Summary
Sundhed af vilde fisk kan bruges som en indikator for akvatiske økosystemer sundhed. Obduktion-baserede fisk sundhed vurderinger levere dokumentation af synlige læsioner eller abnormiteter, der bruges til at beregne betingelse indekser samt mulighed for at indsamle væv til mikroskopisk evaluering, genekspression og andre mere dybdegående analyser.
Abstract
Menneskeskabte påvirkninger fra øget næringsstoffer og forurenende kemiske stoffer til habitat ombygninger og klimaændringer, kan have betydelig indvirkning på fiskebestandene. Bivirkninger overvågning, kan udnytte biomarkører fra den kropsligt på molekylært niveau, bruges til at vurdere de kumulative effekter på fisk og andre organismer. Fisk sundhed er blevet brugt verden over som en indikator for akvatiske økosystemer sundhed. Obduktion-baserede fisk sundhedsvurdering indeholder data om synlige abnormiteter og læsioner, parasitter, tilstand og organosomatic indeks. Disse kan sammenlignes ved site, sæson og køn og timeligt, dokumentet ændres over tid. Klassifikationer kan tildeles til forskellige observationer til at beregne en fisk sundhed index for mere kvantitativ vurdering. En ulempe ved obduktion-baseret vurdering er, at det er baseret på visuelle observationer og betingelse faktorer, som ikke er så følsomme områder som væv og subcellulært biomarkører for subletale virkninger. Desuden er det sjældent muligt at identificere årsagerne eller risikofaktorer forbundet med observerede abnormiteter. Så, for eksempel en hævet læsion eller "tumor" på finner, læber eller kroppens overflade kan være en svulster. Det kunne imidlertid også være en reaktion på en parasit, kronisk inflammation eller hyperplasi af normale celler som reaktion på et irritationsmoment. Omvendt, neoplasmer, visse parasitter, andre smitsomme agenser og mange væv ændringer er ikke synlige, og så kan være undervurderet. Dog under obduktion-baseret vurdering, blod (plasma), væv til histopatologisk (mikroskopiske patologi), kan genomforskning og andre molekylære analyser og ørestenene for aldring afhentes. Disse downstream analyser, samt geospatiale analyser, vurderinger af levesteder, vand kvalitet og forurenende analyser kan alle være vigtigt i omfattende økosystem evalueringer.
Introduction
Menneskelige aktiviteter har mange negative virkninger på akvatiske miljøer. Fisk bebor forskellige vandområder, som den menneskelige befolkning genskaber i og bruger ofte som drikkevand kilde og dermed er vigtige indikatorer for sundheden for vandmiljøet. Vilde fisk, der leve og formere sig i en særlig vækststeder er udsat i hele deres liv til forskellige stressfaktorer herunder patogener, parasitter, dårlig vandkvalitet og kemiske forureninger. Tusindvis af kemikalier indtaste vores vandveje gennem industrielle og humant spildevand, forstæder/urban regnvand og landbrugsprodukter afstrømning. Disse komplekse blandinger af kemikalier kan have additiv, synergistisk eller antagonistisk virkninger på udsatte organismer1,2,3. Derudover andre miljømæssige stressfaktorer såsom forhøjet næringsstoffer, høj temperatur, lav opløst ilt eller svingende pH kan forværre virkningerne af kemiske forurenende stoffer4,5. Miljømæssige stressfaktorer kan også påvirke infektionssygdom resultater direkte ved at øge antallet af smitsomme agenser6, øge virulens af opportunistiske patogener7 eller undertrykke den immunrespons og sygdom modstand af vært8,9,10. Af disse grunde der stigende interesse for biologiske eller negative virkninger overvågning11,12,13,14, udnytte fisk og andre akvatiske organismer til at identificere populationer og økosystemer i fare.
Bivirkninger overvågning udnytter biomarkører på forskellige niveauer i organisationen, fra den kropsligt subcellulært eller Molekylær, identificere subletale virkninger, som kan påvirke befolkningen og være vejledende for eksponering for forskellige stressfaktorer. Indikatorer på organisme niveau omfatter synlige abnormiteter og betingelser. Betingelse indeks baseret på længde og vægt er beregnet for at vurdere trivsel eller egnethed af fiskebestandene. De mest almindelige er Fultons betingelse faktorer (K) = (vægt/længde3) 15. En anden indikator er tilstedeværelsen af synlige abnormiteter. En række metoder har været anvendt i enkelte undersøgelser og overvågningsprogrammer til at vurdere, dokument, og evaluere synlige abnormiteter. Vurdering baseret kun på eksterne abnormiteter, dvs., at andelen af personer med sygdommen, fin skader, tumorer og knogle anomalier, er en af målinger for indekset til biotiske integritet (IBI), der evalueres samfund sundhed16. En lignende vurdering betegnes DELTs (deformiteter, erosioner, læsioner, tumorer) er også blevet brugt til at vurdere sundhed af fisk Fællesskaber17. Men disse metoder kun vurdere eksterne visuelle abnormaliteter og ikke indre læsioner eller tidlige subletale indikatorer.
Obduktion-baserede vurderinger omfatter eksterne og interne bemærkninger og mulighed for måling af yderligere betingelse indekser. Hepatosomatic indeks (leveren vægt/samlede kropsvægt) er også blevet brugt som en indikator for fitness eller energi reserver15 som indikerer en højere indeksværdi, sundere fisk. En række undersøgelser har dog vist, at hypertrofi eller øget lever størrelse opstår på grund af eksponering for forskellige forurenende stoffer metaboliseres af leveren18,19,20. I dette tilfælde ville en højere indeks være vejledende for eksponering for visse kemiske klasser. Gonadosomatic index (gonade vægt/samlede kropsvægt) er en anden betingelse indeks rettet mod reproduktiv sundhed21. Bemærkninger ved en obduktion-baseret vurdering kan bruges til at sammenligne forekomsten af individuelle læsion typer eller procentdel af normale individer. De kan dog også bruges i en mere kvantitativ sundhed vurdering22,23.
Den standardiserede obduktion-baseret vurdering, der beskrives her kan bruges til at forøge den groft synlige vurdering på flere måder afhængigt af spørgsmål der skal besvares, ekspertise og andre tilgængelige ressourcer. Vores rutinemæssige tilgang er at indsamle biometriske data (længde, vægt, leveren vægt, gonade vægt), blod plasma/serum analyser, dokument eksterne og interne synlige abnormiteter, bevare stykker af organer til mikroskopiske analyser og indsamle ørestenene for alder analyser. Obduktion-baseret vurdering, plus alder analyse og histopatologi af forskellige organer, giver mulighed for beregning og sammenligning af forskellige betingelse indekser, forekomsten af synlige abnormiteter, samt mikroskopisk væv ændringer, efter køn, alder, site og stikprøveperioden. Yderligere væv samlinger kan være gjort for mange andre analyser, herunder elektronmikroskopi, bakteriologi, virologi, parasitologi og kemiske koncentrationer. Disse metoder kan også være en del af mere dybdegående analyser bruges til at diagnosticere årsagen til fisk dræber24 eller mortalitet på fangenskab fisker25. Metoder til indsamling af væv til to yderligere analyser, genekspression og funktionelle immun analyser er illustreret.
Protocol
Metoder, der beskrives her er blevet godkendt af Leetown Science Centers institutionelle Animal Care og brug udvalget.
1. fisk samling
- Samle levende fisk med et minimum af stress. Bruge båd eller rygsæk electrofishing, krog og line eller redskaber.
- Holde fiskene i live brønde eller tilsat kulsyre beholdere indtil prøveudtagning.
Bemærk: American fiskeri Society har udgivet en række guider til fisk indsamling, håndtering og anæstesi/eutanasi26,27,28. Bære handsker ved håndtering af fisk.
2. fisk obduktion
-
Aflive en fisk.
- Placer fisk i narkose indtil opercular bevægelse ophører og fisken mister ligevægt. Efter en anden 2-10 min fisk vil være euthanized; Dette kan dog også variere efter art.
Bemærk: Fisk kan aflives med en række af anæstetika (Se Tabel af materialer til mest almindeligt anvendte). Metoden af eutanasi vil afhænge af de laboratoriemålinger, der vil blive gennemført på væv indsamlede29.
- Placer fisk i narkose indtil opercular bevægelse ophører og fisken mister ligevægt. Efter en anden 2-10 min fisk vil være euthanized; Dette kan dog også variere efter art.
-
Måle biometriske kendetegn.
- Veje fisk g nøjagtighed.
- Måle fisk længde til den nærmeste millimeter.
- Måle den samlede længde fra spidsen af snuden med munden lukket for enden af halen når klemt sammen.
- Måle gaffel længde fra gaffel i halen på spidsen af snuden, og den standard længde fra spidsen af snuden til slutningen af kroppen (begyndelsen af halen).
- Beregne den betingelse faktor ved hjælp af følgende formel:
Betingelse faktor = (samlede kropsvægt - gonade vægt) / samlet længde3.
Bemærk: Gonade vægt er trækkes fra den samlede kropsvægt, da gonaderne kan bidrage væsentligt til den samlede kropsvægt, især i prespawn kvindelige fisk.
-
Få en blodprøve.
Bemærk: Blod er oftest taget fra den caudale vene, men kan også trækkes fra dorsal aorta eller ved hjertestop punktere30.- Uddrag en perifer blodprøve fra den caudale vene med 22 eller 23 G nål på en 1 til 5 mL sprøjte, afhængigt af størrelsen på fisken. Indsætte nålen foran den caudale område under sidelinjen (figur 1A og 1B). Vinkel det opad indtil rammer rygsøjlen og derefter trække lidt. Venen er ventrale til overliggende rygsøjlen.
Bemærk: Hvis blod udstrygningspræparater foretages eller serum er nødvendig, bruges ingen antikoagulans. I de fleste tilfælde, plasma vil blive indsamlet, og dermed en antikoagulans som natrium heparin, EDTA eller lithium anvendes til at belægge nål og sprøjte og er også i blodet collection tube (f.eks., vacutainer). - Fjern nålen og placere i en sharps bortskaffelse beholder før ibrugtagning collection tube blod.
Bemærk: Blod kan holdes på is, men afhængig af efterfølgende analyser bør være centrifugeres snarest muligt30. - Hvis nukleare abnormiteter eller differentieret blodtal vil blive evalueret, straks placere en dråbe blod på dublerede rene glas objektglas. Tilbage et andet dias i en 45° vinkel i falde, hvilket er derefter trukket hen over overfladen af kapillaritet. Lad lufttørre31.
- Der centrifugeres blod på 1.500-2.500 x g i 15 min. til sediment cellerne. Fjerne plasma/serum med en steril overførsel pipette, alikvot til kryogene hætteglas, og opbevares ved-80 ° C.
- Uddrag en perifer blodprøve fra den caudale vene med 22 eller 23 G nål på en 1 til 5 mL sprøjte, afhængigt af størrelsen på fisken. Indsætte nålen foran den caudale område under sidelinjen (figur 1A og 1B). Vinkel det opad indtil rammer rygsøjlen og derefter trække lidt. Venen er ventrale til overliggende rygsøjlen.
Figur 1 : At opnå en blodprøve fra en fisk. (A) A seneste euthanized fisk er lagt på sin side og sidelinjen placeret. (B) en nål er indsat ventral at lateral linje (pil), vinklet opad indtil nålen rører rygraden. Det er så lidt trukket tilbage, og suge indledt for at trække blod. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
-
Gennemføre en obduktion-baserede helbredskontrol på hver fisk.
Bemærk: En række publikationer illustrere og beskrive læsioner og abnormiteter er tilgængelige32,33,34,35.- Dokument ydre abnormiteter herunder læsioner på kroppens overflade og finner (figur 2), øjne og gæller (figur 3), ekstern parasitter såsom igler (figur 2D), larver eller trematode metacercarial cyster (figur 2D, 3B) og gill parasitter (figur 3D). Dokument type, placering og størrelse af observerede deformiteter på datablade, såvel som fotografisk, hvis det er muligt.
- Åbn i bughulen (figur 4A) ved hjælp af en saks af skæring fra det anale område til Laag og derefter fjerne flap af muskel til at afdække de indre organer.
Bemærk: Hvis forreste nyre vil blive indsamlet til immun funktion (Se trin 5 nedenfor) eller prøver indsamlet for bakteriologi og virologi, eksterne kroppens overflade skal desinficeres med 70% alkohol og disse prøver bør opnås inden obduktion udføres. Hvis væv bruges kun til visuelle observationer, plasma analyser og histopatologi steril teknik er ikke nødvendigt. - Dokument interne abnormiteter (figur 4) herunder generelle eller fokale misfarvninger af de forskellige organer (figur 4B-4D), tilstedeværelsen af rejst områder (figur 4E), cyster, parasitter, og størrelse () abnormiteter udvidede, forkrøblede).
Figur 2 : Eksempler på synlige læsioner observeret på kroppens overflade og finner fisk. (A) A små, lidt eroderet læsion (pil) på den laterale overflade. (B) en stor rød område (pil) involverer caudale kroppens overflade. (C) hævet, sort læsioner (pile) på kroppens overflade og finner. (D) igler (hvid pil) og små sorte pletter (sorte pile) på fin. Skalalinjen = 3 mm. (E) en rejst, multilobed, bleg læsion (pil) på kroppens overflade. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Eksempler på synlige læsioner af gællerne og øjne fisk. (A) A bleg område (pil) inden for linsen af et øje. Skalalinjen = 5 mm. (B) hvid cyster (hvid pil) og små sorte pletter (sorte pile) forårsaget af trematode parasitter på gællelåget dækker gællerne (en). Skalalinjen = 1 cm. (C) A bleg, eroderede området (pil) på gill (en). Skalalinjen = 5 mm. (D) en gill, der har fjernet viser parasitter (pile) knyttet til gill filamenter. Skalalinjen = 2 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Eksempler på en obduktion og interne abnormiteter fisk. (A) under en obduktion fisken skåret åben (langs de hvide pil) og en flap af muskel (sort pil) fjernet for at eksponere gonade (en) og milt, holdt af saks og pincet. (B) spraglet leveren (a), testiklerne (b), tarmen omgivet af fedt fedt (c) og mave (d). Skalalinjen = 5 mm. (C) lever (en) med en mørk rød område (pil), æggestokken (b) og tarme (c). Skalalinjen = 5 mm. (D) lever med grønligt misfarvede områder (pile). Skalalinjen = 1 cm. (E) eksempel på en normal (a) og abnorm b testiklerne med rejst knuder. Skalalinjen = 1 cm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
-
Få hepatosomatic indeks (HSI).
- Fjern leveren ved overskæring af hepatisk arterie og bindevæv i den forreste ende. Forsigtigt løfte ud mens trimning sammenvoksninger og andre forbindelser til tarmen og fedtaflejringer. Passe på ikke punktere galdeblæren. Veje leveren.
Bemærk: Nogle fisk, såsom karpefisk, har ikke en diskret leveren, men snarere hepatiske væv svøbt omkring tarmene og andre organer. For disse arter, kan det ikke være muligt at opnå lever vægte. - Beregning af hepatosomatic indeks (HSI) ved hjælp af formlen:
HSI = lever vægt/samlede kropsvægt
- Fjern leveren ved overskæring af hepatisk arterie og bindevæv i den forreste ende. Forsigtigt løfte ud mens trimning sammenvoksninger og andre forbindelser til tarmen og fedtaflejringer. Passe på ikke punktere galdeblæren. Veje leveren.
-
Beregning af gonadosomatic indeks.
- Fjerne gonaderne og vejer det.
- Beregne gonadosomatic index (GSI) ved hjælp af formlen:
GSI = gonade vægt/samlede kropsvægt
3. bevare væv til mikroskopisk patologi
Bemærk: En række fikseringsmidler herunder 10% neutrale bufferet formalin og Z-fix, formalin-baserede fiksativ med zink, kan bruges til opbevaring af væv i feltet. Sidstnævnte er foretrukne hvis kan anvendes metoder såsom i situ hybridisering eller fluorescerende antistoffarvning.
- Omhyggeligt skæres men ikke trække ud vævsprøver. Holde individuelle væv stykker < 2 cm i størrelse og < 5 mm tyk til korrekt fiksation. Som en tommelfingerregel kan bruge ca 10 x mere fiksativ volumen end vævet for korrekt opbevaring. Placere alle vævsprøver fra én fisk i samme tætte beholder af passende størrelse, afhængigt af størrelsen af fisk der indgik i stikprøven.
- Læg stykker af eventuelle ydre abnormiteter i Fikseringsvæske container. Desuden et tilstødende stykke af normale væv.
Bemærk: Forkert håndtering af kompression eller andre mekaniske skader, lang eksponering for luft eller sollys, og frysning kan forårsage artefakter. - Skære mindst fem 3-4 mm tykke stykker af leveren fra forskellige regioner og placere i Fikseringsvæske containeren. Omfatte normale og unormale områder, hvis observeret.
- Afhængig af størrelse, skal du placere en hel gonade eller flere stykker langs en gonade i Fikseringsvæske beholderen.
- Sted enten hele organer, hvis små, eller stykker af alle andre organer (milt, anterior og posterior nyre, gæller, hjerte, tarmen og maven) i Fikseringsvæske container. Hvis unormale væv er observeret, bevare et tilstødende stykke af normale væv så godt.
4. Fjern ørestenene alder analyser
Bemærk: Alder kan være en vigtig variabel i fisk sygdom/fisk sundhed undersøgelser. Mens en række bygninger, herunder skalaer og pigge, har været anvendt til bestemmelse af alder, har de fleste undersøgelser sammenligner strukturer fundet ørestenene at give de bedste resultater36,37. Teleost fisk har tre par af ørestenene - lapillus, sagitta og asteriscus. Generelt, sagittal eller lapillus ørestenene indsamles for aging selv om der kan variere efter art. Fjernelse og aldring teknikker har været tidligere beskrevet38.
- Skære igennem gill næs, og bøj hovedet tilbage. Strip væk bindevæv og muskuløs væv omkring den ringere dele af neurocranium til at finde prootic bullae, en hævet knoklede område.
- Score eller skære med knogle kuttere og knæk hen til afsløre otolit. De kan ses med det blotte øje.
- Placer ørestenene i en mærket hætteglas eller en mønt kuvert og opbevares ved stuetemperatur indtil analyseret for alder ved at tælle den ringe eller intervaller38. Hvis anbringelse i et hætteglas, åbne cap engang tilbage til laboratoriet og lade det grundigt tørre inden opbevaring.
Figur 5 : Fjernelse af otolit. (A) landtangen er skåret og bindevæv og muskler trukket væk til at afsløre i bunden af rygsøjlen og neurospinal område. (B) knoglen er krakket for at eksponere otolit. (C) Lapillar ørestenene er fjernet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
5. få væv til immunforsvaret Assays
Bemærk: Den forreste nyre er de store hæmatopoietisk orgel, kilde af lymfocytter og makrofager for funktionelle assays, og skal fjernes aseptisk, hvis celler vil blive kulturperler for funktionelle assays, som mitogenesis, fagocyterende og drab evne til makrofager39,40.
- Spray den udvendige overflade af fisk med 70% ethanol. Brug steril saks, skalpel og pincet til at åbne i bughulen og fjerne det forreste nyrevæv, som er en mørk rød organ placeret foran svømme blæren.
- Forreste nyre prøven anbringes i medierne (f.eks. Leibovitz L-15) til at holde cellerne i live. Homogeniseres nyre prøver med en steril håndholdte væv grinder (f.eks. Tenbroeck væv grinder) i enkelt celle suspensioner. Hold på våde is indtil returneres til laboratoriet.
6. bevare væv for nukleinsyre analyser
Bemærk: Hvis downstream Molekylær analyse vil blive gennemført, som Gen-ekspression ved hjælp af udskrift overflod41 eller kvantitativ PCR42 (polymerase chain reaction), placere stykker af væv skal vurderes i et passende konserveringsmiddel ( f.eks., RNAlater stabilisering løsning) så hurtigt som muligt.
- For RNA bevarelse, sted to til tre små (2 – 3 mm) stykker i den passende konserveringsmiddel i forholdet 10:1 af konserveringsmiddel volumen til væv.
Bemærk: Prøver skal være Afskærmet fra sollys eller ekstrem varme og transporteres på våde is. - For DNA bevarelse, skal du placere to til tre små stykker af væv i 95% ethanol (10:1 ethanol til væv af volumen). Hold derefter prøverne på våde is og derefter opbevares ved-20 ° C.
Representative Results
Store søers områder af bekymring (AOC) er geografiske områder, der var udpeget på grund af svækkelser af forskellige gavnlige anvendelser. En af gavnlige brug svækkelser (BUIs) på mange AOC er fisk tumorer eller andre deformiteter. Millioner af dollars er brugt for oprydning og genopretning af hvert af disse områder for at ophøre af forskellige BUIs og i sidste ende AOC43. Kriterierne for afnotering fisk tumor BUI er forskellig fra medlemsstat til medlemsstat (Se epa.ohio.gov/portals/35/lakeerie/ohio_AOC_delisting_guidance.pdf og dnr.wi.gov/topic/GreatLakes/documents/SheboyganRiverFinalReport2008.pdf); Men, som bemærket i de afnotering dokumenter, der er et krav om at bestemme prævalensen af levertumorer og i nogle tilfælde hudtumorer. I mange tilfælde er forekomsten i forhold til en ikke-AOC referencested.
Fisk tumor BUI blev evalueret ved tre Bob (St. Louis River, Milwaukee River og Sheboygan floden) og en ikke-AOC reference site (Kewaunee River) på søerne Superior og Michigan, udnytter en obduktion-baseret vurdering af hvide sucker (Catostomus commersonii ), efterfulgt af mikroskopisk patologi af huden og levervævet. Fisk blev indsamlet fra Milwaukee, Sheboygan og Kewaunee floder i 2012 og 201344 og fra floden St. Louis i 2015 (ikke-offentliggjorte data). To hundrede hvide suckers blev vurderet fra Milwaukee, Kewaunee og St. Louis og 193 fra Sheboygan.
Pr. definition kan en tumor være enhver hævelse eller hævet område, selv om det anses generelt for at en hævelse forårsaget af en unormal vækst af væv med unormale celler er enten en godartede eller ondartede svulster. Hvid sucker indsamlet fra alle websteder udstillet en lang række eksterne hævet læsioner herunder små, diskrete hvide pletter, større hvide områder, let forhøjet mucoid læsioner og multilobed hævet områder på kroppens overflade og læber (figur 6). Fisk blev vejet og målt til at opnå en tilstand faktor, eksterne og interne abnormiteter blev dokumenteret og hud og leveren væv blev indsamlet til histopatologisk undersøgelse.
Figur 6 : Hævet hudlæsioner observeret på hvide sucker fra de store søer. (A) en diskret hvid plet på kroppens overflade. Skalalinjen = 5 mm. (B) en smule hævet mucoid (pile) og multilobed læsioner (en) på den bageste overflade. Skalalinjen = 1 cm. (C) A store, multilobed læsion på kroppens overflade. Skalalinjen = 1 cm. (D) talrige multi fliget læsioner på læberne. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Den procent af fisk med eksterne tumorer eller hævet misfarvede områder varierede fra 15,5% på St. Louis AOC til 58.0% på Milwaukee AOC. Generelt er var de diskrete hvide pletter den mindste fælles visuelle læsion mens multilobed læbe og krop overflade læsioner var mest almindelige. Antallet af fisk med observerbare lever knuder var lav, lige fra 1,5% på Kewaunee og St. Louis til 2,5% i Milwaukee (tabel 1).
| Floder og år for stikprøven | ||||
| Synlige læsioner | Kewaunee 2013 | St. Louis 2015 | Sheboygan 2012 | Milwaukee 2013 |
| Diskrete hvide pletter | 16 | 3 | 3.1 | 5 |
| Mucoid | 20 | 9.5 | 9,8 | 30,5 |
| Multilobed | 22,5 | 3 | 29,5 | 40 |
| Alt rejst hud abnormiteteren | 46 | 15,5 | 38,3 | 58 |
| Synlige lever knuder | 1.5 | 1.5 | 1,6 | 2.5 |
| en Samlede antal fisk med hævet læsioner. Nogle fisk havde flere typer af abnormiteter. | ||||
Tabel 1: Obduktion-baserede observationer af hvide Sucker indsamlet på store søers områder af bekymring og en Reference Site (Kewaunee River), præsenteret som en procentdel.
Besigtigelse kan bruges til at dokumentere procent af fisk med forskellige abnormiteter. Dog at endeligt diagnosticere tilstedeværelsen og type af neoplasi, væv skal undersøges mikroskopisk (histopatologi). På mikroskopisk undersøgelse konstateredes det, at ikke alle af de rejste læsioner var neoplastiske. Mange af de diskrete hvide pletter og slimet læsioner, særligt på Kewaunee, var hyperplastiske læsioner i stedet for neoplasi (tabel 2). Desuden på Kewaunee og St. Louis var alle af hudtumorer observeret godartet papillomer. På Sheboygan og Milwaukee blev både papillomer og planocellulært karcinom, maligne hudtumorer, observeret (tabel 2).
| Floder stikprøven | ||||
| Svulster Type | Kewaunee 2013 | St. Louis 2015 | Sheboygan 2012 | Milwaukee 2013 |
| Papilloma | 21 | 5.2 | 30,5 | 37,5 |
| Planocellulært karcinom | 0 | 0 | 2.1 | 10.5 |
| Samlede hud neoplasmer | 21 | 5.2 | 32.6 | 48 |
| Galdegang neoplasmeren | 2.5 | 4 | 6.2 | 9.5 |
| Hepatisk celle neoplasmerb | 1 | 0 | 2.1 | 8 |
| Alt lever neoplasmer | 3.5 | 4 | 8.3 | 15,0c |
| en Omfatter cholangioma og leverkræft | ||||
| b Omfatter hepatisk celle adenom og hepatiske karcinom | ||||
| c Nogle fisk havde både galdegang og hepatiske neoplasmer | ||||
Tabel 2: Mikroskopisk verificeret neoplastiske læsioner af hvide Sucker indsamlet på store søers områder af bekymring og en Reference Site (Kewaunee River), præsenteret som en procentdel.
Histopatologisk analysen også identificeret levertumorer, der ikke blev identificeret ved visuel observation. Mens kun 1,5% af de fisk, der opsamlet fra Kewaunee og St. Louis havde synlige lever knuder (tabel 1), var 3,5 og 4,0%, henholdsvis, mikroskopisk identificeret neoplasmer (tabel 2). En større forskel var set på Sheboygan (1,6% synlige versus 8,3% mikroskopiske) og Milwaukee (2,5% synlige versus 15,0% mikroskopiske). Mikroskopisk undersøgelse giver også en differentiering af neoplasmer af galdegang versus hepatisk celle oprindelse (tabel 2) og godartede og ondartede tumorer.
Discussion
Obduktion-baseret vurdering af fisk sundhed kan blive udnyttet på alle fiskearter, som forsøgslederen har en forståelse af den normale udseende af både eksterne og interne strukturer. Ved hjælp af en standardiseret tilgang giver mulighed for sammenligninger mellem websteder og arter samt sæsonbetonede og tidsmæssige ændringer i en befolkning. Resultaterne kan bruges at identificere virkninger forbundet med punkt og nonpoint kilder til forurenende stoffer og informere forvaltningstiltag. Det kan også bruges til at spore forbedringer, når ledelsesmæssige tiltag iværksættes. Metoden, der kan redigeres for at forøge dokumentationen af visuelle ydre abnormiteter i en række forskellige måder. Vurderinger, baseret på visuelle observationer, kan være ikke-dødelige, relativt billig og data kan fremskaffes hurtigt til et stort antal individer. Derfor, de kan være nyttige for sonderende eller indledende vurderinger, til at overvåge ændring over tid eller i kombination med andre indikatorer. Hvis længde og vægt af fisk måles under visuelle observationer, beregnes den betingelse faktor kan også. Selv om vurderinger baseret kun på visuel observation give ikke oplysninger om årsagen eller tilknyttede risikofaktorer, langsigtede tendenser af visse hud abnormiteter45 og biometriske parametre46 har angivet forbedring i nogle områder forbundet med vand kvalitetsforbedringer.
Obduktion-baseret vurdering giver flere oplysninger som de indre organer er også undersøgt og andre betingelse faktorer såsom hepatosomatic indeks og gonadosomatic indeks kan beregnes. Goede og Barton22 udviklet et felt obduktion metode, der inkluderede blodparametre, biometriske faktorer, procentdelen af abnormiteter og indeksværdier for bestemte abnormiteter. En videreudvikling af metoden indgår en klassifikation for nogle variabler, der tillod til beregning af en sundhed vurderingsindeks, der kunne være i forhold statistisk23. Denne sundhed vurderingsindeks har været brugt i regionale site sammenligninger23,47,48 og i kombination med andre biologiske indikatorer, herunder plasma og histopatologiske analyser i USA geologiske Undersøgelsens bioovervågning af miljøtilstand og udvikling Program evaluering af potentielle effekter af forurenende eksponering i store floder landsdækkende49,50,51. En fisk sygdom indeks baseret på eksternt synlige sygdomme og parasitter, synlige lever neoplasmer og andre registreres histopathologically lever læsioner er blevet udviklet og udbredt i Nordsøen, Østersøen, og fra Island. Dette indeks blev anset for at være et vigtigt redskab som et økosystem sundhed indikator52.
Der er nogle kritiske faktorer i den obduktion-baseret bedømmelse på fisk. Først, skal der foretages vurderinger på fisk umiddelbart efter døden. Ændringer i organ farve og konsistens kan forekomme ret hurtigt efter døden. Desuden, kan nogle parasitter forlade værten snart efter døden. For det andet er det vigtigt at vide, hvad der er normalt for arterne af interesse. For eksempel, nogle fisk har normalt fede og derfor bleg lever, mens de fleste arter en bleg lever ville være unormal. Det er også vigtigt at anerkende sæsonbestemte ændringer, der forekommer naturligt. Nogle fisk vil have farveændringer eller udvikle opdræt knuder i gydetiden.
Begrænsninger af den obduktion funderet vurdering som en metode til fisk sundhedsvurdering omfatter manglende evne til at identificere 1) konsekvent "årsagen" til specifikke læsioner og 2) identificere effekter, der ikke kan ses med det blotte øje. Disse ulemper kan overvindes med tilsætning af histopatologi, molekylære eller kulturelle identifikation af patogener og parasitter og genekspression. For eksempel, en "tumor" eller hævet læsion (hævelse) kan være faktiske neoplasi eller det kan være en parasit, betændelse, ødem eller hyperplasi (stigning i antallet af normale celler), forårsaget af kemiske eksponering, smitstoffer eller andre irritationsmomenter. Som vist i de repræsentative resultater, kræver endelige tumor eller neoplasi diagnose mikroskopiske patologi til at identificere læsion typen og sværhedsgraden (dvs. godartet eller ondartet). Vurdering af hvide sucker eksterne "tumorer" ved visuel observation overvurderet prævalens, især på webstedet reference. Mange af de rejste læsioner var ikke svulster, men snarere hyperplastiske læsioner. Det er i øjeblikket uvist, hvorvidt disse hyperplastiske læsioner er præneoplastiske. Omvendt, observation af hævede knuder i leveren væsentligt undervurdere forekomsten af leveren neoplasmer. Derfor, indsamling af væv til mikroskopisk patologi var nødvendigt at tilstrækkelig højde risikoen for varesortimentet.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af US Geological Surveys økosystemer (Chesapeake Bay miljøer og fiskeri) og miljø-og sundhedsområdet (forurenende stoffer biologi) programmer og West Virginia Department of Natural Resources. Brug af handelsnavne er til identifikationsformål og er ikke ensbetydende med påtegning af den amerikanske regering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Folding tables | Any | ||
| Folding chairs | Any | ||
| Dissecting boards | Any | ||
| Measuring board (mm) | Any | ||
| Battery powered scale (g) for fish weight | Any | ||
| Battery powered scale (mg) for organ weights | Any | ||
| Dissecting forceps | Any | ||
| Bone cutters | Any | ||
| Scalpel and blades | Any | ||
| Disposable gloves | Any | ||
| Buckets | Any | ||
| Leak-proof Nalgene bottles (250 mL) | ThermoFischer Scientific | 02-924-5C | |
| Vacutainer tubes with sodium heparin | ThermoFischer Scientific | 02-689-6 | For blood collection |
| Disposable 3 mL syringes with 23 G needle | ThermoFischer Scientific | 14-826-11 | |
| 1 – 2 mL cryovials | Any | Used for plasma and RNAlater samples | |
| Invitrogen RNAlater Stabilization solution | ThermoFischer Scientific | AM7021 | |
| Z-Fix Formaldehyde Zinc fixative | Anatech LTD | SKU-174 | |
| Tricaine-S (MS-222) | Syndel USA | fish anesthetic | |
| Coin Envelopes | Any | for otoliths | |
| Pencils and pens | Any | ||
| 70% alcohol | Any | ||
| Data sheets | Any |
References
- Celander, M. C. Cocktail effects on biomarker responses in fish. Aquatic Toxicology. (105 Supplement), 72-77 (2011).
- Liney, K. E., et al. Health effects in fish of long-term exposure to effluents from wastewater treatment works. Environmental Health Perspectives. 114, 81-89 (2006).
- Silva, E., Rajapakse, N., Kortenkamp, A. Something from "nothing" - eight weak estrogenic chemicals combined at concentrations below NOECs produce significant mixture effects. Environmental Science & Technology. 36, 1751-1756 (2002).
- Noyes, P. D., et al. The toxicology of climate change: environmental contaminants ina warming world. Environment International. 35, 971-986 (2009).
- Witeska, M., Jezierska, B. The effect of environmental factors on metal toxicity to fish. Fresenius Environmental Bulletin. 12, 824-829 (2003).
- Wedekind, C., Gessner, M. O., Vazquez, F., Maerki, M., Steiner, D. Elevated resource availability sufficient to turn opportunistic into virulent fish pathogens. Ecology. 91, 1251-1256 (2010).
- Penttinen, R., Kinnula, H., Lipponen, A., Bamford, J. K. H., Sundberg, L. R. High nutrient concentration can induce virulence factor expression and cause higher virulence in an environmentally transmitted pathogen. Microbial Ecology. 72, 955-964 (2016).
- Bols, N. C., Brubacher, J. L., Ganassin, R. C., Lee, L. E. J. Ecotoxicology and innate immunity in fish. Developmental & Comparative Immunology. 25, 853-873 (2001).
- Dunier, M., Siwicki, A. K. Effect of pesticides and other organic pollutants in the aquatic environment on immunity of fish: a review. Fish and Shellfish Immunology. 3, 423-438 (1993).
- Milla, S., Depiereux, S., Kestemont, P. The effects of estrogenic and androgenic endocrine disruptors on the immune system of fish: a review. Ecotoxicology. 20, 305-319 (2011).
- Connon, R. E., Geist, J., Werner, I. Effect-based tools for monitoring and predicting the ecotoxicological effects of chemicals in the aquatic environment. Sensors. 12, 12741-12771 (2012).
- Eckman, D. R., et al. Biological effects-based tools for monitoring impacted surface waters in the Great Lakes: A multiagency program in support of the Great Lakes restoration initiative. Environmental Practice. 15, 409-426 (2013).
- Khan, M. Z., Law, F. C. P. Adverse effects of pesticides and related chemicals on enzyme and hormone systems of fish, amphibians and reptiles: A review. Proceedings of the Pakistan Academy of Sciences. 42, 315-323 (2005).
- Wernersson, A. S., et al. The European technical report on aquatic effect-based monitoring tools under the water framework directive. Environmental Sciences Europe. 27, (2015).
- Bolger, T., Connolly, P. L. The selection of suitable indices for the measurement and analysis of fish condition. Journal of Fish Biology. 34, 171-182 (1989).
- Karr, J. R. Biological integrity: A long-neglected aspect of water resource management. Ecological Applications. 1, 66-84 (1991).
- Sanders, R. E., Miltner, R. J., Yoder, C. O., Rankin, E. T. The use of external deformities, erosions, lesions, and tumors (DELT anomalies) in fish assemblages for characterizing aquatic resources: a case study of seven Ohio stream. Assessing the sustainability and biological integrity of water resources using fish communities. Simon, I. nT. P. , CRC Press. Florida. 225-246 (1999).
- Bervoets, L., et al. Bioaccumulation of micropollutants and biomarker responses in caged carp (Cyprinus carpio). Ecotoxicology and Environmental Safety. 72, 720-728 (2009).
- Schulte-Hermann, R. Adaptive liver growth induced by xenobiotic compounds: its nature and mechanism. Archives of Toxicology. Supplement. 2, 113-124 (1979).
- Slooff, W., van Kreijl, C. F., Baars, A. J. Relative liver weights and xenobiotic-metabolizing enzymes of fish from polluted surface waters in the Netherlands. Aquatic Toxicology. 4, 1-14 (1983).
- Brewer, S. K., Rabeni, C. F., Papoulias, D. M. Comparing histology and gonadosomatic index for determining spawning condition of small-bodied riverine fishes. Ecology of Freshwater Fish. 17, 54-58 (2003).
- Goede, R. W., Barton, B. A. Organismic indices and an autopsy-based assessment as health and condition of fish. American Fisheries Society Symposium. 8, 93-108 (1990).
- Adams, S. M., Brown, A. M., Goede, R. W. A quantitative health assessment index for rapid evaluation of fish condition in the field. Transactions of the American Fisheries Society. 122, 63-73 (1993).
- Kane, A. S., et al. Field sampling and necropsy examination of fish. Virginia journal of science. 50, 345-363 (1999).
- Yanong, R. P. E. Necropsy techniques for fish. Seminars in Avian and Exotic Pet Medicine. 12, 89-105 (2003).
- American Fisheries Society (AFS) Use of Fishes in Research Committee, American Institute of Fishery Research Biologists and the Society of Ichthyologists and Herpetologists. Guidelines for the Use of Fishes in Research. , American Fisheries Society. Bethesda, Maryland. (2004).
- Bonar, S. A., Hubert, W. A., Willis, D. W. Standard methods for sampling North American freshwater fishes. , American Fisheries Society. Bethesda, Maryland. (2009).
- Zale, A. V., Parrish, D. L., Sutton, T. M. Fisheries Techniques, third edition. , American Fisheries Society. Bethesda, Maryland. 1009 (2013).
- Neiffer, D. L., Stamper, M. A. Fish sedation, anesthesia, analgesia, and euthanasia: considerations, methods, and types of drugs. Institute for Laboratory Animal Research. , 343-360 (2009).
- Clark, T. D., et al. The efficacy of field techniques for obtaining and storing blood samples from fishes. Journal of Fish Biology. 795, 1322-1333 (2011).
- Adewoyin, A. S., Nwogoh, B. Peripheral blood film - a review. Annals of Ibadan Postgraduate Medicine. 12, 71-79 (2014).
- Smith, S. B., et al. Illustrated field guide for assessing external and internal anomalies in fish. Information and Technology Report USGS/BRD/ITR. 2002-007, 46 (2002).
- Kane, A. S. Descriptive guide to observing fish lesions. , Available at http://aquaticpath.phhp.ufl.edu/Lesionguide/Lesionguide.pdf (2005).
- Rafferty, S. D., Grazio, J. Field manual for assessing internal and external anomalies in brown bullhead (Ameiurus nebulosus). , Pennsylvania Sea Grant. Erie, PA. Available at: https://seagrant.psu.edu/sites/default/files/Bullhead%20field%20manual.pdf (2018).
- European Association of Fish Pathologists. Necropsy manual. , Available at www.necropsymanual.net (2018).
- Buckmeier, D. L., Irwin, E. R., Betsill, R. K., Prentice, J. A. Validity of otoliths and pectoral spines for estimating ages of channel catfish. North American Journal of Fisheries Management. 22, 934-942 (2002).
- Maceina, M. J., Sammons, S. M. An evaluation of different structures to age freshwater fish from a northeastern US river. Fisheries Management and Ecology. 13, 237-242 (2006).
- Secor, D. H., Dean, J. M., Laban, E. H. Otolith removal and preparation for microstructural examination. Otolith Microstructure Examination and Analysis. Stevenson, D. K., Campana, S. E. 117, Canadian Special Publication of Fisheries and Aquatic Sciences. 19-57 (1992).
- Gauthier, D. T., Cartwrwight, D. D., Densmore, C. L., Blazer, V. S., Ottinger, C. A. Measurement of in vitro leucocyte mitogenesis in fish: ELISA based detection of the thymidine analogue 5'-bromo-2'-deoxyuridine. Fish and Shellfish Immunology. 14, 279-288 (2003).
- Zelikoff, J. T., et al. Biomarkers of immunotoxicity in fish:from the lab to the ocean. Toxicology Letters. , 325-331 (2000).
- Hahn, C. M., Iwanowicz, L. R., Corman, R. S., Mazik, P. M., Blazer, V. S. Transcriptome discovery in non-model wild fish species for the development of quantitiative transcript abundance assays. Comparative Biochemistry and Physiology - Part D: Genomics and Proteomics. 20, 27-40 (2016).
- Harms, C. A., et al. Quantitative polymerase chain reaction for transforming growth factor-B applied to a field study of fish health in Chesapeake Bay tributaries. Environmental Health Perspectives. 108, 1-6 (2000).
- Braden, J. B., et al. Economic benefits of remediating the Sheboygan River, Wisconsin Area of Concern. Journal of Great Lakes Research. 34, 649-660 (2008).
- Blazer, V. S., et al. Tumours in white suckers from Lake Michigan tributaries: pathology and prevalence. Journal of Fish Diseases. 40, 377-393 (2017).
- Vethaak, A. D., Jol, J. G., Pieters, J. P. F. Long-term trends in the prevalence of cancer and other major diseases among flatfish in the southeastern North Sea as indicators of changing ecosystem health. Environmental Science & Technology. 43, 2151-2158 (2009).
- Teubner, D., Paulus, M., Veith, M., Klein, R. Biometric parameters of the bream (Abramis brama) as indicators for long-term changes in fish health and environmental quality - data from the German ESB. Environmental Science and Pollution Research. 22, 1620-1627 (2015).
- Schleiger, S. L. Fish health assessment index study of four reservoirs in north-central Georgia. North American Journal of Fisheries Management. 24, 1173-1180 (2004).
- Sutton, R. J., Caldwell, C. A., Blazer, V. S. Health assessment of a tailwater trout fishery associated with a reduced winter flow. North American Journal of Fisheries Management. 20, 267-275 (2000).
- Blazer, V. S. The necropsy-based fish health assessment. Biomonitoring of environmental status and trends (BEST) program: selected methods for monitoring chemical contaminants and their effects in aquatic ecosystems. Schmitt, C. J., Dethloff, G. M. , U.S. Geological Survey Information and Technology Report USGS/BRD-2000-005 18-21 (2000).
- Schmitt, C. J. Biomonitoring of environmental status and trends (BEST) program: Environmental contaminants and their effects on fish in the Mississippi River basin. Biological Science Report USGS/BRD/BSR. 2002-0004, 241 (2002).
- Hinck, J. E., et al. Chemical contaminants, health indicators, and reproductive biomarker responses in fish from rivers in the Southeastern United States. Science of the Total Environment. 390, 538-557 (2008).
- Lang, T., et al. Diseases of dab (Limanda limanda): Analysis and assessment of data on externally visible diseases, macroscopic liver neoplasms and liver histopathology in the North Sea, Baltic Sea and off Iceland. Marine Environmental Research. 124, 61-69 (2017).
