Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Hög genomströmning identifiering av reglerande gensekvenser som använder nästa generations sekvensering av cirkulär kromosom konformation fånga (4C-seq)

Published: October 5, 2018 doi: 10.3791/58030
Automatic Translation
1, 1, 1
1Division of Dermatology, Center for Pharmacogenomics, Center for the Study of Itch, Department of Medicine, Washington University School of Medicine

Summary

Identifiering av fysiska interaktioner mellan gener och reglerande element är utmanande men har underlättats med kromosomen konformation fånga metoder. Denna ändring av protokollet 4C-seq mildrar PCR partiskhet genom att minimera överdriven amplifiering av PCR-mallar och maximerar mappability av läser genom att införliva ett tillägg restriktionsenzym digest steg.

Abstract

Identifiering av reglerande element för en given målgenen utgör en betydande teknisk utmaning på grund av variationen i positionering och effekt storlekar av reglerande element till en målgenen. Vissa framsteg har gjorts med bioinformatiska förutsägelse av förekomsten och funktion av proximala epigenetiska förändringar associerade med aktiverade genuttryck med bevarade transkription faktorn bindningsställen. Kromatin konformation fånga studier har revolutionerat vår förmåga att upptäcka fysiska kromatin kontakter mellan sekvenser och även inom en hela arvsmassa. Cirkulär kromatin konformation capture tillsammans med nästa generations sekvensering (4C-seq), i synnerhet syftar till att upptäcka alla möjliga fysiska kromatin interaktioner för en viss sekvens av intresse (synvinkel), såsom en målgenen eller en reglerande förstärkare. Nuvarande 4C-seq strategier direkt sekvens ur inom utsiktspunkten men kräver många och skiftande synpunkter till sekvenseras samtidigt för att undvika de tekniska utmaningarna med enhetlig bas ringer (imaging) med nästa generations sekvensering plattformar. Denna volym av experiment kan inte vara praktiskt för många laboratorier. Här rapporterar vi en annorlunda metod i 4C-seq-protokollet som omfattar både en ytterligare restriktionsenzym digest och qPCR-baserade förstärkning steg som är utformade för att underlätta en större fångst av olika sekvens läsningar och minska risken för PCR bias, respektive. Vår modifierade 4C metod är mottagliga för standard molekylärbiologi labbet för att bedöma kromatin arkitekturen.

Introduction

Identifiering av reglerande element för genuttryck har underlättats av det encyklopedi av DNA element (koda) projekt som utförligt kommenterade funktionell aktivitet för 80% av det mänskliga genom1,2. Identifiering av platserna för i vivo transkription faktorn bindande, DNaseI överkänslighet, och epigenetiska Histon och DNA metylering ändringar i enskilda celltyper banade väg för de funktionella analyserna av kandidat föreskrivande element för målet genuttryck. Beväpnad med dessa fynd, står vi inför utmaningen att fastställa den funktionella sammankopplingen mellan reglerande element och gener. Specifikt, vad är förhållandet mellan en viss målgenen och dess enhancer(s)? Metoden kromatin konformation capture (3C) behandlar direkt denna fråga av identifierande fysiska och sannolikt funktionell, interaktioner mellan en region av intresse och kandidat interagerar sekvenser genom fångade händelserna i fasta kromatin3 . Som vår förståelse av kromatin interaktioner har ökat, men är det klart att utredningen av förvalda kandidat loci är otillräckliga för att ge en fullständig förståelse av gen-enhancer interaktioner. Till exempel koda används metoden hög genomströmning kromosomala konformation fånga carbon copy (5C) för att undersöka en liten del av det mänskliga genomet (1%, pilot uppsättning 44 loci) och rapporterade komplexa sammankoppling av loci. Gener och förstärkare med identifierade interaktioner i genomsnitt 2 – 4 olika samverkande partners, varav många var hundratals kilobases bort i linjärt rum4. Ytterligare, Li et al. används kromatin interaktion analys av Paired-End Tag sekvensering (ChIA-PET) att analysera helgenom-promotorn interaktioner och fann att 65% av RNA-polymeras II bindningsställen involverades i kromatin interaktioner. Några av dessa interaktioner resulterade i stora, flera gen komplex som spänner över hundratals kilobases av genomisk avstånd och innehåller, i genomsnitt 8-9 gener varje5. Tillsammans, belysa dessa fynd behovet av opartisk helgenom-metoder för förhör kromatin interaktioner. Några av dessa metoder granskas i Schmitt et al. 6.

Nyare metoder för kromatin konformation fånga studier tillsammans med nästa generations sekvensering (Hi-C och 4C-seq) Aktivera upptäckten av okända sekvenser interagerar med ett område av intresse6. Specifikt, cirkulär kromosom konformation capture med nästa generations sekvensering (4C-seq) har utvecklats för att identifiera loci interagerar med en sekvens av intresse i ett opartiskt sätt7 genom att sekvensera DNA från fångade kromatin proximalt i regionen av intresse i 3D-rymden. Kromatin är kort, fast att bevara dess infödda protein-DNA interaktioner, klyvs med ett restriktionsenzym och därefter sammanskrivna utspädd villkor att fånga biologiskt relevanta ”trassel” samverkande loci (figur 1). De arga länkarna återförs för att ta bort proteinet, vilket lämnar DNA som är tillgängliga för ytterligare klyvning med ett andra restriktionsenzym. En sista ligering genererar mindre cirklar samverkande loci. Grundfärger till sekvensen av intresse används sedan för att generera ett förstärkt bibliotek av okända sekvenser från circularized fragment, följt av nedströms nästa generations sekvensering.

Det protokoll som presenteras här, som fokuserar på provberedning, gör två stora ombyggnader till befintliga 4C-seq metoder8,9,10,11,12. Först, den använder en qPCR-baserad metod att empiriskt fastställa det optimala antalet förstärkning cykler för 4C-seq bibliotek förberedelser och därmed mildrar potentialen för PCR-bias som härrör från överdriven amplifiering av bibliotek. För det andra, används en ytterligare begränsning digest steg i ett försök för att minska likformigheten av kända ”bete” sekvenser som hindrar korrekt bas-ringer av instrumentet sekvensering och, därmed, maximerar unika, informativ sekvensen i varje Läs. Andra protokoll kringgå problemet genom att samla många (12-15)8 4 C-seq bibliotek med olika bete sekvenser eller begränsning platser, en volym experiment som inte kanske kan uppnås av andra laboratorier. De ändringar som presenteras här kan ett litet antal experiment, prover eller replikerar att indexeras och sammanslagna till en enda lane.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. restriktionsenzym urval

  1. Identifiera ett område av intresse (t.ex., gen promotorn, single nucleotide polymorphism (SNP), förstärkare) och få DNA-sekvensen från databaser såsom National Center för Biotechnology Information (NCBI).
  2. Identifiera de kandidat restriktionsenzym (REs) för första restriktionsenzym matsmältningen (RE1) som skär inte i sekvensen av intresse, som producerar klibbig ändar (DNA termini med överhäng) efter RE matsmältningen, och vars verksamhet inte hämmas av CpG metylering.
    Obs: Upplösning av data bestäms av RE1. Ett enzym med en 6 baspar (bp) erkännande sekvens producerar, i genomsnitt, fragment cirka 4 kilobases (kb) i längd, medan ett enzym med en 4 bp erkännande sekvens producerar fragment cirka 250 bp i längd, vilket gör att mer exakt identifiering av samverkande sekvenser.
  3. Välj en RE1 kandidat enzymerna identifierade i steg 1.2 som producerar en ”synvinkel” begränsning fragment minst 500 bp lång som omfattar regionen av intresse eller, alternativt, en angränsande region.
    Obs: Det enzym som valts måste vara mottagliga för primer design (se steg 2).
  4. För andra matsmältningen, identifiera ett restriktionsenzym (RE2) med en 4 bp erkännande sekvens som producerar klibbig ändar (DNA termini med överhäng) efter RE matsmältningen, vars verksamhet hämmas inte av CpG metylering och att nedskärningar inom begränsningen fragment som genereras av RE1 att producera ett 250 – 500 bp bete fragment (figur 1).
    Obs: Det enzym som valts måste vara mottagliga för primer design (se steg 2).

2. design och Test Primers för omvänd PCR och matsmältningen effektivitet qPCR

  1. Använda en primer designverktyg såsom Primer3 (http://primer3.ut.ee) att utforma inverse primers som är riktade utåt mot ändarna på bete fragmentet (dvs., 5' primer är en ”omvänd” primer, kompletterar den plus strand, medan primern 3' är en ” ««framåt ”primer, kompletterar den minus strand) och som nära begränsning webbplatser som möjligt för att minimera förstärkning av icke-informativa bete sekvens och maximera PCR effektivitet (figur 2A).
    Obs: Primers bör förutses ha minimal icke-specifik amplifiering från genomiskt DNA av i silico PCR förutsägelser och bör inte anpassa någon annanstans i genomet utom deras avsedda målet med mer än 16/18 identitet9. Som sekvensering adaptrar inte ingår i omvänd PCR primers, är platsen för primer bindande mer flexibla än i andra 4C förberedelse metoder. primers bör optimalt glödga inom 50 bp efter utgången av motsvarande begränsning webbplatsen.
    1. Bekräfta specificiteten av inverterad PCR primers genom förstärkning med renat genomiskt DNA (gDNA) som mall.
    2. Optimal primers bör ge några produkter när du använder gDNA som en mall (se steg 11.2 för beskrivning av förväntade 4C produkter). Om betydande förstärkning från gDNA uppstår, utforma nya primers. Om ingen godtagbar primer uppsättningar identifieras, återgå till steg 1 och väljer ett nytt bete genom att välja ny restriktionsenzym.
  2. Design qPCR grundfärger att förstärka fragment 70 – 200 nukleotid (nt) i längd för att övervaka begränsning matsmältningen effektivitet (figur 2B).
    1. Designa ett par grundfärger att förstärka över varje begränsning webbplats (vald i steg 1) som definierar sekvensen bete. Design primers för båda RE1 (se steg 6.5.6) och RE2 platser (se steg 9.2).
    2. Utforma en uppsättning primers som förstärker en region som inte innehåller platserna för antingen restriktionsenzym som en normalisering kontroll (uncut DNA) för RE1 och RE2 (se även steg 6.5.6).

3. insamling av celler

  1. Med en metod som är lämplig för vävnads- eller kulturen, erhålla en encellig suspension. Pellet cellerna för 5 min vid 200 x g, avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 500 µL av 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) per 107 celler.

4. formaldehyd Cross-linking av celler att bevara kromatin interaktioner

  1. Per 107 celler, lägga till 9,5 mL 1% elektronmikroskopi (EM)-grade formaldehyd (metanol-fri) i PBS och inkubera, medan tumlande på rocker (eller liknande), under 10 minuter vid rumstemperatur (RT, 18 – 22 ° C).
    Obs: Fixering villkor kan behöva optimeras för varje celltyp. Tidigare publicerade verk i mus celler rapporterade att optimal fixering resulterar i minst 40% av mappade läser att anpassa till den kromosom som innehåller viewpoint9 förutsatt att en icke-telomeric region för en genomsnittlig storlek kromosom.
  2. Överföra de reaktionsrören is och lägga till iskall 1 M glycin till en slutlig koncentration av 0,125 M (1.425 mL) att släcka crosslinking reaktion. Blanda genom varsam inversion.
  3. Centrifugera under 5 min vid 200 x g, 4 ° C och ta försiktigt bort alla supernatanten. Lagra cellpelleten vid-80 ° C eller omedelbart gå vidare till cell lysis.

5. cell Lysis

  1. Återsuspendera cellpelleten från steg 4,3 i 500 µL av 5 mM etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA) att tvätta. Centrifugera vid 200 x g i 5 min på RT. Kassera supernatanten.
  2. Återsuspendera cellpelleten i 125 µL 5 mM EDTA med 0,5% sodium dodecyl sulfate (SDS) och 1 x proteashämmare, till exempel en 100 x cocktail som innehåller 5 mg/mL antipain, 10 mg/mL chymostatin, 10 mg/mL leupeptin och 10 mg/mL pepstatin A.
    Obs: Tvättmedel koncentration kan behöva optimeras för varje celltyp. Otillräcklig tvättmedel koncentrationer medför ofullständig cellys, lämnar kromatin otillgängliga för restriktionsenzym. Om begränsningen matsmältningen är fortsatt låga i steg 6.5.6 och aktiviteten av enzymet har bekräftats, krävas ytterligare tvättmedel. Öka SDS koncentrationen i steg om 0,1%.
  3. Inkubera cellsuspension på is i 10 min.
    Obs: För primära mänskliga keratinocyter, optimal lysis uppnås med hjälp av en 10 min inkubation vid 65 ° C följt av en 37 ° C över natten inkubation i en skakande värmeblocket med agitation (900 rpm).
  4. Kontrollera att cellen lysis är komplett.
    1. Blanda 6 µL av cellerna med 6 µL av Trypan blå på en bild och täck med ett täckglas. Visa under ett mikroskop.
      Obs: Vid framgångsrik Lys, inre av cellerna bör blå och un-lyserat celler visas vit.
    2. Om cell Lys visas otillräcklig, pellet cellerna vid 200 x g i 5 min och spara supernatanten. Återsuspendera pelleten och upprepa steg 5.2 – 5,4 eller alternativt med olika inkubation temperaturer (se anmärkning i steg 5.3).
    3. Kombinera den åter lyserat pelleten med sparade supernatanten och gå vidare.
      Obs: Okulärbesiktning är inte en garanti för tillräckliga lysis. Matsmältningen effektivitet bör fastställas objektivt som i steg 6.5.6.

6. första begränsning matsmältningen

  1. Lägg till 30 μL 10 x restriktionsenzym buffert (anges av tillverkaren) och 27 μL av 20% Triton x-100 (slutliga 1,8%) till upphängningen från steg 5,4. Föra den totala volymen 300 µL med H2O.
    Obs: Sammansättningen av restriktionsenzym bufferten kommer att bero på RE valt i steg 1.
  2. Ta bort en 15 μL alikvotens som ”osmält control” och förvaras vid 4 ° C.
  3. Lägga till 200 U RE1 återstående reaktionsblandningen och inkubera över natten vid temperaturen som är lämpligt att enzymet i en skakande värmeblocket med agitation (900 rpm). Nästa dag, lägga till en ytterligare 200 U RE1 och fortsätta inkubering över natten.
  4. Ta bort en 15 μL alikvotens som en ”Digested kontroll” och förvaras vid 4 ° C.
  5. Bestämma matsmältningen effektivitet:
    1. Lägga till 82,5 µL 10 mM Tris-HCl pH 7,5 15 µL prov från steg 6.2 och 6.4. Tillsätt 2,5 µL av proteinas K (20 mg/mL) och inkubera i 1 h vid 65 ° C.
    2. Tillsätt 100 µL av fenol-kloroform och blanda kraftigt genom inversion ta bort restprotein kontaminering. Centrifugera i 5 min, 16,100 x g vid rumstemperatur.
    3. Överföra vattenfasen till en ny tub. Tillsätt 6,66 µL av 3 M natrium acetat pH 5.2, 1 µL 20 mg/mL glykogen och 300 µL av 100% etanol (EtOH). Blanda försiktigt genom inversion och plats vid-80 ° C i 1 h.
    4. Centrifugera i 20 min vid 16,100 x g vid 4 ° C. Ta bort supernatanten, tillsätt 500 µL av 70% EtOH och Centrifugera under 5 minuter vid 16,100 x g vid RT.
    5. Avlägsna supernatanten och torka pelleten i rumstemperatur för 2 min. återsuspendera pelleten i 50 µL av nuclease-fri H2O.
    6. Bestämma digest effektivitet av qPCR13,14 med metoden ∆∆Ct. Använda primern Ställ inte flankerar en begränsning webbplats (se steg 2.2.2) som normalisering kontroll. Fortsätt om matsmältningen effektiviteten är > 85%. Annars pellet cellerna och upprepa steg 5,2-6,5, utelämna inkubering vid 65 ° C i steg 5.3.

7. första ligatur

  1. Värme-inaktivera enzymet begränsning av ruva 20 min vid 65 ° C. Alternativt, om enzymet inte kan värme inaktiverat, fenol-kloroform extrahera och etanol fällningen provet.
    Obs: De högre inaktivering temperaturer rekommenderas för vissa restriktionsenzym denaturera proteiner i kromatinet, och det kan negativt påverka provet. Fenol: kloroform utvinning är dessutom inte idealisk, eftersom det leder till förlust av provet.
  2. Överför till en 50 mL konisk tub och tillsätt 6 mL nuclease-fri H2O, 700 µL 10 x ligase buffert (660 mM Tris-HCl pH 7.5, 50 mM magnesiumklorid (MgCl2), 10 mM Ditiotreitol (DTT), 10 mM adenosintrifosfat (ATP)), och 50 U T4 DNA-Ligase. Blanda försiktigt genom omskakning och inkubera över natten vid 16 ° C.
  3. Ta bort en 100 µL alikvot av provet som kontrollen '' Ligation''.
  4. Bestämma ligering effektivitet:
    1. Tillsätt 2,5 µL av proteinas K (20mg/mL) och inkubera 1 h vid 65 ° C.
    2. Tillsätt 100 µL av fenol-kloroform och blanda kraftigt genom inversion. Centrifugera i 5 min, 16,100 x g på RT.
    3. Överföra vattenfasen till en ny tub. Tillsätt 6,66 µL 3 M natrium acetat pH 5.2, 1 µL av glykogen och 300 µL av 100% EtOH. Blanda försiktigt genom inversion och plats vid-80 ° C ca 1 h.
    4. Centrifugera i 20 min vid 16,100 x g vid 4 ° C. Ta bort supernatanten, tillsätt 500 µL av 70% EtOH och Centrifugera under 5 minuter vid 16,100 x g vid 4 ° C.
    5. Avlägsna supernatanten och torka pelleten i rumstemperatur. Återsuspendera pelleten i 20 µL av vatten och belastning på en 0,6% agarosgel bredvid ”matsmältningen kontrollerna” från steg 6,5.
      Obs: Ett väl ligated prov ska visas som ett relativt tight, hög molekylvikt band (figur 3).
    6. Om ligering räcker, Fortsätt med steg 8. Annars Lägg färsk ATP (1 mM slutlig koncentration) och nya ligase; Inkubera över natten vid 16 ° C och upprepa steg 7,3 – 7,4.

8. omvänd Cross-linking och isolera kromatin

  1. Tillsätt 15 µL av proteinas K (20 mg/mL) och inkubera över natten vid 65 ° C att vända tvärbindningar.
  2. Tillsätt 30 µL RNase A (10 mg/mL) och inkubera 45 min vid 37 ° C.
  3. Lägg till 7 mL fenol-kloroform och blanda kraftigt genom inversion. Centrifugera 15 min, 3300 x g på RT.
  4. Överför den vattenhaltiga fasen till en ny 50 mL tub och tillsätt 7,5 mL nuclease-fri H2O (att späda DTT i ligase bufferten, vilket annars påskyndar med DNA), 1 mL 3 M natrium acetat pH 5,6, 7 µL av glykogen (20 mg/mL) , och 35 mL 100% EtOH. Blanda och inkubera vid-80 ° C i 1 h.
  5. Centrifugera 20 min, 3,900 x g vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten (pellets kan vara svårt att se), tvätta pelleten med 10 mL iskallt 70% EtOH och centrifugera 15 min, 3300 x g vid 4 ° C.
  6. Avlägsna supernatanten och kort torka pelleten på RT. Lös pelleten i 150 µL 10 mM Tris-HCl pH 7.5 vid 37 ° C. Förvaras vid-20 ° C eller Fortsätt med steg 9.

9. andra begränsning matsmältningen: Trimning cirklar

Obs: Detta steg skapar mindre cirklar för att minimera Överrepresentationen av mindre fångat fragment på grund av PCR-bias i nedströms förstärkning steg.

  1. I urvalet från steg 8,6, tillsätt 50 µL 10 x restriktionsenzym buffert (anges av tillverkaren), 300 µL av nuclease-fri H2O och 50 U restriktionsenzym RE2. Inkubera över natten vid temperaturen som är lämpliga för enzymet valt.
  2. Ta bort en 15 µL alikvot av provet som kontrollen ”matsmältning”. Fastställa matsmältningen effektivitet som beskrivs i steg 6,5.

10. andra ligering och DNA-rening

  1. Inaktivera restriktionsenzym som rekommenderas av tillverkaren. Om enzymet inte värmeinaktiverade, ta bort enzymet med en kolumnbaserade rening kit.
    Obs: Eftersom detta resulterar i förlust av prov, kolumn rening är inte idealisk.
  2. Överför provet till en 50 mL tub och tillsätt 12,1 mL nuclease-fri H2O, 1,4 mL 10 x ligering buffert (660 mM Tris-HCl, pH 7,5; 50 mM MgCl2; 10 mM DTT; 10 mM ATP) och 100 U T4 DNA-ligase. Inkubera över natten vid 16 ° C.
  3. Tillsätt 467 µL 3 M natrium acetat pH 5,6, 233 µL nuclease-fri H2O 7 µL glykogen (20 mg/mL) och 35 mL 100% EtOH. Blanda väl och inkubera vid-80 ° C 1 h.
  4. Centrifugera 45 min, 3,900 x g vid 4 ° C. Ta bort supernatanten, tillsätt 10 mL kall 70% EtOH och centrifugera 15 min, 3300 x g vid 4 ° C.
  5. Avlägsna supernatanten och kort torka pelleten i rumstemperatur. Tillsätt 150 µL 10 mM Tris-HCl pH 7,5 och inkubera vid 37 ° C att upplösa pelleten.
  6. Rena av prov med en kvarts kolumnbaserade PCR rening kit, följa tillverkarens instruktioner. Använd 1 kolumn per 3 x 106 celler, baserat på det ursprungliga antalet celler. Eluera kolonnerna med 50 µL 10 mm Tris-HCl, pH 7,5 och poolen proverna.
  7. Mätning av koncentrationen av fluorimetry eller spektrofotometri med absorbansen vid 260 nm. 4C mallen är nu redo för inversen PCR. Förvaras vid-20 ° C eller gå direkt till steg 11.

11. PCR förstärka okänd samverkande sekvenser med omvänd PCR

  1. Avgöra det linjära området av förstärkning genom att utföra en PCR använder mallen utspädningar av 12,5, 25, 50 och 100 ng 4C mall. Om du vill förstärka från gDNA parallellt direkt jämföra produkter för att identifiera icke-specifik amplifiering. Köra PCR-reaktioner med en inledande denaturering vid 94 ° C i 2 min; 30 cykler bestående av ett denaturering steg vid 94 ° C i 10 s, en glödgning steg vid 55 ° C i 1 min, och en förlängning vid 68 ° C för 3 min; och en sista förlängning vid 68 ° C i 5 min.
  2. Separat 15 µL av varje PCR-produkt på en 1,5% agarosgel att bekräfta linjär förstärkning och bedöma mall kvalitet (figur 4). Förstärkning från 4C mall bör ge diskreta ränder på låga DNA koncentrationer och ett utstryk vid högre koncentrationer. Förekomsten av utstryket indikerar ökade komplexitet de förstärkta 4C-nering.
  3. När nöjd med kvaliteten och kvantiteten av inverterad PCR-produkten genereras, ställa in en qPCR att avgöra det optimala antalet cykler för förstärkning:
    1. Ställ in de reaktioner som innehåller SYBR och ROX färgämnen använda reaktionsblandningen i tabell 2. Om inte förstärkningen inte är linjär vid höga koncentrationer i steg 11.2, användning 100 ng av mallen per reaktion.
      Obs: Tillägg av ROX underlättar normalisering av fluorescerande signal från brunn till brunn och cykel till cykel.
    2. Kör de PCR-reaktioner med en inledande denaturering vid 94 ° C i 2 min; 40 cykler bestående av ett denaturering steg vid 94 ° C i 10 s, en glödgning steg vid 55 ° C i 1 min, och en förlängning vid 68 ° C för 3 min; och en sista förlängning vid 68 ° C i 5 min.
    3. Bestämma peak (effektmått) fluorescensen av reaktioner med förstärkning tomten. Bestämma den cykeln som reaktioner nå 25% av peak fluorescens (figur 5).
      Obs: Detta är antalet cykler som används för att förstärka 4C biblioteken (se steg 11,4).
  4. Ställa in inversen PCR som i tabell 3 att förstärka okända sekvenser sammanskrivna till betet från mallen 4 C. Dela i 16 reaktioner på 50 µL innan du kör. Köra PCR-reaktioner med en inledande denaturering vid 94 ° C för 2 min och cykler bestående av ett denaturering steg vid 94 ° C i 10 s, en glödgning steg vid 55 ° C i 1 min och en förlängning steg vid 68 ° C för 3 min. Använd antalet cykler som anges i steg 11.3.3.
  5. Samla och pool reaktionerna. Rena med en kvarts kolumnbaserade PCR rening kit. Använd minst 2 kolumner per 16 reaktioner. Poolen de rena PCR-produkterna.
  6. Bestämma provets kvantitet och renhet av spektrofotometri. Typiska avkastningen är mellan 10 och 20 μg med A260/A280 ~ 1,85. Om absorption nyckeltalen är optimalt, åter rena för att förhindra problem under sekvenseringen.
  7. Bedöma komplexiteten i biblioteket genom att separera 300 ng av renat PCR-produkt på en 1,5% agarosgel.
    Obs: Förstärkt produkt bör likna som från steg 11.2.

12. tredje begränsning matsmältningen: Trimma bort bete sekvenser

Obs: Detta steg tar bort icke-informativa bete sekvenser från de inversa PCR-produkterna för att maximera informativ fångade sekvenser i efterföljande sekvensering steg. För att övervaka digest effektivitet, rötas en ”digest monitor”15 parallellt med motsvarande DNA och enzym koncentration. Om RE1 och RE2 är oförenliga för samtidig nedbrytning, exempelvis måste på grund av olika optimala inkubation temperaturer eller reaktion buffertar, detta göras som en sekventiell digest (detta inte är idealiskt).

  1. Skaffa en RE digest monitor och testa rötning i en 50 µL reaktion.
    Obs: Detta är en molekyl av dsDNA (till exempel en plasmid, PCR-amplikon eller syntetiskt DNA) som innehåller RE industriområden. Det enda kravet är att det ska vara lätt att skilja cut från uncut monitorn på en agarosgel. Optimera RE monitor samlas och enzymet koncentration om det behövs.
  2. Digest 1 µg av renat omvänd PCR-produkt från steg 11,6 och, parallellt, RE bildskärmen från steg 12.1.
    Obs: DNA enzym koncentration, samt och inkubationstiden, bör vara samma som för test digest steg 12.1 för både den inversa PCR-produkten och de bildskärm smälter. Justera volymen reaktion efter behov.
  3. Kör den smält RE monitor på en agarosgel koncentration lämpliga för beräknade fragment. Matsmältningen anses tillräcklig när < 10% av DNA förblir uncut (figur 6).
  4. Rena smält inverse PCR-produkten på en kvarts kolumnbaserade DNA rening kit. Om sekventiell smälter krävs, upprepa steg 12.1 – 12.4 med andra enzym.

13. beredning av sekvensering bibliotek

  1. Ligera adaptrarna som är kompatibla med respektive nästa generations sekvensering plattform.
    1. Utforma adaptrarna för varje RE1 och RE2 så att, efter glödgning i oligos, varje RE-adapter har respektive 1-sidig överhänget.
      Obs: till exempel om HindIII används, glödgad adaptern innehålla en 5' fosforyleras ”AGCT” överhäng. Alternativt, om du använder standard T-överhäng adaptrar slutet-reparation och A-tail biblioteket före adapter ligering.
    2. Glödga den respektive adapter RE oligos. Återsuspendera oligos i glödgning buffert (10 mM Tris, pH 7.5, 50 mM natriumklorid (NaCl), 1 mM EDTA), blanda i equimolar mängder till 50 µM, värme till 95 ° C, och låt svalna långsamt till 25 ° C.
    3. Utföra ligatur reaktionen. Blanda nytt smält 4 C bibliotek med en totala 5 - till 10 - faldig molar överskott av glödgad adaptrar (steg 13.1.2; 50: 50 förhållandet för varje RE adapter används) 1 x ligase buffert och 6U DNA-ligase. Inkubera i enlighet med tillverkarens anvisningar.
    4. Ta bort överflödigt kort genom att rena med en låg-elutionsvolymen kiseldioxid-baserade kolumn kit.
  2. Storlek-Välj.
    Obs: Storlek urval kan även utföras med en pärla-baserade Clean kit och rekommenderas även efter kolumn rening.
    1. Kastade en 2% agarosgel använder en högupplöst agaros, lägga till en icke-UV-fläcken innan hälla. Se till att eventuellt vatten som förloras på grund av avdunstning under värme ersätts genom att väga flaskan eller kolven före och efter uppvärmning och lägga till vatten för att återställa förlorade massan.
    2. Kör adapter-sammanskrivna biblioteken på gel, lämnar tomma körfält mellan proverna.
    3. Punktskatt gel skivor motsvarar storlek utbud 150 bp till 1 kb med en ren skalpell eller rakblad.
    4. Rena biblioteken från gelen med en gel utvinning kit. För att minimera GC bias i återhämtningen av DNA, lös gel skivor vid rumstemperatur med rotation.
  3. Bestämma antalet cykler för PCR-amplifiering av qPCR med reaktionsblandningen i tabell 4. Köra PCR-reaktioner med en inledande denaturering på 98 ° C i 2 min och 40 cykler bestående av en denaturering steg vid 98 ° C för 10 s, en glödgning steg vid 60 ° C i 1 min, och en förlängning på 72 ° C under 3 minuter.
    Obs: Cykeln där fluorescens uppgår till 25% av maximalt är antalet cykler som används för att förstärka biblioteket, som i steg 11,3.
  4. Förstärka de bibliotek som använder reaktionsblandningen i tabell 5. Köra PCR-reaktioner med en inledande denaturering på 98 ° C för 2 min och cykler bestående av ett denaturering steg vid 98 ° C för 10 s, en glödgning steg vid 60 ° C i 1 min, och en förlängning på 72 ° C under 3 minuter. Antalet förstärkning cykler som ska användas för varje bibliotek var beslutsam i steg 13,3.
  5. Rena förstärkt bibliotek med hjälp av en låg-elutionsvolymen kiseldioxid-baserade kolumn kit.

14. sekvensering och analys av sekvensering Data

  1. Bestämma koncentrationerna av förstärkt bibliotek med hjälp av en fluorimetriskt analys. Späd biblioteken i lämpliga koncentrationen för sekvensering (kontrollera med sekvensering tjänsten eller kärna för deras rekommendation).
  2. Bestämma kvaliteten på biblioteken använder en mikroflödessystem nukleinsyra analysplattform.
    Obs: Storlek profilen av biblioteket bör spegla som sett på storlek urval gel i steg 13,2, och koncentrationen av de prov som fastställs i det här steget är att användas för sekvensering.
  3. Pool indexerade bibliotek att få minst 3 miljoner läsningar (minst 50 bp Läs; singel [1 X 50] eller parkopplade slutet [2 X 50]) per prov. En hög kvalitet bibliotek kräver minst 1 miljon kartlagt läser9, men det kommer att finnas några bortfall under mappning. Exempelvis rymmer en sekvensering plattform som ger cirka 150 miljoner läsningar per körfält upp till 50 prov i ett enda körfält.

15. analys av sekvensdata

  1. Multiplex data genom att använda index sekvenser för att tilldela läser sina lämpliga prover.
    Obs: Beroende på deras förtrogenhet, användare kan utföra nedströms computational analyser av FASTA/FASTQ sekvens råfiler använder grundläggande kommandoradsgränssnitt eller, alternativt, användarvänlig, webbaserad Galaxy grafiskt användargränssnitt (GUI)16 .
  2. Trim adapter sekvenser och bete sekvenser som härrör från ofullständig RE matsmältningen i steg 12, till exempel, med snabb-X Toolkit (http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/).
  3. Mappa demultiplexed läsningar till lämpliga genomet av intresse (t.ex., UCSC mm10, hg19) med den Burrows-Wheeler Aligner (BWA)17 eller annan justering programvara vilket resulterar i SAM utdatafiler. Om det behövs, konvertera SAM filer till BAM via samtools18 (se steg 15,4).
  4. Använda en 4C-seq analys rörledning som Basic4Cseq19, 4 C-ker20, FourCSeq21eller fourSig22 att analysera data och identifiera interaktionerna.
    Obs: Dataanalys och bedömning av kvaliteten därav bör utföras enligt vald programvara paketets referensmanual. Paket generera BED utdatafiler där inget annat anges. Kort, Basic4CSeq19 använder en indatafil SAM (steg 15,3) att visualisera samspelet (txt, tiff, säng och peruk utdatafiler) och bedömer kvaliteten på data baserat på de kriterier som anges i van de Werken et al. 9 4 C-ker20 (ingång trimmade FASTQ, steg 15,2) och FourCSeq21 (ingång BAM, steg 15,3) identifiera differentiell interaktioner mellan villkor. fourSig22 (ingång SAM) också identifierar signifikanta interaktioner och prioriterar de som sannolikt kommer att vara reproducerbara. Verktyg som genomisk reglerande anrikning av anteckningar verktyget (stor)23, eller integration med koda datauppsättningar kan också användas för att förutsäga den biologiska funktionen av interaktioner upptäcktes av 4 C-följande punkter

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Primära mänskliga keratinocyter isolerades från 2 – 3 kasserade neonatal förhudarna, poolade, och odlade i KSFM kompletteras med 30 mikrog/mL bovint hypofysen extrakt, 0,26 ng/mL rekombinant human epidermal tillväxtfaktor, och 0,09 mM kalciumklorid (CaCl2 ) vid 37 ° C, 5% koldioxid. Cellerna var uppdelade i två kolvar, och en kolv var åtskild genom tillsats av CaCl2 till en slutlig koncentration av 1,2 mM för 72 h. 107 celler varje från frodas och differentierade keratinocyter populationer var fast i 1% formaldehyd i 10 min i rumstemperatur. Separat, odlades K562 celler i RPMI kompletteras med 10% fetalt bovint serum vid 37 ° C, 5% koldioxid. 107 celler fastställdes i 1% formaldehyd i 10 min i rumstemperatur.

Cellerna var lyserat och fasta kromatinet var smält med HindIII och sammanskrivna som beskrivs ovan. Tvärbindningar var ombytta och DNA renas och smält med CviQI. DNA var sammanskrivna och används som mall för omvänd PCR-amplifiering. Primers som användes var: 5'-GATCAGGAGGGACTGGAACTTG/5 '-CCTCCCTTCACATCTTAGAATG. 1 µg av renat inverse PCR-produkten har smält över natten med CviQI parallellt med 225 ng av RE smälta monitor och kolumn-renat. Renade DNA har sedan smält över natten med HindIII parallellt med 125 ng av RE smälta monitor och kolumn-renat. 250 ng av renat dubbel-rötas inverse PCR-produkten användes för bibliotek beredning. Kort, reparerades ändarna via konverteringar till 5'-fosforyleras och blunt-avslutar och efterföljande DNA kolumn-rening. Ändar var A-tailed 20 min vid 72 ° C i en 50 µL reaktion med 1 U Taq-polymeras och 200 µM dATP och kolumn-renat. Kompatibla sekvensering bibliotek prep adaptrar var sammanskrivna i förhållandet 10:1 (adapter: DNA) med T4 DNA-ligase i en 30 µL reaktion i rumstemperatur i 15 min och DNA kolumn-renat. Bibliotek kördes på en 2% agarosgel, gel skivor sänktes från 120 bp till toppen av stegen ta bort adaptrar och bibliotek var renat. 200 pg av varje bibliotek utvärderades hos 10 µL qPCR reaktioner som innehåller indexering primers för att fastställa optimala PCR-amplifiering cykler. Biblioteken var förstärks för att lägga till index använda antalet cykler bestäms av qPCR och sekvenserade i en HiSeq2500 för att få 1 x 50 läsningar.

Läser demultiplexed och trimmas. Först, sekvensering adaptrar togs bort. Därefter trimmats sekvensen från början av varje primer till webbplatsen begränsning. Detta möjliggör kartläggning av inverterad PCR-produkter som inte var helt smält innan biblioteket förberedelse. Ännu viktigare, förhindrar inklusive sekvens mellan primer bindningsstället och webbplatsen begränsning kartläggning av icke-specifikt-förstärkta PCR-produkten. Trimmade läsningar karterades att hg38 använder BWA. Figur 7 visar läser mappning till regionen kring utsiktspunkten.

Figure 1
Figur 1: Schematisk av 4C-seq arbetsflödet. Kromatin är tvärbunden för att bevara protein-DNA kontakter, smält med RE1 och sammanskrivna länka samverkande loci. Tvärbindningar återförs och DNA är smält med RE2 och sammanskrivna. Okänd samverkande sekvenser förstärks med primers som binder till regionen av intresse, och PCR-produkter smälts med RE1 och RE2 att trimma kända sekvenser. Amplifierade DNA av okänd sekvens används i en sekvensering bibliotek prep, där adaptrarna är sammanskrivna och biblioteket är PCR-förstärks och sekvenserade. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: scheman över primer mönster. (A) bindande platser för omvänd PCR primers. Grundfärger är orienterad ”utåt” (dvs., 5' primer är en ”omvänd” primer, kompletterar den plus strand, medan primern 3' är en ”forward” primer, kompletterar den minus strand) och bind inom 50 bp varje begränsning plats (indikeras med röd skuggning). (B) bindande platser för qPCR primers för att bestämma restriktionsenzym digest effektivitet. En primer par flanker varje restriktionsenzym plats. En kontroll primer uppsättning förstärker en sekvens som innehåller inte en plats för antingen enzym och används för att normalisera Ct-värden för DNA-ingång. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: agaros gel-elektrofores att bedöma ligering effektiviteten för RE1-rötas kromatin. Uncut, HindIII-rötas och sammanskrivna prover behandlades med proteinas K och uppvärmd för att vända tvärbindningar, fenol: kloroform extraherade, EtOH utfällda och återsuspenderade i H2O. renade DNA kördes på en 0,6% agarosgel och band visualiseras av etidiumbromid färgning med jämförelse till 1 kb plus stege. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4:4 c mall titrering för inversen PCR. Seriespädningar var gjord av 4C mallar och används i omvänd PCR-reaktioner. PCR-produkter var köra på 1,5% agarosgel och visualiseras av etidiumbromid färgning tillsammans med 1 kb plus stege. NTC betecknar nr-mall kontroll reaktion. Observera en korrelat ökning av förstärkning med en ökning i mallen koncentration. Detta representativa förstärkning genomfördes på kromatin klyvs med HindIII som RE1 och CviQI som RE2 och primer sekvenser används för inversen PCR-amplifiering var 5'-GATCAGGAGGGACTGGAACTTG/5 '-CCTCCCTTCACATCTTAGAATG. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: qPCR-medierad bestämning av förstärkning cykler behövs för att förstärka mall för inversen PCR. 4C mallar var förstärks i reaktioner som innehåller 1 x SYBR Green och 1 x ROX i en realtid termocykler. Topp fluorescens bestämdes och antalet cykler som krävs för att nå ¼ av peak fluorescens beräknades. Detta antal cykler användes för att förstärka 4C mallen för inversen PCR. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: agaros gelelektrofores av rötas RE monitor som visar tillräcklig matsmältning. RE digest var monitor amplifierats från humant genomiskt DNA med hjälp av primers F: 5'-TCCTATCCCTGGTCTGTCTTAT och R: 5'-CCACATTGGTCCTTCTAGTCTTC och renas. 225 ng Monitor var smält med 15 U CviQI i en 50 µL reaktion vid 25 ° C över natten och köra på en 1,5% agarosgel tillsammans med 1 kb plus stege. Band var visualiserat med etidiumbromid bromid färgning. Uncut monitor är 2515 bp; förväntat fragment storlekar är 132, 343, 488, 539 och 1013 bp. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: representativa genomisk spår Läs täckning inom 5 kb av regionen viewpoint. Läser trimmade och mappade till hg38 använder BWA. Majoriteten av läsningar (blå toppar) justera på HindIII eller CviQI platser intill HindIII platser, som förväntat. Regionen synvinkel är markerade i rött. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Volym för 1 x
10 x expandera långa mall buffert 1 2,5 ΜL
dNTP (10 mM) 0,5 ΜL
Forward primer 35 pmol
Reverse primer 35 pmol
Expandera långa mall polymeras (5 U/µL) 0,35 ΜL
DNA
Nuclease-gratis vatten till 25 µL

Tabell 1: PCR-reaktionsblandningen för förstärkning av 4C mall (steg 11,1).

Volym för 1 x
10 x expandera långa mall buffert 1 1,5 ΜL
dNTP (10 mM) 0,3 ΜL
Forward primer 21 pmol
Reverse primer 21 pmol
100 x SYBR Green I 0,15 ΜL
50 x ROX 0,3 ΜL
Expandera långa mall polymeras (5 U/µL) 0.21 ΜL
DNA 100 ng
Nuclease-gratis vatten till 25 µL

Tabell 2: qPCR reaktionsblandningen för bestämning av antalet förstärkning cykler för inversen PCR (steg 11.3.1).

Volym för 1 x
10 x expandera långa mall buffert 1 80 ΜL
dNTP (10 mM) 16 ΜL
Forward primer 1.12 nmol
Reverse primer 1.12 nmol
Expandera långa mall polymeras (5 U/µL) 11.2 ΜL
DNA 3,2 µg
Nuclease-gratis vatten till 800 µL

Tabell 3. PCR-reaktionsblandningen för den slutliga inverse PCR-amplifieringen av 4C mall (steg 11,4).

Volym för 1 x
5 x Phusion HF buffert 2 ΜL
dNTP (10 mM) 0.2 ΜL
Miltiplexing Primer 1.0 5 pmol
Miltiplexing Primer 2.0 0,1 pmol
Index-primer 5 pmol
100 x SYBR Green I 0.1 ΜL
50 x ROX 0.2 ΜL
Phusion polymeras 0.1 ΜL
DNA 2 ΜL
Nuclease-gratis vatten till 10 µL

Tabell 4: qPCR reaktionsblandningen för bestämning av antalet förstärkning cykler för sekvensering bibliotek prep (steg 13,3).

Volym för 1 x
5 x Phusion HF buffert 10 ΜL
dNTP (10 mM) 1 ΜL
Miltiplexing Primer 1.0 25 pmol
Miltiplexing Primer 2.0 0,5 pmol
Index-primer 25 pmol
Phusion polymeras 0,5 ΜL
DNA 10 ΜL
Nuclease-gratis vatten till 50 µL

Tabell 5: PCR-reaktionsblandningen för förstärkning av bibliotek för sekvensering (steg 13,4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

4C resultat har potential att avslöja kromatin interaktioner som kan identifiera tidigare okända reglerande element och/eller målgener som är viktiga i ett specifikt biologiska sammanhang24,25,26. Tekniska hinder får dock begränsa de uppgifter som erhålls från dessa experiment. PCR-bias som härrör från överdriven amplifiering av mallen i 4 C protokoll är sannolikt. Detta protokoll åtgärdar detta problem genom att utnyttja qPCR för att fastställa det optimala antalet förstärkning cykler på ett objektivt sätt. Avlägsnande av bete sekvenser från förstärkt inverse PCR-produkter av begränsning digest kan dessutom underlätta identifieringen av kromatin interaktioner av två skäl. Först, det minskar längden på icke-informativa (bete) baspar från materialet som sekvenseras. Andra, och som ett resultat, ökar det sannolikheten för att fler läser kommer att genereras från olika sekvenser (en egenskap som krävs för korrekt bas samtal) och därmed mer informativ samverkande sekvenser kan mappas. Andra protokoll kräver sammanslagning av många bibliotek använder olika bete sekvenser eller restriktionsenzym eller kräver öka phiX koncentrationen av sekvenserade provet att kringgå sekvens enhetlighet frågan för korrekt bas samtal. Denna metod tillåter flera prover med samma bete sekvens att slås samman till en enda sekvensering lane utan ockuperar värdefulla sekvensering kapacitet med överskott phiX.

Cell fixering och Lys är kritiska tidiga steg, vilka båda kan kräva optimering för speciella celltyper. Otillräcklig fixeringen misslyckas att bevara specifika kontakter mellan ett område av intresse och dess interagerande sekvenser, framställning av intetsägande data domineras av buller. Däremot minskar överdriven fixering restriktionsenzym förmåga att klyva kromatin, vilket resulterar i färre informativ ligering händelser. Både fixativ koncentration och inkubationstiden kan ändras för att optimera denna variabel. Likaså minskar otillräcklig cellys tillträde restriktionsenzym till kromatin, igen minska antalet händelser som informativ ligering. I våra händer lyserat människans primära keratinocyter mest effektivt med en kombination av hypoton villkor och rengöringsmedel. Andra celltyper kan kräva olika lysis villkor, som kommer att fastställas empiriskt. Effektiv Lys kan identifieras genom mikroskopi dye utslagning metoder såsom Trypan blå färgning.

En begränsning med metoden 4C är att resultaten bara kan representera ett genomsnitt för befolkningen. Med en heterogen cell befolkning, kan det vara svårt att bestämma sanna interaktioner vs. buller på grund av biologisk variabilitet. Även användning av en cellinje eller sortering av celler att producera en homogen cell befolkningen förutspås för att generera tydligare signaler, är variabilitet mellan enskilda celler fortfarande en möjlig källa till buller. Senaste framstegen inom encelliga sekvensering teknik har potential att lösa detta problem. Validering av populationsbaserade 4C resultat kan dessutom utföras med metoder såsom digital droplet PCR eller fisk för att avgöra om dessa resultat återspeglas på enskild cell nivå.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av NIAMS (R01AR065523).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HindIII NEB R0104S
CviQI NEB R0639S
DNA oligonucleotide primers IDT To be designed by the reader
50 mL conical centrifuge tubes Fisher Scientific 06-443-19
1.7 mL microcentrifuge tubes MidSci AVSS1700
Phosphate buffered saline Thermo Fisher 14190-136
Formaldehyde, methanol free Electron Microscopy Sciences 15710
Nutator VWR 15172-203
Glycine JT Baker 4059-00
Benchtop centrifuge
Refrigerated microcentrifuge
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich ED2SS
20% SDS solution Sigma-Aldrich 05030
Trypan Blue Thermo Fisher 15250061
Glass slides Fisher Scientific 12-550-143
Cover slips VWR 16004-094
Light microscope
Triton X-100 Alfa Aesar A16046
Shaking heat block
2 M Tris-HCl Quality Biological 351-048-101
Proteinase K NEB P8107S
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1) Sigma-Aldrich P2069
Sodium acetate Sigma-Aldrich M5661
20 mg/mL glycogen Thermo Fisher R0561
Ethanol Fisher Scientific 04-355-223
Nuclease-free water Fisher Scientific MT-46-000-CM
qPCR cycler Thermo Fisher 4453536
qPCR plates Thermo Fisher 4309849
Thermocycler Thermo Fisher 4375786
PCR strip tubes MidSci AVSST-FL
1 M Magnesium chloride Quality Biological 351-033-721
Dithiothreotol Sigma-Aldrich 43815
Adenosine triphosphate Sigma-Aldrich A2383
T4 DNA Ligase NEB M0202S
Agarose Sigma-Aldrich A6013
RNase A Thermo Fisher EN0531
Qiaquick PCR purification kit Qiagen 28104
MinElute PCR Purification kit Qiagen 28004
Spectrophotometer
Expand Long Template PCR System Sigma-Aldrich 11681834001
dNTP mix Thermo Fisher R0191
SYBR Green I Sigma-Aldrich S9430
ROX BioRad 172-5858
Sodium chloride Sigma-Aldrich S5886
End-It DNA End-Repair Kit Lucigen ER0720
LigaFast Rapid DNA Ligation System Promega M8221
SYBR Safe Thermo Fisher S33102
Taq Polymerase NEB M0267S
UltraSieve Agarose IBI Scientific IB70054
Qiaquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dunham, I., et al. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  2. Hoffman, M. M., et al. Integrative annotation of chromatin elements from ENCODE data. Nucleic Acids Research. 41 (2), 827-841 (2013).
  3. Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. Capturing Chromosome Conformation. Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).
  4. Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. The long-range interaction landscape of gene promoters. Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).
  5. Li, G., et al. Extensive promoter-centered chromatin interactions provide a topological basis for transcription regulation. Cell. 148 (1-2), 84-98 (2012).
  6. Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).
  7. Zhao, Z., et al. Circular chromosome conformation capture (4C) uncovers extensive networks of epigenetically regulated intra- and interchromosomal interactions. Nature genetics. 38 (11), 1341-1347 (2006).
  8. Splinter, E., de Wit, E., van de Werken, H. J. G., Klous, P., de Laat, W. Determining long-range chromatin interactions for selected genomic sites using 4C-seq technology: From fixation to computation. Methods. 58 (3), 221-230 (2012).
  9. Van De Werken, H. J. G., et al. 4C technology: Protocols and data analysis. Methods in Enzymology. 513, Elsevier Inc. (2012).
  10. Brouwer, R. W. W., van den Hout, M. C. G. N., van IJcken, W. F. J., Soler, E., Stadhouders, R. Unbiased Interrogation of 3D Genome Topology Using Chromosome Conformation Capture Coupled to High-Throughput Sequencing (4C-Seq). Eukaryotic Transcriptional and Post-Transcriptional Gene Expression Regulation. , 199-220 (2017).
  11. Matelot, M., Noordermeer, D. Determination of High-Resolution 3D Chromatin Organization Using Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq). Polycomb Group Proteins: Methods and Protocols. , 223-241 (2016).
  12. Gheldof, N., Leleu, M., Noordermeer, D., Rougemont, J., Reymond, A. Detecting Long-Range Chromatin Interactions Using the Chromosome Conformation Capture Sequencing (4C-seq) Method. Gene Regulatory Networks: Methods and Protocols. , 211-225 (2012).
  13. Göndör, A., Rougier, C., Ohlsson, R. High-resolution circular chromosome conformation capture assay. Nature. 3 (2), 303-313 (2008).
  14. Hagège, H., et al. Quantitative analysis of chromosome conformation capture assays (3C-qPCR). Nature. 2 (7), 1722-1733 (2007).
  15. Anand, R. D., Sertil, O., Lowry, C. V. Restriction digestion monitors facilitate plasmid construction and PCR cloning. BioTechniques. 36 (6), 982-985 (2004).
  16. Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic acids research. 44 (W1), W3-W10 (2016).
  17. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).
  18. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  19. Walter, C., Schuetzmann, D., Rosenbauer, F., Dugas, M. Basic4Cseq: An R/Bioconductor package for analyzing 4C-seq data. Bioinformatics. 30 (22), 3268-3269 (2014).
  20. Raviram, R., et al. 4C-ker: A Method to Reproducibly Identify Genome-Wide Interactions Captured by 4C-Seq Experiments. PLoS Computational Biology. 12 (3), (2016).
  21. Klein, F. A., Pakozdi, T., Anders, S., Ghavi-helm, Y., Furlong, E. E. M., Huber, W. FourCSeq: analysis of 4C sequencing data. Bioinformatics. 31 (19), 3085-3091 (2015).
  22. Williams, R. L. Jr, et al. fourSig a method for determining chromosomal interactions in 4C-Seq data. Nucleic Acids Research. 42 (8), (2014).
  23. McLean, C. Y., et al. GREAT improves functional interpretation of cis-regulatory regions. Nature Biotechnology. 28 (5), 495-501 (2010).
  24. Stolzenburg, L. R., et al. Regulatory dynamics of 11p13 suggest a role for EHF in modifying CF lung disease severity. Nucleic Acids Research. 45 (15), 8773-8784 (2017).
  25. Meddens, C. A., et al. Systematic analysis of chromatin interactions at disease associated loci links novel candidate genes to inflammatory bowel disease. Genome Biology. 17 (1), 1-15 (2016).
  26. Yeung, J., et al. Transcription factor activity rhythms and tissue-specific chromatin interactions explain circadian gene expression across organs. Genome research. , 207787 (2017).

Tags

Genetik fråga 140 kromatin looping smakförstärkare reglerande ordningsföljd bete restriktionsenzym lysis
Hög genomströmning identifiering av reglerande gensekvenser som använder nästa generations sekvensering av cirkulär kromosom konformation fånga (4C-seq)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brettmann, E. A., Oh, I. Y., de… More

Brettmann, E. A., Oh, I. Y., de Guzman Strong, C. High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq). J. Vis. Exp. (140), e58030, doi:10.3791/58030 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter