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Genetics

Identificação do elevado-throughput de sequências de genes regulatórios utilizando a próxima geração sequenciamento de conformação Circular cromossoma capturar (4C-seq)

Published: October 5, 2018 doi: 10.3791/58030
Automatic Translation
1, 1, 1
1Division of Dermatology, Center for Pharmacogenomics, Center for the Study of Itch, Department of Medicine, Washington University School of Medicine

Summary

A identificação das interações físicas entre genes e dos elementos reguladores é um desafio, mas tem sido facilitada pelos métodos de captura de conformação de cromossomo. Esta modificação no protocolo de 4C-seq atenua o viés PCR, minimizando a amplificação excessiva de modelos PCR e maximiza o mappability de leituras, incorporando um passo de digerir adição da enzima de restrição.

Abstract

A identificação dos elementos reguladores para um gene determinado alvo constitui um desafio técnico significativo devido à variabilidade nos tamanhos de posicionamento e efeito de elementos reguladores de um gene alvo. Alguns progressos com a previsão de bioinformatic da existência e função de proximais modificações epigenéticas associadas com a expressão de gene ativado usando locais de ligação do fator de transcrição conservada. Estudos de captura de conformação da cromatina tem revolucionado nossa habilidade para descobrir contatos físicos cromatina entre sequências e mesmo dentro de um genoma inteiro. Captura de conformação de cromatina circular juntamente com a próxima geração sequenciamento (4C-seq), em particular, é projetada para descobrir todas as possíveis interações físicas da cromatina para uma determinada sequência de interesse (ponto de vista), como um gene alvo ou uma regulamentação atrapalha... Estratégias atuais de 4C-seq diretamente sequência de dentro do ponto de vista, mas exigem numerosos e diversos pontos de vista a ser sequenciado simultaneamente para evitar os desafios técnicos de uniforme base chamando (imagem) com plataformas de sequenciamento de próxima geração. Este volume de experiências pode não ser prático para muitos laboratórios. Aqui, nós relatamos uma abordagem modificada do protocolo 4C-seq que incorpora tanto um digest de enzima de restrição adicional e etapas de amplificação qPCR-baseado que são projetadas para facilitar uma maior captura de sequência diversas leituras e mitigar o potencial para Viés de PCR, respectivamente. Nosso método de 4C modificado é passível de laboratório padrão de biologia molecular para avaliar a arquitetura da cromatina.

Introduction

A identificação dos elementos reguladores para a expressão de gene tem sido facilitada pelo projeto livre de elementos de DNA (ENCODE) que exaustivamente anotada atividade funcional para 80% do genoma humano1,2. A identificação dos locais para na vivo vinculação de fator de transcrição, DNaseI hipersensibilidade e epigenética histona e modificações de metilação do DNA em tipos de células individuais pavimentou o caminho para a análise funcional do candidato regulamentar elementos para a expressão do gene alvo. Armado com estas conclusões, nos deparamos com o desafio de determinar a interconectividade funcional entre genes e dos elementos reguladores. Especificamente, qual é a relação entre um gene alvo determinado e sua enhancer(s)? O método de captura (3c) conformação da cromatina aborda directamente esta questão por interações funcionais, físicas e prováveis identificação entre uma região de interesse e candidato interagindo sequências por meio de eventos capturados na cromatina fixo3 . Como nossa compreensão das interações de cromatina aumentou, no entanto, é evidente que a investigação dos loci candidatos pré-selecionados é insuficiente para fornecer uma compreensão completa das interações gene-realçador. Por exemplo, ENCODE utilizado o método de cópia carbono (5C) de captura de conformação cromossômica de alto rendimento para examinar uma pequena porção do genoma humano (1%, piloto conjunto dos 44 loci) e relatado complexa interconectividade dos loci. Genes e realçadores com interações identificadas em média diferentes parceiros de interação 2 – 4, muitas das quais foram centenas de kilobases afastado no espaço linear4. Além disso, Li et al. usado análise de interação cromatina pela cobertura-final Tag sequenciamento (ChIA-PET) para analisar interações promotor do inteiro-genoma e encontrado que 65% dos sítios de ligação II RNA polimerase estiveram envolvidos em interações de cromatina. Algumas dessas interações resultaram em grandes, genes multi complexos, abrangendo centenas de kilobases de distância genômica e que contém, em média, 8-9 genes cada5. Juntos, esses achados destacam a necessidade de imparcial do inteiro-genoma métodos para interrogar interações de cromatina. Alguns desses métodos são revistos em Schmitt et al. 6.

Métodos mais recentes para estudos de captura de conformação da cromatina juntamente com geração de sequenciamento (Hi-C e 4C-seq) habilitar a descoberta do desconhecido sequências interagindo com uma região de interesse6. Especificamente, a captura de conformação circular cromossoma com sequenciamento de nova geração (4C-seq) foi desenvolvida para identificar loci interagindo com uma sequência de interesse em uma forma imparcial7 por sequenciamento de DNA de cromatina capturada proximal para o região de interesse no espaço 3D. Brevemente, a cromatina é fixo para preservar suas interações da proteína-DNA nativo, clivado com uma enzima de restrição e posteriormente ligados em condições diluir para capturar biologicamente relevantes "emaranhados" dos loci interagindo (Figura 1). As ligações cruzadas são revertidas para remover a proteína, deixando assim o DNA disponível para a segmentação adicional com uma segunda enzima de restrição. Uma ligadura final gera círculos menores dos loci interagindo. Primers para a sequência de interesse são usados para gerar uma biblioteca amplificada de sequências desconhecidas dos fragmentos circularizou, seguidos de sequenciação de geração próxima a jusante.

O protocolo apresentado aqui, que se concentra na preparação da amostra, faz duas alterações principais existentes 4C-seq métodos8,9,10,11,12. Primeiro, ele usa um método baseado em qPCR para determinar empiricamente o número ideal de amplificação ciclos para as etapas de preparação de biblioteca 4C-seq e assim reduz o potencial para viés PCR decorrentes de excesso de amplificação de bibliotecas. Em segundo lugar, ele usa um restrição adicional digerir passo em um esforço para reduzir a uniformidade das sequências conhecidas de "isca" que impede a exata base-chamada pelo instrumento sequenciamento e, daí, maximiza a sequência original, informativa em cada leitura. Outros protocolos de contornar este problema por pool de muitas bibliotecas de 4C-seq8 (12-15) com isca diferentes sequências e/ou locais de limitação, um volume de experiências que pode não ser alcançável por outros laboratórios. As modificações apresentadas aqui permitem que um pequeno número de experimentos, amostras e/ou Replica para ser indexado e agrupados em uma única faixa.

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Protocol

1. enzima de restrição seleção

  1. Identificar uma região de interesse (ex., promotor do gene, polimorfismo de nucleotídeo único (SNP), potenciador) e obter a sequência de DNA de repositórios como National Center for Biotechnology Information (NCBI).
  2. Identificar as enzimas de restrição do candidato (REs) para a primeira enzima de restrição digestão (RE1) que não corte dentro da sequência de interesse, que produz extremidades pegajosas (termini de DNA com saliências) após RE digestão, e cujas atividades não são inibidas por Metilação de CpG.
    Nota: A resolução dos dados é determinada pelo RE1. Uma enzima com uma sequência de reconhecimento de 6 pares de base (PB) produz, em média, fragmentos de aproximadamente 4 kilobases (kb) de comprimento, enquanto que uma enzima com uma sequência de reconhecimento bp 4 produz fragmentos aproximadamente 250 bp no comprimento, permitindo que mais preciso identificação de sequências de interação.
  3. Selecione um RE1 as enzimas candidato identificadas no passo 1.2 que produz um "ponto de vista" restrição fragmento pelo menos 500 bp longa que inclui a região de interesse ou, alternativamente, uma região vizinha.
    Nota: A enzima selecionada deve ser passível de primer design (veja a etapa 2).
  4. Para a digestão segunda, identificar uma enzima de restrição (RE2) com uma sequência de reconhecimento de bp 4 que produz extremidades pegajosas (termini de DNA com saliências) após RE digestão, cuja actividade não é inibida pela metilação de CpG, e que corta dentro a restrição fragmento gerado pelo RE1 para produzir um fragmento de isca 250 – 500 bp (Figura 1).
    Nota: A enzima selecionada deve ser passível de primer design (veja a etapa 2).

2. design e teste de Primers para PCR inverso e eficiência da digestão qPCR

  1. Use uma ferramenta de design de primeira demão como Primer3 (http://primer3.ut.ee) para projetar primers inversas que são dirigidas para o exterior em direção as extremidades do fragmento de isca (i. e., 5' primer é um "Ré" cartilha, complementar a vertente mais, enquanto o 3' primer é um " para a frente"da primeira demão, complementar a vertente menos) e como fechar para os locais de restrição quanto possível para minimizar a amplificação de isca não-informativo sequenciar e maximizar a eficiência do PCR (Figura 2A).
    Nota: Primeiras demão devem ser previstas ter mínima específico amplificação do DNA genômico por em silico previsões de PCR e não devem alinhar em outro lugar no genoma exceto seu alvo com mais de 16/18 identidade9. Como adaptadores de sequenciamento não são incorporados os primers PCR inversas, o local de ligação do primer é mais flexível do que em outros métodos de preparação de 4C; as primeiras demão devem idealmente recozem dentro de 50 bp do fim do site restrição correspondente.
    1. Confirme a especificidade dos primers PCR inversas pela amplificação usando DNA genômico purificado (gDNA) como modelo.
    2. As primeiras demão ideal devem render alguns produtos quando usando gDNA como um modelo (ver passo 11.2 para a descrição dos produtos esperados do 4C). Se amplificação substancial de gDNA ocorre, projetar novas cartilhas. Se não aceitável da primeira demão de moda é identificadas, retornar à etapa 1 e selecione uma nova isca, selecionando novas enzimas de restrição.
  2. Projeto qPCR primers para amplificar os fragmentos 70 – 200 nucleotídeos (nt) de comprimento para monitorar a eficiência de digestão de restrição (Figura 2B).
    1. Desenha um par de primers para amplificar através de cada local de restrição (selecionado na etapa 1) que definem a sequência de isca. Desenhar os primers para ambos RE1 (consulte a etapa 6.5.6) e sites de RE2 (ver passo 9.2).
    2. Desenha um conjunto de primers que amplifica uma região não contendo os sites para qualquer enzima de restrição como um controle de normalização (DNA sem cortes) para RE1 e RE2 (ver também passo 6.5.6).

3. conjunto de células

  1. Usando um método apropriado para a cultura de tecidos ou células, obter uma suspensão de célula única. As células por 5 min a 200 x gde Pelotas, desprezar o sobrenadante e resuspenda o pellet em 500 µ l de solução salina tampão fosfato (PBS) por 107 células de 1x.

4. formaldeído cross-linking de células para preservar a cromatina interações

  1. Por 107 células, adicionar 9,5 mL de microscopia eletrônica de 1% (EM)-grau de formaldeído (metanol livre) em PBS e incubar, enquanto tombamento basculante (ou similar), durante 10 minutos à temperatura ambiente (RT, 18-22 ° C).
    Nota: As condições de fixação podem ter que ser otimizado para cada tipo de célula. Prévia de trabalho publicado em pilhas do rato relatou que a fixação ideal resulta em pelo menos 40% de leituras mapeadas, alinhando o cromossoma que contém o ponto de vista9 supondo que uma região não-oligospermia por um cromossomo de tamanho médio.
  2. Transferi os tubos de reação para o gelo e adicionar gelada 1m de glicina a uma concentração final de 0,125 M (1,425 mL) para saciar a reação de reticulação. Misture gentilmente por inversão.
  3. Centrifugue por 5 min a 200 x g, 4 ° C e Retire cuidadosamente todo o sobrenadante. Armazenar o centrifugado a-80 ° C, ou proceder de imediato à lise de células.

5. lise celular

  1. Resuspenda o pellet de célula de etapa 4.3 em 500 µ l de ácido etilenodiaminotetracético de 5mm (EDTA) para lavar. Centrifugar a 200 x g durante 5 min à RT. descartar o sobrenadante.
  2. Resuspenda o pellet de células em 125 µ l de 5 mM EDTA, com 0,5% sulfato dodecyl de sódio (SDS) e inibidores da protease x 1, como um coquetel contendo Antipaína 5 mg/mL, 10 mg/mL chymostatin, leupeptin de 10 mg/mL e 10 mg/mL pepstatin A. de x 100
    Nota: A concentração de detergente pode ter que ser otimizado para cada tipo de célula. Concentrações de detergente insuficientes resultará na lise celular incompleta, deixando a cromatina inacessível a enzimas de restrição. Se a digestão da limitação é persistentemente baixa na etapa 6.5.6 e confirmou-se a atividade da enzima, detergente adicional pode ser necessária. Aumente a concentração de SDS em incrementos de 0,1%.
  3. Incube a suspensão de células no gelo por 10 min.
    Nota: Para queratinócitos humanos primários, Lise ideal foi conseguido usando uma incubação de 10 min a 65 ° C, seguido de uma incubação de 37 ° C durante a noite em um tremendo bloco de aquecimento com agitação (900 rpm).
  4. Certifique-se de que lise celular é completo.
    1. Mix 6 µ l das células com 6 µ l de Trypan azul em um slide e cobrir com uma lamela. Ver os sob um microscópio.
      Nota: Após lise bem sucedida, o interior das células deve aparecer azul e un-lisadas células aparecerão em brancas.
    2. Se a lise celular parece insuficiente, as células a 200 x g por 5 min de pelotas e salvar o sobrenadante. Resuspenda o pellet e repita as etapas de 5,2-5,4 e/ou alternativamente com temperaturas de incubação diferentes (consulte a observação na etapa 5.3).
    3. Combinar a pelota re-lisada com o sobrenadante salvo e prosseguir.
      Nota: A Inspeção Visual não é uma garantia do lysis suficiente. Eficiência de digestão deve ser determinada objectivamente como na etapa 6.5.6.

6. a primeira restrição de digestão

  1. Adicionar 30 μL de 10x buffer de enzima de restrição (especificado pelo fabricante) e 27 μL de 20% Triton X-100 (final 1,8%) para a suspensão de passo 5.4. Trazer o volume total de 300 µ l com H2O.
    Nota: A composição da enzima de restrição reserva dependerá o RE escolhida na etapa 1.
  2. Retire uma alíquota de μL 15 como um "Controle não digerida" e em 4 ° C.
  3. Adicionar 200 U RE1 para a restante mistura de reação e incubar durante uma noite na temperatura adequada à enzima em um tremendo bloco de aquecimento com agitação (900 rpm). No dia seguinte, mais um adicional de 200 U RE1 e continuar a incubação durante a noite.
  4. Remover um 15 μL alíquota como um controle de"digerido" e armazenar a 4 ° C.
  5. Determine a eficiência da digestão:
    1. Adicione 82,5 µ l de pH de Tris-HCl 10mm 7.5 para amostras de 15 µ l de passos 6.2 e 6.4. Adicionar 2,5 µ l de proteinase K (20 mg/mL) e incubar durante 1 h a 65 ° C.
    2. Adicione 100 µ l de fenol-clorofórmio e misture vigorosamente por inversão para eliminar a contaminação residual da proteína. Centrifugue por 5 min, 16.100 x g , à temperatura ambiente.
    3. Transferi a fase aquosa para um novo tubo. Adicione 6,66 µ l de 3M de sódio acetato pH 5.2, 1 µ l de glicogênio de 20 mg/mL e 300 µ l de 100% de etanol (EtOH). Misture gentilmente por inversão e lugar a-80 ° C durante 1 h.
    4. Centrifugar por 20 min a 16.100 x g a 4 ° C. Remover o sobrenadante, adicionar 500 µ l de 70% EtOH e centrifugar por 5 min a 16.100 x g em RT
    5. Remover o sobrenadante e secar a pelota em temperatura ambiente por 2 min. resuspenda o pellet em 50 µ l de nuclease livre H2O.
    6. Determine a eficiência de digerir por qPCR13,14 , usando o método ∆∆Ct. Usar o primer conjunto não flanqueando um sítio de restrição (consulte a etapa 2.2.2) como o controle de normalização. Proceder-se a eficiência da digestão é > 85%. Caso contrário, as células de pelotas e repita os passos 5.2 – 6,5, omitindo a incubação a 65 ° C, no passo 5.3.

7. primeira ligadura

  1. Calor-inativar a enzima de restrição incubando min 20 a 65 ° C. Como alternativa, se a enzima não pode ser calor inativado, extrair o fenol-clorofórmio e etanol precipitar a amostra.
    Nota: As temperaturas mais elevadas inactivação recomendadas para algumas enzimas de restrição desnaturam as proteínas da cromatina, e isso pode afetar negativamente a qualidade da amostra. Além disso, extração fenol: clorofórmio não é ideal, pois resulta na perda da amostra.
  2. Transfira para um tubo cónico de 50 mL e adicionar 6 mL de nuclease livre H2O, 700 µ l de tampão ligase (660 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM de cloreto de magnésio (MgCl2), 10 mM ditiotreitol (DTT), 10 mM de trifosfato de adenosina (ATP)), de 10x e 50 U T4 DNA Ligase. Misture delicadamente e agitando e incubar durante uma noite a 16 ° C.
  3. Retire uma alíquota de 100 µ l da amostra como o 'controle de ligadura '.
  4. Determine a eficiência de ligadura:
    1. Adicionar 2,5 µ l de Proteinase K (20mg/mL) e incubar 1 h a 65 ° C.
    2. Adicione 100 µ l de fenol-clorofórmio e misture vigorosamente por inversão. Centrifugue por 5 min, 16.100 x g em RT.
    3. Transferi a fase aquosa para um novo tubo. Adicione 6,66 µ l de 3M de sódio acetato pH 5.2, 1 µ l de glicogênio e 300 µ l de 100% EtOH. Misture gentilmente por inversão e lugar a-80 ° C cerca de 1h.
    4. Centrifugar por 20 min a 16.100 x g a 4 ° C. Remover o sobrenadante, adicionar 500 µ l de 70% EtOH e centrifugar por 5 min a 16.100 x g a 4 ° C.
    5. Remover o sobrenadante e secar a pelota à temperatura ambiente. Resuspenda o pellet em 20 µ l de água e carregar em um gel de agarose de 0,6% ao lado os controles de"digestão" do passo 6.5.
      Nota: Uma amostra bem ligada deve aparecer como uma banda relativamente apertados, de alto peso molecular (Figura 3).
    6. Se a ligadura é suficiente, prossiga com a etapa 8. Caso contrário, adicione fresco ATP (concentração final de 1 mM) e ligase novo; Incubar durante uma noite a 16 ° C e repita as etapas 7.3-7.4.

8. inverta o cross-linking e isolar a cromatina

  1. Adicionar 15 µ l de Proteinase K (20 mg/mL) e incubar durante uma noite a 65 ° C para inverter as ligações cruzadas.
  2. Adicionar 30 µ l de RNase A (10 mg/mL) e incubar a 45 min a 37 ° C.
  3. Adicione 7 mL de fenol-clorofórmio e misture vigorosamente por inversão. Centrífuga de 15 min, 3.300 x g em RT.
  4. Transferir a fase aquosa para um novo tubo de 50 mL e adicione 7,5 mL de nuclease livre H2O (para diluir o DTT presente no buffer ligase, que, de outra forma, precipita-se com o DNA), 1 mL de pH 3 M de acetato de sódio 5,6, 7 µ l de glicogênio (20 mg/mL) e 35 mL de 100% EtOH. Misturar e incubar a-80 ° C durante 1 h.
  5. Centrífuga 20 min, 3.900 x g a 4 ° C. Remover o sobrenadante (pelota pode ser difícil de ver), lavar a pelota com 10 mL de gelada 70% EtOH e centrífuga 15 min, 3.300 x g a 4 ° C.
  6. Remover o sobrenadante e secar brevemente a pelota no RT. dissolver a pelota em 150 µ l de pH de 10 mM Tris-HCl 7,5 a 37 ° C. Armazenar a-20 ° C ou continue com o passo 9.

9. segunda restrição digestão: Aparar os círculos

Nota: Este passo cria círculos menores para minimizar a sobre-representação de menores capturados fragmentos devido a viés PCR em etapas de amplificação a jusante.

  1. Para a amostra da etapa 8.6, adicionar 50 µ l de 10x buffer de enzima de restrição (especificado pelo fabricante), 300 µ l de nuclease livre H2O e 50 U de enzima de restrição RE2. Incube durante uma noite na temperatura adequada para a enzima escolhida.
  2. Retire uma alíquota de 15 µ l da amostra como o "controle de digestão". Determine a eficiência da digestão conforme descrito no passo 6.5.

10. segunda ligadura e purificação de DNA

  1. Inativar a enzima de restrição, conforme recomendado pelo fabricante. Se a enzima não pode ser inactivados por calor, remova a enzima usando um kit de purificação baseada na coluna.
    Nota: Como isso resulta na perda da amostra, purificação da coluna não é o ideal.
  2. Transferir a amostra para um tubo de 50 mL e adicionar 12,1 mL de nuclease livre H2O, 1,4 mL de 10x buffer de ligadura (660 mM Tris-HCl, pH 7,5; 50 mM MgCl2; 10 mM DTT 10mm ATP) e 100 ligase do DNA de T4 U. Incubar durante uma noite a 16 ° C.
  3. Adicione 467 µ l de pH 3 M de acetato de sódio 5.6, 233 µ l livre de nuclease H2O, 7 glicogênio µ l (20 mg/mL) e 35 mL 100% EtOH. Misture bem e incubar a-80 ° C durante 1 h.
  4. Centrífuga de 45 min, 3.900 x g a 4 ° C. Remover o sobrenadante, adicionar 10 mL de frio 70% EtOH e centrífuga 15 min, 3.300 x g a 4 ° C.
  5. Remover o sobrenadante e secar brevemente a pelota à temperatura ambiente. Adicionar 150 µ l de pH de Tris-HCl 10mm 7.5 e incubar a 37 ° C para dissolver o sedimento.
  6. Purifica as amostras com uma sílica baseada na coluna PCR purificação kit, seguindo as instruções do fabricante. Use 1 coluna por 3 x 106 células, baseadas no número inicial das células. Eluir as colunas com 50 µ l de 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 e piscina as amostras.
  7. Medir a concentração por fluorimetria ou espectrofotometria usando a absorvância em 260 nm. O modelo de 4C está agora pronto para inverso do PCR. Armazenar a-20 ° C ou vá diretamente para o passo 11.

11. PCR amplificar sequências de interação desconhecidas por PCR inverso

  1. Determine o intervalo linear de amplificação através da realização de um PCR usando diluições de modelo de 12.5, 25, 50 e 100 ng 4C modelo. Se desejado, amplifica de gDNA em paralelo para comparar diretamente os produtos a fim de identificar a amplificação não-específica. Executar as reações de PCR usando uma desnaturação inicial a 94 ° C por 2 min; 30 ciclos consistindo de uma etapa de desnaturação a 94 ° C, durante 10 s, um passo de recozimento a 55 ° C por 1 min e uma etapa de extensão a 68 ° C por 3 min; e uma extensão final a 68 ° C por 5 min.
  2. Separe 15 µ l de cada produto do PCR em um gel de agarose 1,5% para confirmar a amplificação linear e avaliar a qualidade do modelo (Figura 4). Amplificação do modelo 4C deve produzir faixas discretas em baixas concentrações de DNA e um esfregaço em altas concentrações. A presença de mancha indica aumento da complexidade da ligadura 4C amplificado.
  3. Quando estiver satisfeito com a qualidade e quantidade do produto do PCR inverso gerado, configurar um qPCR para determinar o número ideal de ciclos para usar para amplificação:
    1. Configure as reações que contém corantes SYBR e ROX usando a mistura de reação na tabela 2. A menos que a amplificação não é linear em concentrações elevadas no passo 11.2, uso 100 ng do modelo por reação.
      Nota: A adição de ROX facilita a normalização do sinal fluorescente de bem de bem e de ciclo para ciclo.
    2. Executar as reações de PCR usando uma desnaturação inicial a 94 ° C por 2 min; 40 ciclos consistindo de uma etapa de desnaturação a 94 ° C, durante 10 s, um passo de recozimento a 55 ° C por 1 min e uma etapa de extensão a 68 ° C por 3 min; e uma extensão final a 68 ° C por 5 min.
    3. Determine a fluorescência de pico (ponto final) das reações usando o enredo de amplificação. Determine o ciclo em que reações atingirem 25% do pico da fluorescência (Figura 5).
      Nota: Este é o número de ciclos que será usado para amplificar as bibliotecas 4C (ver passo 11.4).
  4. Configure o inverso do PCR como na tabela 3 para amplificar sequências desconhecidas ligadas à isca do modelo 4C. Divida em 16 reações de 50 µ l de antes da execução. Executar as reações de PCR usando uma desnaturação inicial a 94 ° C por 2 min e ciclos consistindo de uma etapa de desnaturação a 94 ° C, durante 10 s, um recozimento passo a 55 ° C por 1 min, e uma etapa de extensão a 68 ° C por 3 min. Use o número de ciclos de determinado na etapa 11.3.3.
  5. Coletar e as reações da piscina. Purifica usando um kit de purificação de PCR de baseados em colunas de sílica. Use pelo menos 2 colunas por 16 reações. Os produtos PCR purificados da piscina.
  6. Determine a quantidade de amostra e pureza por espectrofotometria. Rendimentos típicos são entre 10 e 20 μg com A260/A280 ~ 1.85. Se as taxas de absorção são sub-ótimo, re-purifica a fim de evitar problemas durante o sequenciamento.
  7. Avaliar a complexidade da biblioteca, separando a 300 ng do produto PCR purificado em um gel de agarose 1,5%.
    Nota: Produto amplificado deve se parecer com isso de passo 11.2.

12. terceira restrição digestão: Recortar sequências de isca

Nota: Este passo remove sequências não-informativo isca os produtos PCR inversas para maximizar informativas sequências capturadas nas etapas a jusante de sequenciamento. Para monitorar a eficiência de síntese, um "monitor de digerir"15 é digerido em paralelo usando a concentração de DNA e enzima equivalente. Se RE1 e RE2 são incompatíveis para a digestão simultânea, por exemplo, devido a temperaturas de incubação ideal diferente ou buffers de reação, isto deve ser feito como um digest sequencial (isto não é o ideal).

  1. Obter um monitor de digerir RE e testar a digestão em uma reação de 50 µ l.
    Nota: Esta é uma molécula de dsDNA (por exemplo, um plasmídeo, PCR amplicons ou DNA sintético) que contém o site do RE. A única exigência é que deve ser fácil de distinguir corte de monitor sem cortes em um gel de agarose. Otimizar RE monitor massa e enzima concentração se necessário.
  2. Digest 1 µ g de produto PCR inverso purificado de 11,6 passo e, em paralelo, o monitor RE da etapa 12.1.
    Nota: DNA e concentração de enzima, bem como o tempo de incubação, deve ser o mesmo para o resumo de teste no passo 12.1 para tanto o inverso produto do PCR e digere o monitor. Ajuste o volume de reação conforme necessário.
  3. Execute o digerido RE monitor em um gel de agarose de concentração adequada para os fragmentos esperados. Digestão é considerada suficiente quando < 10% do DNA permanece sem cortes (Figura 6).
  4. Purifica o produto do PCR inverso digerido em um kit de purificação de DNA de baseados em colunas de sílica. Se digere sequenciais é necessárias, repita os passos 12.1 – 12,4 com a segunda enzima.

13. preparação de sequenciamento de biblioteca

  1. Ligar os adaptadores compatíveis com a respectiva plataforma sequenciamento da geração seguinte.
    1. Desenha os adaptadores para cada RE1 e RE2 para que, após recozimento os oligos, cada adaptador RE tem a respectiva saliência de 1 lado.
      Nota: por exemplo, se HindIII é usado, o adaptador recozido deve conter uma ' fosforilada "AGCT" saliência 5. Alternativamente, se o padrão T-saliência adaptadores são usados, fim-reparação e cauda-a biblioteca antes da ligadura do adaptador.
    2. Recoze o respectivo adaptador RE oligos. Resuspenda os oligos em buffer de recozimento (10 mM Tris, pH 7,5, 50 mM de cloreto de sódio (NaCl), 1 mM EDTA), misturar em quantidades equimolar de 50 µM, calor para 95 ° C e deixar arrefecer lentamente a 25 ° C.
    3. Realize a reação da ligadura. Misture 4 re-digerido C biblioteca com um total 5 - a 10 vezes molar excesso de adaptadores recozidos (passo 13.1.2; proporção 50: 50 para cada adaptador RE usado) ligase tampão 1x e adicionar 6U DNA ligase. Incube-se de acordo com as instruções do fabricante.
    4. Remova o excesso adaptadores purificando usando um kit de coluna baseada em sílica de eluição de baixo volume.
  2. Tamanho-selecione.
    Nota: Seleção de tamanho também pode ser realizada usando um kit de limpeza baseados em grânulo e recomenda-se mesmo depois de purificação da coluna.
    1. Conversão de um gel de agarose 2% usando um agarose de alta resolução, adicionando uma mancha não-UV antes de servir. Certifique-se de que toda a água perdida por evaporação durante o aquecimento é substituída pela garrafa ou frasco de pesagem antes e após aquecimento e adição de água para recuperar a massa perdida.
    2. Execute as bibliotecas adaptador-ligados em gel, deixando pistas vazias entre as amostras.
    3. Excisar as fatias do gel correspondente para o bp de escala 150 tamanho para 1 kb usando um limpa bisturi ou lâmina de barbear.
    4. Purifica as bibliotecas do gel usando um kit de extração do gel. Para minimizar o viés de GC na recuperação do DNA, dissolva as fatias do gel em temperatura ambiente com rotação.
  3. Determine o número de ciclos de amplificação por PCR por qPCR usando a mistura de reação na tabela 4. Executar as reações de PCR usando uma desnaturação inicial a 98 ° C por 2 min e 40 ciclos consistindo de uma desnaturação passo a 98 ° C, durante 10 s, um passo de recozimento a 60 ° C por 1 min e uma etapa de extensão a 72 ° C por 3 min.
    Nota: O ciclo em que a fluorescência atinge 25% do máximo é o número de ciclos que será usado para amplificar a biblioteca, como no passo 11.3.
  4. Amplifica as bibliotecas usando a mistura de reação na tabela 5. Executar as reações de PCR usando uma desnaturação inicial a 98 ° C por 2 min e ciclos consistindo de uma etapa de desnaturação a 98 ° C, durante 10 s, um passo de recozimento a 60 ° C por 1 min e uma etapa de extensão a 72 ° C por 3 min. O número de ciclos de amplificação para ser usado para cada biblioteca foi determinado na etapa 13.3.
  5. Purifica amplificadas bibliotecas usando um kit de coluna baseada em sílica de eluição de baixo volume.

14. sequenciamento e análise de dados de sequenciamento

  1. Determine as concentrações de bibliotecas amplificadas usando um ensaio fluorimétrica. Dilua as bibliotecas com a concentração adequada para sequenciamento (verificar com o serviço de sequenciamento ou núcleo para sua recomendação).
  2. Determine a qualidade das bibliotecas usando uma plataforma de análise de ácidos nucleicos microfluidic.
    Nota: O perfil do tamanho da biblioteca deve espelhar que vi sobre o gel de seleção de tamanho em 13,2 passo, e a concentração da amostra determinada nesta etapa vai ser utilizada para o sequenciamento.
  3. Piscina indexados bibliotecas para obter leituras de pelo menos 3 milhões (pelo menos 50 bp ler; single [1 X 50] ou emparelhado final [2 X 50]) por exemplo. Uma biblioteca de alta qualidade requer pelo menos 1 milhão mapeado lê9, mas haverá algum atrito durante o mapeamento. Por exemplo, uma plataforma de sequenciamento que rende aproximadamente 150 milhões leituras por lane pode acomodar até 50 amostras em uma única faixa.

15. análise de dados da sequência

  1. Demultiplex os dados usando sequências de índice para atribuir as leituras de suas amostras adequadas.
    Nota: Dependendo de sua familiaridade, os usuários podem executar análises computacionais a jusante de arquivos raw de FASTA/FASTQ sequência usando a interface de linha de comando básica ou, alternativamente, a user-friendly, web-based galáxia gráfica do usuário interface (GUI)16 .
  2. Apare as sequências de adaptador e qualquer sequência de isca decorrentes incompleta RE digestão no passo 12, por exemplo, usando o Toolkit de FAST-X (http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/).
  3. Mapa demultiplexed leituras para o genoma adequado de interesse (ex., UCSC mm10, hg19) arquivos de saída usar o alinhador de Burrows-Wheeler (BWA)17 ou outro software de alinhamento resultando em SAM. Se necessário, converter arquivos de SAM para BAM através de samtools18 (ver passo 15,4).
  4. Use um pipeline de análise 4C-seq como Basic4Cseq19, 4C-ker20, FourCSeq21ou fourSig22 para analisar os dados e identificar as interações.
    Nota: A análise dos dados e a avaliação da qualidade respectivas devem ser conduzidos de acordo com o manual de referência do pacote software selecionado. Pacotes de geram arquivos de saída cama, exceto onde anotado. Brevemente, Basic4CSeq19 usa um arquivo de entrada SAM (passo 15.3) para visualizar as interações (txt, tiff, cama e arquivos de saída de peruca) e avalia a qualidade dos dados com base nos critérios estabelecidos na van de Werken et al. 9 4C-ker20 (entrada aparado FASTQ, passo 15.2) e FourCSeq21 (entrada BAM, passo 15,3) diferenciais interações entre condições de identificar. fourSig22 (entrada SAM) também identifica interações significativas e prioriza aquelas que são susceptíveis de ser reprodutíveis. Ferramentas como o Genomic regulamentar enriquecimento de anotações ferramenta (grande)23, ou integração com ENCODE de conjuntos de dados também podem ser utilizadas para prever a função biológica de interações descoberto por 4 C-Seq

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Representative Results

Queratinócitos humanos primários foram isolados a partir de prepúcios neonatais descartados de 2 – 3, em pool e cultivadas em KSFM suplementado com 30 µ g/mL bovina pituitária extrato, 0.26 ng/mL recombinante humano fator de crescimento epidérmico e 0,09 mM de cloreto de cálcio (CaCl2 ) a 37 ° C, 5% de dióxido de carbono. As células foram divididas em dois balões, e um balão se diferenciava pela adição de CaCl2 para uma concentração final de 1,2 mM para células de7 72 h. 10 cada da proliferando e diferenciadas queratinócito populações foram fixadas em 1% formaldeído por 10 min à temperatura ambiente. Separadamente, as células K562 foram cultivadas em RPMI suplementado com 10% de soro bovino fetal a 37º C, 5% de dióxido de carbono. 107 células foram fixadas em formol 1% durante 10 minutos à temperatura ambiente.

As células foram lysed e a cromatina fixa foi digerida com HindIII e ligada como descrito acima. Ligações cruzadas foram invertidas, e o DNA é purificado e digerido com CviQI. DNA foi ligado e utilizado como o modelo para amplificação por PCR inversa. Primers utilizados foram: 5'-GATCAGGAGGGACTGGAACTTG/5 '-CCTCCCTTCACATCTTAGAATG. 1 µ g de produto PCR inverso purificado foi digerido durante a noite com CviQI em paralelo com 225 ng de RE digerir monitor e coluna-purificado. ADN purified então foi digerido durante a noite com HindIII em paralelo com 125 ng de RE digerir monitor e coluna-purificado. 250 ng de purificado duplo-digerido inverso produto do PCR foi utilizado para preparação de biblioteca. Resumidamente, as extremidades foram reparadas através de conversões para 5'-fosforilada e blunt-extremidades e coluna-purificação subsequente do DNA. Extremidades foram-de-cauda-A 20 min a 72 ° C, em uma reação de 50 µ l com 1 U de Taq polimerase e 200 µM dATP e coluna-purificado. Compatível de sequenciamento prep biblioteca adaptadores foram ligados a uma proporção de 10:1 (adaptador: DNA) usando T4 DNA ligase em um 30 reação µ l, à temperatura ambiente por 15 min e o DNA coluna-purificado. As bibliotecas foram executados em um gel de agarose 2%, gel de fatias foram cortadas do 120 bp até o topo da escada para remover adaptadores e bibliotecas foram purificados. 200 pg de cada biblioteca foram avaliados em 10 reações de qPCR µ l contendo primers indexação para determinar ciclos de amplificação do PCR ideais. As bibliotecas foram amplificadas para adicionar índices usando o número de ciclos determinados pelo qPCR e sequenciados em um HiSeq2500 para obter leituras 1 x 50.

Leituras foram demultiplexed e aparadas. Primeiro, os adaptadores de sequenciamento foram removidos. Posteriormente, a sequência desde o início de cada primer para o site de restrição foi aparada. Isto permite o mapeamento dos produtos PCR inversas que não foram totalmente digeridos antes da preparação da biblioteca. Importante, incluindo a sequência entre o sítio de ligação do primer e o sítio de restrição impede o mapeamento do produto PCR não especificamente-amplificados. Aparada leituras foram mapeadas para hg38 usando BWA. A Figura 7 mostra lê o mapeamento para a região em torno do ponto de vista.

Figure 1
Figura 1: esquemático do fluxo de trabalho 4C-seq. Cromatina é reticulada para preservar os contatos de proteína-ADN digerida com RE1 e ligada para vincular loci interagindo. Ligações cruzadas são revertidas, e o DNA é digerido com RE2 e ligado. Sequências de interação desconhecidas são amplificadas utilizando primers que se ligam à região de interesse, e os produtos de PCR são digeridos com RE1 e RE2 para aparar sequências conhecidas. DNA amplificado de sequência desconhecida é usado em uma preparação de biblioteca de sequenciamento, em que os adaptadores são ligados e a biblioteca é PCR amplificados e sequenciado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Diagramas esquemáticos dos desenhos da primeira demão. (A) Binding sites para iniciadores de PCR inversas. Cartilhas são voltadas "para fora" (i. e., 5' primer é um primer "reverso", complemento a vertente mais, enquanto o 3' primer é um primer "forward", complemento a vertente menos) e vincular dentro de 50 bp de cada site de restrição (indicado pelo vermelho sombreamento). (B) vinculação sites para qPCR primers para determinar a eficiência de síntese de enzima de restrição. Par de um primer flancos cada site de enzima de restrição. Um conjunto de controles de cartilha amplifica uma sequência que não contém um site para cada enzima e é usada para normalizar os valores de Ct para a entrada de DNA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: electroforese do gel do Agarose para avaliar a eficiência da ligadura para cromatina RE1-digerido. Sem cortes, HindIII-digerido e ligadas amostras foram tratadas com proteinase K e aquecidas para inverter as ligações cruzadas, extraído de fenol: clorofórmio, EtOH precipitado e ressuspensão em H2O. purificado DNA foi executado em um gel de agarose de 0,6% e bandas visualizadas por brometo de etídio manchando com comparação de 1 kb mais escada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4:4 titulação de modelo para o inverso do PCR. Diluições em série foram feitas de modelos de 4C e usadas em reações de PCR inversas. Produtos PCR foram executados em gel de agarose 1,5% e visualizadas com brometo de etídio mancha ao lado de 1 kb mais escada. NTC denota uma reação não-modelo de controle. Observe um aumento correlativo amplificação com um aumento na concentração de modelo. Esta amplificação representativa foi conduzida na cromatina clivada com HindIII como RE1 e CviQI como RE2, e sequências de primer usadas para inverso amplificação por PCR foram 5'-GATCAGGAGGGACTGGAACTTG/5 '-CCTCCCTTCACATCTTAGAATG. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: determinação mediada por qPCR de ciclos de amplificação necessária para amplificar o modelo para o inverso do PCR. 4C modelos foram ampliados em reações contendo 1 x SYBR Green e 1 x ROX em um thermocycler em tempo real. Fluorescência de pico foi determinada e calculou-se o número de ciclos necessários para atingir a ¼ da fluorescência de pico. Este número de ciclos foi usado para amplificar o modelo 4C para inverso do PCR. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: electroforese do gel do Agarose de digerido RE monitor indicando digestão suficiente. RE s digest monitor foi amplificada do DNA genômico humano usando as primeiras demão f: 5'-TCCTATCCCTGGTCTGTCTTAT e r: 5'-CCACATTGGTCCTTCTAGTCTTC e purificado. 225 ng do monitor foi digerido com 15 U CviQI em uma reação de 50 µ l a 25 ° C durante a noite e executar em um gel de agarose 1,5% ao lado de 1 kb mais escada. Bandas foram visualizadas com coloração de brometo de etídio. Monitor sem cortes é 2515 bp; esperado de tamanhos de fragmento são 132, 343, 488, 539 e 1013 BP clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: faixa genômica representativa da cobertura Leia dentro 5 kb da região do ponto de vista. Lê foram aparadas e mapeado para o hg38 usando BWA. A maioria das leituras (picos azuis) alinha HindIII ou CviQI locais adjacentes aos locais de HindIII, como esperado. A região do ponto de vista é destacada em vermelho. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Volume para 1 x
10 x expandir modelo longo Buffer 1 2,5 Μ l
dNTPs (10 mM) 0,5 Μ l
Cartilha para a frente pmol 35
Primeira demão reversa pmol 35
Expandir o modelo longo do Polymerase (5 U / µ l) 0,35 Μ l
DNA
Água livre de nuclease a 25 µ l

Tabela 1: Mistura de reação de PCR para a amplificação de modelo 4C (passo 11.1).

Volume para 1 x
10 x expandir modelo longo Buffer 1 1,5 Μ l
dNTPs (10 mM) 0,3 Μ l
Cartilha para a frente pmol 21
Primeira demão reversa pmol 21
100 x SYBR Green eu 0,15 Μ l
50 x ROX 0,3 Μ l
Expandir o modelo longo do Polymerase (5 U / µ l) 0,21 Μ l
DNA 100 ng
Água livre de nuclease a 25 µ l

Tabela 2: mistura de reação de qPCR para a determinação do número de amplificação ciclos para inverso PCR (etapa 11.3.1).

Volume para 1 x
10 x expandir modelo longo Buffer 1 80 Μ l
dNTPs (10 mM) 16 Μ l
Cartilha para a frente 1.12 nmol
Primeira demão reversa 1.12 nmol
Expandir o modelo longo do Polymerase (5 U / µ l) 11,2 Μ l
DNA 3.2 µ g
Água livre de nuclease a 800 µ l

Tabela 3. Mistura de reação de PCR para a amplificação por PCR inversa final do modelo 4C (passo 11.4).

Volume para 1 x
5 x tampão Phusion HF 2 Μ l
dNTPs (10 mM) 0,2 Μ l
Primer Miltiplexing 1.0 5 pmol
Primer Miltiplexing 2.0 pmol 0.1
Cartilha de índice 5 pmol
100 x SYBR Green eu 0,1 Μ l
50 x ROX 0,2 Μ l
Phusion polimerase 0,1 Μ l
DNA 2 Μ l
Água livre de nuclease a 10 µ l

Tabela 4: ciclos de mistura de reação de qPCR para a determinação do número de amplificação para sequenciamento prep biblioteca (etapa 13.3).

Volume para 1 x
5 x tampão Phusion HF 10 Μ l
dNTPs (10 mM) 1 Μ l
Primer Miltiplexing 1.0 pmol 25
Primer Miltiplexing 2.0 pmol 0,5
Cartilha de índice pmol 25
Phusion polimerase 0,5 Μ l
DNA 10 Μ l
Água livre de nuclease a 50 µ l

Tabela 5: Mistura de reação de PCR para a amplificação de bibliotecas do sequenciamento (passo 13,4).

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Discussion

4C resultados têm o potencial para revelar interações de cromatina que podem identificar elementos normativos anteriormente desconhecidos e/ou genes-alvo que são importantes em um contexto específico biológico24,25,26. No entanto, barreiras técnicas podem limitar os dados obtidos a partir dessas experiências. Viés PCR decorrentes de amplificação excessiva do modelo em protocolos 4C é provável. Este protocolo aborda esta questão utilizando qPCR para determinar que o número ideal de amplificação ciclos de forma objetiva. Além disso, a remoção das sequências isca de produtos PCR amplificados inversas de digest de restrição pode facilitar a identificação das interações de cromatina por duas razões. Primeiro, ele reduz o comprimento de pares de bases não-informativos (isca) do material a ser sequenciado. Em segundo lugar e como resultado, aumenta a probabilidade de que mais leituras serão geradas a partir de diversas sequências (uma propriedade necessária para a chamada base exata) e, portanto, mais informativas interação sequências podem ser mapeadas. Outros protocolos exigem a conjugação de muitas bibliotecas usando iscas diferentes sequências e/ou enzimas de restrição ou exigem aumentando a concentração de phiX da amostra sequenciada para contornar a questão de uniformidade de sequência por ligar base exata. Esse método permite que várias amostras com a mesma sequência de isca ser agrupado em uma pista de sequenciamento único sem capacidade de sequenciamento valioso com excesso phiX que ocupam.

Lise e fixação da pilha são primeiros passos críticos, os quais podem exigir otimização para tipos de célula específica. Fixação insuficiente falhará preservar contatos específicos entre uma região de interesse e suas sequências interagindo, produzindo dados uninformative dominados pelo ruído. Em contraste, fixação excessiva irá diminuir a capacidade das enzimas de restrição de cleave cromatina, resultando em menos eventos informativos da ligadura. Tanto o fixador concentração e o tempo de incubação podem ser alteradas para otimizar essa variável. Da mesma forma, lysis da pilha insuficiente reduz o acesso de enzimas de restrição a cromatina, novamente, reduzindo o número de eventos informativos da ligadura. Em nossas mãos, queratinócitos primários humanos lysed mais eficazmente usando uma combinação de condições hipotônicas e detergente. Outros tipos de células podem exigir condições diferentes de Lise, que terão de ser determinado empiricamente. Lise eficiente pode ser identificado por métodos de exclusão de corante de microscopia como azul Trypan coloração.

Uma limitação do método 4C é que os resultados só podem representar uma média da população. Com uma população celular heterogênea, pode ser difícil determinar a verdadeiras interações vs ruído devido à variabilidade biológica. Enquanto o uso de uma linhagem de células ou a classificação de células para produzir uma população homogênea de célula é previsto para gerar sinais mais claros, a variabilidade entre as células individuais ainda é uma possível fonte de ruído. Recentes avanços em tecnologias de sequenciamento de célula única têm o potencial para ultrapassar este problema. Além disso, a validação dos resultados de 4C base populacional pode ser realizada usando métodos como gotículas digital PCR ou peixe para determinar se esses resultados são refletidos no nível de célula única.

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Disclosures

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pela NIAMS (R01AR065523).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HindIII NEB R0104S
CviQI NEB R0639S
DNA oligonucleotide primers IDT To be designed by the reader
50 mL conical centrifuge tubes Fisher Scientific 06-443-19
1.7 mL microcentrifuge tubes MidSci AVSS1700
Phosphate buffered saline Thermo Fisher 14190-136
Formaldehyde, methanol free Electron Microscopy Sciences 15710
Nutator VWR 15172-203
Glycine JT Baker 4059-00
Benchtop centrifuge
Refrigerated microcentrifuge
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich ED2SS
20% SDS solution Sigma-Aldrich 05030
Trypan Blue Thermo Fisher 15250061
Glass slides Fisher Scientific 12-550-143
Cover slips VWR 16004-094
Light microscope
Triton X-100 Alfa Aesar A16046
Shaking heat block
2 M Tris-HCl Quality Biological 351-048-101
Proteinase K NEB P8107S
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1) Sigma-Aldrich P2069
Sodium acetate Sigma-Aldrich M5661
20 mg/mL glycogen Thermo Fisher R0561
Ethanol Fisher Scientific 04-355-223
Nuclease-free water Fisher Scientific MT-46-000-CM
qPCR cycler Thermo Fisher 4453536
qPCR plates Thermo Fisher 4309849
Thermocycler Thermo Fisher 4375786
PCR strip tubes MidSci AVSST-FL
1 M Magnesium chloride Quality Biological 351-033-721
Dithiothreotol Sigma-Aldrich 43815
Adenosine triphosphate Sigma-Aldrich A2383
T4 DNA Ligase NEB M0202S
Agarose Sigma-Aldrich A6013
RNase A Thermo Fisher EN0531
Qiaquick PCR purification kit Qiagen 28104
MinElute PCR Purification kit Qiagen 28004
Spectrophotometer
Expand Long Template PCR System Sigma-Aldrich 11681834001
dNTP mix Thermo Fisher R0191
SYBR Green I Sigma-Aldrich S9430
ROX BioRad 172-5858
Sodium chloride Sigma-Aldrich S5886
End-It DNA End-Repair Kit Lucigen ER0720
LigaFast Rapid DNA Ligation System Promega M8221
SYBR Safe Thermo Fisher S33102
Taq Polymerase NEB M0267S
UltraSieve Agarose IBI Scientific IB70054
Qiaquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704

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References

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