types of drugs. Institute for Laboratory Animal Research. , 343-360 (2009).
- Clark, T. D., et al. The efficacy of field techniques for obtaining and storing blood samples from fishes. Journal of Fish Biology. 795, 1322-1333 (2011).
- Adewoyin, A. S., Nwogoh, B. Peripheral blood film - a review. Annals of Ibadan Postgraduate Medicine. 12, 71-79 (2014).
- Smith, S. B., et al. Illustrated field guide for assessing external and internal anomalies in fish. Information and Technology Report USGS/BRD/ITR. 2002-007, 46 (2002).
- Kane, A. S. Descriptive guide to observing fish lesions. , Available at http://aquaticpath.phhp.ufl.edu/Lesionguide/Lesionguide.pdf (2005).
- Rafferty, S. D., Grazio, J. Field manual for assessing internal and external anomalies in brown bullhead (Ameiurus nebulosus). , Pennsylvania Sea Grant. Erie, PA. Available at: https://seagrant.psu.edu/sites/default/files/Bullhead%20field%20manual.pdf (2018).
- European Association of Fish Pathologists. Necropsy manual. , Available at www.necropsymanual.net (2018).
- Buckmeier, D. L., Irwin, E. R., Betsill, R. K., Prentice, J. A. Validity of otoliths and pectoral spines for estimating ages of channel catfish. North American Journal of Fisheries Management. 22, 934-942 (2002).
- Maceina, M. J., Sammons, S. M. An evaluation of different structures to age freshwater fish from a northeastern US river. Fisheries Management and Ecology. 13, 237-242 (2006).
- Secor, D. H., Dean, J. M., Laban, E. H. Otolith removal and preparation for microstructural examination. Otolith Microstructure Examination and Analysis. Stevenson, D. K., Campana, S. E. 117, Canadian Special Publication of Fisheries and Aquatic Sciences. 19-57 (1992).
- Gauthier, D. T., Cartwrwight, D. D., Densmore, C. L., Blazer, V. S., Ottinger, C. A. Measurement of in vitro leucocyte mitogenesis in fish: ELISA based detection of the thymidine analogue 5'-bromo-2'-deoxyuridine. Fish and Shellfish Immunology. 14, 279-288 (2003).
- Zelikoff, J. T., et al. Biomarkers of immunotoxicity in fish:from the lab to the ocean. Toxicology Letters. , 325-331 (2000).
- Hahn, C. M., Iwanowicz, L. R., Corman, R. S., Mazik, P. M., Blazer, V. S. Transcriptome discovery in non-model wild fish species for the development of quantitiative transcript abundance assays. Comparative Biochemistry and Physiology - Part D: Genomics and Proteomics. 20, 27-40 (2016).
- Harms, C. A., et al. Quantitative polymerase chain reaction for transforming growth factor-B applied to a field study of fish health in Chesapeake Bay tributaries. Environmental Health Perspectives. 108, 1-6 (2000).
- Braden, J. B., et al. Economic benefits of remediating the Sheboygan River, Wisconsin Area of Concern. Journal of Great Lakes Research. 34, 649-660 (2008).
- Blazer, V. S., et al. Tumours in white suckers from Lake Michigan tributaries: pathology and prevalence. Journal of Fish Diseases. 40, 377-393 (2017).
- Vethaak, A. D., Jol, J. G., Pieters, J. P. F. Long-term trends in the prevalence of cancer and other major diseases among flatfish in the southeastern North Sea as indicators of changing ecosystem health. Environmental Science & Technology. 43, 2151-2158 (2009).
- Teubner, D., Paulus, M., Veith, M., Klein, R. Biometric parameters of the bream (Abramis brama) as indicators for long-term changes in fish health and environmental quality - data from the German ESB. Environmental Science and Pollution Research. 22, 1620-1627 (2015).
- Schleiger, S. L. Fish health assessment index study of four reservoirs in north-central Georgia. North American Journal of Fisheries Management. 24, 1173-1180 (2004).
- Sutton, R. J., Caldwell, C. A., Blazer, V. S. Health assessment of a tailwater trout fishery associated with a reduced winter flow. North American Journal of Fisheries Management. 20, 267-275 (2000).
- Blazer, V. S. The necropsy-based fish health assessment. Biomonitoring of environmental status and trends (BEST) program: selected methods for monitoring chemical contaminants and their effects in aquatic ecosystems. Schmitt, C. J., Dethloff, G. M. , U.S. Geological Survey Information and Technology Report USGS/BRD-2000-005 18-21 (2000).
- Schmitt, C. J. Biomonitoring of environmental status and trends (BEST) program: Environmental contaminants and their effects on fish in the Mississippi River basin. Biological Science Report USGS/BRD/BSR. 2002-0004, 241 (2002).
- Hinck, J. E., et al. Chemical contaminants, health indicators, and reproductive biomarker responses in fish from rivers in the Southeastern United States. Science of the Total Environment. 390, 538-557 (2008).
- Lang, T., et al. Diseases of dab (Limanda limanda): Analysis and assessment of data on externally visible diseases, macroscopic liver neoplasms and liver histopathology in the North Sea, Baltic Sea and off Iceland. Marine Environmental Research. 124, 61-69 (2017).
