הזיהוי של האינטראקציות פיזי בין גנים לבין אלמנטים התקינה הוא מאתגר אבל כבר בהנחייתם של כרומוזום קונפורמציה ללכידת שיטות. שינוי זה בפרוטוקול 4C-seq מפחית את הסיכון של ה-PCR הטיה על-ידי צמצום יתר הגברה של תבניות ה-PCR ומגדיל את mappability את הקריאות על-ידי שילוב צעד תקציר של אנזים הגבלה תוספת.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
זיהוי תפוקה גבוהה של ג'ין רצפים תקינה באמצעות רצף הדור הבא של כרומוזום מעגלי קונפורמציה ללכוד (4C-seq)
במאמר זה
סיכום
תקציר
זיהוי רכיבי רגולטוריות עבור גן יעד נתון מהווה אתגר טכני משמעותי בשל ההשתנות בגדלים מיצוב ותוצאה של האלמנטים רגולטוריות גן המטרה. התקדמות נעשתה עם התחזית bioinformatic על קיומו פונקציה של proximal שינויים epigenetic המשויך ביטוי גנים מופעל באמצעות אתרי קישור פקטור שעתוק ההכפלה. כרומטין קונפורמציה לכידת מחקרים מהפכה ביכולת שלנו לגלות את הקשר הפיזי כרומטין בין רצפים, אפילו במרחק של הגנום כולו. כרומטין מעגלית קונפורמציה לכידת יחד עם הדור הבא רצפי (4C-seq), בפרט, מיועד לגלות את האינטראקציות כרומטין הפיזי כל האפשריות עבור רצף נתון עניין (התצפית), כגון גן המטרה או רגולציה-תקינה משפר. אסטרטגיות 4C-seq הנוכחית ישירות רצף של תוך נקודת התצפית אבל דורשים רבים, נקודות מבט מגוונות בו-זמנית שנקבע כדי למנוע את האתגרים הטכניים של מדים לבסס מתקשר (הדמיה) עם פלטפורמות רצף ' הדור הבא '. אמצעי אחסון זה של ניסויים לא יכול להיות פרקטי עבור מעבדות רבות. כאן, אנחנו מדווחים בגישה שונה פרוטוקול 4C-seq המשלבת תקציר של אנזים הגבלה נוספים וגם הגברה מבוססת qPCR צעדים שנועדו להקל על לכידה גדול הקריאות רצף מגוונות או להמתיק את הפוטנציאל PCR הטיה, בהתאמה. שיטה 4C ששונה שלנו היא נוטה? המעבדה לביולוגיה מולקולרית סטנדרטי להערכת אדריכלות כרומטין.
מבוא
כבר בהנחייתם של זיהוי רכיבי הרגולציה על ביטוי גנים הפרויקט האנציקלופדיה של ה-DNA אלמנטים (קידוד) באופן מקיף מבואר פעילות פונקציונלית עבור 80% של הגנום האנושי1,2. הזיהוי של האתרים ויוו איגוד פקטור שעתוק, רגישות יתר DNaseI, ואת היסטון epigenetic שינויים מתילציה DNA סוגי תאים בודדים סלל את הדרך הניתוחים פונקציונלי של המועמד רגולטוריות רכיבים של ביטוי גנים היעד. חמושים עם ממצאים אלה, אנו מתמודדים עם האתגר של קביעת את מסופר פונקציונלי בין אלמנטים רגולטוריות גנים. באופן ספציפי, מהו הקשר בין גן יעד נתון enhancer(s) שלה? שיטת הלכידה (3 ג) קונפורמציה כרומטין מטפל ישירות שאלה זו על ידי זיהוי פיזי, וסביר פונקציו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. אנזים הגבלה בחירה
- לזהות אזור בעל עניין (למשל., יזם ג'ין, פולימורפיזם נוקלאוטיד יחיד (הסנ פ), משפר) ולקבל את רצף ה-DNA ממאגרי כגון המרכז הלאומי לקבלת מידע ביוטכנולוגיה (NCBI).
- לזהות את אנזימי הגבלה של המועמד (במיל ') לעיכול הראשון אנזים הגבלה (RE1) זה לא מספיק בתוך הרצף של עניין, אשר מייצרים קצוות דביקים (termini DNA עם המסוכך) לאחר RE עיכול, שפעילותם לא מעוכבים בידי CpG מתילציה.
הערה: הרזולוציה של הנתונים נקבע על-ידי RE1. אנזים עם זוג בסיסים 6 (bp) זיהוי רצף מייצרת, בממוצע, שברי כ 4 kilobases (kb) אורך, בעוד אנזים עם 4 bp זיהוי רצף מייצרת שברי כ 250 bp אורך, ומאפשר יותר מדויק זיהוי של רצפי אינטראקציה. - בחר RE1 של אנזימים מוע....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
ראשי keratinocytes האנושי הם בודדו אותנו מהמתרחש 2-3 שהושלכו neonatal. אל תדאג, במאגר, בתרבית ב KSFM בתוספת עם µg 30/mL יותרת המוח שור לחלץ, 0.26 ng/mL רקומביננטי האנושי גורם הגדילה באפידרמיס, מ"מ 0.09 סידן כלורי (CaCl2 ) ב 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו-חמצני. התאים היו לפצל שתי מבחנות ואת הבקבוק אחד היה תריז תוספת של CaCl2 כדי ריכוז סופי של 1.2 מ מ עבור ה 72 107 כל התאים מתרבים הבדיל תקין אוכלוסיות תוקנו ב- 1% פורמלדהיד 10 דקות בטמפרטורת החדר. בנפרד, תאים K.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
תוצאות 4C יש פוטנציאל לחשיפת אינטראקציות כרומטין לזיהוי רכיבי הרגולציה לא מוכרת ו/או היעד גנים חשובים בהקשר ביולוגי מסוים24,25,26. עם זאת, מכשולים טכניים עלולה להגביל את הנתונים המתקבלים ניסויים אלה. הטיה PCR הנובעות הגברה יתר של תבנית ב- 4 C פרוטוקולים סביר. פרוטוקול זה מטפל בנושא על ידי ניצול qPCR כדי לקבוע שמספר אופטימלי של הגברה מחזורי בצורה אובייקטיבית. בנוסף, הסרת רצפי פיתיון ממוצרים מוגבר הופכי PCR על ידי הגבלת digest יכו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי NIAMS (R01AR065523).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| HindIII | NEB | R0104S | |
| CviQI | NEB | R0639S | |
| DNA אוליגונוקלאוטידים פריימרים | IDT | יתוכנן על ידי הקורא | |
| 50 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטיים | פישר סיינטיפיק | 06-443-19 | |
| 1.7 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה | MidSci | AVSS1700 | |
| פוספט חוצץ | Thermo Fisher | 14190-136 | |
| פורמלדהיד, | מיקרוסקופיה אלקטרונית ללא מתנול מדעי המיקרוסקופיה | 15710 | |
| Nutator | VWR | 15172-203 | |
| Glycine | JT Baker | 4059-00 | |
| צנטריפוגה | |||
| מיקרוצנטריפוגה | |||
| Ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) | סיגמא-אולדריץ' | ED2SS | |
| 20% תמיסת SDS | סיגמא-אולדריץ' | 05030 | |
| טריפן כחול | תרמו פישר | 15250061 | |
| שקופיות זכוכית | פישר סיינטיפיק | 12-550-143 | |
| תלושי כיסוי | VWR | 16004-094 | |
| מיקרוסקופ | |||
| טריטון X-100 | אלפא Aesar | A16046 | |
| חום רועד | |||
| 2 M Tris-HCl | איכות ביולוגית | 351-048-101 | |
| פרוטאינאז K | NEB | P8107S | |
| פנול: כלורופורם: אלכוהול איזואמיל (25: 24: 1) | סיגמא-אולדריץ' | P2069 | |
| נתרן אצטט | סיגמא-אולדריץ' | M5661 | |
| 20 מ"ג/ מ"ל גליקוגן | תרמו פישר | R0561 | |
| אתנול | פישר סיינטיפיק | 04-355-223 | |
| מים ללא נוקלאז | פישר סיינטיפיק | MT-46-000-CM | |
| qPCR מחזורי | תרמו פישר | 4453536 | |
| צלחות qPCR תרמו | פישר | 4309849 | |
| תרמו-סייקלר | תרמו פישר | 4375786 | |
| צינורות רצועת PCR | MidSci | AVSST-FL | |
| 1 M מגנזיום כלוריד | איכות ביולוגית | 351-033-721 | |
| Dithiothreotol | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| אדנוזין טריפוספט | סיגמא-אולדריץ' | A2383 | |
| T4 DNA Ligase | NEB M0202S | ||
| אגרוז | סיגמא-אולדריץ' | A6013 | |
| RNase A | תרמו פישר | EN0531 | |
| ערכת טיהור PCR Qiagen | 28104 | ||
| MinElute ערכת טיהור PCR | Qiagen | 28004 | |
| ספקטרופוטומטר | |||
| הרחב תבנית ארוכה מערכת PCR | סיגמא-אולדריץ' | 11681834001 | |
| dNTP mix | תרמו פישר | R0191 | |
| SYBR ירוק I | סיגמא-אולדריץ' | S9430 | |
| ROX | BioRad | 172-5858 | |
| נתרן כלורי | סיגמא-אולדריץ' | S5886 | |
| ערכת תיקון קצה DNA | לוסיגן | ER0720 | |
| מערכת קשירת DNA מהירה LigaFast | Promega | M8221 | |
| SYBR תרמו בטוח | Fisher | S33102 | |
| Taq Polymerase | NEB | M0267S | |
| UltraSieve Agarose | IBI Scientific | IB70054 | |
| ערכת מיצוי ג'ל Qiaquick Qiagen | 28704 |
מקורות
- Dunham, I., et al. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Hoffman, M. M., et al. Integrative annotation of chromatin elements from ENCODE data. Nucleic Acids Research. 41 (2), 827-841....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
