Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Høy gjennomstrømming identifikasjon av regulatoriske gensekvenser med neste generasjons sekvensering av runde kromosom konformasjon fange (4C-seq)

Published: October 5, 2018 doi: 10.3791/58030
Automatic Translation
1, 1, 1
1Division of Dermatology, Center for Pharmacogenomics, Center for the Study of Itch, Department of Medicine, Washington University School of Medicine

Summary

Identifikasjon av fysiske interaksjonene mellom gener og regulatoriske elementer er utfordrende, men har blitt lettere ved kromosom konformasjon fange metoder. Denne endringen i 4C-seq-protokollen begrenser PCR bias ved å minimere over forsterkning PCR maler og maksimerer mappability lyder ved å innlemme et tillegg begrensning enzym digest skritt.

Abstract

Identifikasjon av regulatoriske elementer for et gitt mål gen utgjør en stor teknisk utfordring på grunn av variasjon i posisjonering og effekt størrelser av regulatoriske elementer til et mål gen. Noen fremgang har blitt gjort med bioinformatic prediksjon av eksistensen og funksjon av proksimale epigenetic endringer forbundet med aktivert genuttrykk bruker bevarte transkripsjon faktor bindende områder. Chromatin konformasjon fange studier har revolusjonert vår evne til å oppdage fysiske chromatin kontakter mellom sekvenser og selv innenfor en hel genom. Sirkulære chromatin konformasjon fange sammen med neste generasjons sekvensering (4C-seq), spesielt utviklet for å oppdage alle mulige fysiske chromatin samhandlinger for en bestemt sekvens av interesse (synspunkt), som et mål gen eller et Enhancer. Nåværende 4C-seq strategier direkte sekvensielt fra innen synspunkt, men krever mange og ulike synspunkter for å være samtidig i rekkefølge for å unngå de tekniske utfordringene av uniform base ringer (imaging) med neste generasjons sekvensering plattform. Dette volumet eksperimenter kanskje ikke praktisk for mange laboratorier. Her rapporterer vi en endret fremgangsmåte for 4C-seq-protokollen som inneholder både en ekstra begrensning enzym fordøye og qPCR-baserte forsterkning trinnene som er utformet for å lette en større fangst av ulike sekvens og redusere potensialet for PCR bias, henholdsvis. Våre endret 4C-metoden er mottakelig for standard molekylærbiologi laboratoriet for å vurdere chromatin arkitektur.

Introduction

Identifikasjon av regulatoriske elementer for genuttrykk har blitt lettere ved Encyclopedia av DNA elementer (kode) prosjektet som kommenterte omfattende funksjonelle aktiviteten 80% av den menneskelige genom1,2. Identifikasjon av nettstedene for i vivo transkripsjon faktor bindende, DNaseI overfølsomhet, og epigenetic histone og DNA metylering endringer i individuelle celletyper banet vei for de funksjonelle analysene av kandidat regulatoriske elementer for målet genuttrykk. Bevæpnet med disse funnene, står vi overfor utfordringen med å bestemme den funksjonelle tilkoblinger mellom regulatoriske elementer og gener. Spesielt hva er forholdet mellom et gitt mål gen og dens enhancer(s)? Metoden chromatin konformasjon fange (3C) adresser direkte dette spørsmålet identifiserende fysiske og sannsynlig funksjonelle, samspill mellom en region av interesse og kandidat samspill sekvenser gjennom fanget begivenheter i fast chromatin3 . Som vår forståelse av chromatin vekselsvirkningene har økt, men er det klart at etterforskningen av forhåndsvalgt kandidat loci er tilstrekkelig til å gi en fullstendig forståelse av gen-enhancer interaksjoner. For eksempel kode brukte høy gjennomstrømming chromosomal konformasjon fange kopi (5C) metoden for å undersøke en liten del av det menneskelige genomet (1%, pilot satt for 44 loci) og rapportert komplekse tilkoblinger for loci. Gener og enhancers med identifiserte samhandling i gjennomsnitt 2-4 ulike samspill partnere, hvorav mange var hundrevis av kilobases bort i lineær plass4. Videre Li et al. brukt Chromatin interaksjon analyse av parvise-End Tag sekvensering (ChIA-PET) til å analysere hele-genome Promotoren samhandling og fant at 65% av RNA polymerase II bindende områder var involvert i chromatin vekselsvirkningene. Noen av disse interaksjoner resulterte i stor, multi genet komplekser som spenner over hundrevis av kilobases i genomic avstand og inneholder, i gjennomsnitt 8-9 gener hvert5. Sammen fremheve disse funnene behovet for upartiske hele-genome metoder for avhør chromatin vekselsvirkningene. Noen av disse metodene er gjennomgått i Schmitt et al. 6.

Nyere metoder for chromatin konformasjon fange studier kombinert med neste generasjons sekvensering (Hi-C og 4C-seq) gjør oppdagelsen av ukjent sekvenser samspill med et område av interesse6. Spesielt runde kromosom konformasjon fange med neste generasjons sekvensering (4C-seq) ble utviklet for å identifisere loci bruker en sekvens av interesse i en saklig måte7 fra sekvensering DNA fra fanget chromatin proksimale til den region av interesse i 3D-rom. Kort, chromatin er fast å bevare sin opprinnelige protein-DNA samhandlinger, kløyvde med en begrensning enzym og senere samskrevet under fortynne forhold å fange biologisk relevante "floker" for samspill loci (figur 1). Korset koblingene tilbakeføres for å fjerne protein, dermed forlate DNA tilgjengelig for ekstra spalting med et annet begrensning enzym. En siste ligation genererer mindre sirkler for samspill loci. Primere for sekvensen av interesse brukes deretter til å generere et forsterket bibliotek av ukjent sekvenser fra circularized fragmenter, etterfulgt av nedstrøms neste generasjons sekvensering.

Protokollen presenteres her, som fokuserer på prøven forberedelse, gjør to store endringer i eksisterende 4C-seq metoder8,9,10,11,12. Først, den bruker en qPCR-basert metode å empirisk finne det optimale antallet forsterkning sykluser for 4C-seq biblioteket forberedelsene og dermed begrenser potensialet for PCR bias stammer fra over forsterkning av biblioteker. Andre bruker en ekstra begrensning digest trinn i et forsøk på å redusere sıtt kjent "agn" sekvenser som hindrer nøyaktig base-ringer ved sekvensering instrumentet, og derfor maksimerer unike, informativ sekvensen i hver Les. Andre protokoller omgå dette problemet ved pooling mange (12-15)8 4 C-seq biblioteker med forskjellige agn sekvenser og/eller begrensning områder, et antall som ikke kan være oppnåelig ved andre laboratorier. Endringene presenteres her at et lite antall eksperimenter, eksempler og/eller replikerer å bli indeksert og samles i samme kjørefelt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. restriksjoner enzym utvalg

  1. Identifisere et område av interesse (f.eks., gene arrangøren, single nukleotid polymorfisme (SNP), enhancer) og få DNA sekvensen fra reservoar som National Center for bioteknologi informasjon (NCBI).
  2. Identifisere kandidat begrensning enzymer (REs) for den første begrensningen enzym fordøyelsen (RE1) som ikke klippe i sekvensen av interesse, som produserer klissete ender (DNA termini med overheng) etter RE fordøyelsen og aktiviteter er ikke hemmet av CpG metylering.
    Merk: Oppløsning data bestemmes av RE1. Et enzym med en 6 base par (bp) anerkjennelse sekvens produserer, gjennomsnittlig fragmenter ca 4 kilobases (kb) i lengde, mens et enzym med en 4 bp anerkjennelse sekvens produserer fragmenter ca 250 bp i lengde, slik at mer presis Identifikasjon av samspill sekvenser.
  3. Velg en RE1 fra kandidat enzymer identifisert i trinn 1.2 som produserer en "synet" begrensning fragment minst 500 bp lenge som inkluderer regionen rundt eller alternativt en nabostaten regionen.
    Merk: Enzymet valgt må være mottakelig for primer design (se trinn 2).
  4. For andre fordøyelsen, identifisere en begrensning enzym (RE2) med en 4 bp anerkjennelse sekvens som produserer klissete ender (DNA termini med overheng) etter RE fordøyelsen, der aktiviteten ikke er hemmet av CpG metylering, og som kutter i begrensning fragment generert av RE1 å produsere en 250-500 bp agn fragment (figur 1).
    Merk: Enzymet valgt må være mottakelig for primer design (se trinn 2).

2. design og Test primere for omvendt PCR og fordøyelsen effektivitet qPCR

  1. Bruke en primer designverktøy som Primer3 (http://primer3.ut.ee) å designe omvendt primer som er rettet utover mot endene av agn fragment (dvs., 5' primeren er en "omvendt" primer, utfyllende til pluss Peasmarsh, mens 3 primer er en " Videresend"primer, utfyllende til den minus stranden) og nær webområdene begrensning som mulig å redusere forsterkningen på ikke-informative agn sekvens og maksimere PCR effektivitet (figur 2A).
    Merk: Primere bør bli spådd for å ha minimal uspesifisert forsterkning fra genomisk DNA av i sili PCR spådommer og bør ikke justere andre steder i genomet unntatt sine tiltenkte målet med mer enn 16/18 identitet9. Sekvensering kort er ikke inkorporert i de inverse PCR primerne, er området primer bindingen mer fleksibelt enn i andre 4C forberedelse metoder; primere bør optimalt anneal 50 bp på slutten av det tilsvarende begrensning-området.
    1. Bekreft spesifisiteten av inverse PCR primere ved forsterkning med renset genomisk DNA (gDNA) som mal.
    2. Optimal primere skal gi noen produkter når du bruker gDNA som en mal (se trinn 11.2 for beskrivelsen av forventet 4C-produkter). Hvis betydelige forsterkning fra gDNA oppstår, utforme nye primere. Hvis ingen godkjente primer sett identifiseres, gå tilbake til trinn 1 og velg en ny agn ved å velge ny begrensning enzymer.
  2. Utforme qPCR primere å forsterke fragmenter 70-200 nukleotid (nt) i lengde overvåke begrensning fordøyelsen effektiviteten (figur 2B).
    1. Utforme et par primere å forsterke over hver begrensning nettsted (valgt i trinn 1) som definerer agn sekvensen. Utforme primerne for både RE1 (se trinn 6.5.6) og RE2 (se trinn 9.2).
    2. Utforme en rekke primere som forsterker et område som ikke inneholder nettstedene for enten begrensning enzym som en normalisering (uncut DNA) for RE1 og RE2 (se trinn 6.5.6).

3. samling celler

  1. Bruker en metode som passer for vev eller celle kultur, få en enkeltcelle suspensjon. Pellets celler for 5 min på 200 x g, forkaste nedbryting og resuspend pellet i 500 µL av 1 x fosfat bufret saltvann (PBS) per 107 celler.

4. formaldehyd Cross-linking celler å bevare Chromatin vekselsvirkningene

  1. Per 107 celler, legger du til 9,5 mL 1% elektronmikroskop (EM)-grade formaldehyd (metanol-ledig) i PBS og ruge, mens tumbling på rocker (eller lignende), i 10 minutter ved romtemperatur (RT, 18-22 ° C).
    Merk: Fiksering betingelser må være optimalisert for hver celle. Tidligere publisert arbeid i musen celler rapportert at optimal fiksering resulterer i minst 40% av tilordnede justering til kromosomet inneholder synspunkt9 forutsatt en ikke-telomeric region for en gjennomsnittlig størrelse kromosom.
  2. Overføre reaksjon rør is og legge til iskald 1 M glysin til en siste konsentrasjon av 0.125 M (1.425 mL) å slukke crosslinking reaksjonen. Bland ved mild inversjon.
  3. Sentrifuge for 5 min på 200 x g, 4 ° C, og fjern forsiktig alle nedbryting. Lagre celle pellet ved-80 ° C eller fortsette umiddelbart til celle lysis.

5. celle Lysis

  1. Resuspend celle pellet fra trinn 4,3 i 500 µL av 5 mM ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) å vaske. Sentrifuge 200 x g i 5 min på RT. Forkast nedbryting.
  2. Resuspend celle pellet i 125 µL av 5 mM EDTA med 0,5% natrium dodecyl sulfate (SDS) og 1 x proteasehemmere, som en 100 x cocktail som inneholder 5 mg/mL antipain, 10 mg/mL chymostatin, 10 mg/mL leupeptin og 10 mg/mL pepstatin A.
    Merk: Vaskemiddel konsentrasjon må optimaliseres for hver celle. Utilstrekkelig vaskemiddel konsentrasjoner vil resultere i ufullstendige celle lysis, forlater chromatin utilgjengelig for begrensning enzymer. Hvis begrensning fordøyelsen er vedvarende lav i trinn 6.5.6 og aktiviteten til enzymet er bekreftet, kan ekstra vaskemiddel være nødvendig. Øke SDS konsentrasjon i intervaller på 0,1%.
  3. Inkuber celle suspensjon på is 10 min.
    Merk: For primære menneskelige keratinocytter, optimal lysis ble oppnådd med en 10 min incubation på 65 ° C etterfulgt av en 37 ° C over natten inkubasjon i en risting oppvarming blokk med agitering (900 rpm).
  4. Kontroller at celle lysis er fullført.
    1. Mix 6 µL av cellene med 6 µL Trypan blå på et lysbilde og dekk med en dekkglassvæske. Vis under et mikroskop.
      Merk: Ved vellykket lysis, indre av cellene skal vises blå og un lysed celler vises hvite.
    2. Hvis cellen lysis vises utilstrekkelig, pellets cellene på 200 x g i 5 min og lagre nedbryting. Resuspend pellet og gjenta 5.2-5.4 og/eller alternativt med forskjellige inkubasjon temperaturer (se merknad i trinn 5.3).
    3. Kombinere de re lysed pellet med lagrede nedbryting og Fortsett.
      Merk: Visuell inspeksjon er ikke en garanti for tilstrekkelig lysis. Fordøyelsen effektivitet bør fastsettes objektivt som i trinn 6.5.6.

6. første begrensning fordøyelse

  1. Legge til 30 μL 10 x begrensning enzym buffer (angitt av produsenten) og 27 μL 20% Triton X-100 (siste 1,8%) til suspensjon fra trinn 5.4. Bringe det totale volumet til 300 µL med H2O.
    Merk: Sammensetningen av begrensning enzym bufferen vil avhenge RE valgt i trinn 1.
  2. Fjerne en 15 μL aliquot som "Ufordøyd kontroll" og butikken på 4 ° C.
  3. Legge til 200 U RE1 gjenværende reaksjonsblandingen og ruge over natten ved temperatur avhengig enzymet i en risting oppvarming blokk med agitering (900 rpm). Neste dag, legge en ytterligere 200 U RE1 og fortsette inkubering over natten.
  4. Fjerne en 15 μL aliquot som en "Digested kontroll" og lagre på 4 ° C.
  5. Bestemme fordøyelsen effektivitet:
    1. Legge til 82,5 µL av 10 mM Tris-HCl pH 7.5 15 µL prøvene fra trinn 6.2 og 6.4. Legge til 2,5 µL av proteinasen K (20 mg/mL) og ruge 1t på 65 ° C.
    2. Legg 100 µL av fenol-kloroform og bland kraftig ved inversjon fjerne gjenværende protein forurensning. Sentrifuger i 5 min, 16,100 x g ved romtemperatur.
    3. Overføre den vandige fasen til en ny tube. Legg 6.66 µL av 3 M natrium acetate pH 5.2 1 µL av 20 mg/mL glykogen og 300 µL av 100% etanol (EtOH). Bland forsiktig av inversjon og sted på-80 ° C i 1 time.
    4. Sentrifuge for 20 min 16,100 x g på 4 ° C. Fjern nedbryting, legge 500 µL av 70% EtOH og sentrifuge for 5 min på 16,100 x g ved RT.
    5. Fjerne nedbryting og tørr pellet ved romtemperatur for 2 min. Resuspend pellet i 50 µL nuclease-gratis t2O.
    6. Bestemme digest effektivitet ved qPCR13,14 med metoden ∆∆Ct. Bruke primer sett ikke flankerer en begrensning nettsted (se trinn 2.2.2) som kontrollen normalisering. Hvis fordøyelsen effektiviteten er > 85%. Ellers pellets cellene og gjenta 5.2-6.5, utelater inkubering på 65 ° C i trinn 5.3.

7. første Ligation

  1. Varme-Deaktiver begrensingen enzymet av rugende 20 min på 65 ° C. Alternativt, hvis enzymet ikke blir varme inaktivert, fenol-kloroform ekstra og etanol bunnfall prøven.
    Merk: De anbefalte for noen begrensning enzymer inaktivering temperaturene denature proteiner i chromatin, og dette kan negativt påvirke eksempel kvaliteten. I tillegg er fenol: kloroform utvinning ikke ideelt, som det resulterer i tap av prøven.
  2. Overføre til en 50 mL konisk tube og legge 6 mL av nuclease-fri H2O, 700 µL av 10 x ligase buffer (660 mM Tris-HCl pH 7.5, 50 mM magnesiumklorid (MgCl2), 10 mM dithiothreitol (DTT), 10 mM adenosin trifosfat (ATP)), og 50 U T4 DNA Ligase. Bland forsiktig av virvlende og ruge over natten på 16 ° C.
  3. Fjerne en 100 µL aliquot på utvalget som '' Ligation kontrollen ''.
  4. Bestemme ligation effektivitet:
    1. Legge til 2,5 µL proteinasen k (20mg/mL) og ruge 1t på 65 ° C.
    2. Legge til 100 µL av fenol-kloroform og bland kraftig ved inversjon. Sentrifuge for 5 min, 16,100 x g ved RT.
    3. Overføre den vandige fasen til en ny tube. Legge til 6.66 µL av 3 M natrium acetate pH 5.2 1 µL av glykogen og 300 µL av 100% EtOH. Bland forsiktig av inversjon og sted på-80 ° C ca 1 time.
    4. Sentrifuge for 20 min 16,100 x g på 4 ° C. Fjern nedbryting, legge 500 µL av 70% EtOH og sentrifuge for 5 min 16,100 x g på 4 ° C.
    5. Fjerne nedbryting og tørr pellet ved romtemperatur. Resuspend pellet i 20 µL av vann og laste på en 0,6% agarose gel ved "fordøyelsen kontrollene" fra trinn 6.5.
      Merk: En godt ligated prøve skal vises som et relativt stramt, høy molekylvekt band (Figur 3).
    6. Hvis ligation er tilstrekkelig, Fortsett med trinn 8. Legg ellers friske ATP (1 mM endelige konsentrasjon) og nye ligase; Ruge over natten på 16 ° C og gjenta 7.3-7.4.

8. reversere Cross-linking og isolere Chromatin

  1. Legg til 15 µL proteinasen k (20 mg/mL) og ruge over natten ved 65 ° C å reversere cross-links.
  2. Legge til 30 µL av RNase A (10 mg/mL) og ruge 45 min på 37 ° C.
  3. Legge til 7 mL av fenol-kloroform og bland kraftig ved inversjon. Sentrifuger 15 min, 3300 x g ved RT.
  4. Overføre den vandige fasen til en ny 50 mL tube og legge 7,5 mL nuclease gratis H2O (å fortynne DTT i ligase bufferen, som ellers precipitates med DNA), 1 mL av 3 M natrium acetate pH 5,6, 7 µL av glykogen (20 mg/mL) , og 35 mL 100% EtOH. Bland og ruge ved-80 ° C i 1 time.
  5. Sentrifuger 20 min, 3900 x g på 4 ° C. Fjerne nedbryting (pellets kan være vanskelig å se), vaske pellets med 10 mL iskald 70% EtOH, og sentrifuger 15 min, 3300 x g på 4 ° C.
  6. Fjerne nedbryting og kort tørr pellet på RT. oppløses pellet i 150 µL av 10 mM Tris-HCl pH 7.5 på 37 ° C. Lagre på 20 ° C og fortsett med trinn 9.

9. andre begrensning fordøyelse: Trimming sirkler

Merk: Dette trinnet oppretter mindre sirkler for å minimere overrepresentation av mindre fanget fragmenter på grunn av PCR skjevhet i nedstrøms forsterkning trinnene.

  1. Prøven fra trinn 8.6, legge til 50 µL av 10 x begrensning enzym buffer (angitt av produsenten), 300 µL nuclease-gratis t2O og 50 U begrensning enzymet RE2. Ruge over natten ved temperatur passer for valgte enzymet.
  2. Fjerne en 15 µL aliquot på utvalget som "fordøyelsen kontroll". Bestemme fordøyelsen effektivitet som beskrevet i trinn 6.5.

10. sekund ligatur og DNA rensing

  1. Deaktiver begrensingen enzymet som anbefalt av produsenten. Hvis enzymet ikke blir inaktivert, fjerne enzymet bruker en kolonne-baserte rensing kit.
    Merk: Som dette resulterer i tap av prøven, er ikke kolonnen rensing ideelt.
  2. Overføre prøven til en 50 mL tube og legge 12,1 mL nuclease gratis H2O, 1,4 mL 10 x ligation buffer (660 mM Tris-HCl, pH 7.5, 50 mM MgCl2, 10 mM DTT, 10 mM ATP) og 100 U T4 DNA ligase. Ruge over natten på 16 ° C.
  3. Legge til 467 µL av 3 M natrium acetate pH 5.6, 233 µL nuclease-fri H2O, 7 µL glykogen (20 mg/mL) og 35 mL 100% EtOH. Bland godt og ruge ved-80 ° C 1t.
  4. Sentrifuger 45 min, 3900 x g på 4 ° C. Fjern nedbryting, legge 10 mL kaldt 70% EtOH, og sentrifuger 15 min, 3300 x g på 4 ° C.
  5. Fjerne nedbryting og kort tørr pellet ved romtemperatur. Tilsett 150 µL av 10 mM Tris-HCl pH 7.5 og ruge på 37 ° C å oppløse pellet.
  6. Rense prøvene med en silica kolonne-baserte PCR rensing kit, følger produsentens instruksjoner. Bruke 1 kolonne per 3 x 106 celler, basert på det opprinnelige antallet celler. Elute kolonnene med 50 µL av 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 og basseng prøvene.
  7. Måle konsentrasjonen av fluorimetry eller spectrophotometry med absorbansen på 260 nm. Malen 4C er nå klar for inverse PCR. Lagre på 20 ° C eller gå direkte til trinn 11.

11. PCR forsterke ukjent samspill sekvenser av Inverse PCR

  1. Bestemme lineær omfanget av forsterkning ved å utføre en PCR bruke malen fortynninger av 12,5, 25, 50 og 100 ng 4C mal. Eventuelt forsterke fra gDNA parallelt med direkte sammenligne produkter for å identifisere ikke-spesifikk forsterkning. Kjøre PCR reaksjoner med en innledende rødsprit 94 ° c i 2 minutter; 30 sykluser som består av et rødsprit skritt på 94 ° C for 10 s, en annealing trinn ved 55 ° C i 1 min, og en forlengelse på 68 ° C i 3 min; og en siste utvidelse på 68 ° C i 5 min.
  2. Skille 15 µL av hvert PCR-produkt på en 1,5% agarose gel å bekrefte lineær forsterkning og vurdere mal kvalitet (Figur 4). Forsterkning 4C malen skal gi diskret striper på DNA Lavinnblanding og en smøre på høyere konsentrasjoner. Tilstedeværelsen av smear indikerer økt kompleksitet i forsterket 4C ligations.
  3. Når fornøyd med kvaliteten og kvantiteten av inverse PCR produktet generert, sette opp en qPCR å finne optimalt antall sykluser å bruke for forsterkning:
    1. Definere reaksjonene som inneholder SYBR og ROX fargestoffer bruker reaksjonsblandingen i tabell 2. Hvis forsterkning ikke er lineær i høy konsentrasjoner i trinn 11.2, bruk 100 ng av malen per reaksjon.
      Merk: Tillegg av ROX forenkler normalisering av fluorescerende signalet fra brønn til vel og syklus til syklus.
    2. Kjøre PCR reaksjonene bruker en innledende rødsprit på 94 ° C i 2 minutter; 40 sykluser som består av et rødsprit skritt på 94 ° C for 10 s, en annealing trinn ved 55 ° C i 1 min, og en forlengelse på 68 ° C i 3 min; og en siste utvidelse på 68 ° C i 5 min.
    3. Bestemme peak (sluttpunktet) fluorescens av reaksjoner med forsterkning tomten. Bestemme syklusen som reaksjoner nå 25% av peak fluorescens (figur 5).
      Merk: Dette er antall sykluser som skal brukes til å forsterke 4C bibliotekene (se trinn 11.4).
  4. Definere inverse PCR i tabell 3 å forsterke ukjent sekvenser samskrevet til agn fra malen 4 C. Dele inn 16 reaksjoner på 50 µL før du kjører. Kjøre PCR reaksjoner med en innledende rødsprit 94 ° c for 2 min og sykluser som består av et rødsprit skritt på 94 ° C for 10 s, en annealing trinn ved 55 ° C i 1 min, og en utvidelse trinn på 68 ° C i 3 min. Bruk antall sykluser i trinn 11.3.3.
  5. Samle og forene reaksjonene. Rense bruker en silica kolonne-baserte PCR rensing kit. Bruk minst 2 kolonner per 16 reaksjoner. Basseng renset PCR produktene.
  6. Bestemme prøveantall og renhet av spectrophotometry. Typisk gir er mellom 10 og 20 μg med A260/A280 ~ 1,85. Hvis de absorpsjon er sub-optimale, nytt rense for å unngå problemer under sekvensering.
  7. Vurdere kompleksiteten i biblioteket ved å skille 300 ng renset PCR-produkt på en 1,5% agarose gel.
    Merk: Forsterket produktet skal ligne som fra trinn 11.2.

12. tredje begrensning fordøyelse: Klippe av agn sekvenser

Merk: Dette trinnet fjerner ikke-informative agn sekvenser fra omvendt PCR produktene å maksimere informativ fanget sekvenser i nedstrøms sekvensering trinnene. For å overvåke digest effektivitet, er en "ufullstendig skjerm"15 fordøyd parallelt med tilsvarende DNA og enzym konsentrasjon. Hvis RE1 og RE2 kan ikke samtidig fordøyelsen, for eksempel må på grunn av ulike optimal inkubasjon temperaturer eller reaksjon buffere, dette gjøres som en sekvensiell Sammendrag (dette ikke er perfekt).

  1. Få en RE digest skjerm og teste fordøyelsen i en 50 µL reaksjon.
    Merk: Dette er et molekyl av dsDNA (for eksempel en plasmider, PCR amplicon eller syntetisk DNA) som inneholder RE (r). Det eneste kravet er at det skal være enkelt å skille kutt fra uncut skjermen på en agarose gel. Optimaliser RE skjerm masse og enzym konsentrasjon om nødvendig.
  2. Digest 1 µg renset omvendt PCR produkt fra trinn 11,6 og i parallell, RE skjermen fra trinn 12,1.
    Merk: DNA og enzym konsentrasjon, samt inkubasjon tid, bør være den samme testen sammendraget i trinn 12,1 for både inverse PCR produktet og skjerm-format. Juster volumet reaksjon etter behov.
  3. Kjøre den fordøyde RE skjermen på en agarose gel konsentrasjon passer for forventet fragmenter. Fordøyelsen anses tilstrekkelig når < 10% av DNA forblir uncut (figur 6).
  4. Rense fordøyd omvendt PCR produktet på en silica kolonne-baserte DNA rensing kit. Hvis sekvensiell fordøyer, Gjenta trinn 12,1-12.4 med andre enzymet.

13. utarbeidelse av sekvensering bibliotek

  1. Ligate kortene kompatibel med respektive neste generasjons sekvensering plattformen.
    1. Utforme kortene for hver RE1 og RE2 slik at etter annealing i oligos, hver RE adapter har respektive 1-sidige overheng.
      Merk: For eksempel hvis HindIII brukes, glødet kortet bør inneholde en 5' fosforylert "AGCT" overheng. Alternativt, hvis standard T-overheng adaptere, slutten-reparasjon og A-hale biblioteket før kort hemorroider.
    2. Anneal respektive adapter RE oligos. Resuspend oligos i annealing buffer (10 mM Tris, pH 7.5, 50 mM natriumklorid (NaCl), 1 mM EDTA), bland i ekvimolare mengder til 50 µM, varme til 95 ° C, og Avkjøl sakte til 25 ° C.
    3. Utføre ligation reaksjonen. Bland re fordøyd 4 C biblioteket med en totalt 5 - til 10 ganger molar overskudd av glødet adaptere (trinn 13.1.2, 50/50 forhold for hver RE adapter brukt) i 1 x ligase buffer og legge 6U DNA ligase. Inkuber ifølge instruksjonene fra produsenten.
    4. Fjerne overflødige kort ved rensing med en lav-elueringsrør volum silisium-basert kolonne kit.
  2. Velg.
    Merk: Størrelse kan også utføres ved hjelp av en perle-basert rengjøring kit og anbefales selv etter kolonnen rensing.
    1. Kastet en 2% agarose gel med en høy oppløsning agarose, legge til en ikke-UV flekk før strømme. Kontroller at noe vann tapt på grunn av fordampning under oppvarming er erstattet av veier flaske eller kolbe før og etter oppvarming og vann for å gjenopprette tapt massen.
    2. Kjøre adapter-samskrevet bibliotekene på gel, forlater tom baner mellom utvalgene.
    3. Avgiftsdirektoratet gel skiver tilsvarende størrelse utvalg 150 bp til 1 kb bruker en ren skalpell eller barberblad.
    4. Rense biblioteker fra gel med en gel utvinning kit. For å minimere GC skjevhet i utvinningen av DNA, løses gel skiver ved romtemperatur med rotasjon.
  3. Bestemme antall sykluser for PCR forsterkning av qPCR bruke reaksjonsblandingen i Tabell 4. Kjøre PCR reaksjoner med en innledende rødsprit 98 ° c i 2 minutter og 40 sykluser som består av en rødsprit steg på 98 ° C for 10 s, en annealing trinn ved 60 ° C i 1 min, og en utvidelse ved 72 ° C i 3 minutter.
    Merk: Syklusen der fluorescens når 25% av maksimal er antall sykluser som skal brukes til å forsterke biblioteket, som i trinn 11.3.
  4. Forsterke bibliotekene bruker reaksjonsblandingen i tabell 5. Kjøre PCR reaksjoner med en innledende rødsprit 98 ° c for 2 min og sykluser som består av et rødsprit skritt på 98 ° C for 10 s, en annealing trinn ved 60 ° C i 1 min, og en utvidelse ved 72 ° C i 3 minutter. Antall forsterkning sykluser som skal brukes for hvert bibliotek identifiserte i trinn 13,3.
  5. Rense forsterket bibliotek ved hjelp av en lav-elueringsrør volum silisium-basert kolonne kit.

14. sekvensering og analyse av sekvensering Data

  1. Bestemme konsentrasjonen av forsterket bibliotek ved hjelp av en fluorimetric analysen. Fortynne bibliotekene riktig konsentrasjonen for sekvensering (Sjekk med sekvensering tjenesten eller kjernen for deres anbefaling).
  2. Bestemme kvaliteten på bibliotekene bruker en microfluidic nukleinsyre analyse plattform.
    Merk: Størrelse profilen til biblioteket skal gjenspeile det sett på størrelse utvalg gel i trinn 13.2 og konsentrasjonen av prøven i dette trinnet er å bli anvendt for sekvenser.
  3. Bassenget indeksert biblioteker for å få minst 3 millioner leser (minst 50 bp lese; enkelt [1 X 50] eller sammenkoblede slutten [2 X 50]) per prøve. En høy kvalitet biblioteket krever minst 1 million tilordnet leser9, men det vil være noen slitasje under tilordning. For eksempel rommer en sekvensering plattform som gir ca 150 millioner leser per kjørefelt opptil 50 prøver i samme kjørefelt.

15. analyse av sekvens Data

  1. Demultiplex dataene ved å bruke indeksen sekvenser tilordne lest til sine riktige prøver.
    Merk: Avhengig av deres fortrolighet, brukere kan utføre nedstrøms beregningsformelen analyser rå FASTA/FASTQ sekvens filer ved hjelp av grunnleggende kommandolinjegrensesnittet eller, alternativt, brukervennlig, web-basert Galaxy grafisk bruker grenseflate (GUI)16 .
  2. Trim kortet sekvenser og noen agn sekvens som følge av ufullstendig RE fordøyelsen i trinn 12, for eksempel, med rask-X Toolkit (http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/).
  3. Demultiplexed leser tilordnes riktig genomet av interesse (f.eks., UCSC mm10, hg19) hjelp Hi-hjuling Aligner (BWA)17 eller annen justering programvare resulterer i SAM utdatafiler. Om nødvendig konvertere SAM filer til BAM via samtools18 (se trinn 15,4-tommers).
  4. Bruk en 4C-seq analyse rørledning som Basic4Cseq19, 4 C-ker20, FourCSeq21eller fourSig22 til å analysere data og identifisere interaksjoner.
    Merk: Dataanalyse og vurdering av kvaliteten av bør utføres i henhold til den valgte programvarepakken håndbok. Pakker generere SENG utdatafiler untatt. Kort, Basic4CSeq19 bruker en SAM inndatafil (trinn 15.3) å visualisere samhandlinger (txt, tiff, SENG og parykk utdatafiler) og vurderer kvaliteten på dataene basert på kriteriene fastsatt i van de Werken et al. 9 4 C-ker20 (inngang trimmet FASTQ, trinn 15.2) og FourCSeq21 (input BAM, trinn 15.3) identifisere differensial interaksjoner mellom forhold. fourSig22 (input SAM) også identifiserer betydelig interaksjon og prioriterer dem som skal reproduseres. Verktøy som Genomic regulatoriske berikelse av merknader verktøyet (stor)23eller integrasjon med kode datasett kan også brukes til å forutsi biologiske funksjonen samhandlinger som er oppdaget av 4 C-seq.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Primære menneskelige keratinocytter ble isolert fra 2 – 3 forkastet neonatal forhuder, gruppert og kulturperler på KSFM supplert med 30 µg/mL bovin hypofysen ekstrakt, 0,26 ng/mL rekombinant menneskelige epidermal vekstfaktor og 0.09 mM veisalt (CaCl2 ) ved 37 ° C, 5% karbondioksid. Cellene ble delt i to flasker, og en kolbe var differensiert ved tilsetning av CaCl2 til en siste konsentrasjon av 1,2 mM for 72 h. 107 celler hver fra voksende og differensiert keratinocyte bestander ble løst i 1% formaldehyd i 10 min ved romtemperatur. Separat, ble K562 celler dyrket i RPMI med 10% fosterets bovin serum ved 37 ° C, 5% karbondioksid. 107 celler ble løst i 1% formaldehyd i 10 min ved romtemperatur.

Cellene var lysed, og det faste chromatin ble fordøyd med HindIII og samskrevet som beskrevet ovenfor. Cross-Links ble snudd, og DNA er renset og fordøyd med CviQI. DNA var samskrevet og brukes som mal for omvendt PCR forsterkning. Primere brukt var: 5'-GATCAGGAGGGACTGGAACTTG/5-CCTCCCTTCACATCTTAGAATG. 1 µg renset omvendt PCR produktet ble fordøyd natten med CviQI parallelt med 225 ng av RE fordøye skjermen og kolonne-renset. Renset DNA ble deretter fordøyd natten med HindIII parallelt med 125 ng av RE fordøye skjermen og kolonne-renset. 250 ng renset dobbel-fordøyd omvendt PCR produktet ble brukt for biblioteket forberedelse. Kort, ender reparert via konverteringer til 5'-fosforylert og Butt-ender og påfølgende DNA kolonne-rensing. Endene var A-tailed 20 min ved 72 ° C i en 50 µL reaksjon med 1 U Taq utvalg og 200 µM dATP og kolonne-renset. Kompatible sekvensering biblioteket prep kort var samskrevet i 10:1 (kort: S) forholdet hjelp av T4 DNA ligase i en 30 µL reaksjon ved romtemperatur for 15 min og DNA kolonne-renset. Biblioteker ble kjørt på en 2% agarose gel, gel sektorer ble kuttet fra 120 bp til toppen av stigen fjerne kort og biblioteker ble renset. 200 pg av hvert bibliotek ble vurdert i 10 µL qPCR reaksjoner som inneholder indeksering primere for å bestemme optimale PCR forsterkning sykluser. Biblioteker ble forsterket for å legge til indekser ved hjelp antall sykluser bestemmes av qPCR og rekkefølge på en HiSeq2500 for å få 1 x 50 leser.

Leser demultiplexed og trimmet. Først ble sekvensering kort fjernet. Deretter var rekkefølgen fra begynnelsen av hver primer til området begrensning trimmet. Dette gjør at tilordningen av inverse PCR produkter som ikke var fullt digested før biblioteket forberedelse. Viktigere, hindrer inkludert sekvens mellom primer binding området og området begrensningen tilordning av ikke-spesielt-forsterket PCR produktet. Trimmet leser ble tilordnet til hg38 bruker BWA. Figur 7 viser leser tilordning til regionen rundt synspunkt.

Figure 1
Figur 1: skjematisk av 4C-seq arbeidsflyt. Chromatin er krysskoblet Kunnskapsbasens protein-DNA kontakter, fordøyd med RE1 og samskrevet for å koble samspill loci. Cross-Links tilbakeføres, og DNA er fordøyd med RE2 og samskrevet. Ukjent samspill sekvenser er forsterket med primer som binder til regionen rundt, og PCR produkter er fordøyd med RE1 og RE2 å trimme kjent sekvenser. Forsterket DNA av ukjent brukes i en sekvensering biblioteket prep, der kortene er samskrevet og biblioteket er PCR-forsterket og sekvensert. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: skjemaer primer design. (A) Binding nettsteder for omvendt PCR primere. Primere er orientert "utover" (dvs. 5' primer er en «omvendt» primer, utfyllende til pluss Peasmarsh, mens 3 primer er en "videre" primer, utfyllende til den minus stranden) og binde 50 bp for hvert begrensning område (angitt med rød skyggelegging). (B) Binding nettsteder for qPCR primere for å bestemme begrensning enzym digest effektivitet. En primer par flankene hvert begrensning enzym område. En primer kontrollsett forsterker en sekvens som ikke inneholder et område for enten enzym og brukes til å normalisere Ct verdier for DNA inndata. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Agarose gel geleelektroforese å vurdere ligation effektiviteten for RE1-fordøyd chromatin. Uncut, HindIII-fordøyd og samskrevet prøver ble behandlet med proteinasen K og oppvarmet for å reversere cross-links, fenol: kloroform utdraget, EtOH utfelt og resuspended i H2O. renset DNA ble kjørt på en 0,6% agarose gel og band visualisert ved ethidium bromide flekker med sammenligning til 1 kb pluss stigen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: 4C mal titrering for inverse PCR. Seriell fortynninger var laget av 4C maler og brukt i omvendt PCR reaksjoner. PCR produkter var kjører på 1,5% agarose gel og visualisert ved ethidium bromide flekker sammen med 1 kb pluss stigen. NTC angir ingen-mal kontroll reaksjonen. Merk en correlative økning i forsterkning med en økning i malen konsentrasjon. Denne representant forsterkning ble gjennomført på chromatin kløyvde med HindIII som RE1 og CviQI som RE2, og primer sekvenser brukes for inverse PCR forsterkning var 5'-GATCAGGAGGGACTGGAACTTG/5-CCTCCCTTCACATCTTAGAATG. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: qPCR-mediert fastsettelse av forsterkning sykluser for å forsterke mal for inverse PCR. 4C maler ble forsterket i reaksjoner som inneholder 1 x SYBR Green og 1 x ROX i en sanntids thermocycler. Topp fluorescens var bestemt og antall sykluser må nå lag ¼ av topp fluorescens ble beregnet. Antall sykluser ble brukt til å forsterke 4C malen for inverse PCR. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: Agarose gel geleelektroforese av fordøyd RE skjermen som indikerer nok fordøyelsen. RE oversikten ble skjermen forsterket fra menneskelig genomisk DNA primere F: 5'-TCCTATCCCTGGTCTGTCTTAT og R: 5'-CCACATTGGTCCTTCTAGTCTTC og renset. 225 ng skjermen var fordøyd med 15 U CviQI i en 50 µL reaksjon ved 25 ° C over natten og kjøre på en 1,5% agarose gel sammen med 1 kb pluss stigen. Band var visualisert med ethidium bromide flekker. Uklippet skjermen er 2515 bp; forventet fragment størrelser er 132 343, 488, 539 og 1013 bp. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: representant genomisk spor Les dekning i 5 kb av regionen synspunkt. Leser trimmet og tilordnet hg38 bruker BWA. Fleste leser (blå topper) justere på HindIII eller CviQI nettsteder ved HindIII nettsteder, som forventet. Regionen synspunkt er uthevet i rødt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Volum 1 x
10 x utvide lange mal Buffer 1 2,5 ΜL
dNTPs (10 mM) 0,5 ΜL
Fremover primer 35 pmol
Omvendt primer 35 pmol
Utvide lange mal utvalg (5 U/µL) 0,35 ΜL
DNA
Nuclease-fritt vann til 25 µL

Tabell 1: PCR reaksjonsblandingen for forsterkning av 4C (trinn 11.1).

Volum 1 x
10 x utvide lange mal Buffer 1 1,5 ΜL
dNTPs (10 mM) 0,3 ΜL
Fremover primer 21 pmol
Omvendt primer 21 pmol
100 x SYBR grønne jeg 0,15 ΜL
50 x ROX 0,3 ΜL
Utvide lange mal utvalg (5 U/µL) 0.21 ΜL
DNA 100 ng
Nuclease-fritt vann til 25 µL

Tabell 2: qPCR reaksjonsblandingen for fastsettelse av antall forsterkning sykluser for inverse PCR (trinn 11.3.1).

Volum 1 x
10 x utvide lange mal Buffer 1 80 ΜL
dNTPs (10 mM) 16 ΜL
Fremover primer 1,12 nmol
Omvendt primer 1,12 nmol
Utvide lange mal utvalg (5 U/µL) 11,2 ΜL
DNA 3.2 µg
Nuclease-fritt vann til 800 µL

Tabell 3. PCR reaksjonsblandingen for siste omvendte PCR forsterkning av 4C (trinn 11,4).

Volum 1 x
5 x Phusion HF buffer 2 ΜL
dNTPs (10 mM) 0,2 ΜL
Miltiplexing Primer 1.0 5 pmol
Miltiplexing Primer 2.0 0,1 pmol
Indeks primer 5 pmol
100 x SYBR grønne jeg 0,1 ΜL
50 x ROX 0,2 ΜL
Phusion utvalg 0,1 ΜL
DNA 2 ΜL
Nuclease-fritt vann til 10 µL

Tabell 4: qPCR reaksjonsblandingen for fastsettelse av antall forsterkning sykluser for sekvensering biblioteket prep (trinn 13,3).

Volum 1 x
5 x Phusion HF buffer 10 ΜL
dNTPs (10 mM) 1 ΜL
Miltiplexing Primer 1.0 25 pmol
Miltiplexing Primer 2.0 0,5 pmol
Indeks primer 25 pmol
Phusion utvalg 0,5 ΜL
DNA 10 ΜL
Nuclease-fritt vann til 50 µL

Tabell 5: PCR reaksjonsblandingen for forsterkning av bibliotekene for sekvensering (trinn 13,4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

4C resultatene har potensial til å avsløre chromatin vekselsvirkningene det kan identifisere tidligere ukjente regulatoriske elementer og/eller mål gener som er viktige i en bestemt biologisk sammenheng24,25,26. Tekniske hindringer kan imidlertid begrense dataene innhentet fra disse eksperimentene. PCR bias stammer fra over forsterkning av malen i 4 C protokoller er sannsynlig. Denne protokollen løser dette problemet ved å bruke qPCR for å finne det optimale antallet forsterkning sykluser på en objektiv måte. I tillegg kan fjerning av agn sekvenser fra forsterket omvendt PCR produkter av begrensning digest lette identifikasjonen av chromatin vekselsvirkningene av to grunner. Først, reduseres lengden på ikke-informativ (agn) base parene fra materialet som ble sekvensert. Sekund, og følgelig øker sannsynligheten for at flere leser genereres fra forskjellige sekvenser (en eiendel kreves for nøyaktig base ringer) og dermed mer informative samspill sekvenser kan tilordnes. Andre protokoller krever av mange biblioteker bruker forskjellige agn sekvenser og/eller begrensning enzymer eller krever øker phiX konsentrasjonen av sekvensert prøven å omgå sekvens ensartethet problemet for nøyaktig base ringer. Denne metoden tillater flere eksempler med samme agn sekvens til samordnes i en enkelt sekvensering kjørefelt uten opptar verdifull sekvensering kapasitet med overflødig phiX.

Cellen fiksering og lyseringsbufferen er kritiske tidlige trinn, begge krever optimalisering for bestemt celletyper. Utilstrekkelig fiksering mislykkes å bevare bestemte kontakter mellom en region av interesse og dens samspill sekvenser, gir uninformative data dominert av støy. Derimot vil over fiksering redusere muligheten for begrensning enzymer deler chromatin, som resulterer i færre informativ ligation hendelser. Både etappe, den stabiliserende konsentrasjon og inkubasjonstiden kan endres for å optimalisere denne variabelen. Tilsvarende reduserer utilstrekkelig celle lysis tilgang av begrensning enzymer til chromatin, igjen redusere antall informativ ligation hendelser. I våre hender lysed menneskelige primære keratinocytter mest effektivt å bruke en kombinasjon av hypotonisk forhold og vaskemiddel. Andre celletyper kreve ulike lysis forhold, som må avgjøres empirisk. Effektiv lysis kan identifiseres av mikroskopi fargestoff utelukkelse metoder som Trypan blå flekker.

En begrensning av metoden 4C er at resultatene kan bare representere en befolkningen gjennomsnitt. Med en heterogen celle befolkning, kan det være vanskelig å fastslå sanne interaksjoner vs støy som skyldes biologisk variasjon. Mens bruken av en celle linje eller sorteringen av celler til å produsere en homogen celle befolkningen spådd til å generere klarere signaler, er variasjon mellom individuelle celler fortsatt en mulig kilde til støy. Nylige fremskritt innen encellede sekvensering teknologi har potensial til å løse dette problemet. I tillegg kan valideringen av befolkningen-baserte 4C resultater utføres med metoder som digital slippverktøy PCR eller fisk til å bestemme om disse resultatene gjenspeiles på encellede nivå.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av NIAMS (R01AR065523).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HindIII NEB R0104S
CviQI NEB R0639S
DNA oligonucleotide primers IDT To be designed by the reader
50 mL conical centrifuge tubes Fisher Scientific 06-443-19
1.7 mL microcentrifuge tubes MidSci AVSS1700
Phosphate buffered saline Thermo Fisher 14190-136
Formaldehyde, methanol free Electron Microscopy Sciences 15710
Nutator VWR 15172-203
Glycine JT Baker 4059-00
Benchtop centrifuge
Refrigerated microcentrifuge
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich ED2SS
20% SDS solution Sigma-Aldrich 05030
Trypan Blue Thermo Fisher 15250061
Glass slides Fisher Scientific 12-550-143
Cover slips VWR 16004-094
Light microscope
Triton X-100 Alfa Aesar A16046
Shaking heat block
2 M Tris-HCl Quality Biological 351-048-101
Proteinase K NEB P8107S
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1) Sigma-Aldrich P2069
Sodium acetate Sigma-Aldrich M5661
20 mg/mL glycogen Thermo Fisher R0561
Ethanol Fisher Scientific 04-355-223
Nuclease-free water Fisher Scientific MT-46-000-CM
qPCR cycler Thermo Fisher 4453536
qPCR plates Thermo Fisher 4309849
Thermocycler Thermo Fisher 4375786
PCR strip tubes MidSci AVSST-FL
1 M Magnesium chloride Quality Biological 351-033-721
Dithiothreotol Sigma-Aldrich 43815
Adenosine triphosphate Sigma-Aldrich A2383
T4 DNA Ligase NEB M0202S
Agarose Sigma-Aldrich A6013
RNase A Thermo Fisher EN0531
Qiaquick PCR purification kit Qiagen 28104
MinElute PCR Purification kit Qiagen 28004
Spectrophotometer
Expand Long Template PCR System Sigma-Aldrich 11681834001
dNTP mix Thermo Fisher R0191
SYBR Green I Sigma-Aldrich S9430
ROX BioRad 172-5858
Sodium chloride Sigma-Aldrich S5886
End-It DNA End-Repair Kit Lucigen ER0720
LigaFast Rapid DNA Ligation System Promega M8221
SYBR Safe Thermo Fisher S33102
Taq Polymerase NEB M0267S
UltraSieve Agarose IBI Scientific IB70054
Qiaquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dunham, I., et al. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  2. Hoffman, M. M., et al. Integrative annotation of chromatin elements from ENCODE data. Nucleic Acids Research. 41 (2), 827-841 (2013).
  3. Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. Capturing Chromosome Conformation. Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).
  4. Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. The long-range interaction landscape of gene promoters. Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).
  5. Li, G., et al. Extensive promoter-centered chromatin interactions provide a topological basis for transcription regulation. Cell. 148 (1-2), 84-98 (2012).
  6. Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).
  7. Zhao, Z., et al. Circular chromosome conformation capture (4C) uncovers extensive networks of epigenetically regulated intra- and interchromosomal interactions. Nature genetics. 38 (11), 1341-1347 (2006).
  8. Splinter, E., de Wit, E., van de Werken, H. J. G., Klous, P., de Laat, W. Determining long-range chromatin interactions for selected genomic sites using 4C-seq technology: From fixation to computation. Methods. 58 (3), 221-230 (2012).
  9. Van De Werken, H. J. G., et al. 4C technology: Protocols and data analysis. Methods in Enzymology. 513, Elsevier Inc. (2012).
  10. Brouwer, R. W. W., van den Hout, M. C. G. N., van IJcken, W. F. J., Soler, E., Stadhouders, R. Unbiased Interrogation of 3D Genome Topology Using Chromosome Conformation Capture Coupled to High-Throughput Sequencing (4C-Seq). Eukaryotic Transcriptional and Post-Transcriptional Gene Expression Regulation. , 199-220 (2017).
  11. Matelot, M., Noordermeer, D. Determination of High-Resolution 3D Chromatin Organization Using Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq). Polycomb Group Proteins: Methods and Protocols. , 223-241 (2016).
  12. Gheldof, N., Leleu, M., Noordermeer, D., Rougemont, J., Reymond, A. Detecting Long-Range Chromatin Interactions Using the Chromosome Conformation Capture Sequencing (4C-seq) Method. Gene Regulatory Networks: Methods and Protocols. , 211-225 (2012).
  13. Göndör, A., Rougier, C., Ohlsson, R. High-resolution circular chromosome conformation capture assay. Nature. 3 (2), 303-313 (2008).
  14. Hagège, H., et al. Quantitative analysis of chromosome conformation capture assays (3C-qPCR). Nature. 2 (7), 1722-1733 (2007).
  15. Anand, R. D., Sertil, O., Lowry, C. V. Restriction digestion monitors facilitate plasmid construction and PCR cloning. BioTechniques. 36 (6), 982-985 (2004).
  16. Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic acids research. 44 (W1), W3-W10 (2016).
  17. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).
  18. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  19. Walter, C., Schuetzmann, D., Rosenbauer, F., Dugas, M. Basic4Cseq: An R/Bioconductor package for analyzing 4C-seq data. Bioinformatics. 30 (22), 3268-3269 (2014).
  20. Raviram, R., et al. 4C-ker: A Method to Reproducibly Identify Genome-Wide Interactions Captured by 4C-Seq Experiments. PLoS Computational Biology. 12 (3), (2016).
  21. Klein, F. A., Pakozdi, T., Anders, S., Ghavi-helm, Y., Furlong, E. E. M., Huber, W. FourCSeq: analysis of 4C sequencing data. Bioinformatics. 31 (19), 3085-3091 (2015).
  22. Williams, R. L. Jr, et al. fourSig a method for determining chromosomal interactions in 4C-Seq data. Nucleic Acids Research. 42 (8), (2014).
  23. McLean, C. Y., et al. GREAT improves functional interpretation of cis-regulatory regions. Nature Biotechnology. 28 (5), 495-501 (2010).
  24. Stolzenburg, L. R., et al. Regulatory dynamics of 11p13 suggest a role for EHF in modifying CF lung disease severity. Nucleic Acids Research. 45 (15), 8773-8784 (2017).
  25. Meddens, C. A., et al. Systematic analysis of chromatin interactions at disease associated loci links novel candidate genes to inflammatory bowel disease. Genome Biology. 17 (1), 1-15 (2016).
  26. Yeung, J., et al. Transcription factor activity rhythms and tissue-specific chromatin interactions explain circadian gene expression across organs. Genome research. , 207787 (2017).

Tags

Genetikk problemet 140 Chromatin looper enhancers forskrifter sekvensering agn begrensning enzym lyse
Høy gjennomstrømming identifikasjon av regulatoriske gensekvenser med neste generasjons sekvensering av runde kromosom konformasjon fange (4C-seq)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brettmann, E. A., Oh, I. Y., de… More

Brettmann, E. A., Oh, I. Y., de Guzman Strong, C. High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq). J. Vis. Exp. (140), e58030, doi:10.3791/58030 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter