Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

הערכת הבריאות מבוסס necropsy דגים פראי

Published: September 11, 2018 doi: 10.3791/57946
Automatic Translation
1, 2, 1, 2
1National Fish Health Research Laboratory, Leetown Science Center, U.S. Geological Survey, 2School of Natural Resources, West Virginia University

Summary

בריאות הדגים פראי יכול לשמש כמחוון של בריאות המערכת האקולוגית הימית. הערכות בריאות דגים מבוסס-necropsy לספק תיעוד של פצעים גלויים או מומים, הנתונים המשמשים לחישוב מדדי מצב, כמו גם את ההזדמנות כדי לאסוף את רקמות מיקרוסקופיים, ביטוי גנים והערכת אחרים מעמיק יותר ניתוחים.

Abstract

אנתרופוגניים השפעות של חומרים מזינים מוגברת של מזהמים כימיים, בית גידול שינויים, שינויי אקלים, יכול להיות השפעות משמעותיות על אוכלוסיות דגים. ניצול סמנים ביולוגיים של organismal לרמה מולקולרית, תופעות לוואי, ניטור, ניתן להעריך את ההשפעה המצטברת על דגים ואורגניזמים אחרים. כבר בשימוש ברחבי העולם כמחוון של המערכת האקולוגית הימית בריאות בריאות דגים. ההערכה בריאות דגים מבוסס-necropsy מספק נתונים על גלוי חריגות נגעים, טפילים, מצב organosomatic ומדד. אלה ניתן להשוות על ידי האתר, העונה, סקס, כמו גם במשמורת, מהמסמך משתנים לאורך זמן. דירוגי סיכון ניתן להקצות תצפיות שונות לחישוב של אינדקס בריאות דגים עבור יותר הערכה כמותית. חיסרון המבדק מבוסס-necropsy היא כי הוא מבוסס על תצפיות חזותיות וגורמים תנאי, אשר אינם רגישה כמו רקמות, סמנים ביולוגיים subcellular עבור אפקטים לא קטלני. בנוסף, זה לעתים רחוקות ניתן לזהות גורם או גורמי סיכון הקשורים עם מומים שנצפו. כך, למשל הנגע מוגבה או "גידול" סנפירים, השפתיים או משטח הגוף עשוי להיות גידול. עם זאת, זה יכול להיות גם תגובה טפיל, דלקת כרונית או היפרפלזיה של תאים נורמליים בתגובה מכשלה. לעומת זאת, neoplasms, מסוימים של טפילי, מדבקים אחרים, שינויים ברקמות רבים אינם גלויים, אז יכול לזלזל. עם זאת, במהלך ההערכה מבוססת על necropsy, הדם (פלסמה), רקמות עבור histopathology (מחלה מיקרוסקופית), גנומיקה אחרים ניתוחים מולקולרית ו otoliths עבור הזדקנות ניתן לאסוף. ניתוחים אלה במורד הזרם, יחד עם תמיכה גאו-מרחבית ניתוחים, הערכות בית גידול, ניתוחים מזהם ואיכות מים יכולים להיות חשוב במערכת האקולוגית מקיפה הערכות.

Introduction

פעילות אנושית יש השפעות שליליות רבות על סביבות הימית. דגים המאכלסים גופי המים השונים אוכלוסיית בני האדם משחזר ב ומשתמש לעתים קרובות כמקור מים לשתייה, ולכן הן אינדיקטורים חשוב לבריאות הסביבה התת-מימית. דג בר חיים מתרבים בבית גידול מסוים נחשפים לאורך כל חייהם לחצים שונים לרבות פתוגנים, טפילים, איכות המים המסכן, מזהמים כימיים. אלפי חומרים כימיים הזן נתיבי המים שלנו דרך שפכים תעשייתיים ואנושי, משקעים הפרברים/עירוני, נגר חקלאי. אלה תערובות מורכבים של כימיקלים ניתן מוספים, סינרגיסטי או אפקטים אויבת חשוף אורגניזמים1,2,3. בנוסף, לחצים סביבתיים אחרים כגון גבוהות חומרים מזינים, טמפרטורות גבוהות, נמוך חמצן מומס או pH המשתנות יכול להחריף את ההשפעות של מזהמים כימיים4,5. לחצים סביבתיים יכולים להשפיע גם על מחלה זיהומית תוצאות ישירות על-ידי הגדלת מספר מדבקים6, הגדלת את התקפה אלימה של פתוגנים אופורטוניסטים7 או לדכא את התגובה החיסונית ומחלות ההתנגדות של המארח8,9,10. מסיבות אלו, גוברת ההתעניינות תופעות לוואי או הביולוגי ניטור11,12,13,14, ניצול דגים ואורגניזמים ימיים אחרים כדי לזהות אוכלוסיות, מערכות אקולוגיות בסיכון.

תופעות לוואי ניטור מנצל סמנים ביולוגיים ברמות שונות של הארגון, של organismal subcellular או מולקולרית, לזהות תופעות לא קטלני, אשר עשויים להשפיע על אוכלוסיות ולהיות מעידה על חשיפה לחצים שונים. אינדיקטורים ברמת האורגניזם כוללים ליקויים גלוי ותנאים. תנאי במדדים המבוססים על אורך ומשקל מחושבים כדי להעריך את כושר של אוכלוסיות דגים או בביטחונו. הנפוצה שבהן היא גורמים מצבו של מר פולטון (K) = (משקל/אורך3) 15. סימן נוסף הוא הנוכחות של ליקויים גלוי. מגוון שיטות שימשו מחקרים בודדים ותוכניות ניטור להעריך, מסמך, ולהעריך חריגות גלוי. הערכה מבוססת רק על מומים חיצוניים, קרי, היחס של אנשים עם מחלות, נזק סנפיר, גידולים, חריגות השלד, נמנה המדדים עבור האינדקס של שלמות ביוטיים (אי) המוערכת בריאות הקהילה16. הערכה דומה כינה הפי-דלתא (מומים, ארוזיות, נגעים, גידולים) שימש גם להערכת התקינות של דגים קהילות17. עם זאת, שיטות אלה להעריך רק חריגות חזותי חיצוני ו נגעים פנימיים לא או מוקדם מחוונים לא קטלני.

הערכות מבוססות necropsy לכלול תצפיות חיצוניים ופנימיים ולאפשר המדידה של מדדים נוספים. אינדקס Hepatosomatic (משקל הגוף כבד משקל/סה כ) שימש גם בתור מדד של כושר או עתודות אנרגיה15 עבורו ערך אינדקס גבוה יותר מציין דגים בריאים יותר. עם זאת, מספר מחקרים הראו כי היפרטרופיה או עלייה גודל הכבד מתרחשת עקב חשיפה לחה מטבוליזם על ידי הכבד18,19,20. במקרה זה יהיה אינדקס גדול מעידה על חשיפה שיעורים כימיים מסוימים. מדד gonadosomatic (בלוטת המין משקל/סה כ משקל גוף) הוא עוד אינדקס תנאי המופנה כלפי פוריות21. תצפיות שנעשו במהלך המבדק מבוסס necropsy יכול לשמש כדי להשוות השכיחות של סוגי הנגע בודדים או אחוז של אנשים בריאים. עם זאת, הם יכולים גם לשמש כמותיים יותר בריאות הערכת22,23.

המבדק מבוסס necropsy מתוקננת המתוארים כאן ניתן להגדיל את ההערכה בגסות לעין במספר דרכים שונות בהתאם את ות ייענו, מומחיות ומשאבים זמינים נוספים. הגישה שגרתית שלנו היא כדי לאסוף נתונים ביומטרים (אורך, משקל, משקל כבד, בלוטת המין משקל), דם עבור פלזמה/סרום ניתוחים, מסמך פנימי וחיצוני גלוי חריגות, לשמר את חתיכות של איברים עבור ניתוח מיקרוסקופי ולאסוף otoliths עבור ניתוחים לגיל. הערכה המבוססת על necropsy פלוס ניתוח גיל ואת histopathology של איברים שונים, מאפשר חישוב, השוואה של מדדי מצב שונים, השכיחות של מומים גלוי, כמו גם שינויים מיקרוסקופיים ברקמות, לפי מין, גיל, אתר, תקופת הדגימה. יכול להיות עשוי רקמות נוספות קולקציות עבור ניתוחים רבים אחרים כולל מיקרוסקופ אלקטרונים, בקטריולוגיה, וירולוגיה, פרזיטולוגיה ריכוזים כימי. שיטות אלה ניתן גם חלק ניתוחים מעמיקים יותר לאבחן את סיבת הורג דגים24 או25דגים בהירושימה של השבוי. שיטות עבור אוסף של רקמות שני ניתוחים נוספים, ביטוי גנים וניתוחים המערכת החיסונית פונקציונלי מומחשים.

Protocol

השיטות המתוארות כאן אושרו על-ידי של מרכז מדע Leetown אכפת לי חיה המוסדית והוועדה שימוש.

1. אוסף דגים

  1. לאסוף את הדגים בשידור חי עם מינימום של מתח. השתמש electrofishing סירה או תיק גב, הוק, קו או רשתות.
  2. להחזיק דג בארות בשידור חי או מכולות קצף עד הדגימה.
    הערה: האגודה האמריקנית חלוצת פרסם מספר מדריכים עבור אוסף דגים, טיפול, הרדמה/המתת חסד26,27,28. ללבוש כפפות בעת טיפול דגים.

2. דגים Necropsy

  1. המתת חסד דג.
    1. מקום דגים ההרדמה עד התנועה opercular מפסיק ואת הדג מאבד שיווי משקל. אחרי עוד 2 – 10 דקות המתה הדג; עם זאת, זה יכול גם להשתנות על ידי מינים.
      הערה: דגים יכול להרדימם עם מספר רב של חומרי הרדמה (ראה טבלה של חומרים עבור הנפוץ ביותר). השיטה של המתת חסד תלויות המידה מעבדה ייערך על רקמות שנאספו29.
  2. למדוד המאפיינים הביומטרים.
    1. שוקלים את הדגים גרם הקרוב.
    2. למדוד את אורך דג מילימטר הקרוב.
      1. למדוד את האורך הכולל מהקצה של החוטם בפה סגור עד הסוף של הזנב כאשר צבט ביחד.
      2. למדוד מזלג אורך של המזלג הזנב עד הקצה החוטם, ואת האורך הסטנדרטי מהקצה של האף עד הסוף של הגוף (תחילת הזנב).
    3. לחשב את גורם תנאי שימוש בנוסחה הבאה:
      המצב גורם = (משקל הגוף הכולל - משקל בלוטת המין) / סה כ אורך3.
      הערה: בלוטת המין משקל יופחת ממשקל הגוף הכולל מאז בלוטות המין יכול לתרום באופן משמעותי משקל הגוף הכולל, בעיקר בדגים הנשי prespawn.
  3. להשיג דגימת דם.
    הערה: הדם נלקח בדרך כלל הווריד סימטרית אבל יכול גם להיות מופנמים של העורקים הגבי או על ידי לב לנקב30.
    1. לחלץ דגימת דם היקפיים הווריד סימטרית עם מחט G 22 או 23 על מזרק 1 ל 5 מ"ל, תלוי בגודל הדג. הכנס את המחט והשתרשה עמוק בלבה האזור סימטרית מתחת לקו לרוחב (איור 1A ו 1B). זווית כלפי מעלה עד מפגיעה בעמוד השדרה, ואז לסגת מעט. הווריד הוא הגחון לעמוד השדרה שמעליה.
      הערה: אם יבוצעו בדיקות דם או סרום הוא נדרש, אין קרישה. ברוב המקרים, פלזמה ייאספו, לפיכך, נוגדת קרישה כגון הפארין נתרן, EDTA או ליתיום משמש כדי להרגיע את מחט, מזרק, והוא גם בצינור איסוף דם (למשל, האגירה).
    2. הסר את המחט ולמקם לתוך מכולה סילוק שרפ לפני שמוציאים את הדם לתוך הצינור אוסף.
      הערה: דם יכולים להיות מוחזקים על קרח, אך בהתאם ניתוחים הבאים צריכים להיות centrifuged בהקדם האפשרי30.
    3. אם הגרעין ליקויים או ספירת דם מבדלת יוערך, מיד במקום טיפה של דם על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית נקי כפולים. חזרה שנייה החלק בזווית של 45 מעלות לתוך הטיפה, אשר לאחר מכן נמשך על פני השטח על ידי נימיות. מאפשרים מילה נהדרת.31.
    4. Centrifuge דם ב x 1,500 – 2,500 g למשך 15 דקות כדי משקעים התאים. הסר פלזמה/סרום עם העברת עקר pipet, aliquot לתוך מבחנות הקפאה, ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס.

Figure 1
איור 1 : קבלת דגימת דם דגים. (א) א לאחרונה מורדמים דגים מונח בצד שלה ואת הקו לרוחב ממוקם. (B) A המחט הוא שנוסף הגחוני / לאלתר קו (חץ), בזווית כלפי מעלה עד נוגע המחט את עמוד השדרה. זה ואז נסוגה מעט, שאיבה יזם לסגת דם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

  1. התנהגות הערכה מבוססת-necropsy הבריאות על כל דג.
    הערה: מספר פרסומים הממחישות המתארת נגעים ואת העיוותים הם זמינים32,33,34,35.
    1. המסמך מומים חיצוניים כולל נגעים על פני הגוף, סנפירים (איור 2), העיניים זימים (איור 3), טפילים חיצוניים כמו עלוקות (איור דו-ממדי), זחלים או ציסטות trematode metacercarial (איור דו-ממדי, 3B), גיל טפילים (דמות תלת-ממד). המסמך סוג, מיקום וגודל חריגות שנצפו על גליונות נתונים, כמו גם כמו בתצלום, במידת האפשר.
    2. פתח את חלל הבטן (איור 4A) באמצעות מספריים על-ידי גזירה מן האזור אנאלי operculum ולאחר מכן להסיר את מדף שריר לחשוף את האיברים הפנימיים.
      הערה: אם הכליה הקדמי ייאספו עבור החיסונית לתפקד (ראה שלב 5 להלן) או הדגימות שנאספו עבור בדיקות או וירולוגיה, פני גוף חיצוני צריכים להיות נקיים עם אלכוהול 70% הדגימות צריכה להתקבל לפני לבצע necropsy. אם רקמות רק בשימוש עבור תצפיות חזותיות, פלזמה ניתוחים סטרילי טכניקה histopathology אינה נחוצה.
    3. מסמך פנימי חריגות (איור 4) כולל כתמי כללי או מוקד של האברים השונים (איור 4B-4D), נוכחות של הרים באזורים (איור 4E), ציסטות, טפילים, ושנה את גודלה (מומים מוגדלים, מתנוונים).

Figure 2
איור 2 : דוגמאות של נגעים גלוי שנצפו על פני הגוף וסנפירים של דגים. (א) A קטן, מעט שחוק הנגע (חץ) על פני הגוף לרוחב. (B) A גדול אדומות באזור (חץ) המערבים את פני השטח של הגוף סימטרית. (ג) מוגבהת, נגעים שחור (חיצים) על פני הגוף, סנפירים. עלוקות (D) (חץ לבן), כתמים שחורים קטנים (חיצים שחורים) על הפרק. סרגל קנה מידה = 3 מ מ. (E) A מורמות, multilobed, חיוור הנגע (חץ) על פני הגוף. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : דוגמאות של נגעים גלוי של הזימים ועיניים של דגים. (א) A חיוור שטח (חץ) בתוך העדשה של העין. סרגל קנה מידה = 5 מ מ. (B) לבן ציסטות (החצים הלבנים), כתמים שחורים קטנים (חיצים שחורים) הנגרמת על ידי טפילים trematode על operculum מכסה הזימים (א). סרגל קנה מידה = 1 ס מ. (ג) A חיוור, בירוא אזור (חץ) גיל (א). סרגל קנה מידה = 5 מ מ. (D) גיל זה הוסר מציג טפילים (חיצים) המצורפת חוטים גיל. סרגל קנה מידה = 2 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: דוגמאות necropsy של מומים פנימיים של דגים. (א) במהלך necropsy הדג נחתך פתוח (לאורך החץ הלבן) והוסרו דש של השריר (חץ שחור) לחשוף את בלוטת המין (א) והטחול, מוחזק על ידי מלקחיים ומספריים. (B) מנומרים הכבד (א), האשכים (b), המעי מוקף אדיפוז ושומן (ג) הקיבה (ד). סרגל קנה מידה = 5 מ מ. (ג) בכבד (א) עם אזור אדום כהה (חץ), שחלה (b), המעיים (c). סרגל קנה מידה = 5 מ מ. (D) כבד עם אזורים ירקרק דהוי (חיצים). סרגל קנה מידה = 1 ס מ. (E) דוגמה רגיל (א) ועל האשכים (ב) לא נורמלי עם הרים גושים. סרגל קנה מידה = 1 ס מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

  1. להשיג hepatosomatic אינדקס (מצב HSI).
    1. להסיר את הכבד על ידי ניתוק עורק הכבד ואת רקמת החיבור של הקצה הקדמי. הרם בעדינות החוצה תוך כדי חיתוך הדבקויות וחיבורים אחרים כדי המעי ושומן אדיפוז. לטפל כדי לא לנקב את כיס המרה. שוקלים את הכבד.
      הערה: דגים מסוימים, כגון cyprinids, לא יש בכבד דיסקרטית אבל מעדיף הכבד הרקמה העוטפת את המעיים ואיברים אחרים. עבור מינים אלה, לא ייתכן ניתן לקבל משקל כבד.
    2. לחשב מדד hepatosomatic (מצב HSI) תוך שימוש בנוסחה:
      מצב HSI = משקל הגוף כבד משקל/סה כ
  2. חישוב מדד gonadosomatic.
    1. הסר את בלוטות המין, שוקל אותה.
    2. לחשב מדד gonadosomatic (GSI) תוך שימוש בנוסחה:
      GSI = בלוטת המין משקל/סה כ משקל הגוף

3. לשמר את רקמות עבור מחלה מיקרוסקופית

הערה: מספר כתות ומייצבים כולל פורמלין במאגר נייטרלי 10% ו- Z-fix, מקבע מבוססי פורמלין עם אבץ, ניתן להשתמש לשימור רקמות בשטח. האחרון הוא המועדף אם ייעשה שימוש בשיטות כגון בחיי עיר הכלאה או נוגדן פלורסנט מכתים.

  1. בזהירות לחתוך אבל אין למשוך דגימות רקמה. להשאיר חתיכות רקמה בודדים < 2 ס מ גודל ו- < 5 מ מ עבה עבור קיבוע נאות. כלל אצבע, השתמש בערך 10 x לשבועיים נוספים לפי נפח מאשר הרקמה לשימור נאותה. מקם כל דגימות רקמה של דג אחד באותה אריזה עמיד בפני נזילה בגודל המתאים, בהתאם לגודל הדגים להיות שנדגמו.
  2. המקום פיסות של חריגות חיצוני בתוך המיכל מקבע. בנוסף, כוללים המניח פיסת רקמה נורמלית סמוכים.
    הערה: טיפול כגון דחיסה או נזק מכני אחר, חשיפה ארוכה אויר או אור השמש, פסולים ובלתי קפוא יכול לגרום חפצים.
  3. לחתוך חמש לפחות 3-4 מ מ עבה חתיכות הכבד מאזורים שונים ולמקם לתוך המיכל מקבע. כוללים אזורים תקינה ולא תקינה, אם שנצפו.
  4. בהתאם לגודל, למקם בלוטה כולו או חלקים מרובים לאורך בלוטת המין אחד לתוך המיכל מקבע.
  5. מקם כל האיברים, אם קטן או חתיכות של כל שאר האיברים (טחול, כליות anterior ואת אחורי, זימים, הלב, המעי, בטן) בתוך המיכל מקבע. אם נוצרת רקמה נורמלית, לשמר המניח פיסת רקמה נורמלית כמו גם סמוכים.

4. להסיר את Otoliths עבור ניתוחים גיל

הערה: גיל יכול להיות משתנה חשוב בלימודי בריאות מחלה/דגים דגים. בעוד מספר מבנים, כולל סולמות, קוצים, שימשו לקביעת גיל, רוב המחקרים השוואת מבני גילו את otoliths לתת את הטוב ביותר תוצאות36,37. הדגים teleost יש שלושה זוגות של otoliths - lapillus, אקסלסיור, כוכב. באופן כללי, otoliths הווריד או lapillus נאספים להזדקנות למרות שזה עשוי להשתנות על ידי מינים. טכניקות להסרת והזדקנות כבר שתואר לעיל38.

  1. לחתוך דרך המצר גיל, לכופף את הראש בחזרה. רצועת משם חיבור ושרירי הרקמה סביב פרשת נחות neurocranium לאתר prootic ריהוט יוקרתי שרוף, אזור מוגבה גרמית.
  2. ניקוד או לחתוך עם עצם חותכני ולהיסדק לחשוף את otoliths. הם ניתן לראות בעין בלתי מזוינת.
  3. מקום otoliths בקבוקון עם תוויות ברורות או מטבע המעטפה וחנות בטמפרטורת החדר עד ניתח גיל על ידי ספירת טבעות או התוספות הקבועות הנובעות38. אם הנחת בקבוקון, פתח את הכובע פעם חזר למעבדה וגם תאפשר ביסודיות יבש לפני האחסון.

Figure 5
איור 5 : הסרה של otoliths. (א) המצר נחתך ומשך רקמת חיבור, שרירים כדי לחשוף את בסיס עמוד השדרה ואזור neurospinal. (B) העצם נסדקה לחשוף את otoliths. Otoliths Lapillar (ג) יוסרו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

5. לקבל את רקמות עבור מבחני תפקוד מערכת החיסון

הערה: הכליה הקדמי הוא האיבר hematopoietic הגדולות, המקור של לימפוציטים ו מקרופאגים עבור מבחני פונקציונלי, ויש להסירו גילוח ורחיצה כירורגית אם התאים תרבותי עבור מבחני פונקציונליות, כגון mitogenesis, phagocytic ויכולת הריגה של מקרופאגים39,40.

  1. תרסיס על המשטח החיצוני של הדג עם 70% אתנול. להשתמש במספריים סטרילי, אזמל, מלקחיים פתיחת חלל הבטן ולהסיר את רקמת הכליה הקדמי, אשר הוא איבר אדום כהה ממוקם והשתרשה עמוק בלבה השלפוחית.
  2. מקום המדגם כליות הקדמי מדיה (L-15למשל, של ליבוביץ) כדי לשמור את התאים בחיים. Homogenize כליה דגימות עם מטחנה רקמת כף יד סטרילי (למשל, Tenbroeck רקמות grinder) לתוך תא בודד המתלים. החזק על קרח רטוב עד חזר למעבדה.

6. לשמר את רקמות עבור ניתוחים חומצות גרעין

הערה: אם מטה אנליזה מולקולרית יבוצעו, כגון גנים באמצעות פרוטוקול שפע41 או ה-PCR כמותי42 (תגובת שרשרת של פולימראז), מקם את פיסות רקמה לפנות לבדיקה של חומר משמר המתאים ( למשל, RNAlater מייצב פתרון) בהקדם האפשרי.

  1. לשימור RNA, מקום 2-3 חתיכות קטנות (2-3 מ מ) משמר המתאים בבית 10:1 יחס של שימור נפח לרקמה.
    הערה: צריך להיות מוגן מאור השמש או חום עודף ודוגמאות מועבר על קרח רטוב.
  2. לשימור דנ א, למקם 2-3 חתיכות קטנות של רקמות 95% אתנול (10:1 אתנול לרקמות לפי נפח). אז תחזיק את הדגימות קרח רטוב ולאחר מכן אחסן ב-20 ° C.

Representative Results

האגמים הגדולים של דאגה (AOC) הם אזורים גיאוגרפיים אשר נקבעו בשל מגבלות של שימושים מועילים שונים. אחד ליקויי זיקת הנאה (בואה)-AOC רבים הוא דג גידולים או מומים אחרים. היית להשקיע מיליוני דולרים עבור תיקונים ושחזור של כל אחד מאזורים אלה על מנת delist את בואה שונים ובסופו של דבר את AOC43. הקריטריונים עבור מחיקה לגידול דגים ש-BUI שונה ממדינה למדינה (ראה epa.ohio.gov/portals/35/lakeerie/ohio_AOC_delisting_guidance.pdf, dnr.wi.gov/topic/GreatLakes/documents/SheboyganRiverFinalReport2008.pdf); עם זאת, כפי שמצוין במסמכים delisting, יש דרישה כדי לקבוע את השכיחות של גידולים בכבד, בגידולים העור כמה מקרים. במקרים רבים, השכיחות היא לעומת אתר הפניה הלא-AOC.

הגידול דגים BUI הוערך ב 3 AOCs (סנט לואי הנהר, מילווקי נהר ונהר שבשבוייגן) ואתר ההתייחסות ללא-AOC (נהר Kewaunee) על אגמים סופריור ומישיגן, ניצול הערכה המבוססת על necropsy של לבן מוצץ (Catostomus commersonii ), ואחריו מיקרוסקופיים פתולוגיות של העור, רקמת הכבד. הדגים היו שנאספו מן הנהרות מילווקי, שבשבוייגן ו Kewaunee ב 2012 ו 201344 ומן הנהר סנט לואיס בשנת 2015 (נתונים שלא פורסמו). מאתיים פראיירים לבנים היו העריכו מילווקי, Kewaunee, סנט לואיס, 193 מ שבשבוייגן.

לפי ההגדרה, גידול יכול להיות בכל תחום נפיחות או מוגבה, למרות זאת נחשבת בדרך כלל זה נפיחות הנגרמת על ידי גדילה לא תקינה של רקמות עם תאים חריגים או גידול שפיר או ממאיר. לבן מוצץ שנאספו מכל אתרי הציג מגוון חיצוני נגעים מוגבהים לרבות כתמים לבנים קטנים, דיסקרטית, אזורים לבנים גדולים, מוגבהת מעט נגעים mucoid multilobed אזורים מוגבהים על פני הגוף ועל השפתיים (איור 6). דגים היו שקל, נמדדת להשיג גורם תנאי מומים חיצוניים ופנימיים תועדו, רקמת העור ומסייעים הכבד נאסף עבור histopathology.

Figure 6
איור 6 : נגעים בעור מוגבה מובחנים מוצץ לבן מן האגמים הגדולים- (א) דיסקרטית כתם לבן על פני הגוף. סרגל קנה מידה = 5 מ מ. (B) A מורמת מעט mucoid (חיצים) נגעים multilobed (א) על פני הגוף האחורי. סרגל קנה מידה = 1 ס מ. (ג) A גדול, multilobed הנגע על פני הגוף. סרגל קנה מידה = 1 ס מ. (D) נגעים מרובי אונות רבות על השפתיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

אחוז של דגים עם גידולים חיצוני או מוגבה דהוי אזורים נע מ- 15.5%-AOC סנט לואיס אל 58.0% AOC מילווקי. באופן כללי, כתמים לבנים דיסקרטית היו הנגע חזותי נפוצה לפחות בעוד multilobed שפתיים של נגעים משטח הגוף היה נפוץ במיוחד. המספר של דג עם גושים בכבד הנצפה היה נמוך, ועד 1.5% Kewaunee, סנט לואיס 2.5% ב מילווקי (טבלה 1).

נהרות והשנה שנדגם
פצעים גלויים Kewaunee 2013 סנט לואיס 2015 2012 שבשבוייגן מילווקי 2013
כתמים לבנים דיסקרטית 16 3 3.1 5
Mucoid 20 9.5 9.8 30.5
Multilobed 22.5 3 29.5 40
סה כ העלה עור ליקויים 46 15.5 38.3 58
גושים בכבד גלוי 1.5 1.5 1.6 2.5
. המספר הכולל של דג עם נגעים מוגבה. דגים מסוימים היו מספר סוגים של מומים.

טבלה 1: תצפיות המבוסס על Necropsy של מוצץ לבן הנאספים אזורי האגמים הגדולים של דאגה, אתר הפניה (נהר Kewaunee), מוצג כאחוזים.
בדיקה ויזואלית ניתן לתעד את האחוזים של דג עם מומים שונים. עם זאת, כדי לאבחן בוודאות את הנוכחות ואת סוג neoplasia, רקמות חייב להיבדק ברמה המיקרוסקופית (histopathology). בעת בדיקה מיקרוסקופית, התברר כי לא כל של נגעים מוגבה היו אמצעים. הרבה של כתמים לבנים דיסקרטית, נגעים mucoid, במיוחד ב- Kewaunee, היו נגעים hyperplastic ולא neoplasia (טבלה 2). בנוסף, Kewaunee, סנט לואיס, כל הגידולים העור שנצפו היו papillomas שפיר. ב שבשבוייגן ומילווקי papillomas והן קרצינומה תאים קשקשיים, גידולים ממאירים בעור, נצפו (טבלה 2).

נהרות שנדגם
ניאופלזיה סוג Kewaunee 2013 סנט לואיס 2015 2012 שבשבוייגן מילווקי 2013
פפילומה 21 5.2 30.5 37.5
קרצינומה של תאים קשקשיים 0 0 2.1 10.5
עור הכולל neoplasms 21 5.2 32.6 48
צינור המרה neoplasms 2.5 4 6.2 9.5
תאי הכבד neoplasmsb 1 0 2.1 8
Neoplasms סה כ כבד 3.5 4 8.3 15.0c
. כולל cholangioma, cholangiocarcinoma
b כולל תא הכבד אדנומה קרצינומה של הכבד
c דגים מסוימים היה צינור המרה והן neoplasms הכבד

טבלה 2: אימות ברמה המיקרוסקופית נגעים אמצעים של מוצץ לבן שייאסף אזורי האגמים הגדולים של דאגה, אתר הפניה (נהר Kewaunee), מוצג כאחוזים.
הניתוח histopathological זיהה גם גידולים בכבד לא זוהו על ידי התצפית הויזואלית. בעוד רק 1.5% של הדג שנאסף Kewaunee על סנט לואיס היה גלוי גושים בכבד (טבלה 1), 3.5% ו- 4.0%, בהתאמה, ברמה המיקרוסקופית זיהה neoplasms (טבלה 2). הבדל גדול נראתה שבשבוייגן (1.6% גלוי מול 8.3% מיקרוסקופיים), מילווקי (2.5% גלוי מול 15.0% מיקרוסקופיים). בבדיקה מיקרוסקופית מספק גם הבחנה של neoplasms של צינור המרה לעומת המקור לתא הכבד (טבלה 2) שפירים נגד גידולים ממאירים.

Discussion

המבדק מבוסס necropsy של בריאות דגים יכול להיות מנוצל על כל מיני דגים עבורו החוקר יש הבנה של הופעה רגילה של מבנים חיצוניות ופנימיות. שימוש בגישה מתוקננת מאפשרת השוואות בין אתרים, מינים, כמו גם שינויים עונתיים, זמני באוכלוסיה. הממצאים ניתן לזהות תופעות הקשורות נקודת ומקורות nonpoint של מזהמים, ליידע את פעולות ניהול. זה יכול לשמש גם כדי לעקוב אחר שיפורים לאחר פעולות ניהול מבוצעים. ניתן לשנות את המתודולוגיה להעצמת תיעוד חזותי מומים חיצוניים במגוון דרכים. הערכות, בהתבסס רק על תצפיות חזותיות, יכולים להיות קטלניים, זול יחסית, ניתן להפיק נתונים במהירות עבור מספר גדול של אנשים. כתוצאה מכך, הם עשויים להיות שימושיים עבור הערכות גישוש או הראשונית, לעקוב אחר שינוי לאורך זמן או בשילוב עם סממנים אחרים. אם המשקל של דגים לאורכה נמדדים במהלך תצפיות חזותיות, הגורם תנאי גם ניתן לחשב. למרות הערכות מבוסס רק על התצפית הויזואלית אינם מספקים מידע על הגורם או גורמי סיכון הקשורים, מגמות לטווח ארוך של ליקויים מסוימים העור45 ו פרמטרים ביומטרי46 הראו שיפור באזורים מסוימים הקשורים שיפורים באיכות המים.

המבדק מבוסס-necropsy מספק מידע נוסף כמו איברים פנימיים נבדקים גם גורמים אחרים למצב כמו hepatosomatic אינדקס ואינדקס gonadosomatic יכול להיות מחושב. Goede ו ברטון22 פיתח שיטה necropsy השדה לכלול פרמטרים דם, גורמים ביומטרי, את אחוז חריגות, ואת ערכי אינדקס עבור ליקויים ספציפיים. עידון של השיטה כללה דירוג סיכון עבור משתנים מסוימים שמותר עבור חישוב של אינדקס הערכת בריאות זה יכול להיות מבחינה סטטיסטית לעומת23. אינדקס הערכת בריאות זה שימש האתר האזורי השוואות23,47,48 , בשילוב עם אינדיקטורים ביולוגיים אחרים לרבות פלזמה וניתוחים histopathological הגיאולוגי ארה ב הסקר אפידמיולוגיה סביבתית של מצב סביבתי, מגמות תוכנית הערכת ההשפעות האפשריות של מזהם חשיפה בנהרות גדולים בפריסה ארצית49,50,51. אינדקס מחלות דגים בהתבסס על מחלות חיצוני, טפילים, גלוי neoplasms הכבד ושאר histopathologically זוהה נגעים בכבד פותחה, שימוש נרחב ב ים הצפוני, הים הבלטי, ומחוץ איסלנד. אינדקס זה נמצאה להיות כלי חשוב כמו מחוון בריאות52המערכת האקולוגית.

ישנם כמה גורמים קריטיים בביצוע המבדק מבוסס necropsy על דגים. ראשית, הערכות להתבצע על דגים מיד לאחר המוות. שינויים בצבע איברים, עקביות יכול להתרחש די במהירות לאחר המוות. בנוסף, כמה טפילים עשויים להשאיר את המחשב המארח זמן קצר לאחר המוות. שנית, חשוב לדעת מה זה נורמלי עבור המינים של ריבית. למשל, כמה דגים בדרך כלל יש שומן, כתוצאה מכך, חיוור כבדים, בעוד רוב כבד חיוור יהיה חריג. זה חשוב גם לזהות שינויים עונתיים המתרחשים באופן טבעי. דגים מסוימים שינויי צבע או לפתח גידול tubercles במהלך עונת ההשרצה.

המגבלות של המבדק מבוסס-necropsy כמו שיטה להערכת בריאות דגים כוללים חוסר היכולת בעקביות 1) לזהות את "הגורם" נגעים ספציפיים, 2) לזהות תופעות יהיה בלתי נראה לעין בלתי מזוינת. מחסרונות אלה ניתן להתגבר עם התוספת של histopathology, זיהוי מולקולרי או תרבותית של פתוגנים טפילים, ואת ביטוי גנים. למשל, "גידול" או מוגבה הנגע (נפיחות) ייתכן neoplasia בפועל או ייתכן טפיל, דלקת, בצקת או היפרפלזיה (עלייה במספר תאים נורמליים), שנגרמה עקב החשיפה כימיים, מדבקים או חומרים מגרים אחרים. כפי שניתן לראות את התוצאות נציג, גידול סופי או אבחון neoplasia דורש פתולוגיה מיקרוסקופיים כדי לזהות את סוג הנגע והחומרה (קרי, שפיר או ממאיר). הערכה של מוצץ לבן חיצוני "גידולים" מאת התצפית הויזואלית הפרזתי השכיחות, במיוחד באתר התייחסות. רבים של נגעים מוגבה היו לא neoplasms אבל מעדיף hyperplastic נגעים. כרגע לא ידוע אם הפצעים hyperplastic הם אמצעים מראש. לעומת זאת, התבוננות מוגבה גושים בכבד המעיט באופן משמעותי השכיחות של neoplasms הכבד. לפיכך, אוסף של רקמות פתולוגיה מיקרוסקופיים היה הכרחי להתייחס בצורה הולמת את פוטנציאל מחיקה.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו מומן על ידי מערכות אקולוגיות הגיאולוגי של ארה של (סביבות מפרץ צ'ספיק, חלוצת) ואת תוכניות בריאות וסביבה (מזהמים בביולוגיה) מערב וירג'יניה מחלקת משאבים טבעיים. השימוש שמות מסחריים למטרות זיהוי בלבד, מעיד על ידי ממשלת ארה ב.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Folding tables Any
Folding chairs Any
Dissecting boards Any
Measuring board (mm) Any
Battery powered scale (g) for fish weight Any
Battery powered scale (mg) for organ weights Any
Dissecting forceps Any
Bone cutters Any
Scalpel and blades Any
Disposable gloves Any
Buckets Any
Leak-proof Nalgene bottles (250 mL) ThermoFischer Scientific 02-924-5C
Vacutainer tubes with sodium heparin ThermoFischer Scientific 02-689-6 For blood collection
Disposable  3 mL syringes with 23 G needle ThermoFischer Scientific 14-826-11
1 – 2 mL cryovials Any Used for plasma and RNAlater samples
Invitrogen RNAlater Stabilization solution ThermoFischer Scientific AM7021
Z-Fix Formaldehyde Zinc fixative Anatech LTD SKU-174
Tricaine-S (MS-222) Syndel USA fish anesthetic
Coin Envelopes Any for otoliths
Pencils and pens Any
70% alcohol Any
Data sheets Any

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Celander, M. C. Cocktail effects on biomarker responses in fish. Aquatic Toxicology. (105 Supplement), 72-77 (2011).
  2. Liney, K. E., et al. Health effects in fish of long-term exposure to effluents from wastewater treatment works. Environmental Health Perspectives. 114, 81-89 (2006).
  3. Silva, E., Rajapakse, N., Kortenkamp, A. Something from "nothing" - eight weak estrogenic chemicals combined at concentrations below NOECs produce significant mixture effects. Environmental Science & Technology. 36, 1751-1756 (2002).
  4. Noyes, P. D., et al. The toxicology of climate change: environmental contaminants ina warming world. Environment International. 35, 971-986 (2009).
  5. Witeska, M., Jezierska, B. The effect of environmental factors on metal toxicity to fish. Fresenius Environmental Bulletin. 12, 824-829 (2003).
  6. Wedekind, C., Gessner, M. O., Vazquez, F., Maerki, M., Steiner, D. Elevated resource availability sufficient to turn opportunistic into virulent fish pathogens. Ecology. 91, 1251-1256 (2010).
  7. Penttinen, R., Kinnula, H., Lipponen, A., Bamford, J. K. H., Sundberg, L. R. High nutrient concentration can induce virulence factor expression and cause higher virulence in an environmentally transmitted pathogen. Microbial Ecology. 72, 955-964 (2016).
  8. Bols, N. C., Brubacher, J. L., Ganassin, R. C., Lee, L. E. J. Ecotoxicology and innate immunity in fish. Developmental & Comparative Immunology. 25, 853-873 (2001).
  9. Dunier, M., Siwicki, A. K. Effect of pesticides and other organic pollutants in the aquatic environment on immunity of fish: a review. Fish and Shellfish Immunology. 3, 423-438 (1993).
  10. Milla, S., Depiereux, S., Kestemont, P. The effects of estrogenic and androgenic endocrine disruptors on the immune system of fish: a review. Ecotoxicology. 20, 305-319 (2011).
  11. Connon, R. E., Geist, J., Werner, I. Effect-based tools for monitoring and predicting the ecotoxicological effects of chemicals in the aquatic environment. Sensors. 12, 12741-12771 (2012).
  12. Eckman, D. R., et al. Biological effects-based tools for monitoring impacted surface waters in the Great Lakes: A multiagency program in support of the Great Lakes restoration initiative. Environmental Practice. 15, 409-426 (2013).
  13. Khan, M. Z., Law, F. C. P. Adverse effects of pesticides and related chemicals on enzyme and hormone systems of fish, amphibians and reptiles: A review. Proceedings of the Pakistan Academy of Sciences. 42, 315-323 (2005).
  14. Wernersson, A. S., et al. The European technical report on aquatic effect-based monitoring tools under the water framework directive. Environmental Sciences Europe. 27, (2015).
  15. Bolger, T., Connolly, P. L. The selection of suitable indices for the measurement and analysis of fish condition. Journal of Fish Biology. 34, 171-182 (1989).
  16. Karr, J. R. Biological integrity: A long-neglected aspect of water resource management. Ecological Applications. 1, 66-84 (1991).
  17. Sanders, R. E., Miltner, R. J., Yoder, C. O., Rankin, E. T. The use of external deformities, erosions, lesions, and tumors (DELT anomalies) in fish assemblages for characterizing aquatic resources: a case study of seven Ohio stream. Assessing the sustainability and biological integrity of water resources using fish communities. Simon, I. nT. P. , CRC Press. Florida. 225-246 (1999).
  18. Bervoets, L., et al. Bioaccumulation of micropollutants and biomarker responses in caged carp (Cyprinus carpio). Ecotoxicology and Environmental Safety. 72, 720-728 (2009).
  19. Schulte-Hermann, R. Adaptive liver growth induced by xenobiotic compounds: its nature and mechanism. Archives of Toxicology. Supplement. 2, 113-124 (1979).
  20. Slooff, W., van Kreijl, C. F., Baars, A. J. Relative liver weights and xenobiotic-metabolizing enzymes of fish from polluted surface waters in the Netherlands. Aquatic Toxicology. 4, 1-14 (1983).
  21. Brewer, S. K., Rabeni, C. F., Papoulias, D. M. Comparing histology and gonadosomatic index for determining spawning condition of small-bodied riverine fishes. Ecology of Freshwater Fish. 17, 54-58 (2003).
  22. Goede, R. W., Barton, B. A. Organismic indices and an autopsy-based assessment as health and condition of fish. American Fisheries Society Symposium. 8, 93-108 (1990).
  23. Adams, S. M., Brown, A. M., Goede, R. W. A quantitative health assessment index for rapid evaluation of fish condition in the field. Transactions of the American Fisheries Society. 122, 63-73 (1993).
  24. Kane, A. S., et al. Field sampling and necropsy examination of fish. Virginia journal of science. 50, 345-363 (1999).
  25. Yanong, R. P. E. Necropsy techniques for fish. Seminars in Avian and Exotic Pet Medicine. 12, 89-105 (2003).
  26. American Fisheries Society (AFS) Use of Fishes in Research Committee, American Institute of Fishery Research Biologists and the Society of Ichthyologists and Herpetologists. Guidelines for the Use of Fishes in Research. , American Fisheries Society. Bethesda, Maryland. (2004).
  27. Bonar, S. A., Hubert, W. A., Willis, D. W. Standard methods for sampling North American freshwater fishes. , American Fisheries Society. Bethesda, Maryland. (2009).
  28. Zale, A. V., Parrish, D. L., Sutton, T. M. Fisheries Techniques, third edition. , American Fisheries Society. Bethesda, Maryland. 1009 (2013).
  29. Neiffer, D. L., Stamper, M. A. Fish sedation, anesthesia, analgesia, and euthanasia: considerations, methods, and types of drugs. Institute for Laboratory Animal Research. , 343-360 (2009).
  30. Clark, T. D., et al. The efficacy of field techniques for obtaining and storing blood samples from fishes. Journal of Fish Biology. 795, 1322-1333 (2011).
  31. Adewoyin, A. S., Nwogoh, B. Peripheral blood film - a review. Annals of Ibadan Postgraduate Medicine. 12, 71-79 (2014).
  32. Smith, S. B., et al. Illustrated field guide for assessing external and internal anomalies in fish. Information and Technology Report USGS/BRD/ITR. 2002-007, 46 (2002).
  33. Kane, A. S. Descriptive guide to observing fish lesions. , Available at http://aquaticpath.phhp.ufl.edu/Lesionguide/Lesionguide.pdf (2005).
  34. Rafferty, S. D., Grazio, J. Field manual for assessing internal and external anomalies in brown bullhead (Ameiurus nebulosus). , Pennsylvania Sea Grant. Erie, PA. Available at: https://seagrant.psu.edu/sites/default/files/Bullhead%20field%20manual.pdf (2018).
  35. European Association of Fish Pathologists. Necropsy manual. , Available at www.necropsymanual.net (2018).
  36. Buckmeier, D. L., Irwin, E. R., Betsill, R. K., Prentice, J. A. Validity of otoliths and pectoral spines for estimating ages of channel catfish. North American Journal of Fisheries Management. 22, 934-942 (2002).
  37. Maceina, M. J., Sammons, S. M. An evaluation of different structures to age freshwater fish from a northeastern US river. Fisheries Management and Ecology. 13, 237-242 (2006).
  38. Secor, D. H., Dean, J. M., Laban, E. H. Otolith removal and preparation for microstructural examination. Otolith Microstructure Examination and Analysis. Stevenson, D. K., Campana, S. E. 117, Canadian Special Publication of Fisheries and Aquatic Sciences. 19-57 (1992).
  39. Gauthier, D. T., Cartwrwight, D. D., Densmore, C. L., Blazer, V. S., Ottinger, C. A. Measurement of in vitro leucocyte mitogenesis in fish: ELISA based detection of the thymidine analogue 5'-bromo-2'-deoxyuridine. Fish and Shellfish Immunology. 14, 279-288 (2003).
  40. Zelikoff, J. T., et al. Biomarkers of immunotoxicity in fish:from the lab to the ocean. Toxicology Letters. , 325-331 (2000).
  41. Hahn, C. M., Iwanowicz, L. R., Corman, R. S., Mazik, P. M., Blazer, V. S. Transcriptome discovery in non-model wild fish species for the development of quantitiative transcript abundance assays. Comparative Biochemistry and Physiology - Part D: Genomics and Proteomics. 20, 27-40 (2016).
  42. Harms, C. A., et al. Quantitative polymerase chain reaction for transforming growth factor-B applied to a field study of fish health in Chesapeake Bay tributaries. Environmental Health Perspectives. 108, 1-6 (2000).
  43. Braden, J. B., et al. Economic benefits of remediating the Sheboygan River, Wisconsin Area of Concern. Journal of Great Lakes Research. 34, 649-660 (2008).
  44. Blazer, V. S., et al. Tumours in white suckers from Lake Michigan tributaries: pathology and prevalence. Journal of Fish Diseases. 40, 377-393 (2017).
  45. Vethaak, A. D., Jol, J. G., Pieters, J. P. F. Long-term trends in the prevalence of cancer and other major diseases among flatfish in the southeastern North Sea as indicators of changing ecosystem health. Environmental Science & Technology. 43, 2151-2158 (2009).
  46. Teubner, D., Paulus, M., Veith, M., Klein, R. Biometric parameters of the bream (Abramis brama) as indicators for long-term changes in fish health and environmental quality - data from the German ESB. Environmental Science and Pollution Research. 22, 1620-1627 (2015).
  47. Schleiger, S. L. Fish health assessment index study of four reservoirs in north-central Georgia. North American Journal of Fisheries Management. 24, 1173-1180 (2004).
  48. Sutton, R. J., Caldwell, C. A., Blazer, V. S. Health assessment of a tailwater trout fishery associated with a reduced winter flow. North American Journal of Fisheries Management. 20, 267-275 (2000).
  49. Blazer, V. S. The necropsy-based fish health assessment. Biomonitoring of environmental status and trends (BEST) program: selected methods for monitoring chemical contaminants and their effects in aquatic ecosystems. Schmitt, C. J., Dethloff, G. M. , U.S. Geological Survey Information and Technology Report USGS/BRD-2000-005 18-21 (2000).
  50. Schmitt, C. J. Biomonitoring of environmental status and trends (BEST) program: Environmental contaminants and their effects on fish in the Mississippi River basin. Biological Science Report USGS/BRD/BSR. 2002-0004, 241 (2002).
  51. Hinck, J. E., et al. Chemical contaminants, health indicators, and reproductive biomarker responses in fish from rivers in the Southeastern United States. Science of the Total Environment. 390, 538-557 (2008).
  52. Lang, T., et al. Diseases of dab (Limanda limanda): Analysis and assessment of data on externally visible diseases, macroscopic liver neoplasms and liver histopathology in the North Sea, Baltic Sea and off Iceland. Marine Environmental Research. 124, 61-69 (2017).

Tags

מדעי הסביבה גיליון 139 דגים פראי הערכת הבריאות necropsy אוסף רקמה איסוף דם histopathology
הערכת הבריאות מבוסס necropsy דגים פראי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Blazer, V. S., Walsh, H. L., Braham, … More

Blazer, V. S., Walsh, H. L., Braham, R. P., Smith, C. Necropsy-based Wild Fish Health Assessment. J. Vis. Exp. (139), e57946, doi:10.3791/57946 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter