Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

זיהוי תפוקה גבוהה של ג'ין רצפים תקינה באמצעות רצף הדור הבא של כרומוזום מעגלי קונפורמציה ללכוד (4C-seq)

Published: October 5, 2018 doi: 10.3791/58030
Automatic Translation
1, 1, 1
1Division of Dermatology, Center for Pharmacogenomics, Center for the Study of Itch, Department of Medicine, Washington University School of Medicine

Summary

הזיהוי של האינטראקציות פיזי בין גנים לבין אלמנטים התקינה הוא מאתגר אבל כבר בהנחייתם של כרומוזום קונפורמציה ללכידת שיטות. שינוי זה בפרוטוקול 4C-seq מפחית את הסיכון של ה-PCR הטיה על-ידי צמצום יתר הגברה של תבניות ה-PCR ומגדיל את mappability את הקריאות על-ידי שילוב צעד תקציר של אנזים הגבלה תוספת.

Abstract

זיהוי רכיבי רגולטוריות עבור גן יעד נתון מהווה אתגר טכני משמעותי בשל ההשתנות בגדלים מיצוב ותוצאה של האלמנטים רגולטוריות גן המטרה. התקדמות נעשתה עם התחזית bioinformatic על קיומו פונקציה של proximal שינויים epigenetic המשויך ביטוי גנים מופעל באמצעות אתרי קישור פקטור שעתוק ההכפלה. כרומטין קונפורמציה לכידת מחקרים מהפכה ביכולת שלנו לגלות את הקשר הפיזי כרומטין בין רצפים, אפילו במרחק של הגנום כולו. כרומטין מעגלית קונפורמציה לכידת יחד עם הדור הבא רצפי (4C-seq), בפרט, מיועד לגלות את האינטראקציות כרומטין הפיזי כל האפשריות עבור רצף נתון עניין (התצפית), כגון גן המטרה או רגולציה-תקינה משפר. אסטרטגיות 4C-seq הנוכחית ישירות רצף של תוך נקודת התצפית אבל דורשים רבים, נקודות מבט מגוונות בו-זמנית שנקבע כדי למנוע את האתגרים הטכניים של מדים לבסס מתקשר (הדמיה) עם פלטפורמות רצף ' הדור הבא '. אמצעי אחסון זה של ניסויים לא יכול להיות פרקטי עבור מעבדות רבות. כאן, אנחנו מדווחים בגישה שונה פרוטוקול 4C-seq המשלבת תקציר של אנזים הגבלה נוספים וגם הגברה מבוססת qPCR צעדים שנועדו להקל על לכידה גדול הקריאות רצף מגוונות או להמתיק את הפוטנציאל PCR הטיה, בהתאמה. שיטה 4C ששונה שלנו היא נוטה? המעבדה לביולוגיה מולקולרית סטנדרטי להערכת אדריכלות כרומטין.

Introduction

כבר בהנחייתם של זיהוי רכיבי הרגולציה על ביטוי גנים הפרויקט האנציקלופדיה של ה-DNA אלמנטים (קידוד) באופן מקיף מבואר פעילות פונקציונלית עבור 80% של הגנום האנושי1,2. הזיהוי של האתרים ויוו איגוד פקטור שעתוק, רגישות יתר DNaseI, ואת היסטון epigenetic שינויים מתילציה DNA סוגי תאים בודדים סלל את הדרך הניתוחים פונקציונלי של המועמד רגולטוריות רכיבים של ביטוי גנים היעד. חמושים עם ממצאים אלה, אנו מתמודדים עם האתגר של קביעת את מסופר פונקציונלי בין אלמנטים רגולטוריות גנים. באופן ספציפי, מהו הקשר בין גן יעד נתון enhancer(s) שלה? שיטת הלכידה (3 ג) קונפורמציה כרומטין מטפל ישירות שאלה זו על ידי זיהוי פיזי, וסביר פונקציונליים, האינטראקציות בין אזור עניין לבין המועמד אינטראקציה רצפים דרך אירועים שנתפסו בכרומטין קבוע3 . כפי הבנתנו כרומטין אינטראקציות גדל, עם זאת, ברור כי החקירה של המועמדים שנבחרו מראש לוקוסים אינה מספיקה לספק הבנה מלאה של ג'ין-enhancer אינטראקציות. לדוגמה, קדד השתמש בשיטת עותק מוספר (5 ג) לכידת תפוקה גבוהה קונפורמציה כרומוזומלית לבחון חלק קטן של הגנום האנושי (1%, פיילוט של לוקוסים 44) ודיווח מסופר מורכבים של לוקוסים. גנים ומוצרי טיפוח טבעיים עם אינטראקציות מזוהה בממוצע 2-4 שותפים אינטראקציה שונים, רבים מהם היו מאות kilobases משם, מרחב לינארי4. יתרה מזאת, Li ואח. משמש כרומטין ניתוח האינטראקציה לפי מדגמים מזווגים-End תג רצף (דשא) כדי לנתח את כל הגנום מקדם אינטראקציות ומצא כי 65% של RNA פולימראז II איגוד אתרים היו מעורבים באינטראקציות כרומטין. חלק אינטראקציות אלה גרמו קומפלקסים גדולים, רב הגן משתרע על פני מאות kilobases של מרחק גנומית, המכיל, בממוצע, 8-9 גנים כל5. יחד, ממצאים אלה מדגישות את הצורך שיטות הגנום כולו לא משוחד חקירת האינטראקציות כרומטין. חלק משיטות אלה נבדקות שמיט ואח. 6.

שיטות חדשות יותר ללימודי לכידת קונפורמציה כרומטין יחד עם הדור הבא רצף (Hi-C ו- 4C-seq) לאפשר הגילוי של רצפי לא ידועה אינטראקציה עם אזור של ריבית6. באופן ספציפי, לכידת קונפורמציה כרומוזום מעגלי עם הדור הבא רצפי (4C-seq) פותחה כדי לזהות לוקוסים אינטראקציה עם רצף של עניין לא משוחדת באופן7 על-ידי קביעת רצף ה-DNA של מקורב ל שנתפסו כרומטין אזור עניין במרחב תלת-ממדי. בקצרה, כרומטין קבוע כדי לשמור על אינטראקציות חלבון-DNA המקורי שלה, ביקע עם אנזים ההגבלה ולאחר מכן מאתרים בתנאים שתדללו ללכוד ביולוגית רלוונטית "קשרים" של אינטראקציה לוקוסים (איור 1). הקישורים קרוס מתבטלות כדי להסיר את החלבון, ובכך משאיר ה-DNA זמינים עבור ביקוע חלבונים נוספים עם אנזים ההגבלה השנייה. מצדו הסופי יוצר עיגולים קטנים של לוקוסים אינטראקציה. תחל רצף של עניין משמשות לאחר מכן ליצור ספריה מוגבר של רצפי לא ידוע מן השברים circularized, ואחריו רצף הדור הבא במורד הזרם.

פרוטוקול המובאים כאן, אשר מתמקדת הכנת הדוגמא, הופך את שני שינויים עיקריים ל קיימים 4C-seq שיטות8,9,10,11,12. ראשית, היא משתמשת שיטה המבוססת על qPCR מדעית לקבוע המספר האופטימלי של הגברה מחזורים עבור שלבי הכנה ספריית 4C-seq, ובכך מפחית את הסיכון של הפוטנציאל של הטיה PCR הנובעות הגברה יתר של ספריות. שנית, היא משתמשת צעד תקציר הגבלה נוספת במאמץ להפחית האחידות של רצפים "פיתיון" ידוע מעכבת בסיס-טלפון מדויק על ידי המכשיר רצף, ומכאן, ממקסם את רצף ייחודי, מקיף ב כל קריאה. פרוטוקולים אחרים לעקוף בעיה זו על-ידי איגוד רבים (12-15),8 4 C-seq ספריות עם פיתיון שונים רצפים ו/או הגבלת אתרים, נפח של ניסויים אשר לא ניתן להשגה על ידי מעבדות אחרות. השינויים המוצגים כאן מאפשרים מספר קטן של ניסויים, דוגמאות, ו/או משכפל באינדקס, איחדו לתוך נתיב אחד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. אנזים הגבלה בחירה

  1. לזהות אזור בעל עניין (למשל., יזם ג'ין, פולימורפיזם נוקלאוטיד יחיד (הסנ פ), משפר) ולקבל את רצף ה-DNA ממאגרי כגון המרכז הלאומי לקבלת מידע ביוטכנולוגיה (NCBI).
  2. לזהות את אנזימי הגבלה של המועמד (במיל ') לעיכול הראשון אנזים הגבלה (RE1) זה לא מספיק בתוך הרצף של עניין, אשר מייצרים קצוות דביקים (termini DNA עם המסוכך) לאחר RE עיכול, שפעילותם לא מעוכבים בידי CpG מתילציה.
    הערה: הרזולוציה של הנתונים נקבע על-ידי RE1. אנזים עם זוג בסיסים 6 (bp) זיהוי רצף מייצרת, בממוצע, שברי כ 4 kilobases (kb) אורך, בעוד אנזים עם 4 bp זיהוי רצף מייצרת שברי כ 250 bp אורך, ומאפשר יותר מדויק זיהוי של רצפי אינטראקציה.
  3. בחר RE1 של אנזימים מועמד המזוהה בשלב 1.2 שמייצר bp פרגמנט לפחות 500 של "viewpoint" הגבלת זמן הכולל האזור בעל עניין או, לחילופין, אזור שכנות.
    הערה: האנזים שנבחר חייב להיות נוטה פריימר עיצוב (ראה שלב 2).
  4. לעיכול השני, לזהות באנזים הגבלה (RE2) עם 4 bp זיהוי רצף שמייצר קצוות דביקים (termini DNA עם המסוכך) לאחר RE עיכול, שפעילותם לא מעוכב CpG מתילציה, זה חותך בתוך ההגבלה שבר שנוצר על ידי RE1 כדי לייצר קטע פיתיון bp 250-500 (איור 1).
    הערה: האנזים שנבחר חייב להיות נוטה פריימר עיצוב (ראה שלב 2).

2. עיצוב, צבעי יסוד בדיקת PCR הופכי ויעילות מערכת העיכול qPCR

  1. להשתמש בכלי העיצוב תחל כגון Primer3 (http://primer3.ut.ee) לעצב תחל הופכי זה מופנות מסובבת כלפי חוץ כלפי הקצוות של השבר פיתיון (כלומר., ומהצמיגים 5' הוא "הפוכה" פריימר, משלים סטרנד פלוס, בעוד 3' ומהצמיגים " העבר"פריימר, משלימים לחוף מינוס) וכפי קרוב האתרים הגבלת ככל האפשר כדי למזער ההגברה של פיתיון אינפורמטיבי רצף ולהגביר את יעילות ה-PCR (איור 2 א).
    הערה: תחל צריך להיות שמנבאת יש הגברה מינימלי שאינם ספציפיים מ- DNA גנומי סיליקו PCR תחזיות, לא יתיישר במקומות אחרים בגנום מלבד היעד שלהם עם יותר מ 16/18 זהות9. כמו רצף מתאמים משולבים לא תחל ההופכי PCR, באתר של איגוד פריימר הוא גמיש יותר מאשר בשיטות אחרות הכנה 4C; תחל צריך anneal בצורה אופטימלית בתוך 50 bp של הסוף של אתר ההגבלה המתאימה.
    1. לאשר יחודיות של ההופכי תחל PCR על ידי הגברה באמצעות דנ א גנומי מטוהרים (gDNA) כתבנית.
    2. תחל אופטימלית אמור להניב מוצרים בודדים בעת שימוש gDNA כתבנית (ראה צעד 11.2 לתיאור של מוצרים 4C הצפוי). אם מתרחשת הגברה משמעותית של gDNA, עיצוב חדשה תחל. אם אין תפאורה פריימר מקובל מזוהים, חזור לשלב 1 ובחר של פיתיון חדש על-ידי בחירה חדשה אנזימי הגבלה.
  2. עיצוב qPCR תחל כדי להגביר את השברים נוקלאוטיד 70-200 (nt) אורך כדי לנטר את יעילות עיכול הגבלה (איור 2B).
    1. עיצוב זוג אחד של תחל כדי להגביר ברחבי כל אתר ההגבלה (שנבחר בשלב 1) המגדירות הרצף פיתיון. עיצוב תחל את שתי RE1 (ראה שלב 6.5.6) ואתרים RE2 (ראה צעד 9.2).
    2. עיצוב ערכה של צבעי יסוד מגביר את אזור לא המכיל את האתרים עבור אנזים הגבלה או כפקד נורמליזציה (DNA נימול) עבור RE1 ו- RE2 (ראה גם שלב 6.5.6).

3. אוסף של תאים

  1. באמצעות שיטה שמתאימה התרבות רקמות או תא, לקבל השעיה תא בודד. גלולה את התאים עבור 5 דקות ב x 200 גר', למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב µL 500 1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) לכל 107 תאים.

4. פורמלדהיד cross-linking של תאים כדי לשמר את האינטראקציות כרומטין

  1. לכל 107 תאים, להוסיף 9.5 מ של 1% מיקרוסקופ אלקטרונים (EM)-כיתה פורמלדהיד (מתנול חינם) ב- PBS, דגירה, בעוד נופלת על הנדנדה (או דומה), 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT, 18 – 22 מעלות צלזיוס).
    הערה: קיבוע התנאים ייתכן שתצטרך להיות ממוטבים עבור כל סוג התא. בעבודה שפורסמה מוקדמת בתאים העכבר דיווח שבאותו קיבעון אופטימלית גורמת לפחות 40% הקריאות ממופה יישור כדי כרומוזום המכילה את נקודת התצפית9 בהנחה אזור שאינו telomeric על כרומוזום בגודל ממוצעת.
  2. העברת הצינורות התגובה קרח ולהוסיף קרח 1 מ' גליצין ריכוז סופי של 0.125 מ' (1.425 מ"ל) כדי להרוות את התגובה crosslinking. מערבבים על-ידי היפוך עדין.
  3. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 200 x g, 4 ° C, הסר בזהירות את כל תגובת שיקוע. בגדר תא ב-80 מעלות צלזיוס או פנה/י מיד לתא פירוק.

5. תא פירוק

  1. Resuspend בגדר תא מ 4.3 שלב ב- 500 µL של 5 מ מ ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) לרחוץ. Centrifuge ב x 200 גרם במשך 5 דקות ב RT. להשליך את תגובת שיקוע.
  2. Resuspend בגדר תא ב- 125 µL של 5 מ מ EDTA עם 0.5% dodecyl נתרן גופרתי (מרחביות) ו 1 מעכבי פרוטאז x, כגון סימן x 100 קוקטייל המכיל 5 מ"ג/מ"ל antipain, chymostatin 10 מ"ג/מ"ל, leupeptin 10 מ"ג/מ"ל ו- 10 מ"ג/מ"ל pepstatin א
    הערה: ריכוז דטרגנט ייתכן שתצטרך להיות ממוטבים עבור כל סוג התא. לא מספיק ריכוזים דטרגנט יגרום פירוק תאים לא שלמים, עוזב כרומטין נגיש אנזימי הגבלה. אם עיכול הגבלה הוא נמוך באופן עקבי בשלב 6.5.6 פעילותו של האנזים אושרה, דטרגנט נוספים עשוי להידרש. להגדיל את ריכוז מרחביות במרווחים של 0.1%.
  3. דגירה התליה תא על קרח למשך 10 דקות.
    הערה: עבור ראשי keratinocytes אנושי, פירוק של האופטימלית הושגה באמצעות דגירה של 10 דקות ב 65 ° C ואחריו הדגירה לילה 37 ° C בבלוק חימום חזק עם עצבנות (900 סל ד).
  4. ודא שכי פירוק התא הושלמה.
    1. מיקס 6 µL של התאים עם 6 µL של Trypan Blue על שקופית בעלת כיסוי עם coverslip. הצג תחת מיקרוסקופ.
      הערה: בעת פירוק מוצלחת, הפנים של התאים אמורה להופיע כחול, תאים lysed לא תופיע לבן.
    2. אם פירוק התא נראה לא מספיק, גלולה התאים ב x 200 גרם במשך 5 דקות ולשמור את תגובת שיקוע. Resuspend בגדר וחזור על שלבים 5.2 – 5.4 ו/או לחלופין עם טמפרטורות שונות דגירה (ראה ההערה ב- 5.3 שלב).
    3. לשלב בגדר lysed מחדש עם תגובת שיקוע שנשמרו והמשך.
      הערה: בדיקה ויזואלית אינה ערובה של פירוק מספיק... יעילות עיכול צריך להיקבע באופן אובייקטיבי כמו שלב 6.5.6.

6. ראשית עיכול הגבלה

  1. להוסיף 30 μL של 10 x מאגר אנזים הגבלה (שצוין על-ידי היצרן) 27 μL של 20% טריטון X-100 (% 1.8 הסופי) כדי התליה של 5.4 שלב. להביא את הנפח הכולל 300 µL עם H2O.
    הערה: ההרכב של המאגר אנזים הגבלה תלויות האדומ שבחרת בשלב 1.
  2. להסיר μL 15 aliquot כמו "שליטה מעוכל" וחנות ב 4 º C.
  3. להוסיף 200 U RE1 לתערובת התגובה הנותרים, דגירה בין לילה בטמפרטורה המתאימה של האנזים בבלוק חימום חזק עם עצבנות (900 סל ד). למחרת, הוסף 200 נוספים של U RE1 והמשך הדגירה למשך הלילה.
  4. להסיר את μL 15 aliquot כפקד"Digested" ולאחסן ב 4 º C.
  5. לקבוע יעילות עיכול:
    1. להוסיף µL 82.5 של 10 מ מ טריס-HCl pH 7.5 הדגימות µL 15 מ 6.2 שלבים ו- 6.4. להוסיף 2.5 µL של proteinase K (20 מ"ג/מ"ל), תקופת דגירה של h 1-65 מעלות צלזיוס.
    2. להוסיף 100 µL של פנול-כלורופורם ולערבב נמרצות על ידי היפוך להסרת משקעי חלבון זיהום. צנטריפוגה למשך 5 דקות, x 16,100 g בטמפרטורת החדר.
    3. להעביר את פאזה מימית צינור חדש. הוסף µL 6.66 של 3 מ' סודיום אצטט pH 5.2, µL 1 של גליקוגן 20 מ"ג/מ"ל, µL 300 של 100% אתנול (EtOH). מערבבים בעדינות על-ידי היפוך ומקום ב-80 מעלות צלזיוס לשעה.
    4. צנטריפוגה במשך 20 דקות x 16,100 g ב- 4 מעלות צלזיוס. הסר את תגובת שיקוע, להוסיף 500 µL של 70% EtOH, וצנטריפוגה עבור 5 דקות ב x 16,100 g -RT.
    5. הסר את תגובת שיקוע ויבשה בגדר בטמפרטורת החדר במשך 2 דק Resuspend בגדר ב- 50 µL של נוקלאז ללא H2O.
    6. לקבוע את יעילות תקציר מאת13,qPCR14 בשיטת ∆∆Ct. השתמש הראשיים. הגדר לא איגוף אתר ההגבלה (ראה שלב 2.2.2) של הפקד נורמליזציה. המשך אם יעילות עיכול > 85%. אחרת, גלולה התאים וחזור על שלבים 5.2-6.5, תוך השמטת הדגירה ב 65 ° C ב- 5.3 שלב.

7. קודם מצדו

  1. חום-בטל אנזים הגבלה על-ידי המקננת 20 דקות ב- 65 מעלות צלזיוס. לחלופין, אם האנזים לא יכול להיות חום לא פעיל, פנול-כלורופורם לחלץ, אתנול לזרז את הדגימה.
    הערה: איון שהטמפרטורות מומלצת אנזימי הגבלה כלשהי denature את החלבונים בכרומטין, זה עלול להשפיע לרעה על איכות הדגימה. בנוסף, פנול: כלורופורם החילוץ אינו אידיאלי, כאשר התוצאה היא האובדן של מדגם.
  2. להעביר צינור חרוטי 50 מ"ל ולהוסיף 6 מ של נוקלאז ללא H2O, 700 µL של 10 x מאגר ליגאז (660 מ מ טריס-HCl pH 7.5, 50 מ מ מגנזיום כלוריד (MgCl2), 10 מ מ dithiothreitol (DTT), 10 מ מ אדנוזין טריפוספט (ATP)), ו- 50 U T4 DNA ליגאז. לערבב בעדינות על ידי מתערבל, דגירה בין לילה ב-16 ° c
  3. הסרת aliquot 100 µL של המדגם כמו "שליטה מצדו".
  4. לקבוע מצדו יעילות:
    1. להוסיף 2.5 µL של Proteinase K (20 מ"ג/מ"ל), דגירה h 1-65 מעלות צלזיוס.
    2. להוסיף 100 µL של פנול-כלורופורם, לערבב נמרצות על ידי היפוך. צנטריפוגה למשך 5 דקות, x 16,100 g ב- RT.
    3. להעביר את פאזה מימית צינור חדש. להוסיף µL 6.66 של 3 מ' סודיום אצטט pH 5.2, µL 1 של גליקוגן, 300 µL של 100% EtOH. מערבבים בעדינות על-ידי היפוך ומקום ב-80 מעלות צלזיוס בערך 1 h.
    4. צנטריפוגה במשך 20 דקות x 16,100 g ב- 4 מעלות צלזיוס. להסיר את תגובת שיקוע, להוסיף 500 µL של 70% EtOH, וצנטריפוגה עבור 5 דקות ב x 16,100 g ב- 4 מעלות צלזיוס.
    5. הסר את תגובת שיקוע ויבש בגדר בטמפרטורת החדר. Resuspend בגדר ב 20 µL של מים וטען ב- 0.6% ג'ל agarose ליד "הפקדים עיכול" מ- 6.5 שלב.
      הערה: מדגם מחוברים היטב אמור להופיע כלהקה משקל מולקולרי יחסית חזק, גבוה (איור 3).
    6. אם מצדו מספיקה, להמשיך עם שלב 8. אחרת, להוסיף טריים ATP (ריכוז סופי של 1 מ מ) ואת ליגאז חדש; דגירה בין לילה ב 16 ° C, חזור על שלבים 7.3-7.4.

8. הפוך cross-linking ולבודד כרומטין

  1. להוסיף 15 µL של Proteinase K (20 מ"ג/מ"ל), דגירה בין לילה ב 65 ° C כדי להפוך חוצה קישורים.
  2. להוסיף 30 µL של RNase A (10 mg/mL), דגירה 45 min ב- 37 מעלות צלזיוס.
  3. להוסיף 7 מ של פנול-כלורופורם וב לערבב נמרצות על ידי היפוך. צנטריפוגה 15 דקות, x 3,300 g ב- RT.
  4. להעביר את פאזה מימית צינור 50 מ"ל ולהוסיף 7.5 mL של נוקלאז ללא H2O (כדי לדלל את DTT שבמאגר ליגאז, אשר אחרת ארגונייט שוקע עם דנ א), 1 מ"ל של 3 מ' סודיום אצטט pH 5.6, 7 µL של גליקוגן (20 מ"ג/מ"ל) , ו- 35 מ ל 100% EtOH. לערבב, דגירה ב-80 מעלות צלזיוס לשעה.
  5. צנטריפוגה 20 דקות, x 3,900 g ב- 4 מעלות צלזיוס. הסר את תגובת שיקוע (גלולה ייתכן שתתקשה לראות), לשטוף את גלולה עם 10 מ"ל של 70 כקרח % EtOH, וצנטריפוגה 15 דקות, x 3,300 g ב- 4 מעלות צלזיוס.
  6. הסר את תגובת שיקוע ויבשה בקצרה את צניפה-RT. התמוססות בגדר ב 150 µL של 10 מ מ טריס-HCl pH 7.5 ב 37 º C. לאחסן ב-20 ° C, או להמשיך עם שלב 9.

9. השני עיכול הגבלה: זמירה החוגים

הערה: שלב זה יוצר עיגולים קטנים כדי למזער את overrepresentation של קטן שנלכד קטעים עקב הטיית PCR בשלבים הגברה במורד הזרם.

  1. לדגימת מ- 8.6 צעד, להוסיף 50 µL של 10 x מאגר אנזים הגבלה (שצוין על-ידי היצרן), µL 300 של נוקלאז ללא H2O ואנזים הגבלה U 50 RE2. דגירה בין לילה בטמפרטורה המתאימה עבור האנזים שבחרת.
  2. הסר aliquot 15 µL מדגם של "הפקד עיכול". לקבוע את יעילות עיכול כפי שמתואר בשלב 6.5.

10. השני מצדו, טיהור DNA

  1. בטל את אנזים הגבלה המומלצים ע י היצרן. אם האנזים לא ניתן להשבית-חום, להסיר את האנזים באמצעות ערכת טיהור מבוססי עמודה.
    הערה: כפי התוצאה היא האובדן של המדגם, טיהור העמודה אינה אידיאלית.
  2. להעביר את הדגימה שפופרת 50 מ"ל ולהוסיף 12.1 מ של נוקלאז ללא H2O, 1.4 מיליליטר 10 x מצדו מאגר (660 מ מ טריס-HCl, pH 7.5; 50 מ מ MgCl2; 10 מ מ DTT; 10 מ מ ATP) ו- 100 U T4 DNA ליגאז. דגירה בין לילה ב-16 ° c
  3. להוסיף µL 467 של 3 מ' סודיום אצטט pH 5.6, µL 233 נטולת נוקלאז H2O, µL 7 גליקוגן (20 מ"ג/מ"ל) ו- 35 מ ל 100% EtOH. מערבבים היטב, דגירה ב- 80 ° C 1 h.
  4. צנטריפוגה 45 min, x 3,900 g ב- 4 מעלות צלזיוס. הסר את תגובת שיקוע, להוסיף 10 מ של קר 70% EtOH, וצנטריפוגה 15 דקות, x 3,300 g ב- 4 מעלות צלזיוס.
  5. הסר את תגובת שיקוע ויבש בקצרה בגדר בטמפרטורת החדר. להוסיף 150 µL של 10 מ מ טריס-HCl pH 7.5, דגירה ב 37 ° C כדי להמיס את גלולה.
  6. לטהר את הדגימות עם סיליקה מבוססי עמודה PCR ערכת טיהור, ההוראות של היצרן. להשתמש בעמודת 1 לכל 3 x 106 תאים, בהתבסס על מספר ראשוני של התאים. Elute את העמודות עם 50 µL 10 מ מ טריס-HCl, pH 7.5, מאגר הדגימות.
  7. למדוד הריכוז על ידי fluorimetry או ספקטרופוטומטר באמצעות את ספיגת ב 260 ננומטר. התבנית 4C מוכן כעת עבור ההופכי PCR. ב-20 ° C או להמשיך ישירות אל שלב 11.

11. PCR להגביר את רצפי אינטראקציה לא ידוע על ידי ה-PCR הופכי

  1. לקבוע את הטווח. ליניארית של הגברה על ידי ביצוע של PCR באמצעות תבנית דילולים של 12.5, 25, 50, 100 נג 4C תבנית. אם רצונך בכך, להגביר מ gDNA במקביל להשוות מוצרים ישירות על מנת לזהות הגברה שאינם ספציפיים. להפעיל תגובות PCR בעזרת דנטורציה הראשונית של 94 ° C למשך 2 דקות; מחזורים המורכב צעד דנטורציה ב 94 מעלות צלזיוס במשך 10 s שלב מחזק ב 55 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה, שלב סיומת ב 68 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות; ועם סיומת הסופי ב 68 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
  2. נפרדים µL 15 של כל מוצר ה-PCR על 1.5% agarose ג'ל כדי לאשר הגברה ליניארי והערכת איכות התבנית (איור 4). הגברה מתבנית 4C אמור להניב פסים דיסקרטית ריכוזים נמוכים של ה-DNA, כתם בריכוזים גבוהים. הנוכחות של השמצות מציין מוגברת המורכבות ligations 4C מוגבר.
  3. כשאתה מרוצה האיכות והכמות של המוצר PCR הופכי שנוצר, להגדיר qPCR כדי לקבוע את המספר האופטימלי של מחזורי לשימוש עבור הגברה:
    1. כוונן את תגובות המכילות SYBR ' לוקאס סולאס צבענים באמצעות תערובת התגובה בטבלה מס ' 2. אלא אם כן ההגברה אינה ליניארית בריכוזים גבוהים שלב 11.2, שימוש 100 ננוגרם של התבנית לכל תגובה.
      הערה: התוספת של לוקאס סולאס מקלה את נרמול ניאון האות טוב טוב, מחזור ל מחזור.
    2. הפעל את תגובות PCR בעזרת דנטורציה הראשונית של 94 ° C למשך 2 דקות; 40 מחזורי המורכב צעד דנטורציה ב 94 מעלות צלזיוס במשך 10 s שלב מחזק ב 55 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה, שלב סיומת ב 68 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות; ועם סיומת הסופי ב 68 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
    3. לקבוע את שיא (קצה) זריחה של תגובות באמצעות העלילה הגברה. לקבוע את המעגל בו תגובות להגיע 25% של שיא קרינה פלואורסצנטית (איור 5).
      הערה: זהו המספר של מחזורים ישמש כדי להגביר את ספריות 4C (ראה צעד 11.4).
  4. להגדיר את ההופכי PCR כמו טבלה 3 כדי להגביר את רצפי לא ידוע מאתרים לפיתיון מהתבנית 4 C. לחלק 16 תגובות של 50 µL לפני הפעלת. להפעיל תגובות PCR בעזרת דנטורציה הראשונית של 94 ° C במשך 2 דקות ומחזורי המורכב צעד דנטורציה ב 94 מעלות צלזיוס במשך 10 s, חישול צעד ב 55 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה, ולהשתמש שלב סיומת ב 68 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות מספר מחזורים שנקבע בשלב 11.3.3.
  5. לאסוף, מאגר התגובות. לטהר באמצעות סיליקה מבוססי עמודה PCR ערכת טיהור. להשתמש לפחות 2 טורים 16 תגובות. מאגר המוצרים PCR מטוהרים.
  6. לקבוע את כמות הדגימה ואת טוהר על ידי ספקטרופוטומטר. התשואות טיפוסי הם בין 10 ל- 20 μg עם A260/A280 ~ 1.85. אם היחס ספיגה תת אופטימלית, לטהר מחדש על מנת למנוע הבעיות במהלך רצף.
  7. להעריך את המורכבות של הספרייה על-ידי הפרדת 300 ng של מוצר ה-PCR מטוהרת על 1.5% agarose ג'ל.
    הערה: המוצר מוגבר צריך דומה לזו של שלב 11.2.

12. השלישי עיכול הגבלה: לקצץ את רצפי פיתיון

הערה: שלב זה מסיר פיתיון אינפורמטיבי רצפים מן המוצרים PCR הפוך כדי למקסם אינפורמטיבי שנתפסו רצפי בשלבים רצף במורד הזרם. כדי לפקח על יעילות תקציר, "תקציר מוניטור"15 מתעכלת במקביל באמצעות DNA המקביל ריכוז האנזים. אם RE1 ו- RE2 שאינם תואמים למערכת העיכול הבו-זמניות, לדוגמה, עקב טמפרטורות שונות הדגירה אופטימלית או מאגרי התגובה, זה צריך להתבצע תקציר רציפים (זה לא אידיאלי).

  1. להשיג צג תקציר מחדש ובדוק את העיכול בתגובה 50 µL.
    הערה: זהו מולקולה של dsDNA (לדוגמה, פלסמיד, PCR אמפליקון, או דנ א סינתטי) המכיל את האתר מחדש. הדרישה היחידה היא שלא ניתן יהיה קל להבחין גזור מצג נימולים על ג'ל agarose. מטב RE צג מסה אנזים ריכוז במידת הצורך.
  2. 1 תקציר µg של המוצר מטוהרים PCR ההופכי של שלב 11.6, במקביל, הצג רי מ- 12.1 שלב.
    הערה: ה-DNA ריכוז האנזים, וכן זמן הדגירה, צריך להיות זהה לעכל את הבדיקה ב- 12.1 שלב למוצר הן הופכי PCR ולא מעכל את הצג. לכוונן את עוצמת התגובה לפי הצורך.
  3. להפעיל את מתעכל RE צג ג'ל agarose של ריכוז מתאים השברים הצפוי. עיכול הוא נחשב מספיק כאשר < 10% של ה-DNA נשאר נימול (איור 6).
  4. לטהר את המוצר PCR הופכי מתעכל על סיליקה מבוססי עמודה DNA ערכת טיהור. אם מעכל רציף יש צורך, חזור על שלבים 12.4-12.1 עם האנזים השני.

13. הכנת רצף הספרייה

  1. מאתרים ומפסיקים את המתאמים תואם עם פלטפורמה רצף הדור הבא בהתאמה.
    1. עיצוב המתאמים לכל RE1 ולכל RE2 כך, לאחר חישול את oligos, כל מתאם RE יש הסככה חד-צדדי בהתאמה.
      הערה: לדוגמה, אם HindIII משמש, המתאם annealed צריך להכיל הבליטה "AGCT" של 5' phosphorylated. לחלופין, אם נעשה שימוש רגיל מתאמי T-הסככה, סוף-תיקון ו- A-פלי הספרייה לפני מתאם מצדו.
    2. Anneal oligos מחדש את מתאם בהתאמה. Resuspend את oligos במאגר מחזק (10 מ"מ. טריס, pH 7.5, 50 מ מ נתרן כלורי (NaCl), 1 מ"מ EDTA), לערבב בכמויות equimolar 50 מיקרומטר, חום עד 95 ° C, להתקרר לאט עד 25 מעלות צלזיוס.
    3. לבצע את התגובה מצדו. מערבבים ספריית C 4 מתעכל מחדש עם סה כ 5 - ל 10 פי טוחנת עודף של מתאמים annealed (שלב 13.1.2; יחס 50: 50 עבור כל מתאם RE המשמש) ב 1 x ליגאז מאגר ולהוסיף 6U DNA ליגאז. דגירה בהתאם להוראות היצרן.
    4. להסיר מתאמים עודף על ידי טיהור באמצעות ערכת עמודה מבוסס-סיליקה נמוכה-• תנאי האחסון.
  2. בחר גודל.
    הערה: גודל הבחירה ניתן גם לבצע באמצעות ערכת ניקוי מבוסס-חרוז והוא מומלץ גם אחרי טיהור עמודה.
    1. הטיל ג'ל 2% agarose באמצעות agarose ברזולוציה גבוהה, הוספת כתם שאינו-UV לפני לשפוך. ודא כי כל המים האובדים בשל התאיידות במהלך חימום מוחלף על ידי שקילה את הבקבוק או את הבקבוק לפני ואחרי חימום והוספת מים כדי לשחזר את המסה אבוד.
    2. הפעל את הספריות ובין אם-לא מתאם על הג'ל, עוזב מסלולים ריקים בין הדגימות.
    3. לסלק את הפרוסות ג'ל התואם נקודת הרתיחה של גודל טווח 150 ל 1 kb באמצעות אזמל נקי או גילוח.
    4. לטהר את הספריות של הג'ל באמצעות ערכת חילוץ ג'ל. כדי למזער GC הטיה בשחזור של ה-DNA, לפזר את הפרוסות ג'ל בטמפרטורת החדר עם סיבוב.
  3. לקבוע את מספר מחזורי עבור הגברה PCR על-ידי qPCR באמצעות תערובת התגובה בטבלה4. תגובות PCR בעזרת דנטורציה הראשונית של 98 ° C למשך 2 דקות ולרוץ 40 מחזורי המורכב דנטורציה צעד ב 98 ° C עבור 10 s שלב מחזק ב 60 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה, שלב סיומת ב-72 מעלות למשך 3 דקות.
    הערה: מחזור בו קרינה פלואורסצנטית מגיע ל 25% מהערך המרבי הוא מספר מחזורים ישמש כדי להגביר את הספרייה, כמו שלב 11.3.
  4. להגביר את ספריות באמצעות תערובת התגובה ב טבלה 5. להפעיל תגובות PCR בעזרת דנטורציה הראשונית של 98 ° C במשך 2 דקות ומחזורי המורכב צעד דנטורציה ב 98 ° C עבור 10 s שלב מחזק ב 60 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה, שלב סיומת ב-72 מעלות למשך 3 דקות. מספר מחזורים הגברה כדי לשמש עבור כל ספריה נקבע ב- 13.3 שלב.
  5. לטהר ספריות מוגבר באמצעות ערכת עמודה מבוסס-סיליקה נמוכה-• תנאי האחסון.

14. רצף וניתוח של רצף נתונים

  1. לקבוע את ריכוזי ספריות מוגבר באמצעות וזמינותו של fluorimetric. לדלל את הספריות הריכוז המתאים עבור קביעת רצף (בדוק עם רצף שירות או הליבה להמלצה שלהם).
  2. לקבוע את האיכות של ספריות באמצעות פלטפורמה ניתוח microfluidic חומצת גרעין.
    הערה: גודל הפרופיל של הספרייה והימני לשקף אליו לראות את הג'ל בחירת גודל ב- 13.2 שלב, הריכוז של המדגם נקבע בשלב זה הוא שישמש עבור רצף.
  3. בריכת באינדקס ספריות כדי לקבל לפחות 3 מיליון קריאות (לפחות 50 bp לקרוא; יחיד [1 X 50] או מזווג סוף [2 X 50]) עבור דגימה. ספריה באיכות גבוהה דורשת לפחות 1 מיליון ממופה קורא9, אבל יהיו כמה התשה במהלך המיפוי. לדוגמה, פלטפורמה רצף מניב כ-150 מיליון קריאות בנתיב יכול להכיל עד 50 דוגמאות נתיב אחד.

15. ניתוח של נתוני רצף

  1. Demultiplex את הנתונים באמצעות אינדקס רצפים כדי להקצות את הקריאות דוגמאות המתאימות שלהם.
    הערה: בהתאם ההיכרות שלהם, משתמשים עשויים לבצע ניתוחים חישובית במורד הזרם של קבצי raw רצף FASTA/FASTQ באמצעות ממשק שורת פקודה בסיסי או, לחילופין, ה ידידותי למשתמש, מבוסס-אינטרנט גלקסי משתמש גרפי ממשק (GUI)16 .
  2. חתוך מתאם רצפים של כל רצף פיתיון הנובעים שלם RE עיכול שלב 12, לדוגמה, באמצעות ערכת הכלים מהיר-X (http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/).
  3. קריאות demultiplexed למפות הגנום המתאים עניין (למשל., UCSC mm10, hg19) באמצעות ה בורואוס-וילר Aligner (bwa) נקודה לנקודות17 או תוכנה אחרת יישור וכתוצאה מכך סאם פלט קבצים. אם יש צורך, להמיר קבצי סאם ל BAM via samtools18 (ראה צעד 15.4).
  4. השתמש צינור ניתוח 4C-seq כגון Basic4Cseq19, 4 C-ker20, FourCSeq21או fourSig22 כדי לנתח את הנתונים ולזהות את האינטראקציות.
    הערה: נתונים ניתוח והערכה של איכות הימנו צריך להתנהל על פי מדריך הפניה של חבילת התוכנה שנבחרה. חבילות ליצור מיטה קבצי הפלט למעט אם צוין. בקצרה, Basic4CSeq19 משתמשת בקובץ הקלט סאם (שלב 15.3) כדי להמחיש את האינטראקציות (txt tiff, מיטה, קבצי פלט הפאה) ומודד את האיכות של נתונים בהתבסס על הקריטריונים שנקבעו בואן דה Werken et al. 9 4 C-ker20 (קלט גזוז FASTQ, שלב 15.2) ולזהות FourCSeq21 (באם קלט, שלב 15.3) דיפרנציאלית אינטראקציות בין תנאי. fourSig22 (SAM קלט) גם מזהה אינטראקציות משמעותיות, לפי עדיפות אלה נוטים להיות לשחזור. כלים כגון גנומית רגולטוריות העשרה של ביאורים כלי (גדול)23או שילוב עם ערכות נתונים קדד עשוי לשמש גם לחזות הפונקציה הביולוגי של אינטראקציות התגלה על ידי 4 C-תת סעיף.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ראשי keratinocytes האנושי הם בודדו אותנו מהמתרחש 2-3 שהושלכו neonatal. אל תדאג, במאגר, בתרבית ב KSFM בתוספת עם µg 30/mL יותרת המוח שור לחלץ, 0.26 ng/mL רקומביננטי האנושי גורם הגדילה באפידרמיס, מ"מ 0.09 סידן כלורי (CaCl2 ) ב 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו-חמצני. התאים היו לפצל שתי מבחנות ואת הבקבוק אחד היה תריז תוספת של CaCl2 כדי ריכוז סופי של 1.2 מ מ עבור ה 72 107 כל התאים מתרבים הבדיל תקין אוכלוסיות תוקנו ב- 1% פורמלדהיד 10 דקות בטמפרטורת החדר. בנפרד, תאים K562 גדלו ב- RPMI בתוספת 10% סרום שור העובר ב 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו-חמצני. 107 תאים תוקנו בפורמלין 1% 10 דקות בטמפרטורת החדר.

התאים היו lysed, והן כרומטין קבוע היה מתעכל עם HindIII מאתרים כמתואר לעיל. חוצה קישורים היה הפוך, ואת ה-DNA הוא מטוהרים מתעכל עם CviQI. דנ א מאתרים ומשמש כתבנית עבור הגברה PCR ההופכי. תחל להשתמש היו: 5'-GATCAGGAGGGACTGGAACTTG/5-CCTCCCTTCACATCTTAGAATG. 1 µg של מוצר ה-PCR הופכי מטוהרים היה מתעכל למשך הלילה עם CviQI במקביל 225 ng של RE לעכל צג וטיהרו עמודה. DNA מטוהרים היה אז מתעכל בין לילה עם HindIII במקביל 125 ng של RE לעכל צג וטיהרו עמודה. 250 ng מטוהרים המוצר הופכי כפול-מעוכלים PCR שימשה להכנה הספרייה. בקצרה, הקצוות תוקנו באמצעות המרות ל 5'-phosphorylated, בלאנט-קצוות, העמודה ה-DNA עוקבות-טיהור. הקצוות A-זנב 20 דקות ב-72 מעלות בתגובה 50 µL עם אנזימים U 1, 200 dATP מיקרומטר, מטוהרים עמודה. תואם רצף הספרייה במכינה מתאמי היו מאתרים ביחס של 10:1 (מתאם: DNA) באמצעות ה-T4 DNA ליגאז ב 30 µL התגובה בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות והדנ א טור-טהור. ספריות נוהלו על ג'ל agarose 2%, ג'ל פרוסות נחתכו בין 120 bp לחלק העליון של הסולם כדי להסיר מתאמים וספריות היו מטוהרים. עמוד 200 של כל ספריה הוערכו ב- 10 תגובות qPCR של µL, המכיל תחל יצירת האינדקסים כדי לקבוע אופטימלית PCR הגברה מחזורים. ספריות היו מוגבר כדי להוסיף מדדים באמצעות מספר מחזורים נקבעים על-ידי qPCR, וסודרו על HiSeq2500 כדי להשיג 1 x 50 קריאות.

קריאות demultiplexed, גזוז. ראשית, מתאמי רצף הוסרו. לאחר מכן, הרצף מתחילת כל תחל באתר הגבלת תוקן. פעולה זו מאפשרת את המיפוי של ההופכי מוצרים PCR היו לא מתעכל באופן מלא לפני הכנת ספריה. חשוב לציין, כולל רצף בין האתר מחייב פריימר האתר הגבלת מונע מיפוי של מוצר ה-PCR הלא-במיוחד-מוגבר. קריאות החתוך מופו hg38 באמצעות BWA. איור 7 מראה קורא מיפוי אזור סביב נקודת התצפית.

Figure 1
איור 1: סכימטי של זרימת עבודה 4C-seq. כרומטין קישורים צולבים כדי לשמר את הקשר חלבון-DNA, מתעכל עם RE1, מאתרים לקשר לוקוסים אינטראקציה. חוצה קישורים הפוכים, ו DNA הוא מתעכל עם RE2 מאתרים. רצפים אינטראקציה לא ידוע הם מוגבר באמצעות תחל לאגד לאזור של הריבית, מוצרי ה-PCR מתעכלים עם RE1 RE2 כדי לקצץ רצפים ידועים. DNA מוגבר של רצף לא ידוע משמש הכנה ספריה רצף, בו המתאמים מאתרים, הספרייה היא מוגבר-PCR, ברצף. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: שרטוט של פריימר עיצובים- (א) מחייב באתרי תחל PCR ההופכי. תחל הם שכיוונו "החוצה" (כלומר-5' ומהצמיגים פריימר "לאחור", משלים סטרנד פלוס, בעוד ומהצמיגים 3' הוא פריימר "קדימה", משלים סטרנד מינוס) לאגד בתוך 50 bp של כל אתר ההגבלה (מסומן באדום הצללה). (B) מחייב באתרי qPCR תחל לקביעת יעילות תקציר אנזים הגבלה. פריימר אחד זוג אגפים כל אתר אנזים הגבלה. ערכה פריימר שליטה מגביר את רצף אינו מכיל אתר או אנזים ומשמשת לנרמל Ct ערכים עבור קלט ה-DNA. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: Agarose בג'ל כדי להעריך את היעילות מצדו של כרומטין מתעכל RE1. דוגמאות נימולים HindIII-מעוכלים, מחוברים היו מטופלים עם proteinase K ו מחומם כדי להפוך חוצה קישורים, פנול: כלורופורם חילוץ הקבצים, EtOH זירז, ו resuspended ב H2O. טיהור DNA הופעל ב- 0.6% agarose ג'ל ולהקות דמיינו ידי אתידיום ברומיד מכתים עם השוואה 1 kb פלוס הסולם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: 4C טיטור תבנית עבור ההופכי PCR. טורי דילולים היו עשויים 4C תבניות, בשימוש תגובות PCR ההופכי. מוצרי ה-PCR היו לרוץ על 1.5% agarose ג'ל, דמיינו ידי אתידיום ברומיד מכתים לצד 1 kb פלוס הסולם. NTC מציין התגובה תבנית ללא שליטה. שימו לב עלייה correlative הגברה עם עלייה בריכוז תבנית. הגברה נציג זה נערך בכרומטין ביקע עם HindIII כמו RE1 ו- CviQI כמו RE2, רצפים פריימר המשמש עבור ההופכי הגברה PCR היו 5'-GATCAGGAGGGACTGGAACTTG/5-CCTCCCTTCACATCTTAGAATG. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: קביעת בתיווך qPCR מחזורי הגברה הדרושים כדי להגביר את תבנית עבור ההופכי PCR. 4C תבניות היו מוגבר בתגובות המכיל 1 x SYBR Green ו- 1 x ROX ב thermocycler בזמן אמת. קרינה פלואורסצנטית שיא היה נחוש, מספר מחזורים נדרש להגיע ¼ של שיא פלורסצנטיות חושבה. מספר מחזורים שימש כדי להגביר את התבנית 4C עבור ההופכי PCR. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6: Agarose בג'ל של מתעכל RE צג המציין מספיקים לעיכול. RE תקציר צג מוגבר של דנ א גנומי אנושי באמצעות תחל f: 5'-TCCTATCCCTGGTCTGTCTTAT r: 5'-CCACATTGGTCCTTCTAGTCTTC, טהור. 225 ng של צג היה מתעכל עם 15 CviQI U בתגובה 50 µL-25 ° C בלילה ולהפעיל ג'ל agarose 1.5% לצד 1 kb פלוס הסולם. להקות היו דמיינו אתידיום ברומיד מכתים. צג נימול הוא 2515 bp; צפוי פרגמנט הגדלים 132, 343, 488, 539 ו- 1013 bp. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7: נציג מסלול גנומית של כיסוי קריאה בתוך 5 kb של האזור ' viewpoint. קורא hg38 ממופים מטופח השתמשו BWA. הרוב המכריע של קריאות (פסגות כחול) ישר HindIII או CviQI אתרים סמוכים לאתרי HindIII, כצפוי. האזור ' viewpoint מסומן באדום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

אמצעי האחסון עבור 1 x
10 x להרחיב את מאגר תבנית ארוכה 1 2.5 ΜL
dNTPs (10 מ מ) 0.5 ΜL
פריימר לפנים 35 pmol
פריימר הפוכה 35 pmol
הרחב את תבנית ארוכה פולימראז (U 5/µL) 0.35 ΜL
ה-DNA
נוקלאז ללא מים כדי 25 µL

טבלה 1: תערובת התגובה PCR עבור ההגברה של תבנית 4C (שלב 11.1).

אמצעי האחסון עבור 1 x
10 x להרחיב את מאגר תבנית ארוכה 1 1.5 ΜL
dNTPs (10 מ מ) 0.3 ΜL
פריימר לפנים 21 pmol
פריימר הפוכה 21 pmol
100 x SYBR ירוק אני 0.15 ΜL
50 x ROX 0.3 ΜL
הרחב את תבנית ארוכה פולימראז (U 5/µL) 0.21 ΜL
ה-DNA 100 ng
נוקלאז ללא מים כדי 25 µL

טבלה 2: תערובת התגובה qPCR לקביעת מספר הגברה מחזורים עבור ההופכי PCR (שלב 11.3.1).

אמצעי האחסון עבור 1 x
10 x להרחיב את מאגר תבנית ארוכה 1 80 ΜL
dNTPs (10 מ מ) 16 ΜL
פריימר לפנים 1.12 nmol
פריימר הפוכה 1.12 nmol
הרחב את תבנית ארוכה פולימראז (U 5/µL) 11.2 ΜL
ה-DNA 3.2 µg
נוקלאז ללא מים כדי 800 µL

בטבלה 3. PCR התגובה התערובת הסופית הגברה PCR ההופכי של תבנית 4C (שלב 11.4).

אמצעי האחסון עבור 1 x
5 x מאגר Phusion HF 2 ΜL
dNTPs (10 מ מ) 0.2 ΜL
פריימר Miltiplexing 1.0 5 pmol
פריימר Miltiplexing 2.0 0.1 pmol
אינדקס פריימר 5 pmol
100 x SYBR ירוק אני 0.1 ΜL
50 x ROX 0.2 ΜL
Phusion פולימראז 0.1 ΜL
ה-DNA 2 ΜL
נוקלאז ללא מים כדי 10 µL

טבלה 4: qPCR תערובת התגובה לקביעת מספר הגברה מחזורים עבור קביעת רצף הספרייה במכינה (שלב 13.3 אינץ ').

אמצעי האחסון עבור 1 x
5 x מאגר Phusion HF 10 ΜL
dNTPs (10 מ מ) 1 ΜL
פריימר Miltiplexing 1.0 25 pmol
פריימר Miltiplexing 2.0 0.5 pmol
אינדקס פריימר 25 pmol
Phusion פולימראז 0.5 ΜL
ה-DNA 10 ΜL
נוקלאז ללא מים כדי 50 µL

טבלה 5: תערובת התגובה PCR עבור ההגברה של ספריות עבור קביעת רצף (שלב 13.4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

תוצאות 4C יש פוטנציאל לחשיפת אינטראקציות כרומטין לזיהוי רכיבי הרגולציה לא מוכרת ו/או היעד גנים חשובים בהקשר ביולוגי מסוים24,25,26. עם זאת, מכשולים טכניים עלולה להגביל את הנתונים המתקבלים ניסויים אלה. הטיה PCR הנובעות הגברה יתר של תבנית ב- 4 C פרוטוקולים סביר. פרוטוקול זה מטפל בנושא על ידי ניצול qPCR כדי לקבוע שמספר אופטימלי של הגברה מחזורי בצורה אובייקטיבית. בנוסף, הסרת רצפי פיתיון ממוצרים מוגבר הופכי PCR על ידי הגבלת digest יכול להקל את הזיהוי של אינטראקציות כרומטין משתי סיבות. קודם כל, זה מקטין את אורך בלתי-אינפורמטיבית (פיתיון) בסיסי זוגות מן החומר היה לסדרם. שנית, כתוצאה מכך, מגבירה את הסבירות קריאות יותר ייווצר מ רצפי מגוונות (מאפיין נדרש שהתקשרת הבסיס מדויק), ובכך יכול להיות ממופה רצפים אינטראקציה יותר אינפורמטיבי. פרוטוקולים אחרים דורשים איגום של ספריות רבות באמצעות פיתיונות שונים רצפים ו/או אנזימי הגבלה או מחייבים הגדלת ריכוז phiX של המדגם ברצף כדי לעקוף את הנושא אחידות רצף שהתקשרת הבסיס מדויק. שיטה זו מאפשרת דגימות מרובים עם אותו רצף פיתיון כדי להיות איחדו לתוך מסלול רצף יחיד ללא הכובש קיבולת רצף יקר עם עודף phiX.

קיבוע תא המחפשים לשלב בין טיפול אלטרנטיבי ונוחות צעדים המוקדם קריטי, אשר שניהם עשויים לדרוש אופטימיזציה עבור סוגי לתא מסוים פירוק. קיבוע לא מספיקות ייכשל לשמר את אנשי קשר ספציפיים בין אזור עניין שלה רצפים אינטראקציה, מניב נתונים ומתחמקות נשלט על ידי רעש. לעומת זאת, קיבוע יתר יקטן ליכולת של אנזימי הגבלה קליב כרומטין, וכתוצאה מכך פחות אינפורמטיבי מצדו אירועים. מקבע ריכוז וזמן הדגירה יכול להשתנות כדי למטב את המשתנה הזה. באופן דומה, פירוק תאים מספיקה מפחיתה את הגישה של אנזימי הגבלה כדי כרומטין, שוב להפחית את מספר אירועי מצדו אינפורמטיבי. בידיים שלנו, אנושי keratinocytes ראשי lysed בצורה היעילה ביותר באמצעות שילוב של דטרגנט ותנאים היפוטוניק. סוגי תאים אחרים עשויים לדרוש תנאים פירוק שונים, אשר יהיה חייב להיקבע מדעית. פירוק יעיל יכול להיות מזוהה על ידי מיקרוסקופ לצבוע אי-הכללה של שיטות כגון Trypan Blue מכתים.

מגבלה אחת של השיטה 4C היא כי התוצאות ניתן רק מייצגים ממוצע האוכלוסייה. עם אוכלוסיה הטרוגנית תא, זה יכול להיות קשה לקבוע אינטראקציות נכון לעומת הרעש עקב השתנות ביולוגי. אמנם השימוש קו תא או את המיון של תאים כדי לייצר אוכלוסיה הומוגנית התא הוא ניבא להפקת אותות ברורים, השתנות בין תאים בודדים הוא עדיין מקור אפשרי של רעש. התפתחויות אחרונות טכנולוגיות רצף תא בודד יש את היכולת להתגבר על בעיה זו. בנוסף, האימות של האוכלוסייה המבוססת על תוצאות 4C ניתן לבצע באמצעות שיטות כגון דיגיטלי droplet PCR או דגים כדי לקבוע אם תוצאות אלה באות לידי ביטוי ברמה תא בודד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי NIAMS (R01AR065523).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HindIII NEB R0104S
CviQI NEB R0639S
DNA oligonucleotide primers IDT To be designed by the reader
50 mL conical centrifuge tubes Fisher Scientific 06-443-19
1.7 mL microcentrifuge tubes MidSci AVSS1700
Phosphate buffered saline Thermo Fisher 14190-136
Formaldehyde, methanol free Electron Microscopy Sciences 15710
Nutator VWR 15172-203
Glycine JT Baker 4059-00
Benchtop centrifuge
Refrigerated microcentrifuge
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich ED2SS
20% SDS solution Sigma-Aldrich 05030
Trypan Blue Thermo Fisher 15250061
Glass slides Fisher Scientific 12-550-143
Cover slips VWR 16004-094
Light microscope
Triton X-100 Alfa Aesar A16046
Shaking heat block
2 M Tris-HCl Quality Biological 351-048-101
Proteinase K NEB P8107S
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1) Sigma-Aldrich P2069
Sodium acetate Sigma-Aldrich M5661
20 mg/mL glycogen Thermo Fisher R0561
Ethanol Fisher Scientific 04-355-223
Nuclease-free water Fisher Scientific MT-46-000-CM
qPCR cycler Thermo Fisher 4453536
qPCR plates Thermo Fisher 4309849
Thermocycler Thermo Fisher 4375786
PCR strip tubes MidSci AVSST-FL
1 M Magnesium chloride Quality Biological 351-033-721
Dithiothreotol Sigma-Aldrich 43815
Adenosine triphosphate Sigma-Aldrich A2383
T4 DNA Ligase NEB M0202S
Agarose Sigma-Aldrich A6013
RNase A Thermo Fisher EN0531
Qiaquick PCR purification kit Qiagen 28104
MinElute PCR Purification kit Qiagen 28004
Spectrophotometer
Expand Long Template PCR System Sigma-Aldrich 11681834001
dNTP mix Thermo Fisher R0191
SYBR Green I Sigma-Aldrich S9430
ROX BioRad 172-5858
Sodium chloride Sigma-Aldrich S5886
End-It DNA End-Repair Kit Lucigen ER0720
LigaFast Rapid DNA Ligation System Promega M8221
SYBR Safe Thermo Fisher S33102
Taq Polymerase NEB M0267S
UltraSieve Agarose IBI Scientific IB70054
Qiaquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dunham, I., et al. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  2. Hoffman, M. M., et al. Integrative annotation of chromatin elements from ENCODE data. Nucleic Acids Research. 41 (2), 827-841 (2013).
  3. Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. Capturing Chromosome Conformation. Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).
  4. Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. The long-range interaction landscape of gene promoters. Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).
  5. Li, G., et al. Extensive promoter-centered chromatin interactions provide a topological basis for transcription regulation. Cell. 148 (1-2), 84-98 (2012).
  6. Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).
  7. Zhao, Z., et al. Circular chromosome conformation capture (4C) uncovers extensive networks of epigenetically regulated intra- and interchromosomal interactions. Nature genetics. 38 (11), 1341-1347 (2006).
  8. Splinter, E., de Wit, E., van de Werken, H. J. G., Klous, P., de Laat, W. Determining long-range chromatin interactions for selected genomic sites using 4C-seq technology: From fixation to computation. Methods. 58 (3), 221-230 (2012).
  9. Van De Werken, H. J. G., et al. 4C technology: Protocols and data analysis. Methods in Enzymology. 513, Elsevier Inc. (2012).
  10. Brouwer, R. W. W., van den Hout, M. C. G. N., van IJcken, W. F. J., Soler, E., Stadhouders, R. Unbiased Interrogation of 3D Genome Topology Using Chromosome Conformation Capture Coupled to High-Throughput Sequencing (4C-Seq). Eukaryotic Transcriptional and Post-Transcriptional Gene Expression Regulation. , 199-220 (2017).
  11. Matelot, M., Noordermeer, D. Determination of High-Resolution 3D Chromatin Organization Using Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq). Polycomb Group Proteins: Methods and Protocols. , 223-241 (2016).
  12. Gheldof, N., Leleu, M., Noordermeer, D., Rougemont, J., Reymond, A. Detecting Long-Range Chromatin Interactions Using the Chromosome Conformation Capture Sequencing (4C-seq) Method. Gene Regulatory Networks: Methods and Protocols. , 211-225 (2012).
  13. Göndör, A., Rougier, C., Ohlsson, R. High-resolution circular chromosome conformation capture assay. Nature. 3 (2), 303-313 (2008).
  14. Hagège, H., et al. Quantitative analysis of chromosome conformation capture assays (3C-qPCR). Nature. 2 (7), 1722-1733 (2007).
  15. Anand, R. D., Sertil, O., Lowry, C. V. Restriction digestion monitors facilitate plasmid construction and PCR cloning. BioTechniques. 36 (6), 982-985 (2004).
  16. Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic acids research. 44 (W1), W3-W10 (2016).
  17. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).
  18. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  19. Walter, C., Schuetzmann, D., Rosenbauer, F., Dugas, M. Basic4Cseq: An R/Bioconductor package for analyzing 4C-seq data. Bioinformatics. 30 (22), 3268-3269 (2014).
  20. Raviram, R., et al. 4C-ker: A Method to Reproducibly Identify Genome-Wide Interactions Captured by 4C-Seq Experiments. PLoS Computational Biology. 12 (3), (2016).
  21. Klein, F. A., Pakozdi, T., Anders, S., Ghavi-helm, Y., Furlong, E. E. M., Huber, W. FourCSeq: analysis of 4C sequencing data. Bioinformatics. 31 (19), 3085-3091 (2015).
  22. Williams, R. L. Jr, et al. fourSig a method for determining chromosomal interactions in 4C-Seq data. Nucleic Acids Research. 42 (8), (2014).
  23. McLean, C. Y., et al. GREAT improves functional interpretation of cis-regulatory regions. Nature Biotechnology. 28 (5), 495-501 (2010).
  24. Stolzenburg, L. R., et al. Regulatory dynamics of 11p13 suggest a role for EHF in modifying CF lung disease severity. Nucleic Acids Research. 45 (15), 8773-8784 (2017).
  25. Meddens, C. A., et al. Systematic analysis of chromatin interactions at disease associated loci links novel candidate genes to inflammatory bowel disease. Genome Biology. 17 (1), 1-15 (2016).
  26. Yeung, J., et al. Transcription factor activity rhythms and tissue-specific chromatin interactions explain circadian gene expression across organs. Genome research. , 207787 (2017).

Tags

גנטיקה בעיה 140 כרומטין לולאה מוצרי טיפוח טבעיים רגולציה רצף פיתיון אנזים הגבלה פירוק
זיהוי תפוקה גבוהה של ג'ין רצפים תקינה באמצעות רצף הדור הבא של כרומוזום מעגלי קונפורמציה ללכוד (4C-seq)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brettmann, E. A., Oh, I. Y., de… More

Brettmann, E. A., Oh, I. Y., de Guzman Strong, C. High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq). J. Vis. Exp. (140), e58030, doi:10.3791/58030 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter