Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

تحديد تسلسل الجينات التنظيمية استخدام تسلسل الجيل المقبل من تكيف كروموسوم دائرية الفائق التقاط (ج 4-seq)

Published: October 5, 2018 doi: 10.3791/58030
Automatic Translation
1, 1, 1
1Division of Dermatology, Center for Pharmacogenomics, Center for the Study of Itch, Department of Medicine, Washington University School of Medicine

Summary

تحديد التفاعلات الفيزيائية بين الجينات والعناصر التنظيمية الصعبة ولكن قد تيسرت بفضل أساليب التقاط تكيف كروموسوم. هذا التعديل على البروتوكول ج 4-seq يخفف التحيز PCR بالتقليل من التضخيم المفرط لقوالب بكر ويزيد من مابابيليتي لما يلي: عن طريق إدراج خطوة هضم إنزيم التقييد بإضافة.

Abstract

تحديد العناصر التنظيمية لجين هدف معين يشكل تحديا تقنيا كبيرا نظراً للتغير في أحجام العناصر التنظيمية لجينات مستهدفة لتحديد المواقع والتأثير. وقد تم إحراز بعض التقدم مع bioinformatic التنبؤ بوجود والوظيفة لتعديلات جينية الدانية المقترنة بالتعبير الجيني تم تنشيطه باستخدام مواقع الربط عامل النسخ المصانة. الكروماتين تكيف التقاط الدراسات قد أحدثت ثورة في قدرتنا على اكتشاف اتصالات الكروماتين المادية بين متواليات وحتى داخل جينوم أكمله. التقاط تكيف الكروماتين دائرية مقترنة مع الجيل التالي تسلسل (ج 4-seq)، على وجه الخصوص، يهدف إلى اكتشاف التفاعلات المادية الكروماتين كل شيء ممكن لتسلسل معين من الفائدة (وجهة نظر)، مثل جين المستهدف أو هيئة تنظيمية محسن. ج 4-seq الاستراتيجيات الحالية مباشرة تسلسل من داخل وجهة نظر ولكن تتطلب العديد ووجهات النظر المتنوعة تكون متسلسلة في نفس الوقت لتجنب التحديات التقنية الموحدة قاعدة الدعوة (التصوير) مع منصات تسلسل الجيل القادم. قد لا يكون هذا الحجم من التجارب العملية للعديد من المختبرات. هنا، نحن تقرير نهج تعديل بروتوكول ج 4-seq الذي يشتمل على خلاصة إنزيم التقييد إضافي والخطوات التضخيم المستندة إلى قبكر التي تم تصميمها لتسهيل التقاط أكبر من ما يلي تسلسل المتنوعة والتقليل من احتمالات بكر التحيز، على التوالي. لدينا طريقة ج 4 المعدلة قابلة لمختبر البيولوجيا الجزيئية القياسية لتقييم بنية الكروماتين.

Introduction

وقد تيسر تحديد العناصر التنظيمية للتعبير الجيني في المشروع موسوعة عناصر الحمض النووي (ترميز) شاملة المشروح نشاط وظيفي ل 80% من الجينوم البشري1،2. تحديد المواقع في فيفو النسخ عامل ملزم وفرط دناسي، وجينيه هيستون والحمض النووي مثلايشن التعديلات في أنواع الخلايا الفردية مهدت الطريق للتحليلات الوظيفية للمرشح التنظيمية العناصر للتعبير الجيني المستهدف. المسلحة مع هذه النتائج، أننا نواجه التحدي المتمثل في تحديد الترابط الوظيفي بين العناصر التنظيمية والجينات. على وجه التحديد، ما هي العلاقة بين جينات هدف معين ولها enhancer(s)؟ أسلوب الالتقاط (3 ج) المطابقة الكروماتين يتصدى مباشرة لهذا السؤال بتحديد التفاعلات الوظيفية، المادية، ومن المحتمل بين منطقة الاهتمام والمرشح التفاعل تسلسل من خلال أحداث تم التقاطها في الكروماتين الثابتة3 . كما ازداد فهمنا للتفاعلات الكروماتين، ولكن الواضح أن التحقيق المكاني المرشح المختارة غير كافية لتوفير فهم كامل للتفاعلات بين الجينات-محسن. على سبيل المثال، ترميز استخدمت الأسلوب نسخة كربونية (5 ج) القبض على تكيف الصبغية الفائق لدراسة جزء صغير من الجينوم البشري (1%، التجريبية مجموعة من 44 المكاني) وذكرت الترابط المعقد المكاني. الجينات والقدرة على مع التفاعلات التي تم تحديدها في المتوسط مختلف الشركاء المتفاعلة 2 – 4، كان كثير منها مئات كيلوبس بعيداً في الفضاء الخطي4. علاوة على ذلك، من لي، وآخرون. يستخدم "تحليل التفاعل الكروماتين" بالزوجي-نهاية "تسلسل العلامة" (شيا-PET) لتحليل التفاعلات مروج كل الجينوم وتبين أن 65% مواقع الربط الثاني رنا بوليميراز متورطون في التفاعلات الكروماتين. بعض هذه التفاعلات أدت إلى مجمعات كبيرة ومتعددة الجينات التي تمتد مئات كيلوبس المسافة الجينوم والتي تتضمن، في المتوسط، 8-9 الجينات كل5. معا، هذه النتائج تسلط الضوء على الحاجة إلى أساليب كل الجينوم غير منحازة لاستجواب التفاعلات الكروماتين. يتم استعراض بعض هذه الأساليب في شميت وآخرون. 6.

أساليب أكثر حداثة للدراسات التقاط تكيف الكروماتين يقترن بالجيل التالي التسلسل (مرحبا-ج وج 4-seq) تمكين اكتشاف تسلسل غير معروف التفاعل مع منطقة لفائدة6. على وجه التحديد، وضع التقاط تكيف كروموسوم التعميم مع الجيل التالي تسلسل (ج 4-seq) لتحديد مواضع التفاعل مع تسلسل اهتمامها طريقة غير متحيزة7 بتسلسل الحمض النووي من القبض على الكروماتين الدانية منطقة اهتمام في الفضاء ثلاثي الأبعاد. باختصار، هو ثابت الكروماتين للحفاظ على تفاعلاته DNA البروتين الأصلي، المشقوق مع إنزيم التقييد، ومتصلة في وقت لاحق تحت ظروف مخفف لالتقاط بيولوجيا ذات الصلة "التشابك" من التفاعل المكاني (الشكل 1). يتم عكس الروابط عبر إزالة البروتين، مما ترك الحمض النووي متاح للانقسام إضافية مع إنزيم التقييد ثانية. ربط نهائي ينشئ دوائر أصغر من التفاعل المكاني. كبسولة تفجير لتسلسل الفائدة ثم المستخدمة لإنشاء إحدى مكتبات تضخيم تسلسلات غير معروف من الشظايا سيركولاريزيد، تليها المصب تسلسل الجيل القادم.

البروتوكول المعروضة هنا، الذي يركز على إعداد عينة، يجعل من التعديلات الرئيسية اثنين إلى القائمة ج 4-seq أساليب8،9،10،،من1112. أولاً، فإنه يستخدم أسلوب المستندة إلى qPCR تجريبيا تحديد العدد الأمثل للتضخيم دورات لخطوات إعداد مكتبة ج 4-seq ومما يخفف احتمال التحيز PCR النابعة من التضخيم المفرط للمكتبات. ثانيا، يستخدم خطوة هضم قيود إضافية في محاولة للحد من توحيد تسلسل المعروفة "الطعم" الذي يعوق الدعوة قاعدة دقيقة بتسلسل الصك، ويعظم تسلسل فريدة من نوعها، غنية بالمعلومات ومن ثم، في كل عملية قراءة. بروتوكولات أخرى الالتفاف حول هذه المسألة عن طريق تجميع العديد من المكتبات seq ج 4-8 (12-15) مع تسلسل الطعم مختلفة و/أو تقييد مواقع، وحدة تخزين من التجارب التي قد لا تكون قابلة للتحقيق بمختبرات أخرى. تسمح التعديلات المعروضة هنا عدد قليل من التجارب، عينات، و/أو يعيد فهرسة وتجميع في ممر واحد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-إنزيم تقييد التحديد

  1. تحديد منطقة للفائدة (على سبيل المثال.، المروج الجينات، وتعدد الأشكال النوكليوتيدات واحدة (SNP)، ومحسن) والحصول على تسلسل الحمض النووي من مستودعات مثل المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية (نكبي).
  2. تحديد إنزيمات تقييد المرشح (REs) لهضم إنزيم التقييد الأولى (RE1) التي لا تقطع داخل تسلسل الفائدة، التي تنتج نهايات لزجة (تيرميني الحمض النووي مع يتدلى) بعد إعادة الهضم، وهي لا تحول دون أنشطتها مثلايشن البد.
    ملاحظة: يتحدد القرار البيانات RE1. إنزيم بتسلسل اعتراف 6 زوج قاعدي (bp) ينتج، في المتوسط، الشظايا حوالي 4 كيلوبس (kb) في الطول، بينما تنتج إنزيم مع تسلسل اعتراف بي بي 4 أجزاء حوالي 250 شركة بريتيش بتروليوم في الطول، والسماح لمزيد من الدقة تحديد تسلسل التفاعل.
  3. حدد RE1 من المرشح الإنزيمات المحددة في الخطوة 1.2 التي تنتج "وجهة نظر" تقييد جزء على الأقل من 500 شركة بريتيش بتروليوم طويلة التي تشمل منطقة الفائدة، أو بدلاً من ذلك، منطقة مجاورة.
    ملاحظة: يجب أن تكون قابلة للتمهيدي إنزيم تحديد تصميم (راجع الخطوة 2).
  4. لهضم الثانية، التعرف إنزيم التقييد (RE2) مع تسلسل اعتراف بي بي 4 التي تنتج نهايات لزجة (تيرميني الحمض النووي مع يتدلى) بعد إعادة الهضم، ونشاطها لا تحول دون واسطة مثلايشن البد، وأن التخفيضات في تقييد الشظايا التي تم إنشاؤها بواسطة RE1 لإنتاج 250 – 500 bp طعم جزء (الشكل 1).
    ملاحظة: يجب أن تكون قابلة للتمهيدي إنزيم تحديد تصميم (راجع الخطوة 2).

2-تصميم و "اختبار كبسولة تفجير" ل qPCR بكر معكوس وكفاءة الهضم

  1. استخدام أداة تصميم التمهيدي مثل Primer3 (http://primer3.ut.ee) لتصميم كبسولة تفجير العكسية التي تتجه إلى الخارج إلى نهايات الجزء الطعم (أي.، التمهيدي 5 '"عكس"التمهيدي، مكملة حبلا زائد، بينما التمهيدي 3' " للأمام "التمهيدي، مكملة حبلا ناقص) وقريبة من تسلسل المواقع تقييد ممكن لتقليل تضخيم الطعم غير مفيدة وتحقيق أقصى قدر من الكفاءة بكر (الشكل 2A).
    ملاحظة: ينبغي توقع أن يكون الحد الأدنى من التضخيم غير محددة من الحمض النووي من السيليكون في التنبؤات PCR وينبغي أن لا محاذاة في أماكن أخرى في الجينوم باستثناء الهدف المقصود بها مع أكثر من 16/18 هوية9. محولات التسلسل لم تدمج الإشعال PCR معكوس، موقع الربط التمهيدي أكثر مرونة من غيرها من أساليب إعداد ج 4؛ على النحو الأمثل ينبغي أن يصلب كبسولة تفجير داخل 50 بي بي نهاية الموقع التقييد المقابلة.
    1. تأكيد خصوصية معكوس PCR الإشعال بالتضخيم باستخدام الحمض النووي المنقي (جدنا) كقالب.
    2. كبسولة تفجير الأمثل ينبغي أن تسفر عن عدد قليل من المنتجات عند استخدام جدنا كقالب (انظر الخطوة 11.2 لوصف النواتج المتوقعة ج 4). في حالة حدوث التضخيم الكبير من جدنا، تصميم كبسولة تفجير جديد. إذا كان يتم تحديد لا مجموعات التمهيدي مقبولة، العودة إلى الخطوة 1 وحدد طعم جديد بتحديد جديد تقييد الإنزيمات.
  2. تصميم كبسولة تفجير qPCR لتضخيم الشظايا النوكليوتيدات 70-200 (nt) في الطول لرصد كفاءة الهضم التقييد (الشكل 2).
    1. تصميم زوج واحد من الإشعال تضخيم عبر كل موقع التقييد (المحدد في الخطوة 1) التي تحدد تسلسل الطعم. تصميم كبسولة تفجير لكلا RE1 (راجع الخطوة 6.5.6) ومواقع RE2 (راجع الخطوة 9، 2).
    2. تصميم مجموعة من الإشعال التي يسهب في منطقة لا تحتوي على مواقع أما إنزيم التقييد كعنصر تحكم تطبيع (الحمض النووي غير المصقول) ل RE1 و RE2 (انظر أيضا خطوة 6.5.6).

3-مجموعة من الخلايا

  1. باستخدام أسلوب المناسب لثقافة النسيج أو الخلية، الحصول على تعليق خلية واحدة. بيليه الخلايا لمدة 5 دقائق في 200 x زوتجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 500 ميليلتر من 1 × الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) كل 107 الخلايا.

4-فورمالدهايد العابرة للربط من الخلايا للحفاظ على التفاعلات الكروماتين

  1. كل 107 الخلايا، إضافة مل 9.5 من المجهر الإلكتروني 1% (م)-الصف فورمالدهايد (الميثانول الحرة) في برنامج تلفزيوني واحتضانها، بينما هبط على الكرسي الهزاز (أو ما شابه)، لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT، 18 – 22 درجة مئوية).
    ملاحظة: شروط التثبيت قد يكون الأمثل لكل نوع من الخلايا. وأفادت السابقة الأعمال المنشورة في خلايا الفأر يؤدي هذا التثبيت الأمثل على الأقل 40% القراءات المعينة المحاذاة إلى كروموسوم يحتوي على وجهة نظر9 على افتراض منطقة غير تيلوميريك كروموسوم حجم متوسط.
  2. نقل أنابيب رد فعل الجليد وإضافة المثلج م 1 جليكاين إلى تركيز نهائي من 0.125 M (1.425 مل) إخماد رد فعل كروسلينكينج. مزيج من انعكاس لطيف.
  3. الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 200 س ز، 4 درجة مئوية، وإزالة جميع المادة طافية بعناية. تخزين بيليه الخلية في-80 درجة مئوية أو الشروع فورا في تحلل الخلية.

5. تحلل الخلية

  1. ريسوسبيند بيليه الخلية من 4.3 خطوة في 500 ميليلتر من 5 ملم حمض الإيثيلين (يدتا) لغسل. الطرد المركزي في 200 x ز لمدة 5 دقائق في تجاهل الرايت المادة طافية.
  2. ريسوسبيند بيليه الخلية في ميليلتر 125 ملم 5 يدتا مع 0.5% الصوديوم دوديسيل كبريتات (الحزب الديمقراطي الصربي) ومثبطات البروتياز x 1، مثل علامة x 100 كوكتيل يحتوي على أنتيباين 5 ملغ/مل تشيموستاتين 10 ملغ/مل، ليوبيبتين 10 ملغ/مل و 10 ملغ/مل بيبستاتين أ
    ملاحظة: قد يكون تركيز المنظفات الأمثل لكل نوع من الخلايا. سيؤدي إلى تركيزات مواد التنظيف غير كافية في تحلل الخلية غير مكتملة، تاركاً الكروماتين إليها إنزيمات التقييد. إذا كان تقييد الهضم منخفضة باستمرار في الخطوة 6.5.6 وتم تأكيد نشاط الإنزيم، قد يلزم المنظفات إضافية. زيادة تركيز الحزب الديمقراطي الصربي بزيادات مقدارها 0.1%.
  3. احتضان تعليق خلية في الثلج لمدة 10 دقائق.
    ملاحظة: للخلايا الكيراتينيه البشرية الأولية، أنجز تحلل الأمثل استخدام حضانة 10 دقيقة عند 65 درجة مئوية تليها حضانة بين عشية وضحاها 37 درجة مئوية في كتلة تدفئة تهتز بالانفعالات (900 دورة في الدقيقة).
  4. تأكد من أن تحلل الخلية كاملة.
    1. 6 مزيج ميليلتر من الخلايا مع ميليلتر 6 تريبان الأزرق على الشريحة والغطاء مع ساترة. عرض تحت مجهر.
      ملاحظة: عند تحلل ناجحة، داخل الخلايا ينبغي الأزرق خلايا الأمم المتحدة سوف تظهر والأبيض.
    2. إذا تحلل الخلية يبدو غير كاف، بيليه الخلايا في 200 x ز لمدة 5 دقائق وحفظ المادة طافية. ريسوسبيند بيليه، وكرر الخطوات 5، 2 – 5.4 و/أو بدلاً من ذلك باحتضان مختلف درجات الحرارة (انظر الملاحظة في الخطوة 5، 3).
    3. ضم بيليه إعادة مع المادة طافية المحفوظة والمضي قدما.
      ملاحظة: الفحص البصري ليس ضمانا لتحلل كافية. وينبغي تحديد كفاءة الهضم موضوعيا كما هو الحال في الخطوة 6.5.6.

6-أول تقييد الهضم

  1. إضافة ميكروليتر 30 10 × إنزيم التقييد المخزن المؤقت (المحدد بواسطة الشركة المصنعة) وميكروليتر 27% 20 X-100 تريتون (النهائي 1.8 ٪) إلى التعليق من 5.4 خطوة. إحضار الحجم الإجمالي إلى 300 ميليلتر مع H2o.
    ملاحظة: تكوين المخزن المؤقت إنزيم التقييد سيتوقف على إعادة اختياره في الخطوة 1.
  2. إزالة ميكروليتر 15 الكوة "عسر الهضم السيطرة" ومخزن في 4 درجات مئوية.
  3. إضافة 200 U RE1 إلى خليط رد فعل المتبقية واحتضان بين عشية وضحاها في درجة الحرارة المناسبة للانزيم في كتلة تدفئة تهتز بالانفعالات (900 دورة في الدقيقة). في اليوم التالي، إضافة 200 إضافية RE1 يو، وتستمر في الحضانة بين عشية وضحاها.
  4. إزالة من 15 ميكروليتر الكوة تحكم "ديجيستيد" وتخزينها في 4 درجات مئوية.
  5. تحديد كفاءة الهضم:
    1. إضافة 82.5 ميليلتر من 10 ملم تريس-HCl درجة الحموضة 7.5 إلى 15 عينة ميليلتر من الخطوات 6.2 و 6.4. إضافة 2.5 ميليلتر من البروتيناز ك (20 ملغ/مل) واحتضانها ح 1 في 65 درجة مئوية.
    2. إضافة 100 ميليلتر من الفينول كلوروفورم ومزج بقوة بانعكاس لإزالة التلوث بالبروتين المتبقية. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق، 16,100 س ز في درجة حرارة الغرفة.
    3. نقل المرحلة المائية إلى أنبوب جديد. إضافة 6.66 ميليلتر من م 3 صوديوم اسيتات pH 5.2، 1 ميليلتر من الجليكوجين 20 ملغ/مل، و 300 ميليلتر من 100% إيثانول (EtOH). المزيج بلطف بانعكاس ومكان في-80 درجة مئوية ح 1.
    4. أجهزة الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 16,100 س ز في 4 درجات مئوية. إزالة المادة طافية، إضافة 500 ميليلتر من 70% EtOH، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 16,100 س ز في الرايت
    5. إزالة المادة طافية وجاف بيليه في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 2 ريسوسبيند بيليه في 50 ميليلتر من ح خالية نوكلاس2o.
    6. تحديد كفاءة هضم قبكر13،14 باستخدام الأسلوب ∆∆Ct. استخدام التمهيدي تعيين المرافقة لا موقع تقييد (راجع الخطوة 2.2.2) كعنصر تحكم التطبيع. المضي قدما إذا كانت كفاءة الهضم > 85%. وبخلاف ذلك، بيليه الخلايا وكرر الخطوات 5، 2 – 6.5 أو إهمال في الحضانة عند 65 درجة مئوية في "الخطوة 5، 3".

7-أول عملية ربط

  1. الحرارة--إلغاء تنشيط إنزيم التقييد التي تفرخ 20 دقيقة عند 65 درجة مئوية. بدلاً من ذلك، إذا لم يتمكن الإنزيم الحرارة غير نشط، استخراج الفينول كلوروفورم ويعجل الإيثانول العينة.
    ملاحظة: ارتفاع درجات الحرارة المنظمة أوصت لبعض إنزيمات التقييد تؤذي البروتينات في الكروماتين وقد يؤثر هذا سلبا على نوعية العينة. بالإضافة إلى ذلك، استخراج الفينول: كلوروفورم ليست مثالية، كما أنه يؤدي إلى فقدان عينة.
  2. نقل إلى أنبوب مخروطي 50 مل وإضافة 6 مل ح خالية نوكلاس2س، ميليلتر 700 10 × ليجاسى المخزن المؤقت (660 مم تريس-HCl درجة الحموضة 7.5، كلوريد المغنزيوم 50 مم (MgCl2)، ديثيوثريتول 10 ملم (DTT)، 10 ملم الادينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP))، و 50 ش T4 الحمض النووي ليجاسى. المزيج بلطف بدوامات واحتضان بين عشية وضحاها في 16 درجة مئوية.
  3. إزالة من قاسمة 100 ميكروليتر من العينة ك '' ربط عنصر التحكم ''''.
  4. تحديد كفاءة عملية ربط:
    1. إضافة 2.5 ميليلتر من "البروتيناز ك" (20 ملغ/مل) واحتضان ح 1 في 65 درجة مئوية.
    2. إضافة 100 ميليلتر من الفينول كلوروفورم والمزيج بقوة بعكس. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق، 16,100 س ز في الرايت
    3. نقل المرحلة المائية إلى أنبوب جديد. إضافة 6.66 ميليلتر من 3 أمتار الصوديوم خلات pH 5.2، 1 ميليلتر من الجليكوجين، وميليلتر 300 100% EtOH. المزيج بلطف بانعكاس ومكان في-80 درجة مئوية حوالي 1 ساعة.
    4. أجهزة الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 16,100 س ز في 4 درجات مئوية. إزالة المادة طافية، إضافة 500 ميليلتر من 70% EtOH، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 16,100 س ز في 4 درجات مئوية.
    5. إزالة المادة طافية وجاف بيليه في درجة حرارة الغرفة. ريسوسبيند بيليه في 20 ميليلتر من الماء وتحميلها 0.6% [اغروس] هلام بجوار "عناصر الهضم" من 6.5 خطوة.
      ملاحظة: يجب أن تظهر عينة الواصلة جيدا كشريط ضيق نسبيا، وارتفاع وزن الجزيئي (الشكل 3).
    6. إذا كانت الربط كافية، تابع مع الخطوة 8. خلاف ذلك، إضافة ATP الطازجة (تركيز النهائي 1 مم) وليجاسي الجديدة؛ تبني بين عشية وضحاها في 16 درجة مئوية، ثم كرر الخطوات من 7.3 – 7.4.

8-عكس العابرة للربط وعزل الكروماتين

  1. إضافة 15 ميليلتر من "البروتيناز ك" (20 ملغ/مل) واحتضان بين عشية وضحاها في 65 درجة مئوية لعكس متقاطعة.
  2. إضافة 30 ميليلتر من رناسي A (10 ملغ/مل) واحتضان 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  3. إضافة 7 مل من الفينول كلوروفورم والمزيج بقوة بانعكاس. أجهزة الطرد المركزي 15 دقيقة، 3,300 س ز في الرايت
  4. نقل المرحلة المائية إلى أنبوب 50 مل جديدة وإضافة 7.5 مل من خالية من نوكلياسي ح2س (لإضعاف القيمة الموجودة في المخزن المؤقت ليجاسى، والتي لولاها لرواسب مع الحمض النووي)، 1 مل من م 3 الصوديوم خلات الأس الهيدروجيني 5، 6، 7 ميليلتر من الجليكوجين (20 ملغ/مل) ، ومل 35% 100 EtOH. خلط واحتضان في-80 درجة مئوية ح 1.
  5. أجهزة الطرد المركزي 20 دقيقة، 3,900 س ز في 4 درجات مئوية. إزالة المادة طافية (بيليه قد يصعب رؤية)، يغسل بيليه مع 10 مل من المثلج 70% EtOH، وأجهزة الطرد المركزي 15 دقيقة، 3,300 س ز في 4 درجات مئوية.
  6. إزالة المادة طافية والجاف بإيجاز بيليه في حل الرايت بيليه في 150 ميليلتر من 10 ملم تريس-HCl درجة الحموضة 7.5 عند 37 درجة مئوية. تخزين في-20 درجة مئوية، أو أن تواصل مع الخطوة 9.

9-الثاني التقييد الهضم: التشذيب الدوائر

ملاحظة: هذه الخطوة بإنشاء دوائر أصغر لتقليل العدد المفرط لأصغر الملتقطة الشظايا بسبب التحيز PCR في خطوات التضخيم المتلقين للمعلومات.

  1. إضافة إلى العينة من 8.6 خطوة, 50 ميليلتر من 10 × إنزيم التقييد المخزن المؤقت (المحدد بواسطة الشركة المصنعة)، 300 ميليلتر من خالية نوكلاس ح2س و 50 إنزيم التقييد يو RE2. تبني بين عشية وضحاها في درجة الحرارة المناسبة للانزيم الذي تم اختياره.
  2. إزالة من قاسمة 15 ميليلتر من العينة "التحكم في الهضم". تحديد كفاءة الهضم كما هو موضح في "الخطوة 6، 5".

10-ربط الثاني لتنقية الحمض النووي

  1. إلغاء تنشيط إنزيم التقييد كما أوصت به الشركة المصنعة. إذا كان لا يمكن الإنزيم غير نشط الحرارة، إزالة الإنزيم باستخدام مجموعة أدوات تنقية يستند إلى العمود.
    ملاحظة: كما يؤدي هذا إلى فقدان عينة، تنقية العمود ليست مثالية.
  2. نقل العينة إلى أنبوب 50 مل وإضافة مل 12.1 خالية من نوكلياسي ح2س و 1.4 مل من 10 × ربط المخزن المؤقت (660 مم تريس-HCl، درجة الحموضة 7.5؛ 50 مم مجكل2؛ 10 مم DTT مم 10 ATP) 100 "يو T4 الحمض النووي" ليجاسى. تبني بين عشية وضحاها في 16 درجة مئوية.
  3. إضافة ميليلتر 467 من 3 أمتار الصوديوم خلات pH 5.6، 233 ميليلتر خالية من نوكلياسي ح2س، 7 ميليلتر الجليكوجين (20 ملغ/مل)، و 35 مل 100% EtOH. يخلط جيدا واحتضان في-80 درجة مئوية ح 1.
  4. أجهزة الطرد المركزي 45 دقيقة، 3,900 س ز في 4 درجات مئوية. إزالة المادة طافية، أضف 10 مل من البرد 70% EtOH، وأجهزة الطرد المركزي 15 دقيقة، 3,300 س ز في 4 درجات مئوية.
  5. إزالة المادة طافية والجاف بإيجاز بيليه في درجة حرارة الغرفة. إضافة 150 ميليلتر من 10 ملم تريس-HCl pH 7.5 واحتضان في 37 درجة مئوية لإذابة بيليه.
  6. تنقية العينات مع السليكا المستندة إلى عمود PCR تنقية عدة، اتباع إرشادات الشركة المصنعة. استخدام العمود 1 لكل 3 × 106 خلايا، استناداً إلى العدد الأولى للخلايا. الوت الأعمدة مع 50 ميليلتر من 10 ملم تريس-HCl، درجة الحموضة 7.5 وتجمع العينات.
  7. قياس تركيز فلوريميتري أو كانت تستخدم امتصاص في 260 نيوتن متر. جيم 4 القالب جاهز الآن لعكس PCR. تخزين في-20 درجة مئوية، أو انتقل مباشرة إلى الخطوة 11.

11-بكر تضخيم تسلسلات التفاعل غير معروف ببكر معكوس

  1. تحديد نطاق التضخيم الخطي عن طريق إجراء PCR استخدام قالب تخفيف من 12.5، 25 و 50 و 100 نانوغرام ج 4 قالب. إذا رغبت في ذلك، تضخيم من جدنا بالتوازي مباشرة مقارنة المنتجات بغية تحديد التضخيم غير محددة. تشغيل PCR ردود فعل استخدام تمسخ أولى في 94 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة؛ 30 دورات تتألف من خطوة تمسخ في 94 درجة مئوية لمدة 10 ق وخطوة انلينغ في 55 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، وخطوة تمديد في 68 درجة مئوية لمدة 3 دقائق؛ وتمديد نهائي في 68 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  2. فصل 15 ميليلتر لكل منتج بكر على 1.5% [اغروس] هلام لتأكيد التضخيم الخطي وتقييم نوعية القالب (الشكل 4). التضخيم من قالب ج 4 ينبغي أن تسفر عن النطاقات المنفصلة في تركيزات منخفضة من الحمض النووي وتشهير تركيزات أعلى. وجود اللطاخة يشير إلى زيادة تعقيد ليجيشنز ج 4 تضخيم.
  3. عندما راضية عن نوعية وكمية المنتج بكر العكسية المتولدة، إعداد qPCR لتحديد العدد الأمثل لدورات لاستخدام للتضخيم:
    1. قم بإعداد ردود الفعل التي تحتوي على صبغات سيبر وروكس استخدام خليط رد الفعل في الجدول 2. ما لم يكن التضخيم غير الخطية بتركيزات عالية في "الخطوة 11-2"، استخدام 100 نانوغرام من القالب كل رد فعل.
      ملاحظة: إضافة روكس تسهل تطبيع إشارة الفلورسنت من بئر ودورة لدورة.
    2. تشغيل ردود فعل PCR استخدام تمسخ أولى في 94 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة؛ دورات 40 تتألف من خطوة تمسخ في 94 درجة مئوية لمدة 10 ق وخطوة انلينغ في 55 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، وخطوة تمديد في 68 درجة مئوية لمدة 3 دقائق؛ وتمديد نهائي في 68 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    3. تحديد الأسفار الذروة (نقطة النهاية) من ردود الفعل باستخدام الأرض التضخيم. تحديد الدورة التي تصل ردود الفعل إلى 25 في المائة من ذروة الفلورية (الشكل 5).
      ملاحظة: هذا هو عدد الدورات التي سيتم استخدامها لتضخيم المكتبات ج 4 (راجع الخطوة 11، 4).
  4. إعداد معكوس بكر كما هو الحال في الجدول 3 تضخيم تسلسلات غير معروف متصلة بالطعم من القالب ج 4. وتقسم إلى ردود الفعل 16 من 50 ميليلتر قبل تشغيل. تشغيل PCR ردود الفعل باستخدام تمسخ أولية في 94 ° ج 2 دقيقة ودورات تتألف من خطوة تمسخ في 94 درجة مئوية لمدة 10 ق، الصلب خطوة في 55 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، واستخدام خطوة تمديد في 68 درجة مئوية للحد الأدنى 3 عدد دورات تحديد في الخطوة 11.3.3.
  5. جمع وتجميع ردود الفعل. تنقية استخدام PCR المستندة إلى عمود والسليكا تنقية عدة. استخدام الأعمدة 2 على الأقل لكل 16 ردود الفعل. تجميع المنتجات بكر المنقي.
  6. تحديد كمية العينة والنقاء التي كانت. غلة نموذجي ما بين 10 و 20 ميكروغرام مع A260/A280 ~ 1.85. إذا كانت نسب الاستيعاب دون المستوى الأمثل، إعادة تنقية منعا للمشاكل أثناء تسلسل.
  7. تقييم الطابع المعقد لمكتبة بفصل 300 نانوغرام منتج بكر المنقي على 1.5% [اغروس] هلام.
    ملاحظة: المنتج تضخيم يجب أن يشابه أن من 11.2 خطوة.

12-ثالثا تقييد الهضم: تقليم قبالة "بيت تسلسل"

ملاحظة: هذه الخطوة إزالة تسلسل الطعم غير مفيدة من منتجات PCR معكوس لتعظيم مفيدة تسلسل تم التقاطها في خطوات تسلسل المتلقين للمعلومات. لمراقبة كفاءة هضم، يهضم "رصد دايجست"15 بالتوازي مع استخدام مكافئ تركيز الحمض النووي والأنزيمات. إذا RE1 و RE2 غير متوافقين الهضم متزامنة، على سبيل المثال، بسبب درجات الحرارة المختلفة الحضانة المثلى أو المخازن المؤقتة للرد، يجب أن يتم هذا كخلاصة متسلسلة (هذه ليست مثالية).

  1. الحصول على جهاز هضم RE واختبار الهضم في رد فعل 50 ميليلتر.
    ملاحظة: هذا هو جزيء دسدنا (على سبيل المثال، بلازميد، أمبليكون بكر أو الحمض النووي التركيبية) يحتوي على (ق رد). والشرط الوحيد أنه ينبغي أن يكون من السهل التمييز بين قطع من رصد تقطيعه على [اغروس] هلام. إعادة تحسين مراقبة كتلة الإنزيم تركيز وإذا لزم الأمر.
  2. ملخص 1 ميكروغرام لتنقية المنتج بكر معكوس من 11.6 خطوة، وفي موازاة ذلك، رصد إعادة من 12.1 خطوة.
    ملاحظة: الحمض النووي وتركيز الإنزيم، فضلا عن وقت الحضانة، يجب أن تكون نفس خلاصة التجارب في 12.1 خطوة لكل منتج PCR معكوس والنبذ مراقب. قم بضبط حجم رد الفعل حسب الحاجة.
  3. تشغيل هضمها إعادة العرض على [اغروس] هلام التركيز المناسب للشظايا المتوقعة. الهضم يعتبر كافياً عند < 10% من الحمض النووي ما زال غير المصقول (الشكل 6).
  4. تنقية المنتج بكر معكوس هضمها على السليكا المستندة إلى عمود طقم تنقية الحمض النووي. وإذا لزم النبذ متسلسلة، كرر الخطوات من 12.1 – 12.4 مع الإنزيم الثاني.

13-إعداد تسلسل مكتبة

  1. سد محولات متوافقة مع الجيل القادم كل تسلسل منهاج العمل.
    1. تصميم المحولات لكل RE1 و RE2، بعد الصلب أوليجوس، كل محول الطاقة المتجددة قد تراكم على وجه واحد منها.
      ملاحظة: على سبيل المثال، إذا تم استخدام هيندييي، المحول ملدنة ينبغي أن تحتوي على "أجكت" عبء 5 ' فوسفوريلاتيد. وبدلاً من ذلك، إذا تم استخدام معيار تي-عبء محولات، نهاية لإصلاح والذيل بالمكتبة قبل ربط المحول.
    2. يصلب أوليجوس RE كل محول. ريسوسبيند أوليجوس في المخزن المؤقت انلينغ (10 ملم تريس، درجة الحموضة 7.5، 50 مم كلوريد الصوديوم (NaCl)، 1 مم يدتا) وتخلط بكميات اكويمولار إلى 50 ميكرومتر، الحرارة إلى 95 درجة مئوية، والسماح لتبرد ببطء إلى 25 درجة مئوية.
    3. القيام برد فعل عملية ربط. يخلط مكتبة ج 4 إعادة هضمها مجموع 5 إلى 10 إضعاف مولى الزائدة من محولات الملدن (الخطوة 13.1.2؛ نسبة 50/50 لكل محول الطاقة المتجددة المستخدمة) في 1 × ليجاسى المخزن المؤقت وإضافة 6U الحمض النووي ليجاسى. احتضان وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
    4. قم بإزالة محولات الزائدة بتنقية استخدام حجم منخفض-شطف عمود القائم على السليكا عدة.
  2. قم بتحديد حجم.
    ملاحظة: اختيار حجم يمكن أيضا إجراء باستخدام مجموعة أدوات تنظيف المستندة إلى حبة وينصح حتى بعد تصفية العمود.
    1. ويلقي 2% [اغروس] هلام استخدام [اغروس] عالية الدقة، مشيراً إلى وصمة عار غير الأشعة فوق البنفسجية قبل صب. تأكد من أن يتم استبدال أي المياه المفقودة بسبب التبخر أثناء التسخين تزن قارورة أو زجاجة قبل وبعد التسخين وإضافة الماء لاسترداد الكتلة المفقودة.
    2. تشغيل المكتبات محول متصلة على الهلام، ترك الممرات الفارغة بين العينات.
    3. الرسوم على الشرائح جل تناظر bp حجم نطاق 150 إلى 1 كيلو بايت باستخدام مشرط نظيف أو شفرة حلاقة.
    4. تنقية المكتبات من استخدام مجموعة أدوات استخراج هلام الهلام. للتقليل من التحيز GC في الانتعاش من الحمض النووي، حل جل الشرائح في درجة حرارة الغرفة بالتناوب.
  3. تحديد عدد دورات للتضخيم PCR قبل قبكر باستخدام خليط رد الفعل في الجدول 4. تشغيل PCR ردود الفعل باستخدام تمسخ أولية عند 98 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة و 40 دورات تتكون من تمسخ الخطوة عند 98 درجة مئوية لمدة 10 ق وخطوة انلينغ في 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، وخطوة تمديد في 72 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
    ملاحظة: هو دورة الأسفار التي يصل إلى 25 في المائة من الحد الأقصى لعدد الدورات التي سيتم استخدامها لتضخيم المكتبة، كما هو الحال في الخطوة 11.3.
  4. تضخيم المكتبات باستخدام خليط رد فعل في الجدول 5. تشغيل PCR ردود الفعل باستخدام تمسخ أولية عند 98 درجة مئوية 2 دقيقة ودورات تتألف من خطوة تمسخ عند 98 درجة مئوية لمدة 10 ق وخطوة انلينغ في 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، وخطوة تمديد في 72 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. تم تحديد عدد دورات التضخيم لاستخدامها لكل مكتبة في 13.3 خطوة.
  5. تنقية تضخيم المكتبات باستخدام مجموعة عمود القائم على السليكا حجم شطف منخفضة.

14-تسلسل وتحليل تسلسل البيانات

  1. تحديد تركيزات تضخيم المكتبات باستخدام الإنزيم فلوريميتريك. تمييع المكتبات للتركيز المناسب للتسلسل (الاختيار مع خدمة التسلسل أو الأساسية لهذه التوصية).
  2. تحديد نوعية المكتبات باستخدام منصة تحليل حمض النووي موائع جزيئية.
    ملاحظة: ينبغي أن تعكس الشخصية حجم المكتبة التي ينظر إليها في جل اختيار الحجم في 13.2 خطوة، وتركيز العينة يحدد في هذه الخطوة التي ستستخدم للتسلسل.
  3. تجمع فهرسة المكتبات للحصول على ما يلي: على الأقل 3 مليون (على الأقل 50 بي بي قراءة؛ وواحدة [1 × 50] أو نهاية الاقتران [2 × 50]) كل عينة. مكتبة عالية الجودة يتطلب على الأقل 1 مليون تعيين يقرأ9، ولكن سيكون هناك بعض التناقص أثناء التعيين. على سبيل المثال، يمكن أن تستوعب منبرا تسلسل أن ينتج حوالي 150 مليون يقرأ كل حارة عينات تصل إلى 50 في ممر واحد.

15-تحليل البيانات التسلسل

  1. ديمولتيبليكس البيانات باستخدام تسلسل الرقم القياسي لتعيين على ما يلي للعينات المناسبة الخاصة بهم.
    ملاحظة: اعتماداً على معرفتهم، المستخدمين قد إجراء التحليلات الحسابية المتلقين للمعلومات من ملفات تسلسل FASTA/فستق خام باستخدام واجهة سطر الأوامر الأساسية، أو بدلاً من ذلك، سهل الاستعمال، والمستندة إلى ويب غالاكسي المستخدم الرسومية الواجهة (GUI)16 .
  2. تقليم تسلسل محول وأي تسلسل الطعم الناشئة عن عدم اكتمال إعادة الهضم في الخطوة 12، على سبيل المثال، باستخدام "مجموعة الأدوات" السريعة-X (http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/).
  3. خريطة ديمولتيبليكسيد على ما يلي لجينوم الاهتمام المناسب (مثلاً.، mm10 التسخن، hg19) استخدام راصفة ويلر بوروز (التحالف)17 أو غيرها من البرامج المحاذاة أسفر عن سام ملفات الإخراج. إذا لزم الأمر، تحويل ملفات سام لسوق بكارا للأسلحة عن طريق سامتولس18 (راجع الخطوة مقاس 15.4 بوصة).
  4. استخدام خط أنابيب تحليل ج 4-seq مثل Basic4Cseq19ج 4-كير20،21من فوركسيق أو فورسيج22 لتحليل البيانات وتحديد التفاعلات.
    ملاحظة: أن تحليل البيانات وتقييم نوعية منها ينبغي أن يتم وفقا لدليل مرجعي للمجموعة من البرامج المختارة. إنشاء حزم ملفات الإخراج سرير يصرح. باختصار، Basic4CSeq19 يستخدم ملف سام إدخال (15.3 خطوة) لتصور التفاعلات (txt، tiff، والسرير، وملفات الإخراج شعر مستعار) وتقييم نوعية البيانات استناداً إلى المعايير المبينة في van de ويركين et al. 9 ج 4-كير20 (الإدخال قلص فاستق، الخطوة 15.2) وفوركسيق21 (أم الإدخال، 15.3 الخطوة) تحديد التفاعلات التفاضلية بين الشروط. فورسيج22 (سام الإدخال) كما يعرف التفاعلات الهامة ويعطي الأولوية لتلك التي من المحتمل أن تكون استنساخه. يمكن أيضا استخدام أدوات مثل الجينوم التنظيمية الإثراء من الشروح أداة (الكبرى)23، أو الاندماج مع مجموعات بيانات ترميز التنبؤ بالوظيفة البيولوجية للتفاعلات التي اكتشفها ج 4-ما يليها

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الكيراتينيه البشرية الأولية كانت معزولة من 2 – 3 فوريسكينس حديثي الولادة المهملة، والمجمعة، ومثقف في كسفم تكملة مع 30 ميكروغرام/مل البقري النخامية استخراج، 0.26 نانوغرام/مليلتر الماشوب البشري البشرة عامل النمو، وكلوريد الكالسيوم 0.09 مم (كاكل2 ) عند 37 درجة مئوية، 5% ثاني أكسيد الكربون. تم تقسيم الخلايا إلى قوارير اثنين، وقارورة واحدة كانت متباينة بإضافة كاكل2 إلى نهائي تركز 1.2 مم 72 h. 107 خلايا كل من الانتشار وميزت keratinocyte السكان كانت ثابتة في 1% فورمالدهايد لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. كل على حدة، كانت تزرع الخلايا K562 في ربمي تكملة مع 10% مصل بقرى الجنين عند 37 درجة مئوية، 5% ثاني أكسيد الكربون. 107 خلايا ثابتة في 1% فورمالدهايد لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

تم تفكيك الخلايا، وهضمها مع هنديي الكروماتين الثابتة ومتصلة كما هو موضح أعلاه. تم عكس متقاطعة، والحمض النووي هو تنقية وهضمها مع كفيقي. متصلة واستخدامه كالقالب لعكس [بكر] تضخيم الحمض النووي. تم الإشعال المستخدمة: 5 '--جاتكاجاججاكتجاكتج/5'--ككتكككتكاكاتكتاجاتج. 1 ميكروغرام لتنقية المنتج بكر معكوس كان يهضم بين عشية وضحاها مع كفيقي بالتوازي مع 225 الحرس الوطني لإعادة هضم مراقب وتنقيته من العمود. تنقية الحمض النووي كان ثم يهضم بين عشية وضحاها مع هنديي بالتوازي مع 125 الحرس الوطني لإعادة هضم مراقب وتنقيته من العمود. 250 نانوغرام المنقي يهضم مزدوجة منتج PCR معكوس كان يستخدم لإعداد مكتبة. بإيجاز، أصلحت النهايات عبر التحويلات إلى 5 '--فوسفوريلاتيد وينتهي بلانت والعمود-تنقية الحمض النووي اللاحقة. ينتهي بالذيل 20 دقيقة في 72 درجة مئوية في رد فعل 50 ميليلتر مع 1 "يو بوليميراز" polymerase و 200 ميكرومتر داتب وتنقيته العمود. متوافق مع تسلسل مكتبة الإعدادية محولات كانت متصلة بنسبة 10:1 (محول: الحمض النووي) باستخدام الحمض النووي T4 ليجاسى في 30 رد فعل ميليلتر في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة والحمض النووي العمود-تنقية. تم تشغيل المكتبات على 2% [اغروس] هلام، قطعت شرائح جل من 120 تم تنقيته bp إلى أعلى سلم لإزالة المحولات، والمكتبات. تم تقييم pg 200 لكل مكتبة في 10 ردود فعل qPCR ميليلتر تحتوي على كبسولة تفجير الفهرسة لتحديد دورات التضخيم بكر الأمثل. تم تضخيمها المكتبات لإضافة الأرقام القياسية لاستخدام عدد دورات يحددها qPCR والتسلسل في HiSeq2500 للحصول على ما يلي: 1 × 50.

فيما يلي نص ديمولتيبليكسيد وقلص. أولاً، تم إزالة محولات التسلسل. وفي وقت لاحق، كان قلص التسلسل ابتداء من أول كل كتاب إلى الموقع قيد. وهذا يمكن رسم خرائط لمنتجات PCR العكسية التي كانت لا يهضم تماما قبل إعداد المكتبة. الأهم من ذلك، بما في ذلك التسلسل بين موقع الربط التمهيدي والموقع قيد يمنع التعيين من غير تضخيم تحديداً منتج PCR. يقرأ المشذبة تم تعيينها إلى hg38 باستخدام التحالف. يبين الشكل 7 يقرأ رسم الخرائط في المنطقة المحيطة بوجهة نظر.

Figure 1
رقم 1: التخطيطي لسير العمل ج 4-seq. الكروماتين تصميمهما للحفاظ على اتصالات البروتين-الحمض النووي، وهضمها مع RE1، ومتصلة للارتباط المكاني المتفاعلة. يتم عكس متقاطعة، والحمض النووي هو يهضم مع RE2 ومتصلة. تتضخم تسلسلات التفاعل غير معروف استخدام الإشعال التي تربط منطقة الفائدة، ومنتجات PCR يتم هضمها مع RE1 و RE2 تقليم متواليات المعروفة. يستخدم تضخيم الحمض النووي لتسلسل غير معروف في تسلسل مكتبة الإعدادية، التي هي متصلة المحولات والمكتبة من تضخيم بكر ومتسلسل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: مخططات لتصاميم التمهيدي. مواقع ملزمة (A) لعكس [بكر] كبسولة تفجير. كبسولة تفجير تتجه "إلى الخارج" (أي. التمهيدي 5 'كتاب"عكس"، مكملة حبلا زائد، بينما التمهيدي 3' أول كتاب "الأمام"، مكملة حبلا ناقص) وربط ضمن 50 شركة بريتيش بتروليوم لكل موقع التقييد (المشار إليها بالأحمر تظليل). (ب) ربط مواقع للإشعال qPCR لتحديد كفاءة هضم إنزيم التقييد. زوج واحد التمهيدي للوقائ كل موقع إنزيم التقييد. مجموعة التمهيدي تحكم يستفيض تسلسل لا يحتوي على موقع لأي إنزيم ويستخدم لتطبيع القيم المقطعية لإدخال الحمض النووي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: [اغروس] هلام التفريد لتقييم كفاءة عملية ربط ليهضم RE1 الكروماتين- تعامل مع بروتيناز ك عينات غير المصقول ويهضم هنديي، والواصلة وساخنة على عكس متقاطعة، الفينول: كلوروفورم المستخرجة، EtOH سرع، وحراكه في ح2"سين تنقية الحمض النووي" تم تشغيلها على 0.6% [اغروس] هلام والعصابات التي تصور بها اثيديوم بروميد تلطيخ بالمقارنة إلى 1 كيلو بايت بالإضافة إلى سلم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4:4 قالب المعايرة معكوس PCR. تخفيف المسلسل كانت مصنوعة من قوالب ج 4 والمستخدمة في ردود الفعل PCR معكوس. تم تشغيل على 1.5% [اغروس] هلام منتجات PCR وتصور طريق اثيديوم بروميد تلطيخ جنبا إلى جنب مع 1 كيلو بايت بالإضافة إلى سلم. المجلس الوطني الانتقالي يدل رد فعل لا-قالب عنصر التحكم. ملاحظة إلى زيادة ستتحقق في التضخيم مع زيادة في تركيز القالب. وأجرى هذا التضخيم الممثل في الكروماتين المشقوق مع هنديي ك RE1 وكفيقي ك RE2، ومتواليات التمهيدي تستخدم لعكس التضخيم PCR 5 '--جاتكاجاججاكتجاكتج/5'--ككتكككتكاكاتكتاجاتج. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: قبكر بوساطة تحديد دورات التضخيم بحاجة إلى تضخيم قالب لعكس PCR. قوالب ج 4 تم تضخيمه في ردود الفعل التي تحتوي على 1 × "الأخضر سيبر" و 1 x ROX في ثيرموسيكلير في الوقت الحقيقي. مصممة fluorescence الذروة، وتم حساب عدد الدورات اللازمة للوصول إلى ربع الأسفار الذروة. استخدمت هذا العدد من الدورات لتضخيم القالب ج 4 معكوس PCR. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
رقم 6: [اغروس] هلام التفريد ليهضم إعادة رصد تشير إلى الهضم كافية. إعادة هضم يضخم من الحمض النووي الجينوم البشري باستخدام أجهزة الإشعال واو: 5 '--تككتاتكككتجتكتجتكتات و r: 5'--ككاكاتجتككتكتاجتكتك مراقبة وتنقيته. 225 يهضم مع 15 يو كفيقي في رد فعل 50 ميليلتر في 25 درجة مئوية بين عشية وضحاها الحرس الوطني لمراقبة وتشغيل على 1.5% [اغروس] هلام جنبا إلى جنب مع 1 كيلو بايت بالإضافة إلى سلم. وقد تصور العصابات مع اثيديوم بروميد تلطيخ. مراقب غير المصقول هو bp 2515؛ المتوقعة هي أحجام يفتت 132، 343، 488، 539، وهناك 1013 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 7
رقم 7: المسار الجينوم الممثل قراءة التغطية داخل 5 كيلو بايت من وجهة نظر المنطقة. يقرأ استخدام hg38 المشذبة والمعينة للتحالف. غالبية ما يلي (قمم الأزرق) محاذاة في مواقع هنديي أو كفيقي المجاورة لمواقع هنديي، كما هو متوقع. يتم تمييز منطقة وجهة باللون الأحمر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

وحدة التخزين ل 1 x
10 x توسيع المنطقة العازلة قالب طويل 1 ميليلتر 2.5
دنتبس (10 مم) 0.5 ميليلتر
التمهيدي إلى الأمام بمول 35
عكس التمهيدي بمول 35
قم بتوسيع قالب طويل بوليميراز (يو 5/ميليلتر) ميليلتر 0.35
الحمض النووي
المياه خالية من نوكلياسي إلى 25 ميليلتر

الجدول 1: بكر الخليط رد فعل لتضخيم قالب ج 4 (11.1 الخطوة).

وحدة التخزين ل 1 x
10 x توسيع المنطقة العازلة قالب طويل 1 1.5 ميليلتر
دنتبس (10 مم) ميليلتر 0.3
التمهيدي إلى الأمام بمول 21
عكس التمهيدي بمول 21
100 x سيبر الأخضر أنا ميليلتر 0.15
50 x ROX ميليلتر 0.3
قم بتوسيع قالب طويل بوليميراز (يو 5/ميليلتر) ميليلتر 0.21
الحمض النووي 100 نانوغرام
المياه خالية من نوكلياسي إلى 25 ميليلتر

الجدول 2: دورات qPCR رد فعل خليط لتحديد عدد من التضخيم معكوس بكر (الخطوة 11.3.1).

وحدة التخزين ل 1 x
10 x توسيع المنطقة العازلة قالب طويل 1 ميليلتر 80
دنتبس (10 مم) 16 ميليلتر
التمهيدي إلى الأمام نمول 1.12
عكس التمهيدي نمول 1.12
قم بتوسيع قالب طويل بوليميراز (يو 5/ميليلتر) 11.2 ميليلتر
الحمض النووي ميكروغرام 3.2
المياه خالية من نوكلاس إلى 800 ميليلتر

الجدول 3. بكر الخليط رد فعل للتضخيم PCR معكوس النهائي من القالب ج 4 (11.4 الخطوة).

وحدة التخزين ل 1 x
5 x "التردد فوسيون" المخزن المؤقت 2 ميليلتر
دنتبس (10 مم) ميليلتر 0.2
ميلتيبليكسينج التمهيدي 1.0 بمول 5
ميلتيبليكسينج التمهيدي 2.0 بمول 0.1
الفهرس التمهيدي بمول 5
100 x سيبر الأخضر أنا ميليلتر 0.1
50 x ROX ميليلتر 0.2
بوليميراز فوسيون ميليلتر 0.1
الحمض النووي 2 ميليلتر
المياه خالية من نوكلاس إلى 10 ميليلتر

الجدول 4: دورات qPCR رد فعل خليط لتحديد عدد من التضخيم لتسلسل مكتبة الإعدادية (الخطوة 13.3 بوصة).

وحدة التخزين ل 1 x
5 x "التردد فوسيون" المخزن المؤقت 10 ميليلتر
دنتبس (10 مم) 1 ميليلتر
ميلتيبليكسينج التمهيدي 1.0 بمول 25
ميلتيبليكسينج التمهيدي 2.0 بمول 0.5
الفهرس التمهيدي بمول 25
بوليميراز فوسيون 0.5 ميليلتر
الحمض النووي 10 ميليلتر
المياه خالية من نوكلاس إلى 50 ميليلتر

الجدول 5: بكر الخليط رد فعل لتضخيم المكتبات للتسلسل (الخطوة 13.4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

نتائج ج 4 لديها القدرة على الكشف عن التفاعلات الكروماتين يمكنه التعرف على العناصر التنظيمية لم تكن معروفة سابقا و/أو الجينات المستهدفة التي تعتبر مهمة في25،24،سياق البيولوجي محددة26. ومع ذلك، قد تحد من عقبات فنية البيانات المستقاة من هذه التجارب. ومن المرجح التحيز PCR النابعة من التضخيم المفرط للقالب في البروتوكولات ج 4. هذا البروتوكول يعالج هذه المسألة باستخدام قبكر لتحديد العدد الأمثل للتضخيم دورات بطريقة موضوعية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن إزالة تسلسل الطعم من تضخيم منتجات PCR معكوس من خلاصة القيد تيسير تحديد التفاعلات الكروماتين لسببين. أولاً، أنه يقلل طول زوج قاعدي غير مفيدة (الطعم) من المواد التي تكون متسلسلة. ثانيا، ونتيجة لذلك فإنه يزيد من احتمال التي سيتم إنشاء ما يلي المزيد من سلاسل متنوعة (خاصية المطلوبة لمكالمات قاعدة دقيقة) وهكذا يمكن تعيين تسلسل التفاعل المفيد أكثر. بروتوكولات أخرى تتطلب تجميع العديد من المكتبات باستخدام تسلسلات مختلفة الطعم و/أو إنزيمات التقييد أو تتطلب زيادة تركيز العينة متسلسل للالتفاف حول قضية التوحيد تسلسل استدعاء قاعدة دقيقة فيكس. يسمح هذا الأسلوب مع نفس تسلسل الطعم تجميع في حارة تسلسل واحد دون الاحتلال تسلسل قيمة القدرة الزائدة في عينات متعددة.

تثبيت الخلية وتحلل هي خطوات مبكرة الحرجة، التي قد تتطلب التحسين لأنواع معينة من الخلايا. سوف تفشل التثبيت غير كافية للحفاظ على اتصالات محددة بين منطقة الاهتمام ولها تسلسل المتفاعلة، تسفر عن بيانات مبهمة يهيمن الضجيج. وفي المقابل، ستنخفض التثبيت الإفراط قدرة إنزيمات التقييد على تنشق الكروماتين، أدى إلى أحداث ربط المعلومات أقل. ويمكن تغيير تركيز مثبت ووقت الحضانة لتحسين هذا المتغير. وبالمثل، تحلل الخلية غير كافية يقلل من فرص حصولها إنزيمات التقييد على الكروماتين، خفض عدد الأحداث ربط المعلومات مرة أخرى. في أيدينا، تفكيك الخلايا الكيراتينيه الأولية البشرية الأكثر فعالية باستخدام تركيبة من الشروط ناقص التوتر والمنظفات. وقد تتطلب أنواع الخلايا الأخرى تحلل مختلف الظروف، سيكون لها يحدد تجريبيا. يمكن تحديد كفاءة تحلل أساليب الإقصاء صبغ مجهرية مثل تريبان الأزرق تلطيخ.

واحد الحد من الأسلوب ج 4 أن النتائج التي يمكن أن تمثل فقط بمتوسط سكان. سكان خلية غير متجانسة، يمكن أن يكون من الصعب تحديد التفاعلات الحقيقية مقابل الضوضاء بسبب التنوع البيولوجي. في حين من المتوقع استخدام خط خلية أو فرز الخلايا لإنتاج عدد سكان خلية متجانسة لتوليد إشارات أكثر وضوحاً، تقلب بين الخلايا الفردية لا تزال مصدرا ممكناً للضوضاء. التطورات الحديثة في تكنولوجيا التسلسل خلية واحدة لديها القدرة على التغلب على هذه المشكلة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تنفيذ المصادقة المستندة إلى السكان ج 4 نتائج استخدام أساليب مثل التجميعية الرقمية PCR أو الأسماك لتحديد إذا كانت هذه النتائج تنعكس على مستوى خلية واحدة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل نيامس (R01AR065523).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HindIII NEB R0104S
CviQI NEB R0639S
DNA oligonucleotide primers IDT To be designed by the reader
50 mL conical centrifuge tubes Fisher Scientific 06-443-19
1.7 mL microcentrifuge tubes MidSci AVSS1700
Phosphate buffered saline Thermo Fisher 14190-136
Formaldehyde, methanol free Electron Microscopy Sciences 15710
Nutator VWR 15172-203
Glycine JT Baker 4059-00
Benchtop centrifuge
Refrigerated microcentrifuge
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich ED2SS
20% SDS solution Sigma-Aldrich 05030
Trypan Blue Thermo Fisher 15250061
Glass slides Fisher Scientific 12-550-143
Cover slips VWR 16004-094
Light microscope
Triton X-100 Alfa Aesar A16046
Shaking heat block
2 M Tris-HCl Quality Biological 351-048-101
Proteinase K NEB P8107S
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1) Sigma-Aldrich P2069
Sodium acetate Sigma-Aldrich M5661
20 mg/mL glycogen Thermo Fisher R0561
Ethanol Fisher Scientific 04-355-223
Nuclease-free water Fisher Scientific MT-46-000-CM
qPCR cycler Thermo Fisher 4453536
qPCR plates Thermo Fisher 4309849
Thermocycler Thermo Fisher 4375786
PCR strip tubes MidSci AVSST-FL
1 M Magnesium chloride Quality Biological 351-033-721
Dithiothreotol Sigma-Aldrich 43815
Adenosine triphosphate Sigma-Aldrich A2383
T4 DNA Ligase NEB M0202S
Agarose Sigma-Aldrich A6013
RNase A Thermo Fisher EN0531
Qiaquick PCR purification kit Qiagen 28104
MinElute PCR Purification kit Qiagen 28004
Spectrophotometer
Expand Long Template PCR System Sigma-Aldrich 11681834001
dNTP mix Thermo Fisher R0191
SYBR Green I Sigma-Aldrich S9430
ROX BioRad 172-5858
Sodium chloride Sigma-Aldrich S5886
End-It DNA End-Repair Kit Lucigen ER0720
LigaFast Rapid DNA Ligation System Promega M8221
SYBR Safe Thermo Fisher S33102
Taq Polymerase NEB M0267S
UltraSieve Agarose IBI Scientific IB70054
Qiaquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dunham, I., et al. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  2. Hoffman, M. M., et al. Integrative annotation of chromatin elements from ENCODE data. Nucleic Acids Research. 41 (2), 827-841 (2013).
  3. Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. Capturing Chromosome Conformation. Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).
  4. Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. The long-range interaction landscape of gene promoters. Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).
  5. Li, G., et al. Extensive promoter-centered chromatin interactions provide a topological basis for transcription regulation. Cell. 148 (1-2), 84-98 (2012).
  6. Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).
  7. Zhao, Z., et al. Circular chromosome conformation capture (4C) uncovers extensive networks of epigenetically regulated intra- and interchromosomal interactions. Nature genetics. 38 (11), 1341-1347 (2006).
  8. Splinter, E., de Wit, E., van de Werken, H. J. G., Klous, P., de Laat, W. Determining long-range chromatin interactions for selected genomic sites using 4C-seq technology: From fixation to computation. Methods. 58 (3), 221-230 (2012).
  9. Van De Werken, H. J. G., et al. 4C technology: Protocols and data analysis. Methods in Enzymology. 513, Elsevier Inc. (2012).
  10. Brouwer, R. W. W., van den Hout, M. C. G. N., van IJcken, W. F. J., Soler, E., Stadhouders, R. Unbiased Interrogation of 3D Genome Topology Using Chromosome Conformation Capture Coupled to High-Throughput Sequencing (4C-Seq). Eukaryotic Transcriptional and Post-Transcriptional Gene Expression Regulation. , 199-220 (2017).
  11. Matelot, M., Noordermeer, D. Determination of High-Resolution 3D Chromatin Organization Using Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq). Polycomb Group Proteins: Methods and Protocols. , 223-241 (2016).
  12. Gheldof, N., Leleu, M., Noordermeer, D., Rougemont, J., Reymond, A. Detecting Long-Range Chromatin Interactions Using the Chromosome Conformation Capture Sequencing (4C-seq) Method. Gene Regulatory Networks: Methods and Protocols. , 211-225 (2012).
  13. Göndör, A., Rougier, C., Ohlsson, R. High-resolution circular chromosome conformation capture assay. Nature. 3 (2), 303-313 (2008).
  14. Hagège, H., et al. Quantitative analysis of chromosome conformation capture assays (3C-qPCR). Nature. 2 (7), 1722-1733 (2007).
  15. Anand, R. D., Sertil, O., Lowry, C. V. Restriction digestion monitors facilitate plasmid construction and PCR cloning. BioTechniques. 36 (6), 982-985 (2004).
  16. Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic acids research. 44 (W1), W3-W10 (2016).
  17. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).
  18. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  19. Walter, C., Schuetzmann, D., Rosenbauer, F., Dugas, M. Basic4Cseq: An R/Bioconductor package for analyzing 4C-seq data. Bioinformatics. 30 (22), 3268-3269 (2014).
  20. Raviram, R., et al. 4C-ker: A Method to Reproducibly Identify Genome-Wide Interactions Captured by 4C-Seq Experiments. PLoS Computational Biology. 12 (3), (2016).
  21. Klein, F. A., Pakozdi, T., Anders, S., Ghavi-helm, Y., Furlong, E. E. M., Huber, W. FourCSeq: analysis of 4C sequencing data. Bioinformatics. 31 (19), 3085-3091 (2015).
  22. Williams, R. L. Jr, et al. fourSig a method for determining chromosomal interactions in 4C-Seq data. Nucleic Acids Research. 42 (8), (2014).
  23. McLean, C. Y., et al. GREAT improves functional interpretation of cis-regulatory regions. Nature Biotechnology. 28 (5), 495-501 (2010).
  24. Stolzenburg, L. R., et al. Regulatory dynamics of 11p13 suggest a role for EHF in modifying CF lung disease severity. Nucleic Acids Research. 45 (15), 8773-8784 (2017).
  25. Meddens, C. A., et al. Systematic analysis of chromatin interactions at disease associated loci links novel candidate genes to inflammatory bowel disease. Genome Biology. 17 (1), 1-15 (2016).
  26. Yeung, J., et al. Transcription factor activity rhythms and tissue-specific chromatin interactions explain circadian gene expression across organs. Genome research. , 207787 (2017).

Tags

علم الوراثة، العدد 140، الكروماتين، حلقات، معززات، الطعم التنظيمية، وتتابعها، وإنزيم التقييد، تحلل
تحديد تسلسل الجينات التنظيمية استخدام تسلسل الجيل المقبل من تكيف كروموسوم دائرية الفائق التقاط (ج 4-seq)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brettmann, E. A., Oh, I. Y., de… More

Brettmann, E. A., Oh, I. Y., de Guzman Strong, C. High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq). J. Vis. Exp. (140), e58030, doi:10.3791/58030 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter