Summary
De identificatie van de fysieke interacties tussen genen en regelgevende elementen is uitdagend maar heeft bevorderd door chromosoom conformatie opname methoden. Deze wijziging van het 4C-seq-protocol PCR bias vermindert door het minimaliseren van de over-amplificatie van PCR sjablonen en maximaliseert de mappability van leest door het opnemen van een toevoeging restrictie-enzym digest stap.
Abstract
De identificatie van regulerende elementen voor een bepaald doel-gen is een belangrijke technische uitdaging als gevolg van de variabiliteit in de positionering en effect grootte van regelgevende elementen naar een target-gen. Enige vooruitgang is geboekt met de bioinformatic voorspelling van het bestaan en de functie van de proximale epigenetische aanpassingen geactiveerde genexpressie met behulp van geconserveerde transcriptie factor bandplaatsen is gekoppeld. Chromatine conformatie vangen studies hebben een revolutie teweeggebracht in ons vermogen om te ontdekken van fysieke chromatine contacten tussen sequenties en zelfs binnen een gehele genoom. Circulaire chromatine conformatie vastleggen in combinatie met de volgende-generatie sequencing (4C-seq), in het bijzonder, is ontworpen om te ontdekken alle mogelijke fysieke chromatine interacties voor een bepaalde reeks van belang (gezichtspunt), zoals een target-gen of een regelgevende versterker. Huidige 4C-seq strategieën direct opeenvolging van binnen het gezichtspunt maar vereisen talrijke en uiteenlopende standpunten te worden om te voorkomen dat de technische uitdagingen van uniform gelijktijdig sequenced baseren (imaging) bellen met sequencing-platforms van de volgende generatie. Dit volume van experimenten mogelijk niet praktisch voor veel laboratoria. Hier, rapporteren we een gewijzigde aanpak bij het 4C-seq-protocol waarin zowel een extra restrictie-enzym-digest en versterking van de qPCR gebaseerde stappen die zijn ontworpen om een grotere opname van uiteenlopende reeks luidt vergemakkelijken en beperken de mogelijkheden voor PCR bias, respectievelijk. Onze gemodificeerde 4C methode is vatbaar voor de standaard moleculaire biologie lab voor de beoordeling van de chromatine het platform.
Introduction
De identificatie van regulerende elementen voor genexpressie is bevorderd door de encyclopedie van DNA elementen (CODEER)-Project, dat uitvoerig geannoteerd functionele activiteit voor 80% van het menselijk genoom1,2. De identificatie van de sites voor in vivo transcription factor binding, DNaseI overgevoeligheid, en epigenetische histone en DNA methylering wijzigingen in afzonderlijke celtypen effende de weg voor de functionele analyses van kandidaat regelgevende elementen voor doel genexpressie. Gewapend met deze bevindingen, worden we geconfronteerd met de uitdaging van de functionele interconnectiviteit tussen regelgevende elementen en genen bepalen. Specifiek, wat is de relatie tussen een bepaalde doel-gen en de enhancer(s)? De chromatine conformatie vastleggen (3C) methode adressen direct deze vraag door identificerende fysieke en waarschijnlijk functioneel, interacties tussen een gebied van belang en kandidaat-interactie sequenties via vastgelegde gebeurtenissen in vaste chromatine3 . Als ons begrip van de interacties van de chromatine is toegenomen, maar is het duidelijk dat het onderzoek van vooraf geselecteerde kandidaat loci volstaat om te zorgen voor een compleet begrip van de gen-enhancer interacties. Bijvoorbeeld, ENCODE gebruikt met de methode high-throughput chromosomale conformatie vangen carbon copy (5C) te onderzoeken van een klein deel van het menselijk genoom (1%, pilot set van 44 loci) en complexe interconnectiviteit van de loci gemeld. Genen en versterkers met geconstateerde interacties gemiddeld 2-4 verschillende interagerende partners, waarvan vele honderden kilobases weg in lineaire ruimte4 werden. Verder, Li et al. Chromatine interactie analyse door gepaarde-End Tag Sequencing (ChIA-PET) gebruikt om te analyseren geheel-genoom promotor interacties en vond dat 65% van RNA polymerase II bandplaatsen bij de interacties van de chromatine betrokken waren. Sommige van deze interacties resulteerde in grote, multi gene complexen verspreid over honderden kilobases van genomic afstand en bevatten gemiddeld 8-9 genen elke5. Samen, onderstrepen deze bevindingen de noodzaak voor onbevooroordeelde geheel-genoom methoden voor de raadpleging van de chromatine interacties. Enkele van deze methoden worden beoordeeld in Schmitt et al. 6.
Meer recente methoden voor chromatine conformatie vangen studies in combinatie met volgende-generatie sequencing (Hi-C en 4C-seq) inschakelen de ontdekking van onbekende sequenties interactie met een gebied van belang6. Specifiek, circulair chromosoom conformatie vastleggen met volgende-generatie sequencing (4C-seq) werd ontwikkeld om te identificeren loci interactie met een opeenvolging van belang in een onpartijdige wijze7 door DNA sequencing van vastgelegde chromatine proximale aan de regio van belang in 3D-ruimte. Kort, chromatine is vastgesteld voor het behoud van haar oorspronkelijke eiwit-DNA interacties, gekloofd met een restrictie-enzym, en vervolgens afgebonden verdunde voorwaarden vast te leggen van biologisch relevante "verwarring" van interagerende loci (Figuur 1). De cross links worden teruggedraaid om te verwijderen van het eiwit, waardoor het DNA beschikbaar voor extra decolleté met een tweede restrictie-enzym. Een definitieve afbinding genereert kleinere kringen van interagerende loci. Inleidingen tot de opeenvolging van belang worden vervolgens gebruikt voor het genereren van een versterkte bibliotheek van onbekende sequenties van de circularized fragmenten, gevolgd door sequentiebepaling van downstream komende generatie.
Het protocol gepresenteerd hier, dat zich op de bereiding van de monsters richt, maakt twee belangrijke wijzigingen aan bestaande 4C-seq methoden8,9,10,11,12. Ten eerste het een qPCR gebaseerde methode gebruikt voor het optimale aantal amplificatie cycli voor 4C-seq bibliotheek voorbereiding stappen en vermindert dus het potentieel voor PCR bias die voortvloeien uit over-amplificatie van bibliotheken empirisch te bepalen. Ten tweede, gebruikt het een aanvullende beperkingsopties digest stap in een poging om de uniformiteit van de bekende "aas" opeenvolgingen die nauwkeurige base-roept door het instrument sequencing belemmert en, vandaar, maximaliseert de unieke, informatieve reeks in elke Lees. Andere protocollen omzeilen van dit probleem door de bundeling van de vele (12-15)8 4 C-seq bibliotheken met verschillende aas sequenties en/of beperkingsplaatsen, een volume van experimenten die mogelijk niet haalbaar door andere laboratoria. De hier gepresenteerde wijzigingen toestaan een klein aantal experimenten, monsters, en/of worden gerepliceerd om te worden geïndexeerd en gebundeld in een enkele baan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. restrictie-enzym selectie
- Identificeren van een regio van belang (bv., gene promotor, single nucleotide polymorphism (SNP), versterker) en het verkrijgen van de opeenvolging van DNA van repositories zoals National Center voor de informatie van de biotechnologie (NCBI).
- Identificeren van de kandidaat-restrictie-enzymen (REs) voor de eerste restrictie-enzym vertering (RE1) die doen niet snijden in de opeenvolging van belang, die sticky ends (DNA termini met overhangen) produceren na RE spijsvertering, en waarvan de activiteiten zijn niet geremd door CpG methylering.
Opmerking: De resolutie van de gegevens wordt bepaald door RE1. Een enzym met een opeenvolging van de erkenning 6 basenpaar (bp) produceert, gemiddeld, fragmenten ongeveer 4 kilobases (kb) in lengte, terwijl een enzym met een 4 bp erkenning opeenvolging fragmenten ongeveer 250 bp in lengte produceert, waardoor meer nauwkeurige identificatie van opeenvolgingen van de interactie. - Selecteer een RE1 in de kandidaat-enzymen die geïdentificeerd in stap 1.2 die een "oogpunt" beperking fragment ten minste 500 bp lang produceert die de regio van belang of, als alternatief, een naburige regio bevat.
Opmerking: Het enzym geselecteerd moet vatbaar voor primer ontwerp (zie stap 2). - Voor de tweede vertering, een restrictie-enzym (RE2) te identificeren met een 4 bp erkenning reeks die sticky ends (DNA termini met overhangen) na RE spijsvertering, waarvan de activiteit wordt niet geremd door methylatie van de APR, en die binnen de beperking snijdt produceert fragment gegenereerd door RE1 te produceren een 250-500 bp aas fragment (Figuur 1).
Opmerking: Het enzym geselecteerd moet vatbaar voor primer ontwerp (zie stap 2).
2. ontwerp en Test inleidingen voor omgekeerde PCR en spijsvertering efficiëntie qPCR
-
Gebruik van een primer design tool zoals Primer3 (http://primer3.ut.ee) naar de omgekeerde inleidingen die naar buiten zijn gericht op de uiteinden van het fragment aas ontwerpen (dwz., de 5' primer is een "omgekeerde" primer, complementair aan de plus strand, terwijl de 3'-primer is een " naar voren"primer, complementair aan de min bundel) en dicht bij de beperkingsplaatsen mogelijk om te minimaliseren van de versterking van niet-informatieve aas volgnummer en maximaliseren van de efficiëntie van de PCR (figuur 2A).
Opmerking: Primers hebben minimale niet-specifieke versterking van genomic DNA moeten worden voorspeld door in silico PCR voorspellingen en moeten niet worden uitgelijnd elders in het genoom behalve hun beoogde doel met meer dan 16/18/EG identiteit9. Zoals sequencing adapters niet in de omgekeerde PCR inleidingen opgenomen zijn, is de site van primer bindend flexibeler dan in andere bereidingswijzen 4C; moeten optimaal ontharden de inleidingen binnen 50 bp na afloop van de overeenkomstige beperkingsplaats.- Bevestig de specificiteit van omgekeerde PCR inleidingen door versterking met behulp van gezuiverde genomic DNA (gDNA) als sjabloon.
- Optimale inleidingen paar producten moeten opleveren bij het gebruik van gDNA als een sjabloon (zie stap 11.2 voor de beschrijving van de verwachte 4C-artikelen). Als er substantiële versterking van gDNA optreedt, ontwerp nieuwe inleidingen. Als geen aanvaardbare primer sets zijn geïdentificeerd, terug naar stap 1 en selecteer een nieuwe aas door het selecteren van nieuwe enzymen van de beperking.
-
Ontwerp qPCR primers te versterken de fragmenten 70-200 nucleotide (nt) in lengte tot het controleren van de beperking spijsvertering efficiëntie (figuur 2B).
- Het ontwerp van één paar inleidingen te versterken op de site van elke beperking (in stap 1 hebt geselecteerd) die de aas-reeks definiëren. De inleidingen voor beide RE1 ontwerpen (zie stap 6.5.6) en RE2 sites (zie stap 9.2).
- Het ontwerp van een reeks inleidingen dat een regio niet met de sites voor beide restrictie-enzym als normalisatie controle (Onbesneden DNA) voor RE1 en RE2 (Zie ook stap 6.5.6) versterkt.
3. verzameling cellen
- Met behulp van een methode die geschikt is voor de cultuur van de weefsels of cellen, verkrijgen een eencellige schorsing. De cellen gedurende 5 min. op 200 x gpellet, verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 500 µL 1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) per 107 cellen.
4. formaldehyde Cross-linking van cellen te behouden van de chromatine interacties
- Per 107 cellen, voeg 9.5 mL 1% elektronenmicroscopie (EM)-rang van formaldehyde (methanol-free) in PBS en uit te broeden, terwijl tumbling op rocker (of soortgelijke), gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT, 18-22 ° C).
Opmerking: Fixatie voorwaarden mogelijk moet worden geoptimaliseerd voor elk celtype. Eerder gepubliceerde werk in muis cellen gemeld dat optimale fixatie leidt tot ten minste 40% van toegewezen leest uit te lijnen op het chromosoom met het gezichtspunt9 uitgaande van een niet-Telomere regio voor een gemiddelde grootte chromosoom. - Overdracht van de reactie buizen om ijs en ijskoud 1 M glycine toevoegen om een eindconcentratie van 0,125 M (1.425 mL) om quench het crosslinking reactie. Meng door zachte inversie.
- Centrifugeer gedurende 5 min 200 x g4 ° C en verwijder voorzichtig alle het supernatant. Opslaan van de cel pellet-80 ° c of onmiddellijk overgaan tot lysis van de cel.
5. de cellysis
- Resuspendeer de pellet van de cel uit stap 4.3 in 500 µL van 5 mM ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) te wassen. Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 min op RT. Discard het supernatant.
- Resuspendeer de pellet cell in 125 µL van 5 mM EDTA 0.5% natrium dodecyl sulfaat (SDS) en 1 x proteaseinhibitors, zoals een 100 x cocktail met 5 mg/mL antipain, 10 mg/mL chymostatin, 10 mg/mL leupeptin en 10 mg/mL pepstatin A.
Opmerking: Wasmiddel concentratie mogelijk moet worden geoptimaliseerd voor elk celtype. Onvoldoende wasmiddel concentraties zal resulteren in onvolledige cellysis, chromatine ontoegankelijk voor beperkingsenzymen verlaten. Als beperkingsspijsvertering aanhoudend lage in stap 6.5.6 is en de activiteit van het enzym is bevestigd, is er mogelijk extra wasmiddel nodig. SDS concentratie in stappen van 0,1% te verhogen. - Incubeer de celsuspensie op ijs gedurende 10 minuten.
Opmerking: Voor primaire menselijke keratinocyten, optimale lysis werd bereikt met behulp van een 10 min incubatie bij 65 ° C, gevolgd door een overnachting incubatie van 37 ° C in een schudden verwarming blok met agitatie (900 rpm). -
Ervoor zorgen dat lysis van de cel is voltooid.
- Mix 6 µL van de cellen met 6 µL van Trypan Blue op een dia en dek met een dekglaasje aan. Bekijken onder een microscoop.
Opmerking: Bij lysis van de succesvolle, het interieur van de cellen moet worden in blauw weergegeven en un-lysed cellen zal verschijnen witte. - Als de lysis van de cel wordt weergegeven onvoldoende, pellet de cellen bij 200 x g gedurende 5 min en sla het supernatant. Resuspendeer de pellet en herhaal stap 5.2-5.4 en/of u kunt ook met verschillende incubatie temperaturen (Zie de opmerking in stap 5.3).
- Combineer de opnieuw lysed pellet met het opgeslagen supernatant en gaan.
Opmerking: Visuele inspectie is geen garantie voor voldoende lysis. Spijsvertering-efficiëntie moet objectief worden vastgesteld zoals in stap 6.5.6.
- Mix 6 µL van de cellen met 6 µL van Trypan Blue op een dia en dek met een dekglaasje aan. Bekijken onder een microscoop.
6. eerste beperkingsspijsvertering
- Voeg 30 μL van 10 x restrictie-enzym buffer (opgegeven door de fabrikant) en 27 μL van 20% Triton X-100 (laatste 1,8%) tot de schorsing van stap 5.4. Zodat het totale volume 300 µL met H2O.
Opmerking: De samenstelling van de restrictie-enzym-buffer zal afhangen van de RE gekozen in stap 1. - Verwijderen van een 15 μL aliquoot als een "Onverteerd control" en bewaren bij 4 ° C.
- Voeg toe 200 U RE1 aan de resterende reactiemengsel en na een nacht bebroeden bij de temperatuur die daartoe het enzym in een schudden verwarming blok met agitatie (900 rpm). De volgende dag, voeg een extra 200 U RE1 en blijven van de incubatie 's nachts.
- Verwijderen van een 15 μL aliquoot als een "Digested control" en bewaren bij 4 ° C.
-
Efficiëntie van de spijsvertering te bepalen:
- 82,5 µL van 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 tot de 15 µL monsters uit stappen 6.2 en 6.4 toevoegen. Voeg 2.5 µL van proteïnase K (20 mg/mL) en incubeer gedurende 1 uur bij 65 ° C.
- Voeg 100 µL van fenol-chloroform en meng krachtig door inversie te verwijderen van de resterende eiwit besmetting. Centrifugeer gedurende 5 min, 16.100 x g bij kamertemperatuur.
- De waterfase overbrengen in een nieuwe buis. Voeg 6.66 µL van 3 M natrium acetaat pH 5.2, 1 µL van 20 mg/mL glycogeen, en 300 µL van 100% ethanol (EtOH). Meng zachtjes door inversie en bij-80 ° C gedurende 1 uur.
- Centrifugeer gedurende 20 min bij 16.100 x g bij 4 ° C. Verwijder het supernatant, voeg 500 µL van 70% EtOH en Centrifugeer gedurende 5 min bij 16.100 x g bij RT.
- Verwijder het supernatant en de pellet bij kamertemperatuur drogen voor 2 min. resuspendeer de pellet in 50 µL van nuclease-vrije H2O.
- Bepalen digest efficiëntie door qPCR13,14 met behulp van de methode ∆∆Ct. Gebruik van de primer instellen niet flankerende een beperkingsplaats (zie stap 2.2.2) als het besturingselement van de normalisatie. Ga verder als de efficiëntie van de vertering is > 85%. Anders, de cellen pellet en herhaal stap 5.2 – 6,5, weglaten van de incubatie bij 65 ° C in stap 5.3.
7. eerste afbinding
- Warmte-inactivering de restrictie-enzym door het broeden van 20 minuten bij 65 ° C. Als alternatief, als het enzym niet warmte geïnactiveerd zijn, fenol-chloroform extract en ethanol neerslag het monster.
Opmerking: De hogere temperaturen van de inactivatie aanbevolen voor sommige restrictie-enzymen de eiwitten in de chromatine denatureren, en dit kan negatieve invloed hebben op de kwaliteit van de steekproef. Bovendien, is fenol: chloroform extractie niet ideaal, zoals het resulteert in het verlies van monster. - Overbrengen naar een conische tube van 50 mL en voeg 6 mL nuclease-vrije H2O, 700 µL van 10 x ligase buffer (660 mM Tris-HCl pH 7.5, 50 mM magnesiumchloride (MgCl2), 10 mM dithiothreitol (DTT), 10 mM adenosinetrifosfaat (ATP)), en 50 U T4 DNA Ligase. Meng voorzichtig door het zwenken en na een nacht bebroeden bij 16 ° C.
- Verwijder een hoeveelheid van 100 µL van het monster als het '' afbinding besturingselement ''.
-
Bepalen afbinding efficiëntie:
- Voeg 2.5 µL van proteïnase K (20mg/mL) en Incubeer 1 uur bij 65 ° C.
- Voeg 100 µL van fenol-chloroform en mix krachtig door inversie. Centrifugeer gedurende 5 min, 16.100 x g op RT.
- De waterfase overbrengen in een nieuwe buis. Voeg 6.66 µL van 3 M natrium acetaat pH 5.2, 1 µL van glycogeen, en 300 µL van 100% EtOH. Meng zachtjes door inversie en bij-80 ° C ongeveer 1U.
- Centrifugeer gedurende 20 min bij 16.100 x g bij 4 ° C. Verwijder het supernatant, voeg 500 µL van 70% EtOH en Centrifugeer gedurende 5 min bij 16.100 x g bij 4 ° C.
- Verwijder het supernatant en de pellet bij kamertemperatuur drogen. Resuspendeer de pellet in 20 µL van water en laden op een 0,6% agarose gel naast de "vertering besturingselementen" uit stap 6.5.
Opmerking: Een goed ligaturen monster moet worden weergegeven als een vrij krap, hoog moleculair gewicht band (Figuur 3). - Als de afbinding voldoende is, gaat u verder met stap 8. Anders, voeg verse ATP (1 mM eindconcentratie) en nieuwe ligase; na een nacht bebroeden bij 16 ° C en herhaal stap 7.3 – 7.4.
8. keren dwarsbinding en isoleren van chromatine
- Voeg 15 µL van proteïnase K (20 mg/mL) en na een nacht bebroeden bij 65 ° C tot cross-links omkeren.
- Voeg 30 µL van RNase A (10 mg/mL) en incubeer 45 min bij 37 ° C.
- Voeg 7 mL fenol-chloroform en mix krachtig door inversie. Centrifuge 15 min, 3300 x g op RT.
- De waterfase overbrengen in een nieuwe tube van 50 mL en voeg 7,5 mL nuclease-vrije H2O (Verdun de DTT in de buffer ligase, die anders met het DNA precipitaten aanwezig), 1 mL 3 M natrium acetaat pH 5.6, 7 µL van glycogeen (20 mg/mL) , en 35 mL 100% EtOH. Meng en Incubeer bij-80 ° C gedurende 1 uur.
- Centrifuge 20 min, 3900 x g bij 4 ° C. Verwijder het supernatant (pellet mogelijk moeilijk te zien), wassen van de pellet met 10 mL ijskoud 70% EtOH en centrifuge 15 min, 3300 x g bij 4 ° C.
- Verwijder het supernatant en kort droog de pellet op RT. Los de pellet in 150 µL van 10 mM Tris-HCl pH 7.5 bij 37 ° C. Bewaren bij-20 ° C of gaat u verder met stap 9.
9. tweede beperkingsspijsvertering: Trimmen de cirkels
Opmerking: Deze stap maakt kleinere kringen om te minimaliseren van de oververtegenwoordiging van kleinere gevangen fragmenten als gevolg van PCR bias in downstream amplificatie stappen.
- Voeg aan het monster uit stap 8.6, 50 µL van 10 x restrictie-enzym buffer (opgegeven door de fabrikant), 300 µL van nuclease-vrije H2O en 50 U restrictie-enzym RE2. Na een nacht bebroeden bij de temperatuur die geschikt is voor de gekozen enzym.
- Verwijder een aliquot 15 µL van het monster als de "controle van de spijsvertering". Bepalen spijsvertering efficiëntie zoals beschreven in stap 6.5.
10. tweede afbinding en DNA zuivering
- Inactivering van de restrictie-enzym zoals aanbevolen door de fabrikant. Als het enzym niet warmte-geïnactiveerd zijn, verwijder het enzym met behulp van een kolom gebaseerde zuivering kit.
Opmerking: Als dit in het verlies van monster resulteert, zuivering van de kolom is niet ideaal. - Het monster overbrengen in een tube van 50 mL en voeg 12,1 mL nuclease-vrije H2O, 1,4 mL 10 x afbinding buffer (660 mM Tris-HCl, pH 7.5; 50 mM MgCl2; 10 mM DTT; 10 mM ATP) en 100 U T4 DNA ligase. Na een nacht bebroeden bij 16 ° C.
- Voeg 467 µL van 3 M natrium acetaat pH 5.6, 233 µL nuclease-vrije H2O, 7 µL glycogeen (20 mg/mL) en 35 mL 100% EtOH. Meng goed en Incubeer bij-80 ° C 1 h.
- Centrifuge 45 min, 3900 x g bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en voeg 10 mL koude 70% EtOH en centrifuge 15 min, 3300 x g bij 4 ° C.
- Verwijder het supernatant en kort droog de pellet bij kamertemperatuur. Voeg 150 µL van 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 en Incubeer bij 37 ° C te ontbinden de pellet.
- Zuiveren van de monsters met een silica kolom gebaseerde PCR zuivering kit, na instructies van de fabrikant. Gebruik 1 kolom per 3 x 106 cellen, gebaseerd op het eerste nummer van de cellen. Elueer de kolommen met 50 µL van 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 en bundelen van de monsters.
- Meten van de concentratie door fluorimetrie of spectrofotometrie met behulp van de extinctie op 260 nm. De 4C-sjabloon is nu klaar voor omgekeerde PCR. Bewaren bij-20 ° C of ga direct naar stap 11.
11. PCR versterken onbekende interagerende sequenties door omgekeerde PCR
- Het lineaire bereik van versterking bepalen door het uitvoeren van een PCR met behulp van de sjabloon verdunningen van 12,5, 25, 50 en 100 ng 4C-sjabloon. Indien gewenst, versterken van gDNA parallel aan de rechtstreeks vergelijken producten teneinde niet-specifieke versterking. Uitvoeren van PCR reacties met behulp van een eerste denaturatie bij 94 ° C gedurende 2 minuten; 30 cycli, bestaande uit een denaturatie stap bij 94 ° C gedurende 10 s, een onthardende stap bij 55 ° C gedurende 1 minuut, en een stap in de uitbreiding bij 68 ° C gedurende 3 minuten; en een laatste uitbreiding bij 68 ° C gedurende 5 min.
- Aparte 15 µL van elke PCR product op een 1,5% agarose gel te bevestigen lineaire versterking en beoordelen van de kwaliteit van de sjabloon (Figuur 4). Versterking van 4C sjabloon moet opleveren discrete "banding" bij lage concentraties van DNA en een uitstrijkje bij hogere concentraties. De aanwezigheid van de uitstrijkjes geeft aan grotere complexiteit van het versterkte 4C-ligations.
-
Wanneer tevreden met de kwaliteit en kwantiteit van het omgekeerde PCR product gegenereerd, stelt u een qPCR om te bepalen van het optimale aantal cycli te gebruiken voor versterking:
- Instellen van de reacties met SYBR en ROX kleurstoffen met behulp van het reactiemengsel in tabel 2. Tenzij de versterking niet lineair bij hoge concentraties in stap 11.2, gebruik 100 ng van de sjabloon per reactie is.
Opmerking: De toevoeging van ROX vergemakkelijkt de normalisering van fluorescent signaal van goed tot goed en de cyclus tot cyclus. - Uitvoeren van de PCR reacties met behulp van een eerste denaturatie bij 94 ° C gedurende 2 minuten; 40 cycli, bestaande uit een denaturatie stap bij 94 ° C gedurende 10 s, een onthardende stap bij 55 ° C gedurende 1 minuut, en een stap in de uitbreiding bij 68 ° C gedurende 3 minuten; en een laatste uitbreiding bij 68 ° C gedurende 5 min.
- Bepaal de piek (eindpunt) fluorescentie van de reacties met behulp van de amplificatie plot. Het bepalen van de cyclus waarop reacties 25% van de piek fluorescentie (Figuur 5 bereiken).
Opmerking: Dit is het aantal cycli die worden gebruikt voor het versterken van de 4C-bibliotheken (zie stap 11.4).
- Instellen van de reacties met SYBR en ROX kleurstoffen met behulp van het reactiemengsel in tabel 2. Tenzij de versterking niet lineair bij hoge concentraties in stap 11.2, gebruik 100 ng van de sjabloon per reactie is.
- Omgekeerde PCR zoals in tabel 3 instellen om aan te vullen van onbekende sequenties afgebonden om het aas uit de sjabloon van 4 C. Verdeel in 16 reacties van 50 µL voordat u. Uitvoeren van PCR reacties met behulp van een eerste denaturatie bij 94 ° C voor 2 min en cycli dat bestaat uit een denaturatie stap bij 94 ° C gedurende 10 s, een gloeien stap bij 55 ° C gedurende 1 minuut, en een stap in de uitbreiding bij 68 ° C gedurende 3 minuten op het aantal cycli in stap 11.3.3 vastgesteld.
- Verzamelen en bundelen van de reacties. Zuiveren met behulp van een kit kolom gebaseerde PCR zuivering van siliciumdioxide. Gebruik minstens 2 kolommen per 16 reacties. Zwembad de gezuiverde PCR producten.
- Het bepalen van de hoeveelheid van het monster en de zuiverheid door spectrofotometrie. Typische opbrengsten zijn tussen 10 en 20 μg met A260/A280 ~ 1,85. Als de absorptie ratio's sub-optimale, opnieuw zuiveren om te voorkomen dat de problemen tijdens het rangschikken.
- Beoordelen van de complexiteit van de bibliotheek door het scheiden van 300 ng van gezuiverde PCR product op een 1,5% agarose gel.
Opmerking: Versterkte product moet lijken op die van stap 11.2.
12. derde beperkingsspijsvertering: Trim uit aas sequenties
Opmerking: Deze stap verwijdert niet-informatieve aas sequenties van de omgekeerde PCR producten te maximaliseren informatieve gevangen sequenties in de stroomafwaartse sequencing stappen. Als u wilt controleren digest efficiëntie, wordt een "digest monitor"15 verteerd in parallel gebruik van gelijkwaardige DNA en enzym concentraties. Als RE1 en RE2 voor gelijktijdige spijsvertering stroken, bijvoorbeeld moet als gevolg van verschillende optimale incubatie temperaturen of reactie buffers, dit gebeuren als een sequentiële digest (dit is niet ideaal).
- Verkrijgen van een RE-digest monitor en test de spijsvertering in de reactie van een 50 µL.
Opmerking: Dit is een molecule van dsDNA (bijvoorbeeld een plasmide, PCR amplicon of synthetisch DNA) waarin de RE (s). De enige vereiste is dat het moet gemakkelijk te onderscheiden van knippen van Onbesneden monitor op een agarose gel. Optimaliseren RE monitor massa en enzym concentratie indien nodig. - Digest 1 µg van gezuiverde omgekeerde PCR-product van stap 11,6 en, tegelijkertijd, de RE-monitor uit stap 12.1.
Opmerking: DNA en de concentratie van enzym, evenals de incubatietijd, moet dezelfde als voor de samenvatting van de test in stap 12.1 voor zowel het omgekeerde PCR product en de monitor verteert. Stel het volume van de reactie als nodig. - Voer de verteerd RE monitor op een agarose gel van concentratie geschikt is voor de verwachte fragmenten. Spijsvertering is toereikend geacht wanneer < 10% van het DNA blijft Onbesneden (Figuur 6).
- Zuiveren het verteerd omgekeerde PCR-product op een kit kolom gebaseerde DNA zuivering van siliciumdioxide. Als sequentiële verteert vereist zijn, herhaalt u stappen 12,1 – 12.4 met het tweede enzym.
13. bereiding van de rangschikking van de bibliotheek
-
De adapters die compatibel zijn met de respectieve volgende generatieplatform voor sequencing afbinden.
- De adapters voor elke RE1 en RE2 zo ontwerpen dat, na gloeien de oligos, elke RE-adapter heeft de respectieve 1-zijdige overhang.
Opmerking: bijvoorbeeld als HindIII wordt gebruikt, de ontharde adapter moet bevatten een overstek 5' phosphorylated "AGCT". Als alternatief, als standaard T-overstek adapters worden gebruikt, eind-reparatie en A-staart de bibliotheek vóór adapter afbinding. - Ontharden de respectieve adapter RE oligos. Resuspendeer de oligos in onthardende buffer (10 mM Tris, pH 7.5, 50 mM natriumchloride (NaCl), 1 mM EDTA), mix in mengsel hoeveelheden tot 50 µM, warmte tot 95 ° C, en laat afkoelen langzaam tot 25 ° C.
- De afbinding reactie uit te voeren. Meng opnieuw verteerd 4 C bibliotheek met een totale 5 - tot 10 keer molaire overmaat van ontharde adapters (stap 13.1.2; 50:50 verhouding voor elk RE-adapter gebruikt) in 1 x ligase buffer en voeg 6U DNA ligase. Incubeer volgens de instructies van de fabrikant.
- Verwijder overtollige adapters door zuiveren met behulp van een lage-elutievolume silica gebaseerde kolom kit.
- De adapters voor elke RE1 en RE2 zo ontwerpen dat, na gloeien de oligos, elke RE-adapter heeft de respectieve 1-zijdige overhang.
-
Grootte-select.
Opmerking: Maat keuze kan ook worden uitgevoerd met behulp van een kraal gebaseerde opruimen kit en zelfs na zuivering van de kolom wordt aanbevolen.- Gegoten een 2% agarose gel met een hoge resolutie agarose, het toevoegen van een niet-UV vlek vóór het gieten. Ervoor zorgen dat geen water verloren als gevolg van verdamping tijdens de verwarming is vervangen door de fles of kolf af te wegen voor en na verwarming en water om te herstellen van de verloren massa toe te voegen.
- De adapter-afgebonden bibliotheken op de gel, verlaten van lege rijstroken tussen de monsters worden uitgevoerd.
- De segmenten van de gel overeenkomend met de grootte bereik 150 bp tot 1 kb met een schone scalpel of scheermesje accijnzen.
- Zuiveren van de bibliotheken van de gel met een gel-kit voor extractie. Los om te minimaliseren GC bias in het herstel van DNA, de segmenten van de gel bij kamertemperatuur met rotatie.
- Bepaal het aantal cycli voor PCR versterking door qPCR met behulp van het reactiemengsel in tabel 4. Uitvoeren van PCR reacties met behulp van een eerste denaturatie bij 98 ° C gedurende 2 minuten en 40 cycli, bestaande uit een denaturatie stap bij 98 ° C gedurende 10 s, een onthardende stap bij 60 ° C gedurende 1 minuut, en een stap in de uitbreiding bij 72 ° C gedurende 3 minuten.
Opmerking: De cyclus waarop fluorescentie 25% van het maximumbedrag bereikt is het aantal cycli die worden gebruikt voor het versterken van de bibliotheek, zoals in stap 11.3. - Versterken van de bibliotheken met behulp van het reactiemengsel in tabel 5. Uitvoeren van PCR reacties met behulp van een eerste denaturatie bij 98 ° C voor 2 min en cycli dat bestaat uit een denaturatie stap bij 98 ° C gedurende 10 s, een onthardende stap bij 60 ° C gedurende 1 minuut, en een stap in de uitbreiding bij 72 ° C gedurende 3 minuten. Het aantal amplificatie cycli worden gebruikt voor elke bibliotheek werd bepaald in stap 13,3.
- Zuiveren van versterkte bibliotheken met behulp van een lage-elutievolume silica gebaseerde kolom kit.
14. sequencing en analyse van het rangschikken van gegevens
- Het bepalen van de concentraties van versterkte bibliotheken met behulp van een fluorimetrische assay. Verdun de bibliotheken om de juiste concentratie voor sequencing (Controleer de sequencing dienst of core voor hun aanbeveling).
- Bepalend voor de kwaliteit van de bibliotheken met behulp van een microfluidic platform voor de analyse van de nucleic zuur.
Opmerking: Het profiel van de grootte van de bibliotheek die gezien op de grootte selectie gel in stap 13.2 moet spiegelen en de concentratie van het monster bepaald in deze stap is om te worden gebruikt voor het rangschikken. - Zwembad geïndexeerd bibliotheken te verkrijgen van ten minste 3 miljoen leest (ten minste 50 bp lezen; één [1 X 50] of gekoppelde einde [2 X 50]) per monster. Een kwalitatief hoogwaardige bibliotheek vereist ten minste 1 miljoen toegewezen leest9, maar zal er sommige uitputtingsslag tijdens toewijzing. Bijvoorbeeld, een sequencing-platform dat de opbrengst van ongeveer 150 miljoen leest per rijstrook is geschikt voor maximaal 50 monsters in een enkele rijstrook.
15. analyse van sequencedata
- Demultiplex de gegevens met behulp van de index sequenties het luidt als volgt toewijzen aan hun geschikte monsters.
Opmerking: Afhankelijk van hun vertrouwdheid, gebruikers kunnen uitvoeren downstream computationele analyses van ruwe FASTA/FASTQ bestanden met reeksen met behulp van de eenvoudige interface van de bevellijn of, subsidiair, de gebruiksvriendelijke, web-based Galaxy grafische user interface (GUI)16 . - Trim adapter sequenties en een aas-reeks die voortvloeien uit onvolledige RE spijsvertering in stap 12, bijvoorbeeld, met behulp van de FAST-X Toolkit (http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/).
- Demultiplexed leest toewijzen aan de juiste genoom van belang (bv., UCSC mm10, hg19) met behulp van het Burrows-Wheeler Aligner (BWA)-17 of andere software van de uitlijning resulterend in SAM uitvoerbestanden. Indien nodig, bestanden omzetten in SAM BAM via samtools18 (zie stap 15,4-inch).
- Gebruik een 4C-seq analyse pijpleiding zoals Basic4Cseq19, 4 C-ker20, FourCSeq21of fourSig22 te analyseren van de gegevens en identificeren van de interacties.
Opmerking: Data-analyse en de beoordeling van de kwaliteit daarvan moeten worden uitgevoerd volgens de geselecteerde softwarepakket de reference manual. Pakketten genereren BED uitvoerbestanden tenzij anders aangegeven. Kort, Basic4CSeq19 gebruikt een invoerbestand SAM (stap 15.3) om te visualiseren van de interacties (txt, tiff, BED en pruik uitvoerbestanden) en beoordeelt de kwaliteit van de gegevens op basis van de criteria uiteengezet in van de Werken, et al.. 9 4 C-ker20 (ingang getrimd FASTQ, stap 15.2) en FourCSeq21 (input BAM, stap 15.3) identificeren differentiële interacties tussen voorwaarden. fourSig22 (input SAM) ook identificeert belangrijke interacties en prioriteit die dreigen te worden gereproduceerd. Hulpmiddelen zoals de Genomic regelgevende verrijking van aantekeningen Tool (grote)23of integratie met ENCODE gegevenssets kunnen ook worden gebruikt om te voorspellen van de biologische functie van interacties ontdekt door 4 C-seq.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Primaire menselijke keratinocyten werden geïsoleerd van de afgedankte neonatale foreskins 2 – 3, gebundelde en gekweekte in KSFM aangevuld met 30 µg/mL boviene hypofyse extract, 0,26 ng/mL recombinante menselijke epidermale groeifactor, en 0.09 mM calciumchloride (CaCl2 ) bij 37 ° C, 5% kooldioxide. De cellen werden opgesplitst in twee maatkolven, en één kolf werd onderscheiden door de toevoeging van CaCl2 om een eindconcentratie van 1.2 mM voor 72 h. 107 cellen van prolifererende en gedifferentieerde Keratinocyt populaties werden vastgesteld in 1% formaldehyde gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Afzonderlijk, werden K562 cellen gekweekt in RPMI aangevuld met 10% foetale runderserum bij 37 ° C, 5% kooldioxide. 107 cellen werden vastgesteld in 1% formaldehyde gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
De cellen waren lysed, en de vaste chromatine werd verteerd met HindIII en afgebonden zoals hierboven beschreven. Cross-links werden teruggedraaid, en het DNA is gezuiverd en verteerd met CviQI. DNA werd afgebonden en gebruikt als sjabloon voor omgekeerde PCR versterking. Inleidingen gebruikt werden: 5'-GATCAGGAGGGACTGGAACTTG/5 '-CCTCCCTTCACATCTTAGAATG. 1 µg van gezuiverde omgekeerde PCR product werd 's nachts met CviQI verteerd parallel met 225 ng van RE verteren monitor en kolom-gezuiverd. Gezuiverde DNA werd vervolgens verteerd 's nachts met HindIII parallel met 125 ng van RE verteren monitor en kolom-gezuiverd. 250 ng van gezuiverde dubbel-verteerd omgekeerde PCR product werd gebruikt voor de voorbereiding van de bibliotheek. Kortom, de uiteinden werden gerepareerd via conversies naar 5'-phosphorylated en bot-ends en latere DNA kolom-zuivering. Uiteinden waren A-tailed 20 min bij 72 ° C in de reactie van een 50 µL met 1 U Taq polymerase en dATP van 200 µM en kolom-gezuiverd. Compatibel sequencing bibliotheek prep adapters werden afgebonden met een verhouding van 10:1 (adapter: DNA) met behulp van T4 DNA ligase in een 30 µL reactie bij kamertemperatuur voor 15 min en het DNA kolom-gezuiverd. Bibliotheken zijn uitgevoerd op een 2% agarose gel, gel segmenten werden gesneden van 120 bp naar de top van de ladder te verwijderen adapters en bibliotheken werden gezuiverd. 200 pg van elke bibliotheek zijn geëvalueerd in 10 µL qPCR reacties met indexing inleidingen om te bepalen van de optimale PCR versterking cycli. Bibliotheken werden versterkt om toe te voegen van indexen met behulp van het aantal cycli bepaald door qPCR en sequenced op een HiSeq2500 voor 1 x 50 leest.
Leest waren demultiplexed en bijgesneden. Eerst, sequencing adapters werden verwijderd. Vervolgens was de volgorde van het begin van elke primer naar de beperkingsplaats bijgesneden. Hierdoor kan de toewijzing van omgekeerde PCR producten die waren niet volledig verteerd voorafgaand aan de voorbereiding van de bibliotheek. Nog belangrijker is, met inbegrip van de sequentie tussen de primer bindende site en de beperkingsplaats voorkomt u dat niet-specifiek vergrote PCR product in kaart te brengen. Bijgesneden leest werden toegewezen aan hg38 met behulp van de BWA. Afbeelding 7 toont leest toewijzing aan de regio rondom het gezichtspunt.
Figuur 1: schematische van 4C-seq workflow. Chromatine is kruiselings gekoppelde voor het behoud van de eiwit-DNA contacten met RE1 verteerd en afgebonden om te koppelen van interagerende loci. Cross-links zijn omgedraaid en DNA wordt verteerd met RE2 en afgebonden. Onbekende interagerende sequenties zijn versterkt gebruikend inleidingen die zich aan de regio van belang binden, en PCR producten met RE1 en RE2 trim bekende opeenvolgingen zijn verteerd. Versterkte DNA van onbekende reeks wordt gebruikt in een volgorde bibliotheek prep, waarin de adapters worden afgebonden en de bibliotheek is PCR-versterkte en gesequenceerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: schema van de primer ontwerpen. (A) bindende sites voor omgekeerde PCR inleidingen. De inleidingen zijn georiënteerd "naar buiten" (dwz., de 5' primer is een primer "omgekeerde", ter aanvulling van de plus strand, terwijl de 3'-primer is een "forward" primer, complementair aan de min bundel) en binden binnen 50 bp van elke beperkingsplaats (aangegeven door rode arcering). (B) bindende sites voor qPCR inleidingen voor bepaling van rendement van restrictie-enzym digest. Een primer paar flanks elke restrictie-enzym-site. Een primer besturingsset versterkt een reeks dat geen een site voor een enzym bevat en wordt gebruikt om te normaliseren Ct waarden voor DNA input. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Agarose de Elektroforese van het gel voor de beoordeling van de efficiëntie van de afbinding van chromatine RE1-verteerd. Onbesneden, HindIII-verteerd en ligaturen monsters werden behandeld met proteïnase K en verwarmd om om te keren cross-links, fenol: chloroform uitgepakt, EtOH geprecipiteerde en geresuspendeerde in H2O. gezuiverd DNA werd uitgevoerd op een 0,6% agarose gel en bands gevisualiseerd door ethidiumbromide kleuring met vergelijking aan 1 kb plus ladder. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Sjabloon titratie van figuur 4: 4C voor de omgekeerde PCR. Seriële verdunningen werden gemaakt van 4C sjablonen en gebruikt in omgekeerde PCR reacties. PCR producten waren op 1,5% agarose gel in werking en gevisualiseerd door ethidiumbromide kleuring naast 1 kb plus ladder. NTC duidt neen-template controle reactie. Opmerking een oereenstemming stijging versterking met een toename van de concentratie van de sjabloon. Deze vertegenwoordiger versterking werd uitgevoerd op chromatine gekloofd met HindIII als RE1 en CviQI als RE2, en primer sequenties gebruikt voor omgekeerde PCR versterking werden 5'-GATCAGGAGGGACTGGAACTTG/5 '-CCTCCCTTCACATCTTAGAATG. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: qPCR-gemedieerde bepaling van versterking cycli die nodig zijn voor het versterken van de sjabloon voor omgekeerde PCR. 4C sjablonen werden versterkt in reacties met 1 x SYBR Green en 1 x ROX in een real-time thermocycler. Piek fluorescentie werd bepaald en het aantal cycli verplicht te bereiken ¼ van piek fluorescentie werd berekend. Dit aantal cycli werd gebruikt voor het versterken van de 4C-sjabloon voor omgekeerde PCR. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: Agarose de Elektroforese van het gel van RE monitor geven voldoende spijsvertering verteerd. RE digest was monitor versterkt uit menselijke genomic DNA met behulp van de inleidingen F:-5'-TCCTATCCCTGGTCTGTCTTAT en R: 5'-CCACATTGGTCCTTCTAGTCTTC en gezuiverd. 225 ng van monitor was verteerd met 15 U CviQI in een 50 µL reactie bij 25 ° C's nachts en op een 1,5% agarose gel naast 1 kb plus ladder in werking. Bands waren gevisualiseerd met ethidium bromide kleuring. De monitor van de Onbesneden is 2515 bp; verwacht fragment maten zijn 132, 343, 488, 539 en 1013 bp. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7: vertegenwoordiger genomic spoor van Lees dekking binnen 5 kb van de regio gezichtspunt. Leest gebruikten getrimd en toegewezen aan hg38 BWA. De meerderheid van de leest (blauwe pieken) uitlijnen op HindIII of CviQI HindIII sites, naast sites zoals verwacht. De regio gezichtspunt is rood gemarkeerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Volume voor 1 x | |
| 10 x vouw lange sjabloon Buffer 1 | 2.5 ΜL |
| dNTPs (10 mM) | 0,5 ΜL |
| Voorwaartse primer | 35 pmol |
| Omgekeerde primer | 35 pmol |
| Vouw lange sjabloon Polymerase (5 U/µL) | 0.35 ΜL |
| DNA | |
| Nuclease-gratis water | tot 25 µL |
Tabel 1: PCR reactiemengsel voor de versterking van 4C sjabloon (stap 11.1).
| Volume voor 1 x | |
| 10 x vouw lange sjabloon Buffer 1 | 1.5 ΜL |
| dNTPs (10 mM) | 0,3 ΜL |
| Voorwaartse primer | 21 pmol |
| Omgekeerde primer | 21 pmol |
| 100 x SYBR groene ik | 0,15 ΜL |
| 50 x ROX | 0,3 ΜL |
| Vouw lange sjabloon Polymerase (5 U/µL) | 0.21 ΜL |
| DNA | 100 ng |
| Nuclease-gratis water | tot 25 µL |
Tabel 2: qPCR reactiemengsel voor de bepaling van het aantal amplificatie cycli voor omgekeerde PCR (stap 11.3.1).
| Volume voor 1 x | |
| 10 x vouw lange sjabloon Buffer 1 | 80 ΜL |
| dNTPs (10 mM) | 16 ΜL |
| Voorwaartse primer | 1.12 nmol |
| Omgekeerde primer | 1.12 nmol |
| Vouw lange sjabloon Polymerase (5 U/µL) | 11.2 ΜL |
| DNA | 3.2 µg |
| Nuclease-gratis water | tot 800 µL |
Tabel 3. PCR reactiemengsel voor de definitieve omgekeerde PCR versterking van 4C sjabloon (stap 11.4).
| Volume voor 1 x | |
| 5 x Phusion HF buffer | 2 ΜL |
| dNTPs (10 mM) | 0.2 ΜL |
| Miltiplexing Primer 1.0 | 5 pmol |
| Miltiplexing Primer 2.0 | 0.1 pmol |
| Index primer | 5 pmol |
| 100 x SYBR groene ik | 0.1 ΜL |
| 50 x ROX | 0.2 ΜL |
| Phusion polymerase | 0.1 ΜL |
| DNA | 2 ΜL |
| Nuclease-gratis water | tot 10 µL |
Tabel 4: qPCR reactiemengsel voor de bepaling van het aantal amplificatie cycli voor sequencing bibliotheek prep (stap 13.3).
| Volume voor 1 x | |
| 5 x Phusion HF buffer | 10 ΜL |
| dNTPs (10 mM) | 1 ΜL |
| Miltiplexing Primer 1.0 | 25 pmol |
| Miltiplexing Primer 2.0 | 0.5 pmol |
| Index primer | 25 pmol |
| Phusion polymerase | 0,5 ΜL |
| DNA | 10 ΜL |
| Nuclease-gratis water | tot 50 µL |
Tabel 5: PCR reactiemengsel voor de amplificatie van bibliotheken voor sequencing (stap 13.4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
4C resultaten hebben het potentieel om te openbaren chromatine interacties die voorheen onbekende regelgevende elementen kunnen aanduiden en/of doelgenen die belangrijk in een specifieke biologische context24,25,26 zijn. Technische hindernissen kunnen echter de gegevens uit deze experimenten beperken. PCR bias die voortvloeien uit over-amplificatie van sjabloon in 4 C protocollen is waarschijnlijk. Dit protocol behandelt deze kwestie door gebruik te maken van qPCR om te bepalen van dat het optimale aantal amplificatie cycli op een objectieve manier. Bovendien, kan de verwijdering van de aas-sequenties van versterkte omgekeerde PCR producten door beperking digest vergemakkelijken de identificatie van chromatine interacties om twee redenen. Ten eerste, het vermindert de lengte van de niet-informatieve (aas) basenparen van het materiaal worden sequenced. Ten tweede, en dientengevolge, vergroot het de kans dat meer leest zal worden gegenereerd uit diverse reeksen (een eigenschap vereist voor nauwkeurige basis gesprekken) en dus informatiever interagerende sequenties kunnen worden toegewezen. Andere protocollen vereisen de bundeling van de vele bibliotheken met behulp van verschillende aas sequenties en/of enzymen van de beperking of vereisen verhogen de concentratie phiX van het gesequenceerd monster te omzeilen van de reeks uniformiteit kwestie voor nauwkeurige basis roepen. Met deze methode kunt meerdere monsters met dezelfde aas volgorde te worden gebundeld in een enkele sequencing baan zonder te bezetten waardevolle sequencing capaciteit met overtollige phiX.
Cel fixatie en lysis zijn kritische vroege stappen, die beide optimalisatie dat bepaalde celtypen eisen kunnen. Onvoldoende fixatie mislukt voor het behoud van specifieke contacten tussen een gebied van belang en haar interactie sequenties, uninformative gegevens gedomineerd door lawaai oplevert. Daarentegen zal overmatige fixatie verminderen het vermogen van restrictie-enzymen te klieven chromatine, wat resulteert in minder informatief afbinding gebeurtenissen. Zowel de kleefpoeders concentratie en de incubatietijd kunnen worden gewijzigd voor het optimaliseren van deze variabele. Lysis van de cel onvoldoende reduceert ook toegang van restrictie-enzymen tot chromatine, opnieuw het aantal informatieve afbinding gebeurtenissen te verminderen. In onze handen lysed menselijke primaire keratinocyten meest effectief gebruik maken van een combinatie van hypotone voorwaarden en afwasmiddel. Andere celtypes wellicht lysis van de verschillende voorwaarden, die zal moeten worden empirisch bepaald. Lysis van de efficiënte kan worden geïdentificeerd door microscopie kleurstof uitsluiting methoden zoals Trypan blauw kleuring.
Een beperking van de 4C-methode is dat de resultaten slechts een gemiddelde bevolking kunnen vertegenwoordigen. Met een heterogene celpopulatie kan het moeilijk te bepalen waar interacties vs. geluid ontstaat door biologische variabiliteit. Terwijl het gebruik van een cellijn of het sorteren van de cellen tot een homogene celpopulatie wordt voorspeld voor het genereren van duidelijkere signalen, is variabiliteit tussen de afzonderlijke cellen nog steeds een mogelijke bron van lawaai. Recente vooruitgang in eencellige sequencing technologieën hebben het potentieel om dit probleem te overwinnen. Bovendien, kan de validatie van bevolking gebaseerde 4C resultaten worden uitgevoerd met behulp van methoden zoals digitale druppel PCR of vis om te bepalen als deze resultaten worden weerspiegeld op het niveau van eencellige.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door NIAMS (R01AR065523).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HindIII | NEB | R0104S | |
| CviQI | NEB | R0639S | |
| DNA oligonucleotide primers | IDT | To be designed by the reader | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 06-443-19 | |
| 1.7 mL microcentrifuge tubes | MidSci | AVSS1700 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher | 14190-136 | |
| Formaldehyde, methanol free | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Nutator | VWR | 15172-203 | |
| Glycine | JT Baker | 4059-00 | |
| Benchtop centrifuge | |||
| Refrigerated microcentrifuge | |||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ED2SS | |
| 20% SDS solution | Sigma-Aldrich | 05030 | |
| Trypan Blue | Thermo Fisher | 15250061 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Cover slips | VWR | 16004-094 | |
| Light microscope | |||
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | |
| Shaking heat block | |||
| 2 M Tris-HCl | Quality Biological | 351-048-101 | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1) | Sigma-Aldrich | P2069 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | M5661 | |
| 20 mg/mL glycogen | Thermo Fisher | R0561 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-223 | |
| Nuclease-free water | Fisher Scientific | MT-46-000-CM | |
| qPCR cycler | Thermo Fisher | 4453536 | |
| qPCR plates | Thermo Fisher | 4309849 | |
| Thermocycler | Thermo Fisher | 4375786 | |
| PCR strip tubes | MidSci | AVSST-FL | |
| 1 M Magnesium chloride | Quality Biological | 351-033-721 | |
| Dithiothreotol | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| Adenosine triphosphate | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A6013 | |
| RNase A | Thermo Fisher | EN0531 | |
| Qiaquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| MinElute PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | |
| Spectrophotometer | |||
| Expand Long Template PCR System | Sigma-Aldrich | 11681834001 | |
| dNTP mix | Thermo Fisher | R0191 | |
| SYBR Green I | Sigma-Aldrich | S9430 | |
| ROX | BioRad | 172-5858 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| End-It DNA End-Repair Kit | Lucigen | ER0720 | |
| LigaFast Rapid DNA Ligation System | Promega | M8221 | |
| SYBR Safe | Thermo Fisher | S33102 | |
| Taq Polymerase | NEB | M0267S | |
| UltraSieve Agarose | IBI Scientific | IB70054 | |
| Qiaquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 |
References
- Dunham, I., et al. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Hoffman, M. M., et al. Integrative annotation of chromatin elements from ENCODE data. Nucleic Acids Research. 41 (2), 827-841 (2013).
- Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N.
- Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. The long-range interaction landscape of gene promoters. Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).
- Li, G., et al. Extensive promoter-centered chromatin interactions provide a topological basis for transcription regulation. Cell. 148 (1-2), 84-98 (2012).
- Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).
- Zhao, Z., et al. Circular chromosome conformation capture (4C) uncovers extensive networks of epigenetically regulated intra- and interchromosomal interactions. Nature genetics. 38 (11), 1341-1347 (2006).
- Splinter, E., de Wit, E., van de Werken, H. J. G., Klous, P., de Laat, W. Determining long-range chromatin interactions for selected genomic sites using 4C-seq technology: From fixation to computation. Methods. 58 (3), 221-230 (2012).
- Van De Werken, H. J. G., et al. 4C technology: Protocols and data analysis. Methods in Enzymology. 513, Elsevier Inc. (2012).
- Brouwer, R. W. W., van den Hout, M. C. G. N., van IJcken, W. F. J., Soler, E., Stadhouders, R. Unbiased Interrogation of 3D Genome Topology Using Chromosome Conformation Capture Coupled to High-Throughput Sequencing (4C-Seq). Eukaryotic Transcriptional and Post-Transcriptional Gene Expression Regulation. , 199-220 (2017).
- Matelot, M., Noordermeer, D. Determination of High-Resolution 3D Chromatin Organization Using Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq). Polycomb Group Proteins: Methods and Protocols. , 223-241 (2016).
- Gheldof, N., Leleu, M., Noordermeer, D., Rougemont, J., Reymond, A. Detecting Long-Range Chromatin Interactions Using the Chromosome Conformation Capture Sequencing (4C-seq) Method. Gene Regulatory Networks: Methods and Protocols. , 211-225 (2012).
- Göndör, A., Rougier, C., Ohlsson, R. High-resolution circular chromosome conformation capture assay. Nature. 3 (2), 303-313 (2008).
- Hagège, H., et al. Quantitative analysis of chromosome conformation capture assays (3C-qPCR). Nature. 2 (7), 1722-1733 (2007).
- Anand, R. D., Sertil, O., Lowry, C. V. Restriction digestion monitors facilitate plasmid construction and PCR cloning. BioTechniques. 36 (6), 982-985 (2004).
- Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic acids research. 44 (W1), W3-W10 (2016).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Walter, C., Schuetzmann, D., Rosenbauer, F., Dugas, M. Basic4Cseq: An R/Bioconductor package for analyzing 4C-seq data. Bioinformatics. 30 (22), 3268-3269 (2014).
- Raviram, R., et al. 4C-ker: A Method to Reproducibly Identify Genome-Wide Interactions Captured by 4C-Seq Experiments. PLoS Computational Biology. 12 (3), (2016).
- Klein, F. A., Pakozdi, T., Anders, S., Ghavi-helm, Y., Furlong, E. E. M., Huber, W. FourCSeq: analysis of 4C sequencing data. Bioinformatics. 31 (19), 3085-3091 (2015).
- Williams, R. L. Jr, et al. fourSig a method for determining chromosomal interactions in 4C-Seq data. Nucleic Acids Research. 42 (8), (2014).
- McLean, C. Y., et al. GREAT improves functional interpretation of cis-regulatory regions. Nature Biotechnology. 28 (5), 495-501 (2010).
- Stolzenburg, L. R., et al. Regulatory dynamics of 11p13 suggest a role for EHF in modifying CF lung disease severity. Nucleic Acids Research. 45 (15), 8773-8784 (2017).
- Meddens, C. A., et al. Systematic analysis of chromatin interactions at disease associated loci links novel candidate genes to inflammatory bowel disease. Genome Biology. 17 (1), 1-15 (2016).
- Yeung, J., et al. Transcription factor activity rhythms and tissue-specific chromatin interactions explain circadian gene expression across organs. Genome research. , 207787 (2017).
