Summary
Hälsan hos vilda fiskar kan användas som en indikator på akvatiska ekosystem hälsa. Obduktion-baserade fisk hälsa bedömningar tillhandahålla dokumentation om synliga lesioner eller avvikelser, data används för att beräkna skick index samt möjlighet att samla vävnader för mikroskopiska utvärdering, genuttryck och andra mer djupgående analyser.
Abstract
Antropogena påverkan från ökade näringsämnen och kemiska föroreningar, till habitat förändringar och klimatförändringar, kan ha betydande effekter på fiskbestånden. Biverkningar som övervakning, kan utnyttja biomarkörer från de organismer till molekylär nivå, användas för att bedöma de kumulativa effekterna på fiskar och andra organismer. Fiskens hälsa har använts över hela världen som en indikator på akvatiska ekosystem hälsa. Hälsoundersökning som obduktion-baserade fisk ger data om synliga missbildningar och skador, parasiter, skick och organosomatic index. Dessa kan jämföras efter plats, årstid och kön, samt temporally, till dokumentet förändringar över tid. Risknivån vissa kan tilldelas olika observationer att beräkna en fisk hälsa index för mer kvantitativ bedömning. En nackdel med obduktion-baserat bedömningen är att den är baserad på visuella observationer och skick faktorer, som inte är så känsligt som vävnad och subcellulär biomarkörer för subletala effekter. Dessutom är det sällan möjligt att identifiera orsaker eller riskfaktorer associerade med observerade avvikelser. Så, till exempel kan en upphöjd lesion eller ”tumör” på fenor, läppar eller förkroppsliga ytbehandlar vara en tumör. Det kan dock också vara ett svar på en parasit, kronisk inflammation eller hyperplasi av normala celler som svar på en irriterande. Omvänt, tumörer, vissa parasiter, andra smittämnen och många vävnadsförändringar syns inte och så kan underskattas. Dock under bedömningen på obduktion, blod (plasma), vävnader för histopatologi (mikroskopiska patologi), kan genomik och andra molekylära analyser och öronstenarna för åldrande samlas. Dessa nedströms analyser, tillsammans med geospatiala analyser, habitat bedömningar, vatten kvalitet och föroreningars analyser kan alla vara viktigt i omfattande ekosystem utvärderingar.
Introduction
Mänskliga aktiviteter har många negativa effekter på akvatiska miljöer. Fisk lever olika vattenförekomster som den mänskliga befolkningen återskapar i och ofta använder som en källsjö och därmed är viktiga indikatorer av vattenmiljön hälsa. Vild fisk som lever och förökar sig i en särskild livsmiljö utsätts hela livet på olika stressfaktorer inklusive patogener, parasiter, dålig vattenkvalitet och kemiska föroreningar. Tusentals kemikalier ange våra vattenvägar genom industriell och mänskliga avloppsvatten, förorts/urbana dagvatten och jordbruks avrinning. Dessa komplexa blandningar av kemikalier kan ha additiv, synergistiska eller antagonistiska effekter på exponerade organismer1,2,3. Dessutom andra miljöfaktorer såsom förhöjda näringsämnen, förhöjd temperatur, låg upplöst syrgas eller fluktuerande pH kan förvärra effekterna av kemiska föroreningar4,5. Miljöfaktorer kan också påverka infektionssjukdom utfall direkt genom att öka antalet smittämnen6, ökande virulens opportunistiska patogener7 eller undertrycka immunsvaret och sjukdom motståndet av värd8,9,10. Av dessa skäl, ökar det intresset för biologiska eller negativa effekter övervakning11,12,13,14, utnyttja fisk och andra vattenlevande organismer att identifiera populationer och ekosystem i riskzonen.
Biverkningar som övervakning använder tredjeparts biomarkörer på olika nivåer i organisationen, från de organismer till subcellulär eller molekylär, identifiera subletala effekter som kan påverka populationer och vara vägledande för exponering för olika stressorer. Indikatorer på organismnivå omfattar synliga avvikelser och villkor. Villkor index baserat på längd och vikt beräknas för att utvärdera välbefinnande eller lämplighet av fiskpopulationer. Det vanligaste är Fultons skick faktorer (K) = (vikt/längd3) 15. En annan indikator är förekomsten av synliga avvikelser. Olika metoder har använts i enskilda studier och övervakning program, dokument, bedöma och utvärdera synliga avvikelser. Bedömning enbart utifrån externa avvikelser, dvs andelen individer med sjukdom, fin skador, tumörer och skelett anomalier, är en av mätvärden för index för biotiska integritet (IBI) som utvärderar gemenskapen hälsa16. En liknande bedömning som kallas DELTs (missbildningar, erosioner, lesioner, tumörer) har också använts för att utvärdera hälsan för fisk samhällen17. Dock bedöma dessa metoder endast externa synavvikelser och inte interna lesioner eller tidiga subletala indikatorer.
Obduktion-baserade bedömningar omfattar externa och interna observationer och möjliggör mätning av ytterligare villkor index. Hepatosomatic index (leverns vikt/total kroppsvikt) har också använts som en indikator på fitness eller energireserver15 som indikerar en högre indexvärde friskare fisk. Ett antal studier har dock visat att hypertrofi eller ökar leverns storlek uppstår på grund av exponering för olika föroreningar metaboliseras av levern18,19,20. I detta fall skulle ett högre index vara vägledande för exponering för vissa kemiska klasser. Det gonadosomatic indexet (gonad vikt/total kroppsvikt) är ett annat villkor riktad mot reproduktiv hälsa21. Iakttagelser vid obduktion-baserat bedömningen kan användas för att jämföra förekomsten av enskilda lesionen typer eller procentandel av normala individer. De kan dock också användas i en mer kvantitativ hälsa bedömning22,23.
Standardiserade obduktion-baserat bedömningen beskrivs här kan användas för att utöka grovt synliga bedömning på flera sätt beroende på frågan/frågorna besvaras, expertis och andra tillgängliga resurser. Vår rutin är att samla in biometriska uppgifter (längd, vikt, levervikt, gonad vikt), blod för plasma/serum analyser, dokument externa och interna synliga avvikelser, bevara bitar av organ för mikroskopiska analyser och samla öronstenarna för ålder analyser. Bedömningen på obduktion plus Åldersanalys och histopatologi av olika organ, möjliggör beräkning och jämförelse av olika skick index, förekomst av synliga avvikelser, liksom mikroskopiska vävnadsförändringar, efter kön, ålder, plats och provtagningsperioden. Ytterligare vävnad samlingar kan göras för många andra analyser bl elektronmikroskopi, bakteriologi, virologi, parasitologi och kemiska koncentrationer. Dessa metoder kan också vara en del av mer djupgående analyser används för att diagnostisera orsaken till fisk dödar24 eller mortaliteten fångenskap fiskar25. Metoder för insamling av vävnad för två ytterligare analyser, genuttryck och funktionella immun analyser är illustrerade.
Protocol
Metoderna som beskrivs här har godkänts av Leetown Science centrets institutionella djur vård och användning kommittén.
1. fisk samling
- Samla in levande fisk med ett minimum av stress. Använda båt eller ryggsäck elfiske, krok och linje eller nät.
- Håll fisk i levande brunnar eller kolsyrat behållare tills provtagning.
Obs: American fiske Society har publicerat ett antal guider för fisk insamling, hantering och anestesi/dödshjälp26,27,28. Använd handskar vid hantering av fisk.
2. fisk obduktion
-
Avliva en fisk.
- Placera fisken i bedövningsmedlet tills opercular rörelse upphör och fisken förlorar jämvikt. Efter en annan 2 – 10 min kommer bli euthanized fisken; Detta varierar dock också arter.
Obs: Fisk kan bli euthanized med ett antal anestetika (se Tabell av material för vanligast). Metoden för dödshjälp kommer att bero på laboratoriet mätningar som kommer att genomföras på vävnader insamlade29.
- Placera fisken i bedövningsmedlet tills opercular rörelse upphör och fisken förlorar jämvikt. Efter en annan 2 – 10 min kommer bli euthanized fisken; Detta varierar dock också arter.
-
Mäta biometriska kännetecken.
- Väga fisken till de närmaste grammet.
- Mäta fisk längden på närmaste millimetern.
- Mät den totala längden från spetsen av nosen med munnen stängd till slutet av svansen när klämmas ihop.
- Mäta gaffel längden från gaffeln i svansen till spetsen på nosen och standard längd från spetsen av nosen till slutet av kroppen (början av svansen).
- Beräkna den skick faktor med hjälp av följande formel:
Villkor faktor = (totala kroppsvikt - gonad vikt) / totala längd3.
Obs: Gonad vikt subtraheras från den totala kroppsvikten eftersom gonader kan bidra avsevärt till den totala kroppsvikten, särskilt på prespawn kvinnliga fisk.
-
Skaffa ett blodprov.
Obs: Blod tas oftast från den kaudala ven men kan också dras från dorsala aorta eller av hjärt punktera30.- Extrahera ett perifert blodprov från den kaudala ven med en 22 eller 23 G nål på en 1 till 5 mL spruta, beroende på storleken på fisken. Stick in nålen anterior området kaudalt under den laterala linjen (figur 1A och 1B). Vinkla det uppåt tills drabbar ryggraden och sedan dra tillbaka något. Venen är ventrala till överliggande ryggraden.
Obs: Om blodutstryk kommer att göras eller serum krävs, används ingen antikoagulans. I de flesta fall plasma kommer att samlas in och därför en antikoagulant såsom natriumheparin, EDTA eller litium används att belägga kanylen och sprutan och är också i bloduppsamlingsrör (t.ex., vacutainer). - Ta bort nålen och placera i en avfallsbehållare före ibruktagande samling röret blodet.
Obs: Blod kan hållas på is men beroende på efterföljande analyser bör vara centrifugeras snarast möjligt30. - Om nukleära abnormiteter eller differentiell blodvärden kommer att utvärderas, placera omedelbart en droppe blod på dubbla rent glas objektglas. Tillbaka en andra bild i 45° vinkel i rullgardinsmenyn, som dras sedan över ytan av kapillärkraften. Låt lufttorka31.
- Centrifugera blodet vid 1 500 – 2 500 x g i 15 min till sediment cellerna. Ta bort plasma/serum med en steril överföring Pipettera, alikvotens till kryogen injektionsflaskor, och lagra vid-80 ° C.
- Extrahera ett perifert blodprov från den kaudala ven med en 22 eller 23 G nål på en 1 till 5 mL spruta, beroende på storleken på fisken. Stick in nålen anterior området kaudalt under den laterala linjen (figur 1A och 1B). Vinkla det uppåt tills drabbar ryggraden och sedan dra tillbaka något. Venen är ventrala till överliggande ryggraden.
Figur 1 : Att få ett blodprov från en fisk. (A) A nyligen euthanized fisk läggs på sin sida och den laterala linjen ligger. (B) en nål är infogade ventrala till laterala linjen (pil), vinklad uppåt tills nålen vidrör ryggraden. Den dras sedan något och sug initierade att dra tillbaka blod. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
-
Genomföra en obduktion-baserade hälsoundersökning på varje fisk.
Obs: Ett antal publikationer illustrera och beskriva lesioner och avvikelser är tillgängliga32,33,34,35.- Dokumentera externa avvikelser inklusive lesioner på förkroppsliga ytbehandlar och fenor (figur 2), ögon och gälar (figur 3), externa parasiter såsom iglar (figur 2D), larver eller trematode metacercarial cystor (figur 2D, 3B) och gill parasiter (figur 3D). Dokumentera typ, läge och storlek av observerade avvikelser på datablad, samt som fotografiskt, om möjligt.
- Öppna bukhålan (figur 4A) med en sax av skär från anala området till operculum och sedan ta bort luckan av muskel för att exponera de inre organen.
Obs: Om främre njuren kommer att samlas in för immun funktion (se steg 5 nedan) eller prover som tagits för bakteriologi och virologi, yttre kroppsytan bör desinficeras med 70% alkohol och dessa prover bör erhållas innan en obduktion utförs. Om vävnader används endast för visuella observationer, plasma analyser och histopatologi steril teknik är inte nödvändigt. - Dokument interna avvikelser (figur 4) inklusive allmänna eller fokala missfärgningar av olika organ (figur 4B-4D), förekomst av höjt områden (figur 4E), cystor, parasiter, och storlek () avvikelser utvidgade, förtvinat).
Figur 2 : Exempel på synliga lesioner observerades på förkroppsliga ytbehandlar och fenor fisk. (A) A små, något eroderad lesion (pil) på laterala förkroppsliga ytbehandlar. (B), en stor röd område (pil) med stjärtfenan förkroppsliga ytbehandlar. (C) Upphöjd, svart lesioner (pilar) på förkroppsliga ytbehandlar och fenor. (D) iglar (vit pil) och små svarta fläckar (svarta pilar) på fenan. Skalstapeln = 3 mm. (E) A upp, multilobed, blek lesion (pil) på förkroppsliga ytbehandlar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Exempel på synliga lesioner i gälarna och ögon av fisk. (A) A blek området (pilen) inom linsen av ett öga. Skalstapeln = 5 mm. (B) vita cystor (vita pilar) och små svarta fläckar (svarta pilar) orsakade av trematode parasiter på den operculum som täcker gälarna (a). Skalstapeln = 1 cm. (C) ett blekt, eroderade område (pil) på gill (a). Skalstapeln = 5 mm. (D) en gill som har tagits visar parasiter (pilar) bifogas gill glödtrådarna. Skalstapeln = 2 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4: Exempel på en obduktion och interna avvikelser fisk. (A) under en obduktion fisken skärs öppna (längs den vita pilen) och en flik av muskel (svart pil) bort till exponera gonad (a) och mjälten, som hålls av pincett och sax. (B) fläckiga levern (en), testiklar (b), tarmen omgiven av fett fett (c) och magen (d). Skalstapeln = 5 mm. (C) lever (a) med ett mörkt rött område (pil), ovarium (b) och tarmar (c). Skalstapeln = 5 mm. (D) lever med grönaktig missfärgade områden (pilar). Skalstapeln = 1 cm. (E) exempel på en normal (a) och onormala b testiklarna med upp knutor. Skalstapeln = 1 cm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
-
Skaffa hepatosomatic index (HSI).
- Ta bort levern genom att bryta den hepatiska artären och bindväv av den främre änden. Lyft försiktigt ut medan trimning sammanväxningar och andra anslutningar till tarmen och fett fett. Var noga med att inte punktera gallblåsan. Väga levern.
Obs: Vissa fisk, såsom mörtfiskar, inte har en diskret levern men snarare nedsatt vävnad lindade runt tarmar och andra organ. För dessa arter, kan det inte vara möjligt att få levern vikter. - Beräkna hepatosomatic index (HSI) med hjälp av formeln:
HSI = lever vikt/total kroppsvikt
- Ta bort levern genom att bryta den hepatiska artären och bindväv av den främre änden. Lyft försiktigt ut medan trimning sammanväxningar och andra anslutningar till tarmen och fett fett. Var noga med att inte punktera gallblåsan. Väga levern.
-
Beräkna gonadosomatic index.
- Ta bort könskörtlarna och tynga.
- Beräkna gonadosomatic index (GSI) med hjälp av formeln:
GSI = gonad vikt/total kroppsvikt
3. bevara vävnader för mikroskopiska patologi
Obs: Ett antal fixativ inklusive 10% neutral buffrad formalin och Z-fix, ett formalin-baserade fixativ med zink, kan användas för bevarandet av vävnad i fältet. Den senare är att föredra om metoder såsom i situ hybridisering eller fluorescerande antikropp färgning kan användas.
- Försiktigt skär men dra inte ut vävnadsprover. Hålla enskilda vävnad bitar < 2 cm i storlek och < 5 mm tjock för korrekt fixering. Som en tumregel, Använd ca 10 x mer fixativ volym än vävnaden för korrekt bevarande. Placera alla vävnadsprover från en fisk i samma läckagefria behållare av lämplig storlek, beroende på storleken på fisken som provtas.
- Placera bitar av externa abnormiteter i behållaren fixativ. Även en intilliggande bit av normal vävnad.
Obs: Felaktig hantering såsom komprimering eller andra mekaniska skador, lång exponering för luft eller solljus, och frysning kan orsaka artefakter. - Klipp minst fem 3-4 mm tjocka bitar av levern från olika regioner och placera i behållaren fixativ. Inkludera normala och onormala områden, om iakttas.
- Beroende på storlek, placera en hela gonad eller flera bitar längs en gonad i behållaren fixativ.
- Placera antingen hela organ, om små eller bitar av alla andra organ (mjälte, främre och bakre njure, gälar, hjärtat, tarmen och magen) i behållaren fixativ. Om onormal vävnad observeras, bevara en intilliggande bit av normal vävnad samt.
4. ta bort öronstenarna för ålder analyser
Obs: Ålder kan vara en viktig variabel i fisk sjukdom/fisk hälsa studier. Medan ett antal strukturer, inklusive skalor och ryggar, har använts för åldersbestämning, har de flesta studier som jämförde strukturer hittat de öronstenarna att ge de bästa resultat36,37. Lever fiskar har tre par öronstenarna - lapillus, sagitta och asteriscus. Generellt, de sagittala eller lapillus öronstenarna samlas för åldrande även om det varierar mellan arter. Borttagning och åldrande tekniker har varit tidigare beskrivna38.
- Skär genom gill näset, och böja huvudet tillbaka. Strip away bindväv och muskulös vävnad runt de sämre delarna av neurocranium att lokalisera prootic bullae, en benknöl.
- Poäng eller skär med ben fräsar och spricka för att exponera öronstenarna. De kan ses med blotta ögat.
- Placera öronstenarna i en injektionsflaska märkt eller en mynt kuvert och förvara i rumstemperatur tills analyseras för ålder genom att räkna de ringar eller steg38. Om att placera i en flaska, öppna locket en gång återvände till laboratoriet och låt noggrant torka före lagring.
Figur 5 : Avlägsnande av öronstenarna. (A) näset skärs och den bindväv och muskler drog bort att exponera basen av ryggraden och neurospinal område. (B), benet är knäckt för att exponera öronstenarna. (C) Lapillar öronstenarna tas bort. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
5. Skaffa vävnad för immunförsvaret analyser
Obs: Främre njuren är stora hematopoetiska orgeln, källan av lymfocyter och makrofager för funktionella analyser, och måste tas bort aseptiskt om celler kommer vara odlade för funktionella analyser, såsom verkningssätt, fagocytos och dödande förmåga makrofager39,40.
- Spraya ytan av fisken med 70% etanol. Använd steril sax, skalpell och pincett öppna bukhålan och ta bort den främre njure vävnad, som är en mörk röda organ ligger anterior simblåsan.
- Placera främre njuren provet i mediaexempelvis Leibovitzs l (-15) att hålla cellerna vid liv. Homogenisera njur prover med en steril handhållen vävnad grinder (t.ex. Tenbroeck vävnad kvarnen) till enda cellsuspensioner. Håll på våt is tills återvände till laboratoriet.
6. bevara vävnad för nukleinsyra analyser
Obs: Om nedströms molekylär analys utföras, till exempel genuttryck som använder avskrift överflöd41 eller kvantitativ PCR-42 (polymeraskedjereaktion), placera bitar av vävnad som skall bedömas i ett lämpligt konserveringsmedel ( e.g., RNAlater stabilisering lösning) så snart som möjligt.
- För RNA konservering, placera två till tre små (2 – 3 mm) bitar i lämpliga konserveringsmedlet i förhållandet 10:1 av konserveringsmedel volymen på vävnaden.
Obs: Prover bör skyddas från solljus eller hetta och transporteras på våt is. - För DNA konservering, placera två till tre små bitar av vävnad i 95% etanol (10:1 etanol vävnad volymprocent). Håll sedan proven på våt is och sedan förvaras vid-20 ° C.
Representative Results
Stora sjöarna områden av oro (AOC) är geografiska områden som designerades på grund av nedskrivningar av olika nyttoanvändningar. En av de nyttjanderätt nedskrivningar (BUIs) på många AOC är fisk tumörer eller andra missbildningar. Miljontals dollar har spenderats för sanering och återställande av dessa områden för att avnotera den olika BUIs och slutligen AOC43. Kriterierna för avnotering fisk tumören BUI skiljer sig från stat till stat (se epa.ohio.gov/portals/35/lakeerie/ohio_AOC_delisting_guidance.pdf och dnr.wi.gov/topic/GreatLakes/documents/SheboyganRiverFinalReport2008.pdf); som påpekas i de avförande dokument, finns det dock ett krav för att fastställa förekomsten av levertumörer och i vissa fall hudtumörer. I många fall är prevalensen jämfört med en icke-AOC hänvisning webbplats.
Fisk tumören BUI utvärderades vid tre AOCs (St. Louis River, Milwaukee River och Sheboygan River) och en icke-AOC hänvisning webbplats (Kewaunee flod) på sjöar Superior och Michigan, utnyttja en obduktion-baserad bedömning av vita sucker (Catostomus commersonii ), följt av mikroskopiska patologi av hud och levervävnad. Fisk har samlats in från Milwaukee, Sheboygan och Kewaunee floderna i 2012 och 201344 och från floden St. Louis i 2015 (opublicerade data). Två hundra vita suckers bedömdes från Milwaukee, Kewaunee och St. Louis och 193 från Sheboygan.
Definitionsmässigt kan en tumör vara någon svullnad eller upphöjt område, även om det anses allmänt att en svullnad som orsakas av en onormal tillväxt av vävnad med onormala celler är antingen en godartad eller elakartad tumör. Vita sucker samlas in från alla webbplatser uppvisade en mängd externa upphöjda lesioner inklusive små, diskreta vita fläckar, större vita områden, något förhöjd slemmig lesioner och multilobed upphöjda områden på förkroppsliga ytbehandlar och läppar (figur 6). Fisk var vägs och mäts för att få en skick-faktor, yttre och inre missbildningar dokumenterades och hud och lever vävnad samlades för histopatologi.
Figur 6 : Upphöjda hudförändringar observerats på vita sucker från de stora sjöarna. (A) en diskret vit fläck på kroppsytan. Skalstapeln = 5 mm. (B), en något slemmig (pilar) och multilobed lesioner (a) på bakre förkroppsliga ytbehandlar. Skalstapeln = 1 cm. (C) A stora, multilobed lesion på förkroppsliga ytbehandlar. Skalstapeln = 1 cm. (D) många flera flikiga lesioner på läpparna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Den procent av fisk med externa tumörer eller upphöjda missfärgade områden varierade från 15,5% på St. Louis AOC till 58,0% på Milwaukee AOC. De diskreta vita fläckarna var i allmänhet, den minst vanliga visuella lesionen medan multilobed läpp och body surface lesioner var vanligaste. Antalet fiskar med observerbara levernoduli var lågt, alltifrån Kewaunee och St. Louis 1,5% till 2,5% på Milwaukee (tabell 1).
| Floder och år som ingick i urvalet | ||||
| Synliga lesioner | Kewaunee 2013 | St. Louis 2015 | Sheboygan 2012 | Milwaukee 2013 |
| Diskreta vita fläckar | 16 | 3 | 3.1 | 5 |
| Slemmig | 20 | 9,5 | 9,8 | 30,5 |
| Multilobed | 22,5 | 3 | 29,5 | 40 |
| Totalt tog upp hud avvikelseren | 46 | 15,5 | 38,3 | 58 |
| Synliga levernoduli | 1.5 | 1.5 | 1.6 | 2.5 |
| en Totalt antal fisk med upphöjda lesioner. Vissa fiskar hade flera typer av avvikelser. | ||||
Tabell 1: Obduktion-baserade observationer av vita Sucker som samlats vid stora sjöarna områden av oro och en hänvisning webbplats (Kewaunee flod), presenteras som en procentsats.
Visuell undersökning kan användas för att dokumentera procenten av fisk med olika avvikelser. Dock att definitivt diagnostisera förekomst och typ av neoplasi, vävnader måste undersökas mikroskopiskt (histopatologi). Vid mikroskopisk undersökning konstaterades det att inte alla av upphöjda lesioner var neoplastiska. Många av de diskreta vita fläckarna och slemmig lesioner, särskilt i Kewaunee, var hyperplastiska lesioner i stället för neoplasi (tabell 2). Dessutom på Kewaunee och St. Louis var alla hudtumörer observerades benigna papillom. Sheboygan och Milwaukee observerades både papillom och skivepitelcancer, maligna hudtumörer, (tabell 2).
| Floder som ingick i urvalet | ||||
| Tumör typ | Kewaunee 2013 | St. Louis 2015 | Sheboygan 2012 | Milwaukee 2013 |
| Papillom | 21 | 5.2 | 30,5 | 37,5 |
| Skivepitelcancer | 0 | 0 | 2.1 | 10.5 |
| Totala hud tumörer | 21 | 5.2 | 32,6 | 48 |
| Gallgången neoplasmerett | 2.5 | 4 | 6.2 | 9,5 |
| Nedsatt cell tumörerb | 1 | 0 | 2.1 | 8 |
| Totalt lever neoplasmer | 3.5 | 4 | 8,3 | 15,0c |
| en Inkluderar cholangioma och cholangiocarcinoma | ||||
| b Inkluderar nedsatt cell adenom och nedsatt cellscarcinom | ||||
| c Vissa fiskar hade både gallgången och nedsatt neoplasmer | ||||
Tabell 2: Verifieras mikroskopiskt neoplastiska lesioner av vita Sucker som samlats vid stora sjöarna områden av oro och en hänvisning webbplats (Kewaunee flod), presenteras som en procentsats.
Den histopatologiska analysen identifierade också levertumörer som inte identifierades av visuell observation. Medan endast 1,5 procent av den fisk som samlas in från Kewaunee och St. Louis hade synliga levernoduli (tabell 1), hade 3.5 och 4.0%, respektive, mikroskopiskt identifierat neoplasmer (tabell 2). En större skillnad sågs på Sheboygan (1,6% synlig jämfört med 8,3% mikroskopisk) och Milwaukee (2,5% synlig kontra 15,0% mikroskopisk). Mikroskopisk undersökning ger också en differentiering av tumörer av gallgången kontra nedsatt cell ursprung (tabell 2) och benigna respektive maligna tumörer.
Discussion
Obduktion-baserad bedömning av fiskens hälsa kan utnyttjas på alla fiskarter som Utredaren har en förståelse för både externa och interna strukturer normala utseende. Med hjälp av en standardiserad metod möjliggör jämförelser mellan platser och arter samt säsongsbetonade och tidsmässiga förändringar i en befolkning. Resultaten kan användas för att identifiera effekter i samband med punkt och nonpoint källor till föroreningar och informera förvaltningsåtgärderna. Det kan också användas för att spåra förbättringar när ledningens åtgärder initieras. Metodiken kan ändras för att öka dokumentationen av externa synavvikelser i en mängd olika sätt. Bedömningar, enbart utifrån visuella observationer, kan vara icke-dödande, relativt billig och data kan skapas snabbt för ett stort antal individer. Följaktligen, de kan vara användbara för förberedande eller inledande bedömningar, att övervaka förändring över tiden eller i kombination med andra indikatorer. Om längd och vikt för fisk mäts under visuella observationer, kan också den skick-faktorn beräknas. Även om bedömningar baserade endast på visuell observation ger inte information om orsak eller associerade riskfaktorer, långsiktiga trender på vissa hud avvikelser45 och biometriska parametrar46 har uppgett förbättringar på vissa områden i samband med vatten kvalitetsförbättringar.
Obduktion-baserat bedömningen ger mer information som inre organ undersöks också och andra villkor faktorer såsom hepatosomatic och gonadosomatic index kan beräknas. Goede och Barton22 utvecklat en metod för obduktion av fältet som inkluderade blod parametrar, biometriska faktorer, procentandelen av avvikelser och indexvärden för specifika avvikelser. En förfining av metoden ingår en allvarlighetsgraden för vissa variabler som tillåts för beräkning av en hälsa bedömningsindex som kunde jämfört statistiskt23. Detta hälsa bedömningsindex har använts i regionala webbplats jämförelser23,47,48 och i kombination med andra biologiska indikatorer inklusive plasma och histopatologiska analyser i den amerikanska geologiska Undersökningens biologisk övervakning av miljötillståndet och trender Program utvärdera potentiella effekter av föroreningar exponering i stora floder rikstäckande49,50,51. En fisk sjukdom Index baserat på externt synliga sjukdomar och parasiter, synliga levern tumörer och andra upptäckt histopatologiskt leverlesioner har utvecklats och används i stor utsträckning i Nordsjön, Östersjön, och utanför Island. Detta index befanns vara ett viktigt verktyg som ett ekosystem hälsa indikator52.
Det finns några kritiska faktorer i bedömningen den obduktion-baserade på fisk. Bedömningar måste först utföras på fisken omedelbart efter döden. Förändringar i organ färg och konsistens kan uppstå ganska snabbt efter döden. Vissa parasiter kan dessutom lämna värden snart efter döden. Andra, det är viktigt att veta vad som är normalt för arten av intresse. Exempelvis vissa fiskar har normalt feta och följaktligen blek lever, medan för de flesta arter en blek lever skulle vara onormal. Det är också viktigt att erkänna säsongsmässiga förändringar som förekommer naturligt. Några fiskar har färgändringar eller utveckla avel tuberkler under lekperioden.
Begränsningar i bedömningen på obduktion som en metod för fisk hälsoundersökning inkluderar oförmåga att 1) konsekvent identifiera ”orsaken” till specifika organskador och (2) identifiera effekter som inte kanske syns för blotta ögat. Dessa nackdelar kan övervinnas med tillägg av histopatologi, molekylär eller kulturella identifiering av patogener och parasiter, och genuttryck. Exempelvis en ”tumör” eller upphöjda lesionen (svullnad) kan vara riktiga neoplasi eller det kan vara en parasit, inflammation, ödem eller hyperplasi (ökning antal normala celler), orsakad av kemisk exponering, smittämnen eller andra irriterande ämnen. I de representativa resultat visas slutgiltiga tumör eller neoplasi diagnos kräver mikroskopiska patologi att identifiera lesion typ och svårighetsgrad (dvs. godartade eller elakartade). Bedömning av vita sucker externa ”tumörer” genom visuell observation överskattade prevalensen, särskilt på webbplatsen referens. Många av de upphöjda lesionerna var inte neoplasmer utan snarare hyperplastiska lesioner. Det är för närvarande okänt om dessa hyperplastiska lesioner är pre neoplastiska. Omvänt, observation av upphöjda knölar i levern betydligt underskattat prevalensen av levern neoplasmer. Samling av vävnad för mikroskopiska patologi var därför nödvändigt att kunna hantera risken för avnotering.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av U.S. Geological Surveys ekosystem (Chesapeake Bay miljöer och fiske) och miljöhälsa (föroreningar biologi) program och West Virginia institutionen av naturresurserna. Användning av varunamn är endast i identifieringssyfte och innebär inte godkännande av den amerikanska regeringen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Folding tables | Any | ||
| Folding chairs | Any | ||
| Dissecting boards | Any | ||
| Measuring board (mm) | Any | ||
| Battery powered scale (g) for fish weight | Any | ||
| Battery powered scale (mg) for organ weights | Any | ||
| Dissecting forceps | Any | ||
| Bone cutters | Any | ||
| Scalpel and blades | Any | ||
| Disposable gloves | Any | ||
| Buckets | Any | ||
| Leak-proof Nalgene bottles (250 mL) | ThermoFischer Scientific | 02-924-5C | |
| Vacutainer tubes with sodium heparin | ThermoFischer Scientific | 02-689-6 | For blood collection |
| Disposable 3 mL syringes with 23 G needle | ThermoFischer Scientific | 14-826-11 | |
| 1 – 2 mL cryovials | Any | Used for plasma and RNAlater samples | |
| Invitrogen RNAlater Stabilization solution | ThermoFischer Scientific | AM7021 | |
| Z-Fix Formaldehyde Zinc fixative | Anatech LTD | SKU-174 | |
| Tricaine-S (MS-222) | Syndel USA | fish anesthetic | |
| Coin Envelopes | Any | for otoliths | |
| Pencils and pens | Any | ||
| 70% alcohol | Any | ||
| Data sheets | Any |
References
- Celander, M. C. Cocktail effects on biomarker responses in fish. Aquatic Toxicology. (105 Supplement), 72-77 (2011).
- Liney, K. E., et al. Health effects in fish of long-term exposure to effluents from wastewater treatment works. Environmental Health Perspectives. 114, 81-89 (2006).
- Silva, E., Rajapakse, N., Kortenkamp, A. Something from "nothing" - eight weak estrogenic chemicals combined at concentrations below NOECs produce significant mixture effects. Environmental Science & Technology. 36, 1751-1756 (2002).
- Noyes, P. D., et al. The toxicology of climate change: environmental contaminants ina warming world. Environment International. 35, 971-986 (2009).
- Witeska, M., Jezierska, B. The effect of environmental factors on metal toxicity to fish. Fresenius Environmental Bulletin. 12, 824-829 (2003).
- Wedekind, C., Gessner, M. O., Vazquez, F., Maerki, M., Steiner, D. Elevated resource availability sufficient to turn opportunistic into virulent fish pathogens. Ecology. 91, 1251-1256 (2010).
- Penttinen, R., Kinnula, H., Lipponen, A., Bamford, J. K. H., Sundberg, L. R. High nutrient concentration can induce virulence factor expression and cause higher virulence in an environmentally transmitted pathogen. Microbial Ecology. 72, 955-964 (2016).
- Bols, N. C., Brubacher, J. L., Ganassin, R. C., Lee, L. E. J. Ecotoxicology and innate immunity in fish. Developmental & Comparative Immunology. 25, 853-873 (2001).
- Dunier, M., Siwicki, A. K. Effect of pesticides and other organic pollutants in the aquatic environment on immunity of fish: a review. Fish and Shellfish Immunology. 3, 423-438 (1993).
- Milla, S., Depiereux, S., Kestemont, P. The effects of estrogenic and androgenic endocrine disruptors on the immune system of fish: a review. Ecotoxicology. 20, 305-319 (2011).
- Connon, R. E., Geist, J., Werner, I. Effect-based tools for monitoring and predicting the ecotoxicological effects of chemicals in the aquatic environment. Sensors. 12, 12741-12771 (2012).
- Eckman, D. R., et al. Biological effects-based tools for monitoring impacted surface waters in the Great Lakes: A multiagency program in support of the Great Lakes restoration initiative. Environmental Practice. 15, 409-426 (2013).
- Khan, M. Z., Law, F. C. P. Adverse effects of pesticides and related chemicals on enzyme and hormone systems of fish, amphibians and reptiles: A review. Proceedings of the Pakistan Academy of Sciences. 42, 315-323 (2005).
- Wernersson, A. S., et al. The European technical report on aquatic effect-based monitoring tools under the water framework directive. Environmental Sciences Europe. 27, (2015).
- Bolger, T., Connolly, P. L. The selection of suitable indices for the measurement and analysis of fish condition. Journal of Fish Biology. 34, 171-182 (1989).
- Karr, J. R. Biological integrity: A long-neglected aspect of water resource management. Ecological Applications. 1, 66-84 (1991).
- Sanders, R. E., Miltner, R. J., Yoder, C. O., Rankin, E. T. The use of external deformities, erosions, lesions, and tumors (DELT anomalies) in fish assemblages for characterizing aquatic resources: a case study of seven Ohio stream. Assessing the sustainability and biological integrity of water resources using fish communities. Simon, I. nT. P. , CRC Press. Florida. 225-246 (1999).
- Bervoets, L., et al. Bioaccumulation of micropollutants and biomarker responses in caged carp (Cyprinus carpio). Ecotoxicology and Environmental Safety. 72, 720-728 (2009).
- Schulte-Hermann, R. Adaptive liver growth induced by xenobiotic compounds: its nature and mechanism. Archives of Toxicology. Supplement. 2, 113-124 (1979).
- Slooff, W., van Kreijl, C. F., Baars, A. J. Relative liver weights and xenobiotic-metabolizing enzymes of fish from polluted surface waters in the Netherlands. Aquatic Toxicology. 4, 1-14 (1983).
- Brewer, S. K., Rabeni, C. F., Papoulias, D. M. Comparing histology and gonadosomatic index for determining spawning condition of small-bodied riverine fishes. Ecology of Freshwater Fish. 17, 54-58 (2003).
- Goede, R. W., Barton, B. A. Organismic indices and an autopsy-based assessment as health and condition of fish. American Fisheries Society Symposium. 8, 93-108 (1990).
- Adams, S. M., Brown, A. M., Goede, R. W. A quantitative health assessment index for rapid evaluation of fish condition in the field. Transactions of the American Fisheries Society. 122, 63-73 (1993).
- Kane, A. S., et al. Field sampling and necropsy examination of fish. Virginia journal of science. 50, 345-363 (1999).
- Yanong, R. P. E. Necropsy techniques for fish. Seminars in Avian and Exotic Pet Medicine. 12, 89-105 (2003).
- American Fisheries Society (AFS) Use of Fishes in Research Committee, American Institute of Fishery Research Biologists and the Society of Ichthyologists and Herpetologists. Guidelines for the Use of Fishes in Research. , American Fisheries Society. Bethesda, Maryland. (2004).
- Bonar, S. A., Hubert, W. A., Willis, D. W. Standard methods for sampling North American freshwater fishes. , American Fisheries Society. Bethesda, Maryland. (2009).
- Zale, A. V., Parrish, D. L., Sutton, T. M. Fisheries Techniques, third edition. , American Fisheries Society. Bethesda, Maryland. 1009 (2013).
- Neiffer, D. L., Stamper, M. A. Fish sedation, anesthesia, analgesia, and euthanasia: considerations, methods, and types of drugs. Institute for Laboratory Animal Research. , 343-360 (2009).
- Clark, T. D., et al. The efficacy of field techniques for obtaining and storing blood samples from fishes. Journal of Fish Biology. 795, 1322-1333 (2011).
- Adewoyin, A. S., Nwogoh, B. Peripheral blood film - a review. Annals of Ibadan Postgraduate Medicine. 12, 71-79 (2014).
- Smith, S. B., et al. Illustrated field guide for assessing external and internal anomalies in fish. Information and Technology Report USGS/BRD/ITR. 2002-007, 46 (2002).
- Kane, A. S. Descriptive guide to observing fish lesions. , Available at http://aquaticpath.phhp.ufl.edu/Lesionguide/Lesionguide.pdf (2005).
- Rafferty, S. D., Grazio, J. Field manual for assessing internal and external anomalies in brown bullhead (Ameiurus nebulosus). , Pennsylvania Sea Grant. Erie, PA. Available at: https://seagrant.psu.edu/sites/default/files/Bullhead%20field%20manual.pdf (2018).
- European Association of Fish Pathologists. Necropsy manual. , Available at www.necropsymanual.net (2018).
- Buckmeier, D. L., Irwin, E. R., Betsill, R. K., Prentice, J. A. Validity of otoliths and pectoral spines for estimating ages of channel catfish. North American Journal of Fisheries Management. 22, 934-942 (2002).
- Maceina, M. J., Sammons, S. M. An evaluation of different structures to age freshwater fish from a northeastern US river. Fisheries Management and Ecology. 13, 237-242 (2006).
- Secor, D. H., Dean, J. M., Laban, E. H. Otolith removal and preparation for microstructural examination. Otolith Microstructure Examination and Analysis. Stevenson, D. K., Campana, S. E. 117, Canadian Special Publication of Fisheries and Aquatic Sciences. 19-57 (1992).
- Gauthier, D. T., Cartwrwight, D. D., Densmore, C. L., Blazer, V. S., Ottinger, C. A. Measurement of in vitro leucocyte mitogenesis in fish: ELISA based detection of the thymidine analogue 5'-bromo-2'-deoxyuridine. Fish and Shellfish Immunology. 14, 279-288 (2003).
- Zelikoff, J. T., et al. Biomarkers of immunotoxicity in fish:from the lab to the ocean. Toxicology Letters. , 325-331 (2000).
- Hahn, C. M., Iwanowicz, L. R., Corman, R. S., Mazik, P. M., Blazer, V. S. Transcriptome discovery in non-model wild fish species for the development of quantitiative transcript abundance assays. Comparative Biochemistry and Physiology - Part D: Genomics and Proteomics. 20, 27-40 (2016).
- Harms, C. A., et al. Quantitative polymerase chain reaction for transforming growth factor-B applied to a field study of fish health in Chesapeake Bay tributaries. Environmental Health Perspectives. 108, 1-6 (2000).
- Braden, J. B., et al. Economic benefits of remediating the Sheboygan River, Wisconsin Area of Concern. Journal of Great Lakes Research. 34, 649-660 (2008).
- Blazer, V. S., et al. Tumours in white suckers from Lake Michigan tributaries: pathology and prevalence. Journal of Fish Diseases. 40, 377-393 (2017).
- Vethaak, A. D., Jol, J. G., Pieters, J. P. F. Long-term trends in the prevalence of cancer and other major diseases among flatfish in the southeastern North Sea as indicators of changing ecosystem health. Environmental Science & Technology. 43, 2151-2158 (2009).
- Teubner, D., Paulus, M., Veith, M., Klein, R. Biometric parameters of the bream (Abramis brama) as indicators for long-term changes in fish health and environmental quality - data from the German ESB. Environmental Science and Pollution Research. 22, 1620-1627 (2015).
- Schleiger, S. L. Fish health assessment index study of four reservoirs in north-central Georgia. North American Journal of Fisheries Management. 24, 1173-1180 (2004).
- Sutton, R. J., Caldwell, C. A., Blazer, V. S. Health assessment of a tailwater trout fishery associated with a reduced winter flow. North American Journal of Fisheries Management. 20, 267-275 (2000).
- Blazer, V. S. The necropsy-based fish health assessment. Biomonitoring of environmental status and trends (BEST) program: selected methods for monitoring chemical contaminants and their effects in aquatic ecosystems. Schmitt, C. J., Dethloff, G. M. , U.S. Geological Survey Information and Technology Report USGS/BRD-2000-005 18-21 (2000).
- Schmitt, C. J. Biomonitoring of environmental status and trends (BEST) program: Environmental contaminants and their effects on fish in the Mississippi River basin. Biological Science Report USGS/BRD/BSR. 2002-0004, 241 (2002).
- Hinck, J. E., et al. Chemical contaminants, health indicators, and reproductive biomarker responses in fish from rivers in the Southeastern United States. Science of the Total Environment. 390, 538-557 (2008).
- Lang, T., et al. Diseases of dab (Limanda limanda): Analysis and assessment of data on externally visible diseases, macroscopic liver neoplasms and liver histopathology in the North Sea, Baltic Sea and off Iceland. Marine Environmental Research. 124, 61-69 (2017).
