Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Høj overførselshastighed identifikation af regulerende gensekvenser ved hjælp af næste generations sekventering af cirkulære kromosom kropsbygning Capture (4C-seq)

Published: October 5, 2018 doi: 10.3791/58030
Automatic Translation
1, 1, 1
1Division of Dermatology, Center for Pharmacogenomics, Center for the Study of Itch, Department of Medicine, Washington University School of Medicine

Summary

Identifikation af fysiske interaktion mellem gener og regulerende elementer er udfordrende men er blevet fremmet af kromosom kropsbygning fange metoder. Denne ændring i 4C-seq protokollen afbøder PCR bias ved at minimere overdreven forstærkning af PCR skabeloner og maksimerer mappability af læser ved at indarbejde en tilføjelse begrænsning enzym digest trin.

Abstract

Identifikation af regulerende elementer for en given mål gen udgør en betydelig teknisk udfordring som følge af variabiliteten i positionering og virkning størrelser af regulerende elementer til en mål-genet. Har gjort nogle fremskridt med bioinformatic forudsigelse af eksistensen og funktion af proksimale epigenetiske ændringer forbundet med aktiveret genekspression ved hjælp af bevarede transskription faktor bindingssteder. Kromatin kropsbygning capture undersøgelser har revolutioneret vores evne til at opdage fysiske kromatin kontakter mellem sekvenser og selv inden for en hele genom. Cirkulær kromatin kropsbygning capture kombineret med næste generation sequencing (4C-FF.), især, er designet til at opdage alle mulige fysiske kromatin interaktioner for en given sekvens af interesse (synspunkt), som et mål gen eller en regulerende forstærker. Nuværende 4C-seq strategier direkte sekvens fra inden for et synspunkt, men kræver talrige og forskelligartede synspunkter til at være samtidig sekventeret for at undgå de tekniske udfordringer ved uniform base ringer (imaging) med næste generation sequencing platforme. Denne mængde af eksperimenter kan ikke være praktisk for mange laboratorier. Her rapporterer vi en modificeret tilgang i 4C-seq-protokollen, der omfatter både en yderligere begrænsning enzym digest og qPCR-baseret forstærkning trin, der er designet til at lette en større fangst af forskelligartede sekvens læsninger og mindske risikoen for PCR bias, henholdsvis. Vores ændrede 4C metode er indstillet til standard molekylær biologi lab for at vurdere kromatin arkitektur.

Introduction

Identifikation af regulerende elementer for genekspression er blevet fremmet som encyklopædi af DNA elementer (INDKODE) projekt, der udførligt kommenteret funktionelle aktivitet for 80% af det menneskelige genom1,2. Identifikation af websteder for i vivo transskription faktor bindende, DNaseI overfølsomhed, og epigenetiske Histon og DNA methylering ændringer i enkelte celletyper banede vejen for de funktionelle analyser af kandidat regulerende elementer for target genekspression. Bevæbnet med disse resultater, står vi over for udfordringen, fastsættelse af den funktionelle sammenkobling mellem regulerende elementer og gener. Specifikt, hvad er forholdet mellem et givet mål gen og dets enhancer(s)? Metoden kromatin kropsbygning capture (3C) omhandler direkte dette spørgsmål ved at identificere fysiske, og sandsynligvis funktionelle, interaktioner mellem en region af interesse og kandidat interagere sekvenser gennem optagne begivenheder i faste kromatin3 . Som vores forståelse af kromatin interaktioner er steget, men er det klart, at undersøgelsen af forudvalgte kandidat loci er utilstrækkelige til at give en komplet forståelse af gen-forstærker interaktioner. For eksempel, ENCODE bruges metoden høj overførselshastighed kromosomale kropsbygning capture carbon copy (5C) til at undersøge en lille del af det menneskelige genom (1%, pilot sæt 44 loci) og rapporteret kompleks sammenkobling af loci. Gener og smagsforstærkere med konstaterede interaktioner i gennemsnit 2 – 4 forskellige interagerende partnere, hvoraf mange var hundredvis af kilobases væk i lineære plads4. Yderligere, Li al.. brugt kromatin interaktion analyse af forbundne-ende Tag sekventering (ChIA-PET) at analysere hele-genom promotor interaktioner og fandt, at 65% af RNA polymerase II bindingssteder var involveret i kromatin interaktioner. Nogle af disse interaktioner resulterede i store, multi gen komplekser spanning hundredvis af kilobases af genomisk afstand og indeholder i gennemsnit 8-9 gener hver5. Sammen, fremhæve disse resultater behovet for fordomsfri hele-genom metoder til spørgekriterierne kromatin interaktioner. Nogle af disse metoder er gennemgået i Schmitt mfl. 6.

Nyere metoder til kromatin kropsbygning capture undersøgelser kombineret med næste generation sequencing (Hi-C og 4C-seq) aktiver opdagelsen af ukendte sekvenser interagere med en region af interesse6. Specifikt, cirkulær kromosom kropsbygning opsamling med næste generation sequencing (4C-FF.) blev udviklet til at identificere loci interagere med en sekvens af interesse i en fordomsfri måde7 ved sekventering DNA fra erobrede kromatin proksimalt for den region af interesse i 3D-rum. Kort, kromatin er fastsat til at bevare sin oprindelige protein-DNA interaktioner, kløvet med en restriktion enzym, og efterfølgende forbundet fortyndet betingelser at fange biologisk relevante "tangles" af interagerende loci (figur 1). Cross links er vendt for at fjerne protein, hvilket giver DNA tilgængelige for ekstra kavalergang med en anden begrænsning enzym. En endelige ligatur genererer mindre cirkler af interagerende loci. Primere til sekvens af interesse er derefter bruges til at generere en forstærket bibliotek af ukendt sekvenser fra de circularized fragmenter, efterfulgt af downstream næste generation sequencing.

Protokollen præsenteres her, som fokuserer på prøveforberedelse, gør to væsentlige ændringer til eksisterende 4C-seq metoder8,9,10,11,12. Først, det bruger en qPCR-baseret metode til empirisk bestemme det optimale antal forstærkning cykler for 4C-seq bibliotek præparationstrin og dermed afbøder potentialet for PCR bias som følge af overdreven forstærkning af biblioteker. Andet, det bruger en yderligere begrænsning digest skridt i et forsøg på at reducere den ensartethed af kendte "lokkemad" sekvenser, der hæmmer præcis base-ringer af sekventering instrument og derfor maksimerer den unikke, informative sekvens i hvert Læs. Andre protokoller omgå dette problem ved at samle mange (12-15)8 4 C-seq biblioteker med forskellige agn sekvenser og/eller begrænsning steder, en mængde af eksperimenter, der ikke kan opnås af andre laboratorier. De ændringer, der præsenteres her tillader et lille antal eksperimenter, prøver og/eller kopierer for at blive indekseret og samles i en enkelt lane.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. begrænsning enzym udvalg

  1. Identificere en region af interesse (fx., gen promotor, enkelt nukleotid polymorfisme (SNP), enhancer) og få DNA-sekvens fra repositories som National Center for bioteknologi oplysninger (NCBI).
  2. Identificere kandidat-restriktionsenzymer (REs) for det første begrænsning enzym fordøjelse (RE1) der ikke skære i rækkefølgen af interesse, som producerer sticky ender (DNA termini med udhæng) efter RE fordøjelsen, og hvis aktiviteter ikke hæmmes af CpG methylering.
    Bemærk: Opløsning af dataene, der er bestemt af RE1. Et enzym, der med en 6 basepar (bp) anerkendelse sekvens producerer, i gennemsnit fragmenter ca 4 kilobases (kb) i længden, mens et enzym med en 4 bp anerkendelse sekvens producerer fragmenter ca 250 bp i længde, giver mulighed for mere præcis identifikation af interagerende sekvenser.
  3. Vælg en RE1 fra kandidat enzymer identificerede i trin 1.2 der producerer et "viewpoint" restriktion fragment mindst 500 bp længe, der indeholder det pågældende område, eller, alternativt, en nærliggende region.
    Bemærk: Enzymet valgt skal efterproeve primer design (Se trin 2).
  4. For den andet fordøjelsen, identificere en restriktion enzym (RE2) med en 4 bp anerkendelse sekvens, der producerer sticky ender (DNA termini med udhæng) efter RE fordøjelse, hvis aktivitet ikke er hæmmet af CpG methylering, og at nedskæringer inden for begrænsning fragment genereret af RE1 til at producere en 250-500 bp agn fragment (figur 1).
    Bemærk: Enzymet valgt skal efterproeve primer design (Se trin 2).

2. design og Test primere for Inverse PCR og fordøjelsen effektivitet qPCR

  1. Brug en primer designværktøj såsom Primer3 (http://primer3.ut.ee) til at designe inverse primere, der er rettet udad mod enderne af agn fragment (dvs., 5' primeren er en "omvendt" primer, supplerer den plus strand, mens 3' primeren er et " Videresend"primer, supplerer den minus strand) og så tæt på begrænsning steder som muligt for at minimere forstærkningen af ikke-informativ agn sekvens og maksimere PCR effektivitet (figur 2A).
    Bemærk: Primere skal forudsiges for at have minimal uspecifikke forstærkning fra genomisk DNA i siliciummangan PCR forudsigelser og bør ikke tilpasse andre steder i genomet undtagen deres tilsigtede mål med mere end 16/18 identitet9. Som sekventering adaptere ikke er indarbejdet i de inverse PCR primere, er webstedet for primer bindende mere fleksible end i andre 4C præparationsmetoder; primere bør optimalt anneal inden for 50 bp efter udløbet af den tilsvarende begrænsning site.
    1. Bekræfte specificiteten af inverse PCR primere af forstærkning ved hjælp af renset genomisk DNA (gDNA) som skabelon.
    2. Optimal primere bør give få produkter, når du bruger gDNA som en skabelon (Se trin 11.2 til betegnelse af forventede 4C). Hvis væsentlige forstærkning fra gDNA opstår, designe nye primere. Hvis ingen acceptabel primer sæt identificeres, vende tilbage til trin 1 og vælge en ny agn ved at vælge ny restriktionsenzymer.
  2. Design qPCR primere til at forstærke fragmenter 70-200 nukleotid (nt) i længden at overvåge begrænsning fordøjelsen effektivitet (figur 2B).
    1. Designe et par af primere til at forstærke på tværs af hver begrænsning websted (valgt i trin 1), der definerer agn sekvensen. Design af primere for begge RE1 (Se trin 6.5.6) og RE2 websteder (Se trin 9.2).
    2. Design et sæt primere, der forstærker en region ikke indeholder websteder for enten begrænsning enzym normalisering kontrol (uncut DNA) for RE1 og RE2 (Se også trin 6.5.6).

3. indsamling af celler

  1. Bruger en metode, der er relevante for vævs- eller kultur, få en enkelt celle suspension. Sammenpresse cellerne i 5 min på 200 x g, supernatanten og resuspenderes i 500 µL 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS) pr. 107 celler.

4. formaldehyd Cross-linking af celler til at bevare kromatin interaktioner

  1. Pr. 107 celler, tilføje 9,5 mL 1% elektronmikroskopi (EM)-grade formaldehyd (methanol-fri) i PBS og inkuberes, mens tumbling på rocker (eller lignende), i 10 min. ved stuetemperatur (RT, 18-22 ° C).
    Bemærk: Fiksering betingelser skal optimeres for hver celle. Tidligere publicerede artikler i mus celler rapporterede, at optimal fiksering resulterer i mindst 40% af tilknyttede læser tilnærmelse til kromosom indeholder synspunkt9 antager en ikke-telomeric regionen for en gennemsnitlig størrelse kromosom.
  2. Overføre reaktion rør til is og tilføje iskold 1 M Glycin til en endelig koncentration på 0,125 M (1.425 mL) til at slukke crosslinking reaktionen. Mix af blid inversion.
  3. Der centrifugeres i 5 min. ved 200 x g, 4 ° C og fjern forsigtigt alle supernatanten. Gemme celle pellet ved-80 ° C eller gå straks til celle lysering.

5. cellen Lysis

  1. Resuspenderes celle fra trin 4.3 i 500 µL af 5 mM ethylendiamintetra syre (EDTA) at vaske. Der centrifugeres ved 200 x g i 5 min på RT. udsmid supernatanten.
  2. Resuspend celle pellet i 125 µL af 5 mM EDTA med 0,5% natriumsulfat dodecylbenzensulfonsyremethylester (SDS) og 1 x proteasehæmmere, som en 100 x cocktail, som indeholder 5 mg/mL antipain, 10 mg/mL chymostatin, 10 mg/mL leupeptin og 10 mg/mL pepstatin A.
    Bemærk: Vaskemiddel koncentration skal optimeres for hver celle. Utilstrækkelig vaskemiddel koncentrationer vil resultere i ufuldstændig celle lysis, forlader kromatin utilgængelige for restriktionsenzymer. Hvis begrænsning fordøjelsen er vedvarende lave taktfast 6.5.6, og aktiviteten af enzymet er blevet bekræftet kan yderligere vaskemiddel være nødvendig. Øge SDS koncentration i intervaller på 0,1%.
  3. Inkuber cellesuspension i isbad i 10 min.
    Bemærk: For primære humane keratinocytter, optimal lysis blev opnået ved hjælp af en 10 min inkubation ved 65 ° C efterfulgt af et 37 ° C natten inkubation i en rystende varme blok med agitation (900 omdr. / min.).
  4. Sikre, at cellen lysis er fuldført.
    1. Mix 6 µL af celler med 6 µL af Trypan blå på et dias og dækkes med en coverslip. Se under et mikroskop.
      Bemærk: Efter vellykket lysis, bør indre af cellerne vises en blå og un-lysed celler vises hvide.
    2. Hvis celle lysis viser sig utilstrækkelig, sammenpresse cellerne på 200 x g i 5 min og gemme supernatanten. Resuspenderes og Gentag trin 5,2-5,4 og/eller alternativt med forskellige inkubation temperaturer (Se Note i trin 5.3).
    3. Kombinere de re lysed pellet med gemte supernatanten og fortsætte.
      Bemærk: Besigtigelse er ikke en garanti for tilstrækkelig lysering. Fordøjelsen effektivitet bør afgøres objektivt som i trin 6.5.6.

6. den første begrænsning fordøjelsen

  1. Tilsæt 30 μL af 10 x begrænsning enzym buffer (angivet af fabrikanten) og 27 μL af 20% Triton X-100 (endelige 1,8%) til suspension fra trin 5.4. Bringe den samlede mængde til 300 µL med H2O.
    Bemærk: Sammensætningen af begrænsning enzym bufferen vil afhænge af RE valgt i trin 1.
  2. Fjerne 15 μl alikvot som en "Ufordøjet control" og opbevares ved 4 ° C.
  3. Tilføje 200 U RE1 at de resterende reaktionsblandingen og inkuberes natten over ved den temperatur, der er passende til enzym i en rystende varme blok med agitation (900 omdr. / min.). Den næste dag, tilføje en ekstra 200 U RE1 og fortsætte inkubering natten over.
  4. Fjerne 15 μl alikvot som "fordøjet kontrol" og opbevares ved 4 ° C.
  5. Bestemme fordøjelsen effektivitet:
    1. Tilføje 82,5 µL af 10 mM Tris-HCl pH 7,5 til 15 µL prøverne fra trin 6.2 og 6.4. Tilføje 2,5 µL af proteinase K (20 mg/mL) og Inkuber i 1 time ved 65 ° C.
    2. Tilsæt 100 µL af phenol-chloroform og bland kraftigt ved inversion fjerne resterende protein forurening. Der centrifugeres i 5 min, 16,100 x g ved stuetemperatur.
    3. Overføre den vandige fase til en ny tube. Tilføje 6,66 µL af 3 M natrium acetat pH 5,2, 1 µL af 20 mg/mL glykogen og 300 µL af 100% ethanol (EtOH). Blandes forsigtigt ved inversion og sted ved-80 ° C i 1 time.
    4. Der centrifugeres i 20 min. ved 16,100 x g ved 4 ° C. Fjern supernatanten, tilsættes 500 µL af 70% EtOH, og der centrifugeres i 5 min på 16,100 x g på RT.
    5. Fjern supernatanten og tørre pellet ved stuetemperatur for 2 min. resuspenderes i 50 µL af nukleasen-fri H2O.
    6. Bestemme digest effektivitet af qPCR13,14 ved hjælp af metoden ∆∆Ct. Brug primeren sæt ikke flankerende en restriktion websted (Se trin 2.2.2) som kontrolelementet normalisering. Fortsæt hvis fordøjelsen effektivitet er > 85%. Ellers sammenpresse cellerne og Gentag trin 5.2 – 6.5, udelade inkubation ved 65 ° C i trin 5.3.

7. første ligatur

  1. Varme-Deaktiver begrænsning enzym af inkubere 20 min. ved 65 ° C. Alternativt, hvis enzymet ikke kan varme inaktiveret, phenol-chloroform uddrag og ethanol bundfald prøven.
    Bemærk: De højere inaktivering temperaturer anbefales for nogle restriktionsenzymer denaturerer proteiner i kromatin, og dette kan have negativ indflydelse prøve kvalitet. Derudover er phenol: chloroform ekstraktion ikke ideel, da det resulterer i tab af prøven.
  2. Overførsel til en 50 mL konisk slange og tilføje 6 mL af nukleasen-fri H2O, 700 µL af 10 x ligase buffer (660 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM magnesiumchlorid (MgCl2), 10 mM dithiothreitol (DTT), 10 mM adenosin trifosfat (ATP)), og 50 U T4 DNA Ligase. Bland forsigtigt af hvirvlende og inkuberes natten over ved 16 ° C.
  3. Fjerne en 100 µL alikvot af prøven som kontrolelementet '' ligatur ''.
  4. Bestemme ligatur effektivitet:
    1. Tilføje 2,5 µL af Proteinase K (20mg/mL), og der inkuberes 1 h ved 65 ° C.
    2. Tilføj 100 µL af phenol-chloroform og mix kraftigt ved inversion. Der centrifugeres i 5 min, 16,100 x g på RT.
    3. Overføre den vandige fase til en ny tube. Tilføje 6,66 µL af 3 M natrium acetat pH 5,2, 1 µL af glykogen og 300 µL af 100% EtOH. Blandes forsigtigt ved inversion og sted ved-80 ° C om 1 h.
    4. Der centrifugeres i 20 min. ved 16,100 x g ved 4 ° C. Fjern supernatanten, tilsættes 500 µL af 70% EtOH, og der centrifugeres i 5 min på 16,100 x g ved 4 ° C.
    5. Fjern supernatanten og tørre pellet ved stuetemperatur. Resuspenderes i 20 µL vand og indlæse på en 0,6%-agarosegel ud for kontrolelementerne"fordøjelsen" fra skridt 6,5.
      Bemærk: Et godt sammenskrevne udsnit skal vises som en forholdsvis stram, høj molekylvægt band (figur 3).
    6. Hvis ligation er tilstrækkelig, Fortsæt med trin 8. Ellers tilføje frisk ATP (1 mM slutkoncentration) og nye ligase; Der inkuberes natten over ved 16 ° C og Gentag trin 7.3-7,4.

8. vende Cross-linking og isolere kromatin

  1. Tilføj 15 µL af Proteinase K (20 mg/mL) og der inkuberes natten over ved 65 ° C til at tilbageføre cross-links.
  2. Tilføj 30 µL af RNase A (10 mg/mL), og der inkuberes 45 min ved 37 ° C.
  3. Tilføje 7 mL af phenol-chloroform og mix kraftigt ved inversion. Centrifuge 15 min, 3.300 x g på RT.
  4. Overføre den vandige fase til en ny 50 mL tube og tilsættes 7,5 mL af nukleasen-fri H2O (til at fortynde DTT findes i bufferen til ligase, som ellers udfældes med DNA), 1 mL 3 M natrium acetat pH 5,6, 7 µL af glykogen (20 mg/mL) , og 35 mL 100% EtOH. Blandes og inkuberes ved-80 ° C i 1 time.
  5. Centrifuge 20 min, 3.900 x g ved 4 ° C. Fjern supernatanten (pellet kan være svært at se), vaske pellet med 10 mL iskold 70% EtOH, og der centrifugeres 15 min, 3.300 x g ved 4 ° C.
  6. Fjern supernatanten og kortvarigt tørre pellet på RT. opløses pellet i 150 µL af 10 mM Tris-HCl pH 7,5 ved 37 ° C. Opbevares ved-20 ° C eller Fortsæt med skridt 9.

9. anden begrænsning fordøjelse: Trimning cirkler

Bemærk: Dette trin opretter mindre cirkler for at minimere overrepræsentation af mindre erobrede fragmenter på grund af PCR bias i downstream forstærkning trin.

  1. Eksemplet fra trin 8,6, tilføje 50 µL af 10 x begrænsning enzym buffer (angivet af fabrikanten), 300 µL af nukleasen-fri H2O og 50 U begrænsning enzym RE2. Der inkuberes natten over ved den temperatur, der er relevante for den valgte enzym.
  2. Fjerne en 15 µL alikvot af prøven som kontrolelementet"fordøjelsen". Bestemme fordøjelsen effektivitet, som beskrevet i trin 6.5.

10. andet ligatur og DNA oprensning

  1. Deaktiver begrænsning enzym, som anbefalet af fabrikanten. Hvis enzymet ikke kan varme-inaktiverede, fjerne enzymet ved hjælp af en kolonne-baserede rensning kit.
    Bemærk: Da dette resulterer i tab af prøven, kolonne rensning er ikke ideel.
  2. Overføre prøven til en 50 mL tube og tilføje 12,1 mL nukleasen-fri H2O, 1,4 mL 10 x ligatur buffer (660 mM Tris-HCl, pH 7,5; 50 mM MgCl2, 10 mM DTT, 10 mM ATP) og 100 U T4 DNA ligase. Der inkuberes natten over ved 16 ° C.
  3. Tilføje 467 µL af 3 M natrium acetat pH 5.6, 233 µL nukleasen-fri H2O, 7 µL glykogen (20 mg/mL) og 35 mL 100% EtOH. Bland godt og Inkuber ved-80 ° C 1 h.
  4. Centrifuge 45 min, 3.900 x g ved 4 ° C. Fjern supernatanten, der tilsættes 10 mL af kolde 70% EtOH, og der centrifugeres 15 min, 3.300 x g ved 4 ° C.
  5. Fjern supernatanten og kortvarigt tørre pellet ved stuetemperatur. Tilsæt 150 µL af 10 mM Tris-HCl pH 7,5 og inkuberes ved 37 ° C til at opløse pelleten.
  6. Rense prøver med en silica kolonne-baserede PCR rensning kit, efter fabrikantens anvisninger. Brug 1 kolonne pr. 3 x 106 celler, baseret på det oprindelige antal celler. Elueres kolonner med 50 µL af 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 og pool prøverne.
  7. Måler koncentrationen af fluorimetry eller spektrofotometri ved hjælp af absorbans på 260 nm. Skabelonen 4C er nu klar til inverse PCR. Opbevares ved-20 ° C eller gå direkte til trin 11.

11. PCR forstærke ukendt interagerende sekvenser af Inverse PCR

  1. Bestemme det lineære område af forstærkning ved at udføre en PCR ved hjælp af skabelonen fortyndinger af 12.5, 25, 50 og 100 ng 4C skabelon. Hvis det ønskes, forstærke fra gDNA sideløbende at direkte sammenligne produkter for at identificere ikke-specifikke forstærkning. Køre PCR reaktioner ved hjælp af en indledende denaturering på 94 ° C i 2 min.; 30 cykler bestående af en denaturering trin på 94 ° C i 10 s, en udgloedning trin ved 55 ° C i 1 min og en forlængelse trin på 68 ° C i 3 min. og en sidste udvidelse på 68 ° C i 5 min.
  2. Adskille 15 µL af hver PCR produkt på en 1,5%-agarosegel at bekræfte lineær forstærkning og vurdere skabelon kvalitet (figur 4). Forstærkning fra 4C skabelon bør give diskrete banding på lave DNA koncentrationer og en smear ved højere koncentrationer. Tilstedeværelsen af smøre angiver øgede kompleksitet af de forstærkede 4C ligations.
  3. Når tilfreds med kvaliteten og kvantiteten af den inverse PCR produkt genereret, oprette en qPCR til at bestemme det optimale antal cykler til brug for forstærkning:
    1. Konfigurer de reaktioner, der indeholder SYBR og ROX farvestoffer ved hjælp af reaktionsblandingen i tabel 2. Medmindre forstærkningen ikke er lineær i høje koncentrationer i trin 11.2, brug 100 ng af skabelonen pr. reaktion.
      Bemærk: Tilsætning af ROX letter normalisering af fluorescerende signal fra godt til brønden og cyklus til cyklus.
    2. Køre PCR reaktioner ved hjælp af en indledende denaturering på 94 ° C i 2 min.; 40 cykler bestående af en denaturering trin på 94 ° C i 10 s, en udgloedning trin ved 55 ° C i 1 min og en forlængelse trin på 68 ° C i 3 min. og en sidste udvidelse på 68 ° C i 5 min.
    3. Bestemme peak (slutpunktet) Fluorescens reaktioner ved hjælp af handlingen forstærkning. Bestemme den cyklus, hvor reaktioner nå 25% af peak fluorescens (figur 5).
      Bemærk: Dette er antallet af cyklusser, der vil blive brugt til at forstærke de 4C biblioteker (Se trin 11.4).
  4. Oprette inverse PCR som i tabel 3 til at forstærke ukendt sekvenser forbundet til agn fra skabelonen 4 C. Opdele i 16 reaktioner af 50 µL inden du kører. Køre PCR reaktioner ved hjælp af en indledende denaturering på 94 ° C for 2 min og kredsløb bestående af en denaturering trin på 94 ° C i 10 s, en udglødning trin ved 55 ° C i 1 min., og en udvidelse trin på 68 ° C i 3 min. Brug antallet af cyklusser bestemmes i trin 11.3.3.
  5. Indsamle og samle reaktioner. Rense, ved hjælp af en silica kolonne-baserede PCR rensning kit. Brug mindst 2 kolonner pr. 16 reaktioner. Pool renset PCR produkter.
  6. Bestemme vareprøveantal og renhed af spektrofotometri. Typisk udbytte er mellem 10 og 20 μg med A260/A280 ~ 1,85. Hvis absorption nøgletal er optimal, igen rense for at undgå problemer under sekvensering.
  7. Vurdere kompleksiteten i biblioteket ved at adskille 300 ng af renset PCR produkt på en 1,5%-agarosegel.
    Bemærk: Forstærket produkt bør ligne som fra trin 11.2.

12. tredje begrænsning fordøjelse: Trim off agn sekvenser

Bemærk: Dette trin fjerner ikke-informativ agn sekvenser fra de inverse PCR-produkter til maksimere informative erobrede sekvenser i downstream sekventering trin. For at overvåge digest effektivitet, er en "digest skærm"15 fordøjet parallelt med tilsvarende DNA og enzym koncentration. Hvis RE1 og RE2 er uforenelig i simultan fordøjelse, for eksempel skal på grund af forskellige optimal inkubation temperaturer eller reaktion buffere, dette ske som en sekventiel digest (dette ikke er ideelt).

  1. Opnå en RE digest skærm og teste fordøjelsen i en 50 µL reaktion.
    Bemærk: Dette er et molekyle af dsDNA (f.eks. et plasmid, en PCR-amplikon eller en syntetisk DNA), som indeholder RE kvadratnetsreference. Det eneste krav er, at det skal være nemt at skelne klip fra uslebne skærm på en agarosegel. Optimer RE skærm masse og enzym koncentration om nødvendigt.
  2. Digest 1 µg renset inverse PCR produkt fra trin 11.6 og parallelt, RE-skærm fra trin 12.1.
    Bemærk: DNA samt enzym koncentration og inkubationstiden, bør være den samme som for test digest i trin 12.1 for både den inverse PCR produkt og monitor fordøjer. Juster lydstyrken på reaktion efter behov.
  3. Kør den fordøjede RE skærm på en agarosegel koncentration passende for de forventede fragmenter. Fordøjelse er fundet tilstrækkelige når < 10% af DNA forbliver uncut (figur 6).
  4. Rense fordøjet inverse PCR produktet på en silica kolonne-baseret DNA rensning kit. Hvis sekventielle fordøjer er påkrævet, skal du gentage trin 12,1-12,4 med det andet enzym.

13. forberedelse af sekventering bibliotek

  1. Ligate kompatible med de respektive næste generation sequencing platform adaptere.
    1. Design adaptere for hver RE1 og RE2, således at efter Udglødning af oligos, hver RE adapter har de respektive 1-sidet overhæng.
      Bemærk: For eksempel, hvis HindIII bruges, udglødet adapteren skal indeholde en 5' fosforyleret "AGCT" udhæng. Alternativt benyttes standard T-udhæng adaptere, ende-reparation og A-hale bibliotek før adapter ligatur.
    2. Anneal respektive adapter RE oligos. Resuspend oligos i udgloedning buffer (10 mM Tris, pH 7,5, 50 mM natriumchlorid (NaCl), 1 mM EDTA), blandes i equimolar mængder til 50 µM, opvarmes til 95 ° C, og afkøles langsomt til 25 ° C.
    3. Udføre ligatur reaktion. Bland re fordøjet 4 C bibliotek med en samlet 5 til 10 gange kindtand overskydende udglødet adaptere (trin 13.1.2; 50/50 forhold for hver RE adapter bruges) 1 x ligase buffer og tilføje 6U DNA ligase. Inkuber ifølge producentens anvisninger.
    4. Fjern overskydende adaptere ved rensning af ved hjælp af en lav-eluering volumen silica-baseret kolonne kit.
  2. Størrelse-Vælg.
    Bemærk: Størrelse udvælgelse kan også udføres ved hjælp af en perle-baserede oprydning kit og anbefales selv efter kolonne rensning.
    1. Kaste en 2% agarosegel ved hjælp af en høj opløsning agarosegelelektroforese, føje et ikke-UV pletten før hælde. Sikre, at vand tabt på grund af fordampning under opvarmning erstattes af vejning flaske eller kolbe før og efter opvarmning og tilsætning af vand for at genoprette den tabte masse.
    2. Kør de adapter-forbundet biblioteker på gel, efterlader tomme baner mellem prøverne.
    3. Punktafgifter gel skiver svarende til størrelse sortiment 150 bp til 1 kb ved hjælp af en ren skalpel eller et barberblad.
    4. Rense biblioteker fra gel ved hjælp af en gel udvinding kit. For at minimere GC bias i forbindelse med inddrivelse af DNA, opløse gel skiver ved stuetemperatur med rotation.
  3. Bestem antallet af cyklusser for PCR-amplifikation af qPCR bruger reaktionsmiljøet i tabel 4. Køre PCR reaktioner ved hjælp af en indledende denaturering på 98 ° C i 2 min. og 40 cykler bestående af en denaturering trin på 98 ° C i 10 s, et optimerende skridt på 60 ° C i 1 min og en forlængelse trin ved 72 ° C i 3 min.
    Bemærk: Den cyklus, hvor fluorescens når 25% af maksimalt er antallet af cyklusser, der vil blive brugt til at forstærke biblioteket, som i trin 11.3.
  4. Forstærke biblioteker benytter reaktionsblandingen i tabel 5. Køre PCR reaktioner ved hjælp af en indledende denaturering på 98 ° C for 2 min og kredsløb bestående af en denaturering trin på 98 ° C i 10 s, et optimerende skridt på 60 ° C i 1 min og en forlængelse trin ved 72 ° C i 3 min. Antallet af forstærkning cykler skal anvendes for hvert bibliotek blev fastsat i trin 13.3.
  5. Rense forstærket biblioteker ved hjælp af en lav-eluering volumen silica-baseret kolonne kit.

14. sekvensering og analyse af Sequencing Data

  1. Bestemme koncentrationen af forstærkede biblioteker ved hjælp af en fluorimetri assay. Fortynd biblioteker til den passende koncentration for sekventering (check med sekventering service eller kerne for deres anbefaling).
  2. Bestemme kvaliteten af bibliotekerne ved hjælp af en mikrofluid-nukleinsyre analyse platform.
    Bemærk: Størrelse profil af biblioteket bør spejl, set på størrelse udvælgelse gel i trin 13.2, og koncentrationen af prøven bestemmes i dette trin er at blive brugt til sekvensering.
  3. Pool indekseret biblioteker at opnå mindst 3 millioner læser (mindst 50 bp læse; enkelt [1 X 50] eller parret ende [2 X 50]) pr. prøve. En høj kvalitet bibliotek kræver mindst 1 million kortlagt læser9, men der vil være nogle nedslidning under tilknytningen. For eksempel, kan en sekventering platform, der giver ca 150 millioner læser per lane rumme op til 50 prøver i en enkelt lane.

15. analyse af sekvens Data

  1. Afmultiplekse data ved hjælp af indeks sekvenser til at tildele læser til deres relevante prøver.
    Bemærk: Afhængigt af deres fortrolighed, brugerne kan udføre downstream beregningsmæssige analyser af rå FASTA/FASTQ sekvens filer ved hjælp af grundlæggende kommando linie interface eller, alternativt, den brugervenlige, webbaserede Galaxy anskuelighed brugergrænseflade (GUI)16 .
  2. Trim adapter sekvenser og enhver agn sekvens som følge af ufuldstændig RE fordøjelsen i trin 12, for eksempel, ved hjælp af hurtig-X Toolkit (http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/).
  3. Kort demultiplexed læser til det relevante genom af interesse (fx., UCSC mm10, hg19) ved hjælp af Burrows-Wheeler Aligner (BWA)17 eller andre justering software resulterer i SAM output-filer. Du kan eventuelt konvertere SAM filer til BAM via samtools18 (Se trin 15.4).
  4. Bruge en 4C-seq analyse rørledning som Basic4Cseq19, 4 C-ker20, FourCSeq21eller fourSig22 til at analysere data og identificere interaktionerne.
    NOTE: Dataanalyse og vurdering af kvaliteten heraf bør gennemføres efter den valgte programpakke reference manual. Pakker generere BED outputfiler medmindre andet er angivet. Kort, Basic4CSeq19 bruger en SAM inputfil (trin 15.3) til at visualisere interaktioner (txt, tiff, BED og paryk outputfiler) og vurderer kvaliteten af data baseret på kriterierne i van de Werken mfl. 9 4 C-ker20 (input trimmet FASTQ, trin 15.2) og FourCSeq21 (input BAM, trin 15.3) identificere differential interaktioner mellem betingelser. fourSig22 (input SAM) også identificerer betydningsfulde vekselvirkninger og prioriterer dem, der er tilbøjelige til at være reproducerbare. Værktøjer såsom genomisk regulerende berigelse af anmærkninger værktøj (stor)23eller integration med ENCODE datasæt kan også bruges til at forudsige den biologiske funktion af interaktioner opdaget af 4 C-FF.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Primære humane keratinocytter blev isoleret fra 2 – 3 kasserede neonatal foreskins, samles og kulturperler i KSFM suppleret med 30 µg/mL bovin hypofyse ekstrakt, 0,26 ng/mL rekombinant human epidermal vækstfaktor og 0,09 mM calciumchlorid (CaCl2 ) ved 37 ° C, 5% kuldioxid. Cellerne var opdelt i to kolber, og én kolbe blev differentieret ved tilsætning af CaCl2 til en endelig koncentration på 1,2 mM for 72 h. 107 celler hver fra prolifererende og differentierede keratinocytter befolkninger blev fastsat i 1% formaldehyd i 10 min ved stuetemperatur. Separat, blev K562 celler dyrket i RPMI suppleret med 10% føtal bovint serum ved 37 ° C, 5% kuldioxid. 107 celler blev fastsat i 1% formaldehyd i 10 min ved stuetemperatur.

Cellerne var mængden, og de faste kromatin var fordøjet med HindIII og forbundet som beskrevet ovenfor. Cross-links blev vendt, og DNA er renset og fordøjes med CviQI. DNA var forbundet og bruges som skabelon for inverse PCR-amplifikation. Primere brugte var: 5'-GATCAGGAGGGACTGGAACTTG/5 '-CCTCCCTTCACATCTTAGAATG. 1 µg renset inverse PCR produkt var fordøjet natten over med CviQI parallelt med 225 ng af RE fordøje skærm og kolonne-renset. Oprenset DNA blev derefter fordøjet natten med HindIII parallelt med 125 ng af RE fordøje skærm og kolonne-renset. 250 ng af renset dobbelt-fordøjet inverse PCR produkt blev brugt til biblioteket forberedelse. Kort fortalt blev ender repareret via konverteringer til 5'-fosforyleret og blunt-ender og efterfølgende DNA kolonne-rensning. Enderne blev A-tailed 20 min ved 72 ° C i et 50 µL reaktion med 1 U Taq-polymerase og 200 µM dATP og kolonne-renset. Kompatible sekventering bibliotek prep adaptere blev forbundet i forholdet 10:1 (adapter: DNA) ved hjælp af T4 DNA ligase i en 30 µL reaktion ved stuetemperatur for 15 min og DNA kolonne-renset. Biblioteker blev kørt på en 2%-agarosegel gel skiver blev skåret fra 120 bp til toppen af stigen til at fjerne adaptere og biblioteker var renset. 200 pg af hvert bibliotek blev evalueret i 10 µL qPCR reaktioner der indeholder indeksering primere for at bestemme optimal PCR forstærkning cyklusser. Biblioteker blev forstærket for at tilføje indekser anvende antallet af cyklusser bestemmes af qPCR og sekventeret på en HiSeq2500 til at opnå 1 x 50 lyder.

Læser var demultiplexed og trimmet. Først, sekventering adaptere blev fjernet. Efterfølgende blev sekvens fra begyndelsen af hver primer til webstedet begrænsning trimmet. Dette giver mulighed for kortlægning af inverse PCR-produkter, der ikke var fuldt fordøjet før bibliotek forberedelse. Vigtigere, forhindrer herunder sekvensen mellem primer bindende websted og webstedet restriktion kortlægning af ikke specielt forstærkes PCR produkt. Trimmet læser var knyttet til hg38 ved hjælp af BWA. Figur 7 viser læser tilknytning til området omkring udsigtspunktet.

Figure 1
Figur 1: skematisk 4C-seq arbejdsproces. Kromatin er tværbundet for at bevare protein-DNA kontakter, fordøjes med RE1 og forbundet for at sammenkæde interagerende loci. Cross-links er vendt, og DNA er fordøjet med RE2 og forbundet. Ukendt interagerende sekvenser forstærkes ved hjælp af primere, som binder til det pågældende område, og PCR produkterne er fordøjet med RE1 og RE2 at trimme kendte sekvenser. Amplificerede DNA af ukendt sekvens er anvendt i en sekventering bibliotek prep, hvori adapterne er forbundet og biblioteket er PCR-forstærket og omkostningsstyring. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: skemaer af primer design. (A) bindende websteder for inverse PCR primere. Primere er orienteret "passiv" (dvs., 5' primeren er en "omvendt" primer, supplerer den plus strand, mens 3' primeren er et "fremad" primer, supplerer den minus strand) og binde inden for 50 bp af hver begrænsning websted (angivet med rødt skygge). (B) bindende websteder til qPCR primere til bestemmelse af begrænsning enzym digest effektivitet. En primer par ligger hver begrænsning enzym site. En kontrol primer sæt forstærker en sekvens, der ikke indeholder et websted for enten enzym og bruges til at normalisere Ct værdier for DNA input. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Agarosen gelelektroforese at vurdere ligatur effektivitet for RE1-fordøjet kromatin. Uncut, HindIII-fordøjet og sammenskrevne prøver blev behandlet med proteinase K og opvarmet for at vende cross-links, phenol: chloroform udvundet, EtOH udfældet og resuspenderet i H2O. renset DNA blev kørt på en 0,6%-agarosegel og bands visualiseret ved ethidiumbromid farvning med sammenligning til 1 kb plus stige. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4:4 c skabelon titrering for inverse PCR. Serielle fortyndinger var lavet af 4C skabeloner og bruges i inverse PCR reaktioner. PCR produkter blev kørt på 1,5% agarosegel og visualiseret ved ethidiumbromid farvning sammen med 1 kb plus stige. NTC betegner no-skabelon kontrol reaktion. Bemærk en korrelationsmaalinger stigning i forstærkning med en stigning i skabelonen koncentration. Denne repræsentant forstærkning blev gennemført på kromatin kløvet med HindIII som RE1 og CviQI som RE2, og primer sekvenser bruges til inverse PCR-amplifikation var 5'-GATCAGGAGGGACTGGAACTTG/5 '-CCTCCCTTCACATCTTAGAATG. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: qPCR-medieret bestemmelse af amplifikation cyklusser for at forstærke skabelon for inverse PCR. 4C skabeloner blev forstærket i reaktioner indeholdende 1 x SYBR Green og 1 x ROX i en real-time thermocycler. Peak fluorescens blev fastlagt og antallet af cyklusser kræves for at nå ¼ af peak fluorescens blev beregnet. Dette antal cyklusser blev brugt til at forstærke 4C skabelonen for inverse PCR. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Agarosen gelelektroforese af fordøjet RE skærm der viser tilstrækkelig fordøjelse. RE digest var skærm amplificeret fra humant genomisk DNA ved hjælp af primere F: 5'-TCCTATCCCTGGTCTGTCTTAT og R: 5'-CCACATTGGTCCTTCTAGTCTTC og renset. 225 ng af skærm var fordøjet med 15 U CviQI i en 50 µL reaktion ved 25 ° C natten over og køre på en 1,5%-agarosegel sammen med 1 kb plus stige. Bands blev visualiseret med ethidium bromid farvning. Uncut skærm er 2515 bp; forventet fragment størrelser er 132, 343, 488, 539 og 1013 bp. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: repræsentative genomisk spor af Læs dækning inden for 5 kb i regionen synspunkt. Læser blev trimmet og tilknyttede til hg38 ved hjælp af BWA. Fleste læser (blå toppe) justeres på HindIII eller CviQI steder støder op til HindIII websteder, som forventet. Regionen synspunkt er fremhævet med rødt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Mængde for 1 x
10 x udvide lang skabelon Buffer 1 2,5 ΜL
dNTP'er (10 mM) 0,5 ΜL
Fremad primer 35 pmol
Omvendt primer 35 pmol
Udvid lang skabelon Polymerase (5 U/µL) 0,35 ΜL
DNA
Nukleasen-frit vand til 25 µL

Tabel 1: PCR reaktionsblandingen til forstærkning af 4C skabelon (trin 11.1).

Mængde for 1 x
10 x udvide lang skabelon Buffer 1 1,5 ΜL
dNTP'er (10 mM) 0,3 ΜL
Fremad primer 21 pmol
Omvendt primer 21 pmol
100 x SYBR Green jeg 0,15 ΜL
50 x ROX 0,3 ΜL
Udvid lang skabelon Polymerase (5 U/µL) 0.21 ΜL
DNA 100 ng
Nukleasen-frit vand til 25 µL

Tabel 2: qPCR reaktionsblandingen til bestemmelse af antallet af forstærkning cykler for inverse PCR (trin 11.3.1).

Mængde for 1 x
10 x udvide lang skabelon Buffer 1 80 ΜL
dNTP'er (10 mM) 16 ΜL
Fremad primer 1.12 nmol
Omvendt primer 1.12 nmol
Udvid lang skabelon Polymerase (5 U/µL) 11.2 ΜL
DNA 3.2 µg
Nukleasen-frit vand til 800 µL

Tabel 3. PCR reaktionsblanding for den endelige inverse PCR-amplifikation af 4C skabelon (trin 11.4).

Mængde for 1 x
5 x Phusion HF buffer 2 ΜL
dNTP'er (10 mM) 0.2 ΜL
Miltiplexing Primer 1,0 5 pmol
Miltiplexing Primer 2.0 0,1 pmol
Indeks primer 5 pmol
100 x SYBR Green jeg 0,1 ΜL
50 x ROX 0.2 ΜL
Phusion polymerase 0,1 ΜL
DNA 2 ΜL
Nukleasen-frit vand til 10 µL

Tabel 4: qPCR reaktionsblandingen til bestemmelse af antallet af forstærkning cykler til sekvensering bibliotek prep (trin 13.3).

Mængde for 1 x
5 x Phusion HF buffer 10 ΜL
dNTP'er (10 mM) 1 ΜL
Miltiplexing Primer 1,0 25 pmol
Miltiplexing Primer 2.0 0,5 pmol
Indeks primer 25 pmol
Phusion polymerase 0,5 ΜL
DNA 10 ΜL
Nukleasen-frit vand til 50 µL

Tabel 5: PCR reaktionsblandingen til forstærkning af biblioteker for sekventering (trin 13.4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

4C resultater har potentiale til at afsløre kromatin samspil, der kan identificere hidtil ukendte regulerende elementer og/eller target gener, der er vigtige i en bestemte biologiske forbindelse24,25,26. Tekniske forhindringer kan imidlertid begrænse resultaterne af disse eksperimenter. PCR bias som følge af overdreven forstærkning af skabelon i 4 C protokoller er sandsynligt. Denne protokol løser dette problem ved at udnytte qPCR for at bestemme det optimale antal forstærkning cykler på en objektiv måde. Derudover kan fjernelse af agn sekvenser fra forstærkede inverse PCR-produkter af begrænsning digest lette identifikationen af kromatin interaktioner af to grunde. Første, det reducerer længden af ikke-informativ (lokkemad) basepar fra materiale til at blive sekventeret. For det andet, og som et resultat, øger det sandsynligheden for, at flere læser vil blive genereret fra forskellige sekvenser (en ejendom kræves til nøjagtig base kald) og dermed mere informativ interagerende sekvenser kan tilknyttes. Andre protokoller kræver en sammenlægning af mange biblioteker ved hjælp af forskellige agn sekvenser og/eller restriktionsenzymer eller kræve øget phiX koncentration af sekventeret prøven at omgå sekvens ensartethed spørgsmålet til nøjagtig base kald. Denne metode giver mulighed for flere prøver med den samme agn sekvens til at samles i en enkelt sekventering lane uden besætter værdifulde sekventering kapacitet med overskydende phiX.

Celle fiksering og lysis er kritiske tidlige trin, som begge kan kræve optimering for bestemte celletyper. Utilstrækkelig fiksation vil undlade at bevare bestemte kontaktpersoner mellem en region af interesse og dens interagerende sekvenser, giver intetsigende data domineret af støj. Derimod vil overdrevne fiksering falde restriktionsenzymer evne til at kløve kromatin, resulterer i færre informative ligatur begivenheder. Både Fikseringsvæske koncentration og inkubationstiden kan ændres for at optimere denne variabel. På samme måde, utilstrækkelig celle lysis reducerer adgang af restriktionsenzymer til kromatin, igen reducere antallet af informative ligatur begivenheder. I vores hænder mængden menneskers primære keratinocytter mest effektivt ved hjælp af en kombination af hypotonic betingelser og vaskemiddel. Andre celletyper kan kræve forskellige lysis betingelser, som skal fastlægges empirisk. Effektiv lysis kan identificeres ved mikroskopi farvestof udstødelse metoder såsom Trypan blå farvning.

En begrænsning af metoden 4C er, at resultaterne kun kan repræsentere en befolkning gennemsnit. Med en heterogen celle population, kan det være vanskeligt at fastslå rigtigt interaktioner vs støj på grund af biologiske variation. Mens brugen af en cellelinie eller sortering af celler til at producere en homogen celle befolkning forventes for at generere klarere signaler, er variabiliteten mellem individuelle celler stadig en mulig kilde til støj. De seneste fremskridt i encellede sekventering teknologier har potentiale til at løse dette problem. Derudover kan validering af befolkningen-baserede 4C resultater udføres ved hjælp af metoder som digital droplet PCR eller FISH til at bestemme, hvis disse resultater afspejles på én celle-niveau.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af NIAMS (R01AR065523).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HindIII NEB R0104S
CviQI NEB R0639S
DNA oligonucleotide primers IDT To be designed by the reader
50 mL conical centrifuge tubes Fisher Scientific 06-443-19
1.7 mL microcentrifuge tubes MidSci AVSS1700
Phosphate buffered saline Thermo Fisher 14190-136
Formaldehyde, methanol free Electron Microscopy Sciences 15710
Nutator VWR 15172-203
Glycine JT Baker 4059-00
Benchtop centrifuge
Refrigerated microcentrifuge
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich ED2SS
20% SDS solution Sigma-Aldrich 05030
Trypan Blue Thermo Fisher 15250061
Glass slides Fisher Scientific 12-550-143
Cover slips VWR 16004-094
Light microscope
Triton X-100 Alfa Aesar A16046
Shaking heat block
2 M Tris-HCl Quality Biological 351-048-101
Proteinase K NEB P8107S
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1) Sigma-Aldrich P2069
Sodium acetate Sigma-Aldrich M5661
20 mg/mL glycogen Thermo Fisher R0561
Ethanol Fisher Scientific 04-355-223
Nuclease-free water Fisher Scientific MT-46-000-CM
qPCR cycler Thermo Fisher 4453536
qPCR plates Thermo Fisher 4309849
Thermocycler Thermo Fisher 4375786
PCR strip tubes MidSci AVSST-FL
1 M Magnesium chloride Quality Biological 351-033-721
Dithiothreotol Sigma-Aldrich 43815
Adenosine triphosphate Sigma-Aldrich A2383
T4 DNA Ligase NEB M0202S
Agarose Sigma-Aldrich A6013
RNase A Thermo Fisher EN0531
Qiaquick PCR purification kit Qiagen 28104
MinElute PCR Purification kit Qiagen 28004
Spectrophotometer
Expand Long Template PCR System Sigma-Aldrich 11681834001
dNTP mix Thermo Fisher R0191
SYBR Green I Sigma-Aldrich S9430
ROX BioRad 172-5858
Sodium chloride Sigma-Aldrich S5886
End-It DNA End-Repair Kit Lucigen ER0720
LigaFast Rapid DNA Ligation System Promega M8221
SYBR Safe Thermo Fisher S33102
Taq Polymerase NEB M0267S
UltraSieve Agarose IBI Scientific IB70054
Qiaquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dunham, I., et al. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  2. Hoffman, M. M., et al. Integrative annotation of chromatin elements from ENCODE data. Nucleic Acids Research. 41 (2), 827-841 (2013).
  3. Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. Capturing Chromosome Conformation. Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).
  4. Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. The long-range interaction landscape of gene promoters. Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).
  5. Li, G., et al. Extensive promoter-centered chromatin interactions provide a topological basis for transcription regulation. Cell. 148 (1-2), 84-98 (2012).
  6. Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).
  7. Zhao, Z., et al. Circular chromosome conformation capture (4C) uncovers extensive networks of epigenetically regulated intra- and interchromosomal interactions. Nature genetics. 38 (11), 1341-1347 (2006).
  8. Splinter, E., de Wit, E., van de Werken, H. J. G., Klous, P., de Laat, W. Determining long-range chromatin interactions for selected genomic sites using 4C-seq technology: From fixation to computation. Methods. 58 (3), 221-230 (2012).
  9. Van De Werken, H. J. G., et al. 4C technology: Protocols and data analysis. Methods in Enzymology. 513, Elsevier Inc. (2012).
  10. Brouwer, R. W. W., van den Hout, M. C. G. N., van IJcken, W. F. J., Soler, E., Stadhouders, R. Unbiased Interrogation of 3D Genome Topology Using Chromosome Conformation Capture Coupled to High-Throughput Sequencing (4C-Seq). Eukaryotic Transcriptional and Post-Transcriptional Gene Expression Regulation. , 199-220 (2017).
  11. Matelot, M., Noordermeer, D. Determination of High-Resolution 3D Chromatin Organization Using Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq). Polycomb Group Proteins: Methods and Protocols. , 223-241 (2016).
  12. Gheldof, N., Leleu, M., Noordermeer, D., Rougemont, J., Reymond, A. Detecting Long-Range Chromatin Interactions Using the Chromosome Conformation Capture Sequencing (4C-seq) Method. Gene Regulatory Networks: Methods and Protocols. , 211-225 (2012).
  13. Göndör, A., Rougier, C., Ohlsson, R. High-resolution circular chromosome conformation capture assay. Nature. 3 (2), 303-313 (2008).
  14. Hagège, H., et al. Quantitative analysis of chromosome conformation capture assays (3C-qPCR). Nature. 2 (7), 1722-1733 (2007).
  15. Anand, R. D., Sertil, O., Lowry, C. V. Restriction digestion monitors facilitate plasmid construction and PCR cloning. BioTechniques. 36 (6), 982-985 (2004).
  16. Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic acids research. 44 (W1), W3-W10 (2016).
  17. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).
  18. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  19. Walter, C., Schuetzmann, D., Rosenbauer, F., Dugas, M. Basic4Cseq: An R/Bioconductor package for analyzing 4C-seq data. Bioinformatics. 30 (22), 3268-3269 (2014).
  20. Raviram, R., et al. 4C-ker: A Method to Reproducibly Identify Genome-Wide Interactions Captured by 4C-Seq Experiments. PLoS Computational Biology. 12 (3), (2016).
  21. Klein, F. A., Pakozdi, T., Anders, S., Ghavi-helm, Y., Furlong, E. E. M., Huber, W. FourCSeq: analysis of 4C sequencing data. Bioinformatics. 31 (19), 3085-3091 (2015).
  22. Williams, R. L. Jr, et al. fourSig a method for determining chromosomal interactions in 4C-Seq data. Nucleic Acids Research. 42 (8), (2014).
  23. McLean, C. Y., et al. GREAT improves functional interpretation of cis-regulatory regions. Nature Biotechnology. 28 (5), 495-501 (2010).
  24. Stolzenburg, L. R., et al. Regulatory dynamics of 11p13 suggest a role for EHF in modifying CF lung disease severity. Nucleic Acids Research. 45 (15), 8773-8784 (2017).
  25. Meddens, C. A., et al. Systematic analysis of chromatin interactions at disease associated loci links novel candidate genes to inflammatory bowel disease. Genome Biology. 17 (1), 1-15 (2016).
  26. Yeung, J., et al. Transcription factor activity rhythms and tissue-specific chromatin interactions explain circadian gene expression across organs. Genome research. , 207787 (2017).

Tags

Genetik spørgsmål 140 kromatin looping smagsforstærkere lovgivningsmæssige sekventering agn begrænsning enzym lysis
Høj overførselshastighed identifikation af regulerende gensekvenser ved hjælp af næste generations sekventering af cirkulære kromosom kropsbygning Capture (4C-seq)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brettmann, E. A., Oh, I. Y., de… More

Brettmann, E. A., Oh, I. Y., de Guzman Strong, C. High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq). J. Vis. Exp. (140), e58030, doi:10.3791/58030 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter